CN103520700A - 藻青素二肽的生物技术制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过用CGP酶降解聚合物制剂从藻青素(CGP)或CGP样聚合物制剂酶法制备二肽组合物的方法,特别适于所述方法的CGP酶,以及藻青素(CGP)或CGP样聚合物或其片段、尤其是通过如上所定义的方法获得的二肽组合物作为药物组合物、药物或作为食品或饲料替代品的应用。
Description
技术领域
本发明涉及通过用CGP酶降解聚合物制剂从藻青素(CGP)或CGP样聚合物制剂酶法制备二肽组合物的方法,特别适于所述方法的CGP酶,以及藻青素(CGP)或CGP样聚合物或其片段、尤其是通过如上所定义的方法获得的二肽组合物作为药物组合物、药物或作为食品或饲料替代品的应用。
背景技术
已知天然存在三种不同的聚(氨基酸):聚(ε-L-赖氨酸)(ε-PL)、聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)和藻青素(CGP)。聚(氨基酸)存在于许多环境中,并且为生产性生物体实现不同的功能(Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。例如,藻青素(多-L-精氨酰-聚-[L-天冬氨酸]),作为藻青素颗粒性多肽(CGP)被熟知,在100多年前在蓝细菌中发现(Borzi,A.,Malpighia1:28-74(1887)),其为该生物体提供氮、碳和能量。它在每个结构单元中含有5个氮原子并且因此形成理想的细胞内氮储库(Mackerras,A.H.等,J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990))。聚(氨基酸)的生物相容性和彻底的生物可降解性使它们成为生物医药、农业、农业化学、个人护理和药学领域中人类生活的许多应用的理想候选物(Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。
包括蓝绿藻螺旋藻(Spirulina)的蓝细菌的几个种已经被制成为人和动物的营养来源(Kihlberg,R.,A.Rev.Microbiol.26:427-466(1972))。CGP本身于1887年在蓝细菌中发现。蓝细菌的大多数属带有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合成CGP(Mackerras,A.H.等,J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990))。编码CphA的基因也在异氧细菌中被鉴定(Krehenbrink,M.等,Arch.Microbiol.177:371-380(2002);Fuser,G.等,Macromol.Biosci.7:278-296(2007))。支化聚合物作为不溶的细胞内无膜颗粒出现在细胞质中(Allen,M.M.等,J.Bacteriol.154:1480-1484(1983))。其由等摩尔量的精氨酸和天冬氨酸以聚(天冬氨酸)(PAA)主链形式排列组成,一部分精氨酸通过其α-氨基与每个天冬氨酸的β-羧基连接(Simon,R.D.等,Biochim.Biophys.Acta420:165-176(1976))。对于大规模生产,蓝细菌cphA基因异源地克隆进大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。来自重组细菌的CGP含有很少的赖氨酸(Voss,I.等,Metabol.Eng.8:66-78(2006))。CGP广泛地分布在不同的自然生活环境中,并且被细胞内或细胞外的CGP酶降解(分别为CphB、CphE)。具有CphE的细菌见于多个生活环境中;CphEPa和CphEBm分别从病鳝假单胞菌B1(P.angulliseptica B1)和巨大芽孢杆菌BAC19(B.megaterium BAC19)分离和表征(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002);Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004))。CGP降解还发生在缺氧的生活环境中,分别由诸如香港互营单胞菌KI(Sedimentibacterhongkongensis KI)或产碱假单胞菌DIP1(P.alcaligenes DIP1)的专性厌氧菌或兼性厌氧菌进行(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。所有已知的CGP酶从CGP产生水溶性β-二肽,然后其被转运至细胞中进一步被分解代谢(Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。
蛋白消化和转运对生命是至关重要的。例如在反刍动物中,饮食蛋白质的主要部分被瘤胃菌丛(rumen flora)降解成氨基酸和肽。氨基酸结合至微生物蛋白中或传送至消化道的下一部位或经过瘤胃壁直接吸收至血液中(Faix,.等,Acta Vet.Brno.70:243-246(2001))。然而,三肽和二肽比游离氨基酸更有效地被利用,具有较高的营养价值,被更好地吸收(至多达游离氨基酸的185%)(Adibi,S.A.,J.Clin.Invest.50:2266-2275(1971))并且比完整蛋白保留更多的氮,从而促进体重增长的增加(Dock,D.B.等,Biocell28:143-150(2004))。在其某些氨基酸的转运遗传性受损的患者中的吸收研究显示,如果作为二肽施用则这些氨基酸的吸收正常。这表明存在二肽的专用和有效的转运系统(Adibi,S.A.,Gastroenterology113:332-340(1997))。因此,水解蛋白饮食经常用作饲料补充剂以使营养不良的病例痊愈(Dock,D.B.等,Biocell28:143-150(2004))。
半必需氨基酸精氨酸在细胞生理学中具有多个关键的作用,并且因此被应用于许多心血管、生殖泌尿、胃肠、或免疫疾病的治疗方案中(其综述参见(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。必需氨基酸赖氨酸已知作为用于人和动物的食品添加剂,具有抗单纯疱疹病毒的活性,并且改善小肠中的钙吸收,因此起对抗骨质疏松症的作用(Cynober,L.A.,Metabolic and therapeutic aspects of amino acids inclinical nutrition.(在临床营养中氨基酸的代谢和治疗状况),第二版,CRC Press LLC,Boca Raton,USA(2003))。非必需氨基酸中的天冬氨酸充当L-精氨酸的前体,用于能量代谢(Voet,D.等,Biochemistry(生物化学).第三版,John Wiley and Sons Inc.,New York(2004)),并且用于阳离子或其它氨基酸的药物递送(Cynober,L.A.,Metabolic andtherapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在临床营养中氨基酸的代谢和治疗状况),第二版,CRC Press LLC,Boca Raton,USA(2003))。由于二肽形式的氨基酸具有较高的生物利用度,因此它们作为二肽的施用在临床上得到批准并可在市场上作为产品获得(Duruy,A.等,Vie.Med.Int.9:1589(1965);Duruy,A.,Med.Int.1:203(1966);Sellier,J.,Rev.Med.Toulouse5:879(1979);De-Aloysio,D.等,Acta Eur.Fertil.13:133-167(1982);Rohdewald,P.,Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.40:158-168(2002);Lamm,S.等,Eur.Bull.Drug Res.11:29-37(2003))。
迄今,对于CGP本身还未知有直接的应用。以前对CGP的研究受到CGP作为生物可降解PAA的潜在来源的启发(Mooibroek,H.等,Appl.Microbiol.Biotechnol.77:257-267(2007))。后者具有许多潜在的应用(Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004)),例如作为透析膜、人工皮肤和整形外科植入体中的成分或作为药物载体。PAA还可以替代非生物可降解的具有多种技术应用的聚丙烯酸酯。这是关于哺乳动物、禽类和鱼类肠道菌丛生物降解CGP,和随之CGP和其二肽作为营养和/或治疗添加剂的潜在应用的最初研究。
对哺乳动物、禽类和鱼类肠道菌丛的几个样品研究藻青素降解。所有样品在37℃中12~48h的孵育期内实现了彻底的厌氧降解CGP。在所有样品中发现了CGP降解细菌,并且其高度地集中在来自兔和绵羊的盲肠菌丛和来自鲤鱼的消化道菌丛中。总计62株未被污染的培养物被分离并且需氧地降解CGP,其中46株还在24h~7天的孵育期内厌氧地降解CGP。HPLC分析表明所有分离株菌将CGP降解成其组成性的二肽。8株通过16S rDNA测序鉴定,并且隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和小单孢菌属(Micromonospora)。CGP可以见于三种不同的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)市售产品中,这些产品中含有0.06~0.15%(wt/wt)CGP。现在发现CGP可以在细胞外被降解,以及关于消化道中CGP生物可降解性的最初证据,和随后,CGP及其二肽在营养和治疗中作为精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和可能其它的氨基酸的可高度生物利用的来源的潜在应用。
CGP在从指数生长期至静止生长期的过渡期间在蓝细菌中积累(Mackerras,A.H.等,J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990);Sherman,D.M.等,J.Phycol.36:932-941(2000))。蓝细菌的大多数属带有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合成CGP(Simon,R.D.1987.Inclusionbodies in the cyanobacteria:cyanophycin,polyphosphate,polyhedralbodies(蓝细菌中的包涵体:藻青素、聚磷酸酯(盐)、多面体),199-225页。见P.Fay和C.van Baalen(编辑),The cyanobacteria(蓝细菌),Elsevier,Amsterdam,The Netherlands;Allen,M.M.等,MethodsEnzymol.167:207-213(1988);Mackerras,A.H.等,J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990);Liotenberg,S.等,Microbiology142:611-622(1996);Wingard,L.L等,Appl.Environ.Microbiol.68:1772-1777(2002))。cphA基因还在异氧细菌中被鉴定(Krehenbrink,M.等,Arch.Microbiol.177:371-380(2002);Ziegler,K.等,Naturforsch.57c:522-529(2002))。聚合物作为无膜颗粒出现在细胞质中并且在中性pH下以及生理学离子强度中是不溶的(Allen,M.M.等,J.Bacteriol.141:687-693(1980))。CGP在限制条件下积累,所述条件包括低温、低光强度、磷或硫限制(Stephan等,Z.Naturforsch.55:927-942(2000))。在蓝细菌中,聚合物链的分子质量范围为25~100kDa(Simon,R.D.,Biochim.Biophys.Acta422:407-418(1976)),而来自重组菌株的聚合物链则显示较低的范围(25~30kDa)和多分散性。此外,发现来自重组菌株的聚合物含有赖氨酸作为另外的氨基酸组分(Ziegler,K.等,Eur.J.Biochem.254:154-159(1998);Aboulmagd,E.等,Biomacromolecules2:1338-1342(2001))。CGP的作用是临时性的氮、能量和可能的碳的储库(Li,H.等,Arch.Microbiol.176:9-18(2001);Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))。由于CGP在每个结构单元中含有5个氮原子,因此其满足完善的细胞内氮储库的标准(Simon,R.D.1987.Inclusion bodies in the cyanobacteria:cyanophycin,polyphosphate,polyhedral bodies(蓝细菌中的包涵体:藻青素、聚磷酸酯(盐)、多面体),199-225页。见P.Fay和C.van Baalen(编辑),The cyanobacteria(蓝细菌),Elsevier,Amsterdam,The Netherlands)。
CGP的细胞内降解由在细胞质内出现的高度特异性的藻青素酶(CphB)催化并且经α-裂解机制进行,结果形成β-二肽(Richter,R.等,Eur.J.Biochem.263:163-169(1999))。CGP作为还用于不能够积累CGP的细菌的有价值底物(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007a)。从池塘沉积物中分离的一种新的嗜温性蛋白水解细菌,硫酸盐还原梭菌(Clostridiumsulfatireducens sp.nov.)能够还原硫代硫酸盐、硫磺以及短暂地还原硫酸盐,这些细菌中的许多显示具有细胞外藻青素酶,该酶将CGP降解成其可利用的二肽,二肽可以被转运至细胞中并进一步被利用(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIP1-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)。已投稿待发表)。这些酶的几种实例被分离和表征,诸如来自革兰氏阴性细菌病鳝假单胞菌(Pseudomonas angulliseptica)B1株的CphEPa。此细胞外酶显示类似于CphB的用于CGP降解的α-裂解机制(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002))。
当从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BAC19株中分离细胞外CphEBm时发现革兰氏阳性细菌也分泌CGP酶(Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004)),CphEPa和CphEBm均鉴定为丝氨酸型水解酶。最近的研究揭示了细胞外CGP降解也可由分别来自专性以及兼性厌氧菌,诸如香港互营单胞菌KI株(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005))和产碱假单胞菌DIP1株(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIP1-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)。已投稿待发表)的CGP酶催化。所有研究的CGP酶产生β-Asp-Arg二肽作为裂解产物,然而,在CphEBm时另外检测到(Asp-Arg)2四肽(Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004))。直到最近,已知对于CGP本身或其二肽没有实际的应用。相反,对于聚(天冬氨酸)(PAA)已经确立了作为非生物可降解的聚丙烯酸酯的替代品的经济上重要的应用,所述PAA是CGP的结构元件(聚合物主链)(Schwamborn,M.,Polym.Degrad.Stab.59:39-45(1998))。PAA还可以用于许多领域包括造纸、涂料和油工业(其综述见Joentgen,W.等人,2003.Polyaspartic acids(聚天冬氨酸),175-199页,见;S.R.Fahnestock和A.Steinbuchel(编辑),Biopolymers,vol7.Wiley,Weinheim)。对于PAA也描述了生物医学应用(Leopold,C.S.等,J.Pharmacokinet.Biopharm.4:397-406(1995);Yokoyama,M.等,CancerRes.6:1693-1700(1990))。仅在最近,出现对于CGP-二肽和可能对于CGP本身的生物医学应用,这些应用首先取决于CGP降解细菌在大量研究的哺乳动物、禽类和鱼类群落中的令人惊奇的广泛分布,这表明CGP可能在各自的消化道中是可降解的。另一方面,如果以二肽或三肽形式施用氨基酸的生物利用度提高是熟知的理论并且有效地应用于一些治疗领域中。因此,CGP和/或其β-二肽可以被认为是不久将来的潜在的天然食品和/或治疗用添加剂(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007c.Potential of cyanophycin and itsβ-dipeptides as possible additivesin therapy,food and feed industries(藻青素和其β-二肽作为治疗、食品和饲料工业中的可能添加剂的潜力))。
仅在最近几年期间建立了对CGP的半工艺量生产和有效分离。应用大肠杆菌、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADP1株,后者显示约46%的最大CGP收率(wt/wt)(Obst,M.等,167-194页。见J.M.Shively(编辑),Inclusions in Prokaryotes(原核生物中的包涵体),vol.1.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg(2006))。然而,要求的底物和培养条件也是选择经济适当的CGP-生产源的决定性因素。
现在发现纯CGP-二肽可以在经济的大规模工艺中制备,该工艺从含有CGP的生物量开始并以纯CGP-二肽结束。由于产碱假单胞菌DIP1株可以显示在简单生长要求基础上的高酶生产率,发现此菌株对于这样的工艺方法是理想的。
藻青素在每个结构单元中含有5个碳原子,并且因此确实达到了完善的动态细胞内氮储库的标准((Simon,R.D.1987.Inclusion bodies inthe cyanobacteria:cyanophycin,polyphosphate,polyhedral bodies(蓝细菌中的包涵体:藻青素、聚磷酸酯(盐)、多面体),199-225页。见P.Fay和C.van Baalen(编辑),The cyanobacteria(蓝细菌),Elsevier,Amsterdam,The Netherlands);其量根据细胞的需要而波动(Carr,N.G.1988.Nitrogen reserves and dynamic reservoirs in cyanobacteria(蓝细菌中的氮储库和动态储库),13-21页。见L.J.Rogers和J.R.Gallon(编辑),Biochemistry of the algae and cyanobacteria(藻类和蓝细菌的生物化学),Annual Proceedings of the Phytochemical Society of Europe,Clarendon,Oxford.)。当蛋白合成减少时聚合物在蓝细菌积累,所述蛋白合成减少是从指数生长期至静止生长期的过渡期间天然引起的(Simon,R.D.,Arch.Microbiol.92:115-122(1973a))或是通过添加蛋白生物合成的抑制剂(例如,氯霉素)导致的(Ingram,L.O.等,Arch.Microbiol.81:1-12(1972);Simon,R.D.,J.Bacteriol.114:1213-1216(1973b))并且当继续平衡生长时该聚合物消失(Mackerras,A.H.等,J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990))。CGP积累也受磷限制(Stephan等,Z.Naturforsch.55:927-942(2000))、硫限制(Ariho,X.等,Arch.Microbiol.163:447-453(1995))、低温、低光强度或这些因素的组合(Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004))促进。
不同的方法被开发用于确定和定量纯化的CGP或其在细胞中的含量。通过Sakagushi试剂在水解或在未水解的聚合物中以比色法定量CGP的精氨酸含量(Simon,R.D.,J.Bacteriol.114:1213-1216(1973b))。纯化的藻青素的氨基酸组分可以通过HPLC测定(Aboulmagd,E.等,Arch.Microbiol.174:297-306(2000))。对于藻青素的快速和灵敏的测定,开发了基于1H核磁共振(NMR)的方法(Erickson,N.A.等,Biochim.Biophys.Acta.1536:5-9(2001))。
CGP降解(细胞内或细胞外)主要引起其可利用的二肽的释放,然后这些二肽在细胞内裂解成其组成性的氨基酸以进入细胞代谢中。藻青素的细胞内降解由藻青素酶(CphB)催化。Gupta,M.等,J.Gen.Microbiol.125:17-23(1981)描述了在柱胞鱼腥藻(Anabaena cylindrica)的异形胞和营养细胞中的第一种藻青素酶。该酶是一种单体为29.4kDa、丝氨酸型和藻青素特异性的外肽酶,其主要降解产物是经α-裂解机制的天冬氨酸-精氨酸二肽(Richter,R.等,Eur.J.Biochem.263:163-169(1999))。在近几年中,分离了能够通过细胞外藻青素酶(CphE)降解藻青素的需氧和厌氧细菌(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002));Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004);Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIP1-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)已投稿待发表)。类似于CphB,以前表征的分别来自病鳝假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)B1株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BAC19株的细胞外CGP酶;CphEPa和CphEBm被鉴定为丝氨酸型藻青素特异性酶并且产生CGP-二肽作为降解产物,然而,在CphEBm时另外检测到(Asp-Arg)2四肽。CphEPa的标记研究显示该酶在羧基末端处水解CGP并且从降解的聚合物链端连续地释放β-Asp-Arg二肽(其综述参见Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。此外,来自产碱假单胞菌DIP1的第三种细胞外藻青素酶(CphEal)最近以粗制形式应用于CGP-二肽的工艺生产中(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnologicalprocess for the technical production ofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中))。
仅在近几年期间建立了半工艺量的CGP的生产和有效分离。成功了应用了几种细菌菌株:大肠杆菌、富养罗尔斯通氏菌和鲍氏不动杆菌(Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。然而,CGP的生物工艺相关性在理论上基于其是聚(天冬氨酸)的来源,后者在工业应用中具有很高的潜力[例如,用于水处理;造纸和皮革工业,作为分散剂(Roweton,S.等,J.Environ.Polym.Degrad.5:175-181(1997);Mooibroek,H.等,Appl.Microbiol.Biotechnol.77:257-267(2007))或作为用于聚丙烯酸酯的生物可降解替代品(Schwamborn,M.,Polym.Degrad.Stab.59:39-45(1998))。PAA还具有潜在的生物医学应用作为透析膜、人工皮肤、整形外科植入体中的成分和作为药物载体(Leopold,C.S.等,J.Pharmacokinet.Biopharm.4:397-406(1995))。
如上所述,揭示了CGP-二肽和可能CGP本身的生物医学应用,这表明CGP在哺乳动物和鱼类消化道内可能是可降解的;这显示在不久的将来该聚合物和其二肽作为天然食品和/或治疗用添加剂的可能性。因此,最近构建了用于使用来自产碱假单胞菌DIP1株的粗制CphEal从CGP生产二肽的大规模工艺。此初步工艺包括三个阶段;阶段I:CGP的大规模提取和纯化,阶段II:粗制CphEal粉末的大规模生产,阶段III:如上所述建立CGP至其二肽的降解。现在发现,该初步工艺的后两个阶段可以为未来的应用被大大地优化。此外,CphEal从粗制粉末中工艺纯化,并且揭示了其生物化学特征。
发明内容
本发明在于提供:
(1)一种从藻青素(CGP)或CGP样聚合物制剂中酶法制备二肽组合物的方法,所述方法包括以CGP酶降解所述聚合物制剂;
(2)上面(1)所述的方法的优选实施方式,其中所述CGP酶:
(i)其分子量为45kDa,最适温度为50℃,且最适pH范围为7~8.5并且将CGP降解为β-Asp-Arg;和/或
(ii)其是能够将CGP或CGP样聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作为DSM21533保藏的产碱假单胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突变体、衍生物或片段;
(3)如上面(2)中所述的CGP酶;和
(4)一种组合物、药物组合物、药物、食品或饲料补充剂,其含有藻青素(CGP)或CGP样聚合物或其片段;
(5)藻青素(CGP)或CGP样聚合物或其片段在制备用于营养治疗的药物,或作为食品或饲料补充剂中的应用;
(6)一种用于需要营养治疗的患者的营养治疗的方法,所述方法包括向所述患者施用合适量的含有藻青素(CGP)或CGP样聚合物或其片段的组合物;
(7)上面(4)~(6)的优选实施方式,其中所述组合物、药物组合物、药物、食品或饲料补充剂含有通过酶法蛋白水解从CGP或CGP样聚合物得到的二肽或二肽混合物,优选所述二肽混合物由β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸构成和/或可由上面(1)或(2)所述的方法获得。
附图说明
图1:基于16S rDNA序列的相邻连接树(Neighbour-joining tree)显示以前以及本研究期间分离的CGP降解细菌的评估亲缘关系。粗体的菌株是本研究期间分离的菌株。下划线的菌株是以前用于CGP降解的研究的菌株(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002);Obst,M.等,Biomacro-molecules5:153-161(2004);Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。大肠杆菌K12用作外类群。登录号在括号中给出。步长值显示为100次重复的百分比。Bar:2%序列趋异。
图2:由来自产碱假单胞菌DIP1株的细胞外CGP酶在CGP覆层琼脂板上引起的降解晕;CphE:降解阶段(阶段III)之前的粗制粉末,CphE R:降解阶段后回收的粉末。
图3:产碱假单胞菌DIP1株在不同底物上的生长。培养在100ml带有挡板的Klett培养瓶中进行;每个培养瓶含有10ml SM培养基和1g1-1的测试底物。试验进行两次,其接种以在相同测试条件下生长的预培养物。在30℃中的24h孵育期后通过OD578nm的增加监测生长。
图4:在不同浓度(1~10g/l)的粗制CphE的催化作用下完全降解不同浓度(10~50g/l)的CGP需要的孵育时间。反应试管在30℃中在转速为3rpm的试管旋转器中孵育。最高测试浓度的CGP(50g/l)在2g/l粗制CphE粉末的存在下可以在10h内降解。
图5:产碱假单胞菌DIP1在Biostat D650搅拌釜式反应器中的分批发酵,所述反应器含有具有g/l柠檬酸钠的420l SM培养基并接种以4%(vol/vol)预培养物。预培养物培养在含有1l相同培养基的2l带有挡板的培养瓶中并在30℃中孵育12h。Biostat D650反应器中的发酵参数和培养条件为;pH为6.9~7.5,温度为30℃,并以0.2vvm通风。pO2设置为40%的最小值,并且通过搅拌自动地调整,否则搅拌保持为100rpm。箭头指示诱导时间。*600nm处的光密度(OD600),◆)*pH,⊥).*搅拌器速度(rpm),▲)。*pO2(%饱和度),-)。*通气量(l min-1),●)。
图6:用于在产碱假单胞菌DIP1株的发酵上清液中收集、浓缩和脱盐蛋白的连续系统(阶段II)。为了收集,CEPA Z41连续离心机用来分离细胞,上清液收集在中央的100l槽中。为了浓缩,具有30kDa盒的错流装置连接到中央槽;浓缩的渗余物重新泵入槽中,同时直接弃去渗透物。调节错流的流速以保持槽中仅50l。最后浓缩的5l用5柱床体积的H2O脱盐,在-30℃中冷冻并冻干。
图7:用于制备的CGP-二肽的质量控制的TLC板。I:标准氨基酸和在测试的过滤系统后获取的直接二肽样品;1:30kDa。-COP.错流盒(cross flow cassette)。2:滤膜(10kDa.-COP)。3:滤膜(5kDa.-COP)。4:滤膜(1kDa.-COP)。5:滤膜(0.5kDa.-COP)。6:CGP-二肽(错流和冻干后的最终装料)。II:标准氨基酸和下列的水解样品;a:CGP-二肽(错流和冻干后的最终装料)。b:Asp-Arg二肽。c:Asp-Lys二肽。(b,c;Sigma Aldrich,Deisenhofen,Deutschland)。仅一个斑点指示所有直接样品(I)而水解样品显示标准氨基酸天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸的典型斑点(II)。
图8:大肠杆菌DH1(pMa/c5-914::cphAPCC6803)在Biostat D650搅拌釜式反应器中的分批发酵,所述反应器含有具有100mg l-1氨苄西林的400l7%(vol/vol)protamylase培养基。预培养物(4%,vol/vol)在2l培养瓶中制备,每个培养瓶含有1l与发酵相同的培养基并在30℃中孵育20h。Biostat D650反应器中的发酵参数和培养条件为:pH为7.5,以0.17vvm通风,pO2恒定地保持在20%并且通过搅拌自动地调节。发酵进行15h,首先在30℃中6h,然后在37℃中以诱导CGP-合成酶的表达。浊度(OD850)(◆),pO2(%饱和度)(▼),通风(l/min)(▲),搅拌(rpm)(●),温度(℃)(■)。
图9:在Biostat D650反应器中在7%(vol/vol)protamylasse培养基上发酵第15h时大肠杆菌DH1(pMA/c5.914::cphAPCC6803)细胞的相差显微照片。CGP色素粒作为细胞中的反光积聚物出现。Bar:10μm。
图10:经对CGP的特异性结合来自产碱假单胞菌DIP1株的CphEal的纯化步骤的SDS-PAGE。凝胶A:通过硝酸银法染色的SDS-PAGE;M:分子量标准蛋白,C:粗制CphEal的对照,SI:在将CGP和粗制CphEal混合在一起后即刻获得的上清液样品,S2:6min结合时间后的上清液样品,S2':10倍浓缩后的与SI相同的样品,W1,W2:两次洗涤步骤后的上清液样品。凝胶B:使用如A中三倍体积的纯化CphEal并用硝酸银染色较长时间的SDS-PAGE。除了在45kDa处CphEal的条带以外可以观察到很少其它的低-浓缩蛋白条带。
具体实施方式
在本发明的方面(1)的方法中,二肽组合物可以由单个二肽或二肽混合物构成。然而优选所述二肽含有选自天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和存在于CGP样聚合物的其它氨基酸残基的氨基酸残基。特别优选的是所述二肽选自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸。
根据本发明的“CGP”和“CGP样聚合物”是主要由一个或多个二肽单元构成的肽结构,优选所述二肽单元由下列氨基酸残基的两种构成:天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸等。
本领域中已知的大量CGP酶可以用于CGP降解(参见表2和4)。然而,优选CGP酶是来自产碱假单胞菌的CGP酶,特别优选来自产碱假单胞菌DIP1株。根据本发明的方面(2),CGP酶(i)其具有45kDa的分子量,最适温度为50℃,且最适pH范围为7~8.5并且将CGP降解为β-Asp-Arg;和/或(ii)其是能够将CGP或CGP样聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作为DSM21533保藏的产碱假单胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突变体、衍生物或片段。上述天然CGP酶的突变体、衍生物或片段包括片段(具有至少50个天然序列的连续氨基酸残基,优选N-和/或C-末端截短产物,其中至多50,至多30,或至多10个末端氨基酸残基被去除),衍生物(特别是具有功能蛋白和肽诸如分泌肽、前导序列等的融合产物,和具有化学结构部分诸如PEG、醇类、胺类等的反应产物)和突变体(特别是添加、置换、倒位和/或缺失的变异体,基于氨基酸与天然酶具有至少80%、优选至少90%、最优选至少95%序列同一性,或其中1~20,优选1~10个连续或分离的氨基酸被添加、置换、倒位和缺失;对于置换突变体,特别优选保守置换),然而,条件是所述修饰的CGP酶具有天然CGP酶的酶活性。
本发明的方面(1)和(2)所述的方法可以进一步包括通过培养原核或真核生物生产细胞系来制备CGP或CGP样聚合物制剂。所述生产细胞系可以是能够产生CGP或CGP样聚合物的任何细胞系。优选所述生产细胞系选自大肠杆菌、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌株和植物生物质。特别优选的生产细胞系是富养罗尔斯通氏菌H16-PHB-4-Δeda(pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16)和大肠杆菌DH1(pMa/c5-914::cphAPCC6803)。
上述方法可以进一步包括分离、纯化和/或化学修饰通过培养所述生产细胞系获得的所述CGP产物的步骤。这样的分离、纯化和化学修饰分离可以通过本领域中充分确立的方法来实现。
然而对于方面(1)和(2)所述的方法优选通过培养所述生产细胞系获得的CGP产物直接用所述CGP酶进行降解,即,无需分离或纯化。
在另一优选实施方式中,方面(1)和(2)所述的方法进一步包括纯化或分离降解产物和/或化学修饰降解产物。同样,这样的纯化、分离或化学修饰可以通过本领域中充分确立的方法来实现。
本发明的方面(3)涉及一种CGP酶,
(i)其分子量为45kDa,最适温度为50℃,且最适pH范围为7~8.5并且将CGP降解为β-Asp-Arg;和/或
(ii)其是能够将CGP或CGP样聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作为DSM21533保藏的产碱假单胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突变体、衍生物或片段。对于突变体、衍生物和片段,其指上面给出的定义。
根据本发明的方面(4)、(5)和(6)的药物组合物、药物、食品或饲料补充剂可以进一步含有药学或饮食可接受的合适载体、粘合剂等。它们可以进一步含有用于各种药用目的的其它活性化合物。该药物组合物特别适合于营养治疗。营养治疗的类型当然取决于组合物/药物内存在的氨基酸,如下所述将变得显而易见:
近年来在病危患者的营养治疗中的进展更好地揭示了某些氨基酸对在疾病过程中维持组织蛋白内稳态的必要性(Witte,M.B.和Barbul A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。以前,氨基酸被分类为非必需氨基酸(非必要的)或必需氨基酸(必要的)。然而,随着对涉及氨基酸的体内生理学的更好理解,提出了可替代的分类法,该分类将某些氨基酸的必要性重新定义为是有条件地非必要的(Laidlaw,S.A.和Kopple,J.D.,Am.J.Clin.Nutr.46:593-605(1987))。这使得这些氨基酸单独作为完备的营养方案或作为营养方案的一部分以改善营养结局、免疫应答、和组织痊愈的应用变得有吸引力。在下面的章节中,讨论关于构成CGP的这三种氨基酸的生理学和作用机制的发现。这些氨基酸为:非必需的L-天冬氨酸、半必需的L-精氨酸和必需氨基酸L-赖氨酸。由于精氨酸具有大量的生理效应,对精氨酸给予了特别的关注。
L-天冬氨酸:非必需的L-天冬氨酸的分子质量为133.10g/mol,并且是二羧基氨基酸。大多数L-天冬氨酸可以在蛋白质中发现,而在体液和在植物中也发现小量的其游离形式(Barrett,G.C.和Elmore D.T.Amino Acids and Peptides.(氨基酸和肽)Cambridge University Press,Cambridge,UK(1998))。L-天冬氨酸是天然生物聚合物CGP和合成甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)的组成成分。天冬氨酸在水中微溶,并且其盐形式水溶性较高。饮食的天冬氨酸从小肠通过主动转运被吸收以进入门静脉循环,然后被转运至肝脏,在此其许多被代谢为蛋白、嘌呤类、嘧啶类物质(Barrett,G.C.和Elmore D.T.Amino Acids andPeptides(氨基酸和肽).Cambridge University Press,Cambridge,UK(1998))。L-天冬氨酸还可以充当柠檬酸循环中的能量来源,并且因此被认为有效地对抗疲劳(还参见下面:Asp-Arg)。天冬氨酸用于阳离子如Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+,或其它氨基酸的药物递送中以增加其生物利用度(Cynober,L.A.,Metabolic and therapeutic aspects of amino acidsin clinical nutrition.(在临床营养中氨基酸的代谢和治疗状况),第二版,CRC Press LLC,Boca Raton,USA(2003))。
L-精氨酸:L-精氨酸是分子质量为174.2g/mol的强碱性氨基酸并且见于大多数蛋白中。其每分子含有4个氮原子,并且因此是人和动物中氮丰度最高的载体(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。精氨酸对于鱼类必不可少的(Ahmed,I.和Khan,M.A.,Aquacult.Nutr.10:217-225(2004)),而在哺乳动物中,由于其可以经营养摄取或经重新合成(内源性的)来补偿,其被认为是半必需的。在肾脏中,大多数内源性精氨酸来源于瓜氨酸,后者是肠道或肝脏中谷氨酰胺代谢的副产物。然而,由于精氨酸生物合成不能增加以补偿耗竭或供应不足,因此饮食摄取(对人平均为大约5~6g/天,Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))仍然是血浆精氨酸水平的基本决定因素。约50%摄入的精氨酸在小肠中直接利用,而剩余的释放至门静脉循环中。通常,摄入的精氨酸的约一半主要通过精氨酸酶迅速地转变为鸟氨酸(Modolell,M.等,Eur.J.Immunol.25:1101-1104(1995);Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。鸟氨酸,依次地,可被代谢为谷氨酸和脯氨酸,或通过酶鸟氨酸脱羧酶转变为聚胺(Boutard,V.等,J.Immunol.155:2077-2084(1995))。剩余的精氨酸被四种其它酶之一加工:一氧化氮合成酶(以变为一氧化氮),精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(以变成肌氨酸),精氨酸脱羧酶(以变成胍丁胺),或精氨酰-tRNA合成酶(以变成精氨酰-tRNA,一种蛋白合成的前体)(Vodovotz,Y.等,J.Exp.Med.178:605-613(1993))。
精氨酸对人和动物的内分泌功能具有显著的效应,特别是对肾上腺和垂体分泌功能。然而,关于精氨酸发挥这些效应的确切机制了解很少。精氨酸是一氧化氮(NO)的生物前体,一氧化氮是参与心血管系统中多种内皮依赖性生理效应的内源性信使分子(Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。因此,精氨酸的许多临床作用被认为是通过其对内皮源性舒张因子的作用来介导的。NO-合成酶具有两种变异体(Rohdewald,P.和Ferrari V.,专利申请US2004137081(2004));具有其亚型的组成型变异体(cNOS);eNOS(在血管内皮细胞衬里)和nNOS(在神经元中),和在巨噬细胞、白细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞中发现的诱导型变异体(iNOS)。NO的功能可以随着其细胞来源的不同而不同;成纤维细胞NO支持胶原合成,而内皮细胞NO影响血管发生,和巨噬细胞NO抑制细菌生长(Rohdewald,P.和Ferrari V.,专利申请US2004137081(2004))。另一方面,精氨酸酶共用并竞争NOS的天然底物,即L-精氨酸。L-羟基精氨酸和亚硝酸盐,分别是NO途径的中间体和终产物,它们均为强的精氨酸酶抑制剂(Hrabak,A.等,FEBS Lett.390:203-206(1996))。相反,精氨酸酶活性的终产物尿素抑制NO形成和NO依赖性过程(Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。
精氨酸在心血管病症中:在众多的临床试验中,证明若施用于患有心血管病症的患者中,精氨酸是有益的(由Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002)综述)。例如,口服补充精氨酸极大地改善了心绞痛患者的运动能力和耐力(Bednarz,B.等,Int.J.Cardiol.75:205-210(2000)),并且显著改善充血性心力衰竭(CHF)病例的血流量、动脉顺应性和肾功能(Watanabe,G.H.等,J.Hypertens.18:229-234(2000))。动物研究表明补充精氨酸的抗动脉粥样硬化作用,包括血胆固醇过多的成人中改善的血管扩张,抑制斑块形成,减少主动脉内膜的增厚,和血小板凝集的正常化(Nakaki,T.和Kato R.,Jpn J.Pharmacol.66:167-171(1994))。此外,早期提供精氨酸在大鼠和人中改善高血压,预防肾衰竭(Sanders,P.W.,Am.J.Kidney Dis.28:775-782(1996)),和提高高血压患者对诸如依那普利的药物的反应(Pezza,V.等,Am.J.Hypertens.11:1267-1270(1998))。另外,精氨酸显著地改善间歇性跛行(Boger,R.H.等,J.Am.Coll.Cardiol.32:1336-1344(1998)),和先兆子痫(Roberts,J.M.,Am.J.Kidney Dis.33:992-997(1999))的症状。
精氨酸在生长激素(GH)分泌和运动表现中:生长激素负责增加肌肉生长,燃烧脂肪和维护免疫系统,然而,在人体中到30岁时其分泌开始下降(由Dean,W.和Pryor,K.,Growth hormone:amino acids as GHsecretagogues-a review of the literature.(生长激素:作为GH促分泌物质的氨基酸-文献综述)Vit.Res.News;可在www.vrp.com处获得(2001)综述)。尽管机制未完全阐明,但已知精氨酸能增加GH分泌。此外,临床医生常规地在人中使用精氨酸输注试验来确定垂体对释放GH的反应性(Penny,R.等,J.Clin.Endocrinol.29:1499-1501(1969))。精氨酸的低剂量静脉内(IV)摄入引起血清精氨酸的52%升高和血清GH水平的显著增加。另一方面,口服精氨酸,不像IV精氨酸,被认为对于增加GH分泌是无效的(Marcell,T.J.等,J.Gerontol.54:395-399(1999)),而口服高剂量的精氨酸天冬氨酸被认为仅在晚上充当生长激素促分泌物(Besset,A.等,Acta Endocrinol.99:18-23(1982))。在鱼类中,精氨酸是必需氨基酸,因此,饮食精氨酸对于最适生长和有效的饲料利用是必不可少的,并且其缺乏导致生长速率减慢,免疫应答低下和死亡率增加(Ahmed,I.和Khan,M.A.,Aquacult.Nutr.10:217-225(2004))。
精氨酸在创伤、烧伤、危重创伤和老年性痴呆中:由于精氨酸通过产生一氧化氮密切地参与细胞信号传导中,和通过其代谢为鸟氨酸和其它聚胺而与细胞增殖相关,因此大量的研究显示其补充对于愈合是必不可少的。此作用不依赖于给药途径,并且推测与胶原、NO、鸟氨酸和聚胺的合成途径相关(Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。
胶原合成对于瘢痕形成是必不可少的,而瘢痕形成是大多数哺乳动物愈合的基础。饲以无精氨酸饮食的大鼠显示伤口愈合不良而饲以富精氨酸饮食的人和动物具有改善的胶原沉积和伤口断裂强度(Barbul,A.等,Surgery108:331-336(1990))。由于iNOS抑制剂减少胶原沉积并且延缓切开伤口的愈合,而在补充精氨酸后在伤口液体中发现较高水平的NO代谢物,推测精氨酸对胶原合成的作用部分地经由NO合成介导,(Murrell,G.A.C.等,Inflamm.Res.46:19-27(1997);Schaffer,M.R.等,Eur.J.Surg.165:262-267(1999))。NO对伤口愈合的作用甚至被认为是全身性介导的(Witte,M.B.和Barbui.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003)),这是由于:1)无精氨酸营养不仅在伤口部位而且在几个器官中抑制诱导的NO合成;2)NO介导炎症诱导的水肿并抑制细胞浸润至肉芽肿中;3)由于eNOS敲除小鼠也显示愈合不良,NO对伤口愈合的作用不仅是iNOS-介导的;和4)iNOS抑制剂在高浓度下具有高致死率。另外,伤口收缩很大程度上归因于开放性伤口的闭合,而iNOS抑制延缓切开伤口的闭合(Stallmeyer,B.等,J.Invest.Dermatol.113:1090-1098(1999))并且iNOS敲除小鼠显示切开伤口的闭合延缓,其可通过用iNOS-cDNA转染来逆转(Yamasaki,K.等,J.Clin.Invest.101:967-971(1998))。所有这些数据使人相信精氨酸经NOS的代谢是精氨酸对愈合的积极作用所必不可少的(Shi,H.P.等,Surgery128:374-378(2000))。
精氨酸酶的诱导或过度表达,其是聚胺生物合成的第一个步骤,增强内皮细胞增殖(Wei,L.H.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9260-9264(2001);Witte,M.B.和Barbui.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。精氨酸还已知通过刺激宿主和伤口T细胞应答,然后T细胞应答增加成纤维细胞反应,从而增强伤口愈合(Barbui,A.等,Surgery108:331-336(1990))。在健康人体中,精氨酸增强外周血淋巴细胞的有丝分裂活性并且极大地减少淋巴细胞转化的创伤后损害(Daly,J.M.等,Ann.Surg.208:512-23(1988))。精氨酸已经显示对于骨髓淋巴细胞分化是必不可少的。由于T淋巴细胞对于正常伤口愈合是必不可少的,因此清除T细胞的小鼠和大鼠具有显著的伤口愈合不良。其它研究显示补充精氨酸对伤口愈合的有益作用类似于向创伤的动物或烧伤的儿童施用GH的作用(Jorgensen,P.H和Andreassen,T.T.,ActaChir.Scand.154:623-626(1988);Herndon,D.N.等,Ann.Surg.212:424-9(1990)),这是因为精氨酸对垂体和胰腺的熟知的高促分泌活性。这通过对切除垂体的动物的试验来证实,在该试验中精氨酸不影响伤口愈合(Wei,L.H.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9260-9264(2001);Witte,M.B.和Barbui.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。
Seifter,E.等,Surgery84:224-230(1978)显示精氨酸在创伤后的情形中变得很重要;接受较小创伤的精氨酸缺陷大鼠显示显著较多的体重减轻和死亡率。烧伤损伤也显著地增加精氨酸氧化和其储备的波动。经常使用的全胃肠外营养(TPN)增加精氨酸至鸟氨酸的转化并成正比地增加不可逆的精氨酸氧化。增加的精氨酸氧化,结合以有限的重新合成,使精氨酸在接受TPN的严重烧伤患者中条件性必需的(Yu,Y.M.等,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.280:E509-E517(2001))。几个其它研究证明精氨酸缩短住院期,减少获得性感染,减少烧伤和创伤患者中的免疫损害(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002)),以及减少患有老年痴呆症的老年患者中的脂质过氧化(Ohtsuka,Y.和NakayaJ.,Am.J.Med.1:108-439(2000))。这些大量的观察结果,结合相对的安全性,使得精氨酸在创伤、烧伤或危重患者的护理中的应用中变得非常有吸引力(Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。
精氨酸在免疫调节和癌症中:精氨酸是有效的免疫调节剂,并且显示在分解代谢状态下诸如脓毒症和术后应激中具有有益的作用(Evoy,D.等Nutrition14:611-617(1998);Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。精氨酸还在患有HIV/AIDS的个体中是有益的。谷氨酰胺、精氨酸和HMB(丁酸羟甲酯)的组合预防患有AIDS的个体中的瘦体质体重减轻(Swanson,B.,Nutrition18:688-690(2002))。动物和人体试验显示大剂量的精氨酸可以干扰肿瘤诱发并且短期补充大剂量精氨酸有助于维持化疗期间的免疫功能(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
精氨酸在糖尿病和胰岛素抵抗中:在患有糖尿病(DM)的人和动物中观察到降低的血浆精氨酸水平和内皮依赖性舒张受损。推测其原因可能是内皮NO缺乏。因此,补充精氨酸被认为能改善这些状况;在I型DM患者中IV精氨酸降低血压和减少血小板聚集(Giugliano,D.等,Am.J.Physiol.273:E606-E612(1997)),而在肥胖症和2型DM患者以及健康受试者中低剂量IV精氨酸改善胰岛素敏感性(Wascher,T.C.等,Eur.J.Clin.Invest.27:690-695(1997))。精氨酸还可以抵抗脂质过氧化,并且因此减少DM的微血管长期并发症。此外,双盲试验显示口服补充精氨酸显著地改善2型DM患者中外周和肝脏的胰岛素敏感性(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
精氨酸在胃肠病症中:在初步研究中,精氨酸对NO、胃泌素和聚胺的作用与加速溃疡愈合有关,该作用发挥其充血、血管生成和促生长效应(Brzozowski,T.,J.Gastroenterol.32:442-452(1997))。另外,NO在胃肠运动的调节中具有重要作用。口服补充精氨酸显著地降低食管动力障碍患者中胸痛发作的频率和强度(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。同样,L-精氨酸-NO途径参与胆囊运动和摄入L-精氨酸增加的饮食节制和残余胆囊体积的调节(Luiking,Y.C.等,Am.J.Physiol.274:984-991(1998))。
精氨酸在生殖泌尿病症中:在美国进行的观察(1999)指出年龄为18~59岁的31%男性和43%女性具有不同程度的性功能障碍(Christianson,D.W.,Ace.Chem.Res.38:191-201(2005))。此问题可以具有生理原因或心理原因,或两者皆有。在男性中,性功能障碍被简单地描述为勃起功能障碍(阳痿或ED),而在女性,性功能障碍分为4种主要类别:性欲减退,性高潮障碍,性交疼痛障碍和性唤起障碍(Basson,R.等,J.Urol.163:888-893(2000))。后者被定义为不能达到或维持充分的性冲动包括阴蒂勃起和生殖器充血,其类似于男性ED,由生殖器血液循环不足所导致。这可以导致两种性别发生支配进出海绵体的血流量的酶促反应中的生理性缺陷,海绵体是在勃起的阴茎或阴蒂中变得充血的可扩张组织的肌化腔室(Christianson,D.W.,Ace.Chem.Res.38:191-201(2005))。
特别地,阴茎勃起是涉及在中枢或外周性刺激后增加的动脉流入和限制性的静脉流出的血液动力学过程(Musicki,B.等,Biol.Reprod.70:282-289(2004))。由作为阴茎勃起的主要介质的内皮细胞NO合成酶(eNOS)和神经元阴茎NO合成酶(PnNOS)两者产生的NO的参与也有大量的文献记载。NO扩散至邻近的靶平滑肌组织,刺激鸟苷酸环化酶产生环鸟甘酸(cGMP)导致海绵体的舒张(Ferrini,M.等,Biol.Reprod.64:974-982(2001))。相反,当cGMP特异性磷酸二酯酶(PDEs)将cGMP水解为5'-GMP导致平滑肌收缩时勃起结束(Firoozi,F.等,Br.J.Urol.Int.96:164-168(2005))。因此,L-精氨酸和作用于L-精氨酸-NO途径的药物作为ED治疗剂是有吸引力的。此外,PDE的选择性抑制剂如西地那非枸橼酸盐被广泛地应用,其抑制cGMP降解并因此延长勃起。然而,西地那非具有全身性血管舒张和降血压作用,导致从疼痛开始的大范围的副作用,并且可以甚至导致死亡(Cohen,J.S.,Ann.Pharmaco.Ther.35:337-342(2001))。
L-精氨酸“营养物质”经常被开发为用于男性和女性性唤起的药物。例如,长期或补充以超生理剂量的饮食L-精氨酸分别增加大鼠(Moody等1997)和男性的海绵体内压和勃起功能。长期补充L-精氨酸改善具有异常一氧化氮代谢的男性的ED(Zorgniotti和Lizza1994),而在另一个对女性的研究,73.5%的测试受试者中L-精氨酸营养补充使整体性生活满意度得到改善(Ito,T.Y.等,J.Sex Marital Ther.27:541-549(2001))。另一方面,NOS并不是唯一影响阴茎勃起的酶,精氨酸酶共用其唯一底物精氨酸并且与NOS在男性和女性生殖器中的平滑肌组织中共表达。因此,精氨酸酶抑制可以增强性唤起所需的NO依赖性生理过程。由于许多精氨酸酶抑制剂对全身动脉血压没有明显的影响,因此其成为治疗性功能障碍的另一潜在靶标(Christianson,D.W.,Acc.Chem.Res.38:191-201(2005))。
精氨酸在不育和妊娠中:精氨酸是男性正常精子发生所必需的(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。在50年前,研究者发现食以缺乏精氨酸的饮食9天的成年男性的精子计数减少90%并且不运动精子的百分比增加大约10倍(Holt,L.E.Jr.和Albanese,A.A.,Trans.Assoc.Am.Physicians58:143-156(1944))。不育男性每天口服施用0.5g精氨酸-HCl几周显著地增加大多数测试患者中的精子计数和运动,并且引起成功的妊娠(Tanimura,J.,Bull.Osaka Med.School13:84-89(1967))。在其它初步试验中已经报道了对少精液症和受孕率的类似作用(Tanimura,J.,Bull.Osaka Med.School13:84-89(1967);De-Aloysio,D.等,Acta Eur.Fertil.13:133-167(1982))以及改善的生育力。然而,当基数精子计数小于1000万个/ml时,补充精氨酸可能没有帮助(Mroueh,A.,Fertil.Steril.21:217-219(1970);Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
在一个研究中对体外受精反应差的女性口服补充精氨酸改善卵巢反应、子宫内膜容受性和妊娠率Battaglia,C.等,Hum.Reprod.14:1690-1697(1999))。另外,在早产宫缩的女性中静脉内精氨酸输注(30g,在30min内)暂时性地减少子宫收缩性(Facchinetti,F.等,J.Perinat.Med.24:283-285(1996))。来自人和动物研究的更多证据表明一氧化氮抑制妊娠期间的子宫收缩性并且可能有助于和由此拮抗早产阵痛和分娩(Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
在间质性膀胱炎患者(IC)中,在6个月内口服精氨酸显著地减少排尿不适、腹痛和/或阴道/尿道疼痛。昼夜尿频也显著减少(Smith,S.D.等,J.Urol.158:703-708(1997);Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
L-赖氨酸:L-赖氨酸是必需的基础氨基酸,其分子量为146.19g/mol,并且在生理pH下携带正电荷。尽管赖氨酸的D-立体异构体没有生物活性,但L-赖氨酸是已知的用于人和动物的食品添加剂(Cynober,L.A.,Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinicalnutrition.(在临床营养中氨基酸的代谢和治疗状况),第二版,CRC PressLLC,Boca Raton,USA(2003))。摄入的L-赖氨酸通过主动转运从小肠腔吸收至肠细胞。其一部分在肠细胞内代谢,剩余的经门静脉循环转运至肝脏参与蛋白生物合成或代谢为L-α-氨基己二酸半醛,后者进一步代谢为乙酰乙酰CoA。在肝脏中不代谢的L-赖氨酸被转运至机体的各个组织(Cynober,L.A.,Metabolic and therapeutic aspects of aminoacids in clinical nutrition.(在临床营养中氨基酸的代谢和治疗状况),第二版,CRC Press LLC,Boca Raton,USA(2003))。
赖氨酸具有许多功能。它作为糖原、葡萄糖和脂质的前体起作用,或其直接用于产生能量。它在肌肉中浓集,促进骨生长并且增加胶原的形成(Voet,D.和Voet,J.G.,Biochemistry.(生物化学),第三版,JohnWiley and Sons Inc.,New York(2004))。胶原是结缔组织(见前)、皮肤、软骨和骨的基础基质。赖氨酸缺乏可能促进生长减缓和免疫力下降,精子健康受损,以及尿钙增加。后一事实表明充足的赖氨酸可以有助于通过钙的更好吸收和沉积来预防骨质疏松症(Flodin,N.W.,J.Am.Coll.Nutr.16:7-21(1997))。当一些研究显示L-赖氨酸可以降低单纯疱疹感染的复发率和刺激生长激素分泌时,它作为一种营养补充剂得到普及(见下)。
推荐的剂量、副作用和禁忌症:上面讨论的氨基酸的补充剂量变化很大,取决于待治疗的病症。然而,对于普通人必需氨基酸赖氨酸的正常饮食需求估计为每天0.75~1g,以避免缺乏的问题。在临床研究中使用的精氨酸剂量变化相当大,从用于少精液症的少至每天0.5g至用于癌症、先兆子痫和早产宫缩的多至每天30g。对于本文各处中讨论的氨基酸的补充尚未报道有显著的不良反应。然而,提及的临床应用中的许多需要更多的对照以及长期研究来证实。本文仅概述了对这些氨基酸的作用的肯定报道,而也存在相反的报道,其中这些作用中的许多可能没有被证实(对于完全的综述参见Flodin,N.W.,J.Am.Coll.Nutr.16:7-21(1997);Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002);以及Dean,W.和Pryor,K.,Growth hormone:aminoacids as GH secretagogues-a review of the literature.(生长激素:作为GH促分泌物质的氨基酸-文献综述)Vit.Res.News;可在www.vrp.com处获得(2001))。
二肽和天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸在临床治疗中:天冬氨酸和精氨酸有利地作为二肽或以混合物一起施用以对两种氨基酸提供更高的生物利用度,并且因此以较低的剂量增加它们的功效。在几个对不同生理功能障碍的治疗的研究中研究了两种氨基酸的给药。通常,对于上述用于游离氨基酸的所有应用,两种氨基酸均可以以二肽形式施用。尽管下面的章节进行了概述,但报道的研究结果专门针对联合的给药形式。这些报道来源于关于伤口愈合、关于内分泌病症如GH分泌障碍和提高运动能力,或关于生殖泌尿系病症包括勃起功能障碍以及男性和女性不育的研究。
精氨酸-天冬氨酸于1965年第一次针对身体虚弱和神经衰弱进行了临床试验(Duruy,A.和Baujat,J.P.,Vie.Med.Int.9:1589(1965))并且后来证实了积极作用(Duruy,A.,Med.Int.1:203(1966))。其它研究显示精氨酸-天冬氨酸的长期给药改善需氧能量代谢和能力(Sellier,J.,Rev.Med.Toulouse5:879(1979);Schmid,P.等,Leistungssport10:486-495(1980))。精氨酸-天冬氨酸补充增强伤口愈合和T细胞的免疫功能(Barbul,A.等,Surgery108:331-336(1990))。关于运动能力也报道了其它积极作用;例如关于脂质代谢,其中精氨酸摄入仅2周就引起总胆固醇浓度下降(Hurson,M.等,J.Parenter.Enteral Nutr.19:227-230(1995))。因此,L-精氨酸-L-天冬氨酸广泛地被运动员和患者使用以增加训练效果以及运动耐量。在此领域已经报道了对耐力表现的令人惊奇的效果,在延长摄入L-精氨酸-L-天冬氨酸后导致亚极量运动期间的降低的血乳酸盐浓度和心率以及随着工作负荷量增加而增加的耗氧量(Schmid,P.等,Leistungssport10:486-495(1980);Sellier,J.,Rev.Med.Toulouse5:879(1979);Burtscher,M.等,J.Sports.Sci.Med.4:314-322(2005))。
健康的老年人志愿者饮食补充30g/d精氨酸天冬氨酸2周显著地增加了伤口胶原积累(Witte,M.B.和Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。当向5名年龄为20~35岁的健康受试者口服施用250mg/kg/天精氨酸天冬氨酸7天,在慢波睡眠期间出现GH增加60%(Besset,A.等,Acta Endocrinol.99:18-23(1982))。另一组研究人员在采用一次大剂量(37.5g)口服精氨酸天冬氨酸治疗12名正常成人后获得了有效的结果,该治疗引起小但显著的血清hGH的释放(Elsair1987)。这使得健身者对精氨酸天冬氨酸产生兴趣,希望能够利用hGH的合成代谢特性(Macintyre,J.G.,Sports Med.4:129-142(1987))。
还报道了在一些类型癌症的治疗中口服施用L-精氨酸-L-天冬氨酸诱导了积极作用。例如,其在小鼠中诱导对涎腺腺样囊性癌的抗转移作用,伴有肺转移灶形成受抑制和存活延长。此外体外和体内试验证实了这些结果(Li,F.等,Chin.J.Stomatol.36:464-466(2001);Li,F.等,Chin.J.Stomatol.37:87-89(2002);Appleton,J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
在牙齿健康领域,牙菌斑,其为牙齿表面上紧密附着的海绵状有机物质,发现在其基质内接纳一定尺寸和形状的肽类。此外,2~4个单元的肽类,其中一个或多个是精氨酸,显示保存在牙菌斑内避免被稀释并且有效地将口pH恢复至无龋水平(6.1或更高)。还显示这些寡聚体甚至当与碳水化合物同时提供时仍然有效。这表明这样的肽可以包含在常见的牙用产品诸如牙膏和口香糖中(Kleinberg,I.,美国专利申请4225579(1980))。
L-精氨酸-L-天冬氨酸也应用治疗生殖泌尿系功能障碍。ED常见于年龄为45~70岁的男性中,25%患有中度勃起功能障碍,且10%患有严重勃起功能障碍(Kernohan,A.F.B.等,Br.J.Clin.Pharmacol.59:85-93(2004))。近年来,“L-精氨酰天冬氨酸”用作用于治疗男性ED的几种药物的成分,这些药物诸如(Lamm,S.等,Eur.Bull.Drug Res.11:29-37(2003))。关于的成分的临床研究显示在患有ED的40名男性中在接受3次剂量的单独1g“L-精氨酰天冬氨酸”(每天1.7g精氨酸),或与(刺激NOS分泌)一起使用,分别在5%和92%的上述男性中改善了勃起功能(Stanislavov,R.和Nikolova,V.,J.Sex Marit.Ther.29:207-213(2003))。在长期研究中,年龄在45和60岁之间的50名患有ED、精液量较低、精子运动减少和精子形态学异常的男性首先用单独治疗1个月。这些男性中的10%体验到正常勃起。在治疗中加入持续第二个月后,具有正常勃起的男性的百分比增加至80%。该治疗持续1年的时间,期间精子质量显著改善,并且42%的夫妇实现了妊娠(Stanislavov,R.和Nikolova,V.,Int.J.Impot.Res.14(4):S65(2002);Lamm,S.等,Eur.Bull.Drug Res.11:29-37(2003))。后一观察结果证实了先前对精氨酸-天冬氨酸的应用的研究,其中补充几个月增加了精子计数和质量(Tanimura,J.,Bull.Osaka Med.School13:84-89(1967);Schellen,T.M.和Declerq,J.A.,Dermatol.Monatsschr.164:578-80(1978);De-Aloysio,D.等,Acta Eur.Fertil.13:133-167(1982))和改善的生育力(Schacter,A.等,J.Urol.110:311-13(1973);Schacter,A.等,Int.J.Gynaecol.Obstet.11:206-209(1973))。
由于此二肽不能大量获得,关于由天冬氨酸和赖氨酸组成的二肽的临床报道几乎不存在。然而,赖氨酸的此二肽形式可以在已知用于游离赖氨酸或其盐的应用领域中(见前),在具有赖氨酸转运蛋白遗传缺陷的人中,或简单地作为食品添加剂是有效的,对于人和动物其具有比游离赖氨酸更高的生物利用度。
精氨酸和赖氨酸协同地作用以释放生长激素(GH)(Suminski,R.R.等,Int.J.Sport Nutr.7:48-60(1997))并且它们的浓度在人和动物营养中非常重要(Ahmed,I.和Khan,M.A.,Aquacult.Nutr.10:217-225(2004))。低赖氨酸︰精氨酸比具有降低胆固醇的作用(Sanchez,A.等,Nutr.38:229-238(1998)),并且因此,提出了用于心血管疾病患者的Arg︰Lys比为至少5.5︰1的蛋白混合物的专利(Radha,C.等,专利申请7091001(2006))。相反,由于单纯疱疹病毒的蛋白富含L-精氨酸,因此饮食中的高赖氨酸/精氨酸比已知有助于减少病毒复制,减少愈合时间,和爆发流行期间的致细胞病变性(Griffith,R.S.等,Dermatologica156(5):257-267(1978))。因此,在疱疹预防和治疗中,避免富含精氨酸的食物和使用更多富含赖氨酸的食物认为是有帮助的。
最近的研究已经提出在刺激hGH时共同使用L-赖氨酸和L-精氨酸的治疗是有用的并且可能甚至好于精氨酸/鸟氨酸组合,并且因此改善肌肉增长、体重增加和免疫支持。在年龄为15~20岁的15名健康男性受试者中,1.2g精氨酸焦谷氨酸结合L-赖氨酸盐酸盐在消耗该氨基酸混合物后使H水平显著地升高2~8倍(Isidori,A.等,Curr.Med.Res.Opin.7:475-481(1981))。另一研究指出在休息状态下摄入1.5g精氨酸和1.5g赖氨酸引起GH分泌的急剧增加(Suminski,R.R.等,Int.J.Sport Nutr.7:48-60(1997))。
为了模拟消化道内的自然条件,制备的肠“液”用作含有CGP的厌氧Hungate试管中的培养液并用作营养补充物。在所有试管中CGP的完全降解指示CGP可以容易地在这样的类似于消化道的厌氧环境中被降解。这还通过短降解期来证实,该短降解期类似于以前对于专性和兼性厌氧CGP降解细菌所观察到的现象(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。
在此研究中,并且第一次证明了CGP降解细菌在动物、禽类和鱼类消化道中的广泛分布(表1,2)。先前关于环境样品的研究还显示了在纯化步骤期间观察到的CGP降解集落之间和后来所得的纯性培养物之间的形态学多样性,这显示了CGP降解者在原核动物中的广泛分布(表2)。另一方面,降解CGP的能力似乎更多地分布在特定属的种间;迄今关于细胞外CGP降解的研究显示CGP降解者在假单胞菌属和芽孢杆菌属间广泛分布(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002);Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004);Sallam,A.等,已投稿待发表(2008),本研究)。然而,这可能与应用的实验室条件有关,这些条件可能已经有利于这些细菌,或简单地因为这些细菌属在自然界中的超优势度。另外,许多CGP降解细菌,不像假单胞菌属和芽孢杆菌属的菌株,在不丧失降解CGP的能力的条件下非常难以得到无污染的培养物(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Krug,A.,Diplom thesis,Institut fur Molekulare Mikrobiologie undBiotechnologie,Westfalische Wilhelms-Universitat,Munster,Germany(2001))并且通常被忽视。
在厌氧条件下对于纯性培养物仅观察到部分CGP降解,并且46个菌株中仅8株厌氧性地降解CGP。对此似乎合理的原因是在这些菌株和其它菌株之间缺少如在它们的天然环境中那样的天然相互作用,这分别经常导致限制性的或必需物质的积累或消耗。这与以前对专性厌氧内生孢子生产株香港互营单胞菌KI株的观察结果相吻合,在其共分离物无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)G株的存在下该菌株的生长和CGP利用极大地提高(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005))。
在8种已鉴定的分离物中,7个菌株显示厌氧性降解CGP的能力,尽管它们术语已知为需氧的属如芽孢杆菌属或假单胞菌属。然而,枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的菌株已知厌氧地生长,并且一些已知还原硝酸盐(Glaser,P.等,J.Bacteriol.177:1112-1115(1995))。同样,假单胞菌属成员的厌氧生长和硝酸盐还原作用被充分地研究(Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。小单孢菌属、链霉菌数和短芽孢杆菌属的种还已知是兼性厌氧的(Cochrane,V.W.,Annu.Rev.Microbiol.15:1-26(1961);Borodina,I.等,Genome Res.15:820-829(2005);Baek,S.H.等,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.56:2665-2669(2006))。通常,近年来对CGP降解的研究针对CGP降解细菌在兼性厌氧菌间的广泛分布。
尽管CGP和其二肽是天然来源的简单的蛋白物质,但需要临床研究来将这些物质推向市场。CGP降解细菌在本研究中测试的哺乳动物、禽类或鱼类的肠道菌丛中的广泛分布提供了第一个证据,即,口服使用CGP将是快速的,并且至少容易被微生物降解。这些细菌从不同动物和鸟类的下消化道中的分离(表1)显示,如果CGP的消化在上消化道中没有完成,则其可能在下消化道中继续进行。
HPLC分析揭示了二肽是所有62株分离物的CGP降解产物。从CGP没有产生更高级的二肽寡聚体如(β-Asp-Arg)2四肽。这与来自病鳝假单胞菌BI株(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002)、香港互营单胞菌KI株(Obst,M.等,Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005))和产碱假单胞菌DIP1株(Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))的CGP酶的作用相吻合。螺旋藻的营养和治疗作用已经已知了几个世纪,并且迄今其在许多国家中作为食品消费。螺旋藻的蛋白含量已知达到60%以上(Narasimha,D.L.R.等,J.Sci.Food Agric.33:456-460(1982))。在钝顶螺旋藻的市售产品中CGP的存在指示CGP可能参与了定期服用螺旋藻的健康作用。然而,在被分析的样品中测定的CGP含量变化很大,并且相对很低。这与先前对蓝细菌中的CGP积累的研究一致,其中CGP的积累已知受到许多因素的影响,并且相应地发生变化(Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))。而且,市售的螺旋藻产品在其获得商业化许可之前一定已经经过了大量的临床和毒性试验。这显示提取的CGP和CGP-二肽如果经口摄入将不会诱发毒性作用。此外,CGP二肽通常被细菌摄取并利用于生长,并且在靶向研究(数据未显示)期间显示没有抑菌或杀菌作用。通常,螺旋藻的已知作用和应用非常类似于对精氨酸所证明的那些作用,表明这些作用的一部分可能实际上是由其精氨酸含量(约6%)所引起的,包括CGP的作用。
细菌具有三种肽转运系统,两种属于ABC(ATP-结合盒)转运蛋白的大家族,寡肽透膜酶(Opp)和二肽透膜酶(Dpp),和用于二肽和三肽的一种属于PTR(肽转运蛋白)家族。仅后一系统在从酵母开始的高级真核生物中是保守的(Daniel,H.等,Physiology21:93-102(2006))。在哺乳动物中,用于二肽和三肽的载体系统PEPT(SLC15家族)包括2种变异体;肠PEPT1(SLC15A1)和肾亚型PEPT2(SLC15A2)。它们以立体选择性的方式转运几乎所有可能的二肽和三肽,对于L-α氨基酸和它们的衍生物是优先的。含仅D-氨基酸或四个以上氨基酸的肽不被接受。因为PEPT1在整个小肠中具有显著的表达,并且由于其高转运能力,PEPT1的所有药物底物具有优异的口服利用度,因此,PEPT1已经成为了药物递送的主要靶标(Daniel,H.等,Physiology21:93-102(2006))。CGP二肽、Asp-Arg和Asp-Lys(重组CGP)的构成性L-氨基酸经α-β肽键连接。此类型的键和CGP二肽的立体结构强力地提示它们可以充当PEPT系统的底物,并且当它们被摄入时可以从哺乳动物肠腔转运。因此,CGP和/或其二肽的应用将是用于构成性氨基酸作为治疗和/或营养剂的口服给药的理想方式。
从几个世纪前便已知氨基酸的营养和临床价值,包括构成CGP的那些氨基酸诸如天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸以及仍然可以结合至其结构中的那些如瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸或谷氨酸。这些氨基酸的合成寡聚体组合证明比游离氨基酸更高的生物利用度并且因此经常在营养和治疗中进行研究和应用(见前)。CGP代表了这些寡聚体的理想天然来源,预期其可以在比其游离形式的构成性氨基酸更低的剂量下更为有效。因此,CGP和其二肽的吸收、安全性和作用目前正在研究当中。而且,关于将其它氨基酸结合在CGP中的研究显示了有效的结果(数据未显示)。得到的二肽可以应用于几个治疗领域中,例如,天冬氨酸-鸟氨酸用于治疗肝脏疾病(Kircheis,G.等,Hepatology25:1351-1360(1997))。因此,未来对CGP结构的任何改变将增加CGP二肽的范围并且随之扩展其作为治疗和/或营养补充剂的应用范围。
对于从藻青素(CGP)大规模制备β-二肽建立了三阶段方法。阶段I基于用于从生物质工艺分离CGP的优化的酸提取法,获得总计704g纯CGP,并且在结构上该CGP含有天冬氨酸、精氨酸和少量的赖氨酸。阶段II是细胞外CGP酶(CphE)的发酵制备,该酶从产碱假单胞菌DIP1株中以500l规模并且使用1g/柠檬酸盐作为唯一底物制备,获得17.5g粗制蛋白粉末,并且该蛋白显示对CGP的高降解活性。阶段III包括经CphE降解CGP,250g CGP降解为β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸二肽,纯度级别超过99%(TLC,HPLC)。阶段III的总效率为91%,同时回收了78%(wt/wt)的使用的CphE粉末,并且该粉末显示对CGP的持久活性。建立的方法取决于根据工业标准的原料和设备,并且对于每一种所需的规模均适用。
产碱假单胞菌的菌株,包括DIP1株,已知生长在大范围的底物上,并且需要量其极微量。这些菌株的高酶生产率也是其应用于细胞外脂肪酶的发酵制备中的主要原因(WO95/30744;Gerritse,G.等,Appl.Environ.Microbiol.64:2644-2651(1998);Moore,E.R.B.等Mai1999.Pseudomonas:Nonmedical.(假单胞菌属:非医学)见Moore等(编辑),The Prokaryotes:An Evolving Electronic Resource for theMicrobiological Community,(原核生物:微生物群体的进化电子资源)第三版,release3.0,Springer-Verlag,New York))。除了来自DIP1株的CGP酶的高稳定性和活性以外(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifyingbacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIP1-Role of other threeco-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)已投稿待发表),这些特性是考虑此菌株理想地用于设计的工艺方法的主要因素。
在建立最终的三阶段方法之前,进行了几个试验通过直接在CGP上培养DIP1株以达到相同的目标,然而,由于CGP-二肽被正在生长的细胞快速消耗,该策略不太有效,在该三阶段方法的规定步骤中避免了此问题,在该三阶段方法中去除了DIP1株的细胞。此外,通过直接培养获得的二肽溶液具有大的体积,并且因此难以处置,在得到的二肽溶液中还存在小蛋白和盐类,作为该策略的另一缺点。相反,通过三阶段方法CGP的降解浓度以及降解时间是完全可以控制的。因此,获得的二肽溶液限于小且容易处置的体积。最高的测试浓度(50g/l)是各个方面之一,其仍可以为未来应用而进行优化,使得该方法更为经济有效。
对于工艺方法经济因素通常是最重要的,因此在培养基优化和底物利用中获得的结果发现是令人满意的,柠檬酸盐是工艺数量级时的廉价底物,并且理想地作为唯一底物用于应用的菌株,其已经应用于细胞外脂肪酶的发酵制备中(Gerritse,G.等,Appl.Environ.Microbiol.64:2644-2651(1998)),然而,对于粗制CphE的制备阶段(阶段II)需要优化的培养基,使得必需准确地监测发酵期间的浊度等级,尤其是在诱导和降解阶段期间。以前试验性CGP降解的经验显示不透明的培养基以及细胞的强力生长可能会令人误解,除此之外,较好的细胞生长实质上不意味细胞外CGP酶的较高产量(未发表的数据)。
Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002)的CGP酸提取法在以前的研究中被成功地应用,该方法被优化以适用于从任何工艺量的生物质中分离纯CGP。对原始方法的最有效的改变是溶解的CGP的无菌过滤步骤,此步骤保证完全去除不溶于稀HCl的任何细胞碎片。相反,增加的使用稀酸和水的纯化步骤可能不必要地增加CGP的损失,这就解释了获得的CGP和预测量之间的差异。CGP的损失以及其提取所需的时间可以通过将CGP离心代替将其置于4℃而最小化。
备选地,如果应用有效的设备诸如错流,则此提取法的总生产率可以大幅度增加,在此情况下,需要具有两种不同的COP的2个盒;一个比待分离的CGP的分子大小大,而另一个比该大小小,这两个盒被应用于分别交替地过滤溶解和沉淀状态下的CGP。然而,这样的超滤盒的相对高的价格和然而有限的寿命使其应用成为一个成本的问题。在粗制CphE的发酵制备(阶段II)期间,在静止生长期内采用CGP的诱导以保证CphE的最大制备,并且仅仅参考培养基中CGP量的浊度变化。
培养基的pH增加超过耐受范围(pH6.9~7.5)并且通过加入HCl来控制,这最可能的原因是产碱假单胞菌DIP1株的细胞释放氨的缘故。类似的生理行为也在以前关于CGP降解的研究中对此菌株提及(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIP1-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)已投稿待发表)。
在不同的测试过滤系统之前和之后,得到的CGP-二肽纯度等级相同的原因显然是初始二肽溶液中开始就没有杂质。这显示与使用细菌细胞直接培养的策略相比,应用确定的酶法过程的另一优点。另一方面,由于过滤造成的二肽的定量损失是预期的并且可惜是无法避免的;已知有几种一般因素会导致这样的损失,包括;过滤材料,截留点,和/或被过滤的物质本身的特性。这还解释了降解阶段(阶段III)期间9%CGP和22%粗制CphE的损失。除此之外,仅测试了新的滤膜(0.5~10kDa.COPs),并且因此CGP-二肽的损失量最可能附着在膜表面上直至饱和。
即便91%的总过程产率是十分高的,几个方面可以甚至进一步改进,并且均在优化之中,这些方面包括粗制CphE的较高生产率,对CphE的可能工艺纯化策略和用于降解阶段的更有效的条件(未发表的数据)。CGP-二肽的商业价值与CGP本身的生产成本直接相关,尽管,在过去几年中,CGP的生产被广泛地研究并且使用几种细菌菌株进行优化,从而正在使用新的和更适合的经济底物来实现对CGP含量的提高,这些发展似乎在商业化CGP生产的方向上快速地发展(见上),此方式也是其它已知的细菌性聚(氨基酸)诸如聚(谷氨酸)和聚(ε-赖氨酸)被商业化以用于工艺以及食品应用所需要的(由Oppermann-Sanio F.B.等,Naturwissenschaften89:11-22(2002);Obst,M.等,Biomacromolecules5:1166-1176(2004)综述)。到那时,CGP-二肽的生物医学价值可能才事实上为CGP的实际生产成本提供均衡的关系。因此,CGP-二肽的生物医学作用目前正在研究之中(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2007c.Potential of cyanophycin and itsβ-dipeptides aspossible additives in therapy,food and feed industries(藻青素和其β-二肽作为治疗、食品和饲料工业中的可能添加剂的潜力))。
以前应用的用于从藻青素(CGP)大规模生产β-二肽的生物工艺方法被优化;该原始方法由三个阶段组成;阶段I:从生物质中大规模提取纯CGP,阶段II:从产碱假单胞菌DIP1株大规模生产粗制藻青素酶(CphEal),阶段III:将CGP降解为其二肽。对于第二阶段确定最适培养条件;2g l-1柠檬酸盐,pH6.5和培养温度为37℃。作为CphEal的诱导物的CGP的最适浓度为50g l-1,这是以前应用的浓度的1/5。在诱导后5h获得最大酶浓度。相同浓度的CGP-二肽在仅3h后显示类似的诱导效率。然而,最适的4g l-1L-天冬氨酸也诱导CphEal,其效率为CGP的1/3。CphEal经CGP上的底物特异性结合来纯化。纯化的酶被表征并且结果显示是一种丝氨酸蛋白酶,在50℃和pH7~8.5时具有最大活性。对于初始方法的阶段III(CGP降解)的条件:50g l-1CGP,10gl-1粗制CphEal和在30℃中孵育10h可以优化为:100g l-1CGP,10g l-1粗制CphEal和在50℃中仅孵育4h。CGP降解为β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸二肽,纯度等级超过99%(HPLC)。这些优化使得该工艺方法是更成本、时间和投入有效的。
在protamylasse上以500-l规模发酵制备CGP之前,在可利用的protamylasse装料上进行的预试验表明对于CGP制备7%(vol/vol)是最适的,然而,在先前Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005)对以前的protamylasse装料的研究中,最适浓度发现为6%(vol/vol)。这是因为protamylasse(其是工业淀粉生产的残余化合物)是一种复杂的培养基,其组成可以在每批装料之间发生变化,并且因此必需在作为培养基应用之前进行调节。
在发酵期间和第一个6h之后,温度升高至37℃以便使温度敏感的λ-抑制物(cl857)失活,并且因此能够诱导CGP-合成酶(CphA)基因。在此时间点,重组大肠杆菌菌株细胞已经处于指数生长期中2h。此发酵过程证明对于CGP-合成酶的诱导以及对于CGP的最大细胞内积累是最适的(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))。
在发酵6h后,培养基的浊度还显示突跳(sudden jump),自动控制的搅拌与其相平行地增加。这可以解释为,通过除温度升高至37℃以外,由于强力的细胞生长引起的培养基中氧的减少。显然,培养基中的氧含量变得低于预先调节的最小值并且导致搅拌的自动增加,这引起较多地形成泡沫和气泡,并且随后引起失真的OD850nm值。人工地加入消泡乳液导致浊度快速降至正常水平。
当用显微镜估计达到细胞中的最大CGP积累(15h后)时,终止发酵。然而,后来对发酵样品的分析指示较好的收获时间为孵育13h后。在该时间点处,CGP含量为约13%(CDM的wt/wt),而在15h后,其下降至10%(CDM的wt/wt)。这种损失显然是由于显微镜对CGP含量估计的不准确造成的,该方法是发酵期间仅有的可用方法。此外,CGP含量的降低最可能是由于质粒损失引起的,这种质粒损失在孵育期间随着时间推移而发生(Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))。在提取和纯化聚合物后,HPLC分析指示CGP的高纯度等级,并且其由三种氨基酸组成:天冬氨酸(47.7mol%),精氨酸(45.6mol%)和赖氨酸(6.8mol%)。SDS-PAGE显示CGP的分子大小为25~30kDa。这些特征与以前由相同菌株在几种培养基上产生的CGP的特征非常一致(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002);Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))。
近年来,含有1g l-1柠檬酸盐的简单矿物盐培养基(SM-培养基)被应用于从产碱假单胞菌DIP1菌株中大规模生产CphEal。此培养基是有利的,原因是其简单和节约成本的组成以及其对使用的菌株的适合性(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for thetechnical production ofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中))。然而,在此研究中,即使对生长最适的柠檬酸盐浓度为6g l-1,在这样的培养中也不产生CphEal。CphEal的最大产量出现在2g l-1柠檬酸盐上生长的培养物中;这说明该酶仅在底物的限制条件下被诱导。其它对温度和pH最适值的试验显示37℃和5.5~7.5的pH范围,最适值为6.5,对于DIP1株以及对于CphEal的生产是最适的。这提高了生产过程的效率,该生产过程最初应用在1g l-1柠檬酸盐上,pH7.5和孵育温度为30℃(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for thetechnical production ofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中))。
对CphEal诱导的渗入研究揭示了以前应用的CGP浓度(250mg l-1)的仅1/5(50mg l-1)就足以达到相同的作用。在相同的浓度(50mg l-1)下CGP-二肽也足以以相同的效率诱导CphEal。然而,至收获用二肽诱导的培养物时所需的较短孵育期(3h)显示CGP-二肽是CphEal的实际诱导物而非CGP本身。
另外,天冬氨酸是CphEal的成功诱导物,而与CGP-二肽不同,对于最大CphEal产量需要4g l-1的浓度和更长的5h孵育期,这显示CphEal生产效率仅为CGP或其二肽的三分之一。因此,在未来应用中选择诱导物仍然取决于个例和成本。
原始方法的第三个阶段(经粗制CphEal大规模降解CGP)发现在50℃中是非常有效的,而非在30℃中。此优化使得高得多的CGP浓度(至多达100g l-1)可容易地在为30℃中降解时间的仅四分之一的时间内降解。这是根据Van't Hoff方程,其中温度增加10开(10℃),反应速率加倍。在此升高的温度下降解混合物的体积和其污染的风险被最小化。在30℃和50℃两种孵育温度下,降解时间显示随着粗制CphEal的浓度下降和随着CGP浓度增加而共线增加。因此,所得的公式可以有助于在未来的工艺应用中应用最适的降解参数。由于降解阶段的效率在50℃中高得多,因此该公式对在50℃中的应用进行计算,并且随后适合于至多达100g l-1的CGP浓度。
有机溶剂或硫酸铵沉淀提供弱的纯化作用和低的酶回收速率。相反,通过对CGP的特异性结合开发的方法证明高度有效,并且具有使用一种底物(CGP)从粗制溶液中的其它蛋白中分离CphEal的优点。纯化方法以CGP混合物降解为其二肽结束;这些同时的都是该方法的有价值的终产物,并且因此可以进一步引导至主生产物流(无原料损失)。该纯化方法容易扩大规模并且如果需要结合在未来的工艺应用中。
建立两个公式来增加原始方法的第二阶段(粗制CphEal的大规模生产)和其可能的纯化的效率。第一个公式(s.a.)基于CphEal的光量分析,并且能够在粗上清液中快速测定CphEal含量。测定的CphEal浓度可以然后结合至第二个公式中以估计要结合的CGP的所需量,并且因此纯化上清液中全部的CphEal含量。此方案为未来粗制CphEal的生产装料提供了一种可信赖的手段,这些装料在其蛋白组成方面可能极大地不同。
在用于纯化CphEal的底物特异性的试验中,不仅CGP被降解,然而,BSA也以较小的程度被降解。这显示来自产碱假单胞菌DIP1株的CGP酶可能分别不如以前表征的来自病鳝假单胞菌B1株和巨大芽孢杆菌BAC19株的CphEPa和CphEBm特异。对此非特异性作用的更为合理的解释是在纯化的酶溶液中存在少数其它的蛋白。即使这些蛋白仅在高度浓缩的样品和用强烈的硝酸银染色在SDS-PAGE中可见到;仅极小量的非特异性蛋白酶就可能对CGP以外的测试物质产生这样的作用。
来自产碱假单胞菌DIP1株的CphEal主要被丝氨酸蛋白酶抑制剂和PMSF抑制。这显示此CGP酶最可能属于丝氨酸型蛋白酶。这与以前表征的CGP酶;CphB,CphEPa和CphEBm的结果一致。此外,CphEal被色氨酸氧化剂N-溴代琥珀酰亚胺完全抑制,显示色氨酸残基可能参与该酶的分解代谢中。这还指出了CphEal和细胞外CphEPa和CphEBm之间的高度相似性。用亮抑酶肽或EDTA处理的CphEal样品显示在CGP覆层琼脂板上没有活性抑制,然而,对用EDTA处理的样品的HPLC分析显示CGP酶的抑制为约75%。这是由于在OPA衍生化期间形成了大量的沉淀物引起,而不是由于酶抑制引起的(Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002);Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004))。与以前表征的分别来自集胞藻属(Synechocystissp.)PCC6803、病鳝假单胞菌B1株和巨大芽孢杆菌BAC19株的CphB,CphEpa和CphEBm相比较,在表3中说明了产碱假单胞菌DIP1株的CphEal的生化特性。尽管纯化CphEal的几种特性相对地类似于CphEPa和CphEBm,但可以观察到一些相关的差异诸如分子大小和最适温度。对于CphEal后者为50℃,这是对于所有已知CGP酶的最高最适温度,并且因此,为以纯净形式以及以粗制形式应用此酶提供了极大的益处。纯化的酶显示最适pH范围为7~8.5,最适值为8.5,该范围偏离了对粗酶所测定的范围(5.5~7.5,最适值为6.5)。这最可能是由于粗提取物中许多其它蛋白的存在引起的,所述粗提取物代表了复杂的环境;在这种环境内的相互作用可能反过来影响CGP酶的结构和/或性质。细胞系产碱假单胞菌DIP1于2008年6月10日保藏在DMSZ,DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,MascheroderWeg1b,38124Braunschweig,Germany,保藏号为DSM21533。
在下面的实施例进一步描述本发明,然而,这些实施例不应解释为对本发明的限制。
实施例
材料和方法
样品采集和样品制备:肠道菌丛样品采集自刚处死的健康标本(表1)。除了反刍动物以外(饲养史不能确定),所有选择的动物,鸟类和鱼类至少部分地自由生活或自由放牧。通过完全填充50ml无菌falcon试管,从每个来源动物的几个部位(表1)以及消化道采集样品,样品在4℃保存备用。样品用无菌生理盐水稀释(表1),然后在无菌体检下过滤(折纸漏斗,Schleicher&Schuell,Dassel,Germany)固体物质。排泄物样品在无菌盐水中切碎并如上所述过滤。
培养基:为了富集能够在厌氧条件下降解CGP的细菌,应用下列的基础培养基(BM):每l蒸馏水中1.0g NH4Cl,3.0g KH2PO4,3.0g K2HPO4,0.1g KCl,0.5g MgCI2·6H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.5g NaCl,0.5g半胱氨酸-HCl,0.5g酵母提取物(除非文中另外指明),10ml SL10微量元素溶液,和1mg刃天青。pH用KOH调节至7.0。将培养基煮沸,并在加入Na2S·9H2O至0.04%(wt/vol)的终浓度后,立即将其转移至含有Formier气体(N2:H2,95:5%,vol/vol)的气氛的厌氧培养室(A型–手动气闸;Coy Inc.,Grass Lake,MI,USA)中。在冷却至室温后,将10ml等分试样分配至Hungate试管中,密封,从厌氧培养是中取出,随后通过在121℃中高压灭菌20min而进行灭菌。厌氧培养在含有缺少还原剂半胱氨酸-HCl和Na2S·9H2O的BM培养基的100ml Klett培养瓶中进行。
Luria Bertani(LB)培养基(Sambrook,J.等,Molecular cloning:aLaboratory Manual(分子克隆:实验室指南),第二版,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbour Laboratory(1989))用于纯化CGP降解细菌和用于维持有活力的培养物。
对于产碱假单胞菌DIP1株的分离,使用Dufresne,A.等,Macromolecules31:6426-6433(1998)的改良矿物质培养基(SM-medium);每l自来水中,1.0g NH4Cl,5.0g KH2PO4,1g MgSO4·7H2O(灭菌并单独地加入)和10ml微量元素储备溶液。微量元素储备溶液含有次氮基三乙酸(70mM,pH6.5),FeSO4·7H2O(5g/l),MnCl2·4H2O(0.85g/l),CoCl2·6H2O(0.14g/l),CuCl2·2H2O(0.085g/l),H3BO3(0.17g/l),ZnSO4·7H2O(0.9g/l),和Na2MoO4·2H2O(0.09g/l)。培养基的pH调节至7.0丙醚随后通过在121℃中高压灭菌20min而进行灭菌。
液体培养在带有挡板的Erlenmeyer培养瓶中进行,并且在Pilotshake RC-4/6-W水平式振荡器(Kuhner AG,Birsfelden,Switzerland)上以150rpm孵育。为了制备CGP覆层琼脂板,1.2%(wt/vol)细菌-琼脂加入至CGP悬液(1~2g/l)中,此混合物随后通过在121℃中高压灭菌20min而进行灭菌,冷却至45℃后,将其倾倒在事先制备的SM琼脂板上成为薄层。
为了制备CGP覆层琼脂板,将1.2%(wt/vol)细菌-琼脂加入至CGP悬液(1~2g l-1)中,此混合物随后通过在121℃中高压灭菌20min而进行灭菌,冷却至45℃后,将其倾倒在事先制备的SM琼脂板上成为薄层。
CGP的来源和分离:“重组”CGP分离自富养罗尔斯通氏菌H16-PHB-4-Δeda(pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16)的细胞(Voss,I.等,Metabol.Eng.8:66-78(2006))并根据改良的酸提取法纯化(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))。CGP根据以前对于蓝细菌所述的方法分离自螺旋藻市售产品(Simon,R.D.等,Biochim.Biophys.Acta420:165-176(1976))。
为了以较大的规模分离和纯化CGP,酸提取法(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))如下进行优化;含CGP的干物质悬浮在自来水中得到0.1g/ml的终浓度。pH用浓HCl(32%)降低至1并搅拌过夜。悬液用CEPA Z61连续离心机(CEPA,Carl PadbergZentrifugenbau GmbH,Lahr,Germany)以17000rpm离心,片状沉淀物重新悬浮在20l HCl0.1N中,搅拌1h,再次离心,将上清液加入至第一批装料中,并弃去片状沉淀物。用NaOH(50%)在30l玻璃瓶中中和含CGP的上清液(pH7.3),使得CGP沉淀。使乳状悬液放置在4℃澄清过夜,然后弃去上清液。反复溶解CGP并中和三次以上以去除所有在稀HCl中不溶的杂质。得到的CGP溶解在30l HCL0.1N中,并通过0.2μm Sartobran-P00型过滤装置(Sartorius AG,Gottingen,Germany)。溶液再次用NaOH中和(pH7.3),放置澄清过夜,弃去上清液。为了去除任何水溶性杂质和使CGP脱盐,片状沉淀物用5柱床体积的蒸馏水连续洗涤3次。最后,CGP片状沉淀物以20000rpm离心(CEPA Z41连续离心机),在-30℃冷冻和在BETA1-16型冻干机(Christ Gefriertrocknungsanlagen,Osterode,Germany)冻干。
CGP的灭菌:为了制备CGP的无菌储备悬液,二乙醚以3:1(vol/wt)的比率加入至CGP。15min后,弃去溶剂,完全蒸发后,通过将CGP溶解在无菌0.1N HCl中,然后通过加入等体积的无菌0.1N NaOH在pH7.3下将聚合物沉淀,而获得悬浮液。备选地,CGP首先溶解在0.1N HCl中,通过滤器(孔径0.2μm,Millipore GmbH,Eschborn,Germany)并且最终如上所述再沉淀。通过短暂离心(3500×g,2分钟)沉降CGP,或通过使CGP放置在4℃沉积过夜来调节储备溶液中CGP的浓度。在两种情况下,然后部分弃去上清液,从而最终获得所需浓度的CGP。在含有带有或不带有0.5g l-1酵母提取物的10ml BM的厌氧制备的Hungate试管中进行厌氧CGP降解的试验。将无菌CGP悬液直接注入至厌氧制备的BM Hungate试管中至1g l-1的终浓度。看到试管中CGP消失指示其降解。为了制备CGP覆层琼脂板,将1.2%(wt/vol)细菌-琼脂加入至CGP悬液中,此混合物随后通过在121℃中高压灭菌20min而进行灭菌,冷却至45℃后,将其倾倒在事先制备的SM琼脂板上成为薄层。
哺乳动物、禽类和鱼类肠道菌丛对CGP的厌氧性降解:为了模拟获取菌丛样品的生活环境的自然条件,制备的样品用作接种物和同时用作营养补充物。含有在BM培养基(不含酵母提取物)中的1g l-1CGP的无菌厌氧Hungate试管接种至10%的终浓度,并在37℃中孵育直至CGP降解出现。
在肠道菌丛中筛选CGP降解细菌:为了分离CGP降解细菌,100μl等分试样的已制备的菌丛样品涂布在厌氧制备的带有CGP覆层的BM琼脂板上。在37℃孵育几天期间,检查各板中由CGP降解细菌集落导致的晕圈(halo)的出现。在孵育期间,还应用集落计数步骤以确定CGP降解细菌集落和非降解集落之间的比率。
CGP降解纯性培养物的分离:选择形态学不同的CGP降解细菌集落并通过将来自显示降解晕的集落的物质转移至新鲜的CGP覆层琼脂板上进行三次连续传代而进一步纯化。在LB琼脂板上应用另外三次纯化步骤,然后在CGP覆层琼脂板上测试纯性培养物以确认它们保留了降解CGP的能力。
纯度对照:分离的纯性培养物的纯度通过显微镜,且还通过在不同的培养基上在厌氧以及需要条件下培养定期地确认。
分析技术:游离氨基酸和小肽(CGP-二肽)通过反相HPLC(KontronInstruments,Neufahrn,Germany)检测,在检测前它们的游离氨基用邻苯二甲醛(OPA)试剂如前所述(Aboulmagd,E.等,Arch.Microbiol.174:297-306(2000))进行柱前衍生化。对于CGP样品的分析,聚合物预先进行酸水解(6N HCl,95℃,过夜)。同样,应用酸水解以进行二肽构成的氨基酸的定性和定量确认。HPLC系统安装有B801柱(PrepNova-Pak HR3.9x300)(Knauer GmbH,Berlin,Germany),并用起始洗脱液(81%,vol/vol,硝酸钠(50mM):19%,vol/vol,甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19~75%,vol/vol)在40℃中和以1.0ml/min的流速洗脱,然后采用1046A型荧光检测仪(Hewlett Packard,Waldbronn,Germany)在330/450nm(激发/发射)下进行荧光检测。为进行校准,使用色谱纯的氨基酸(来自Serva Feinbiochemica,Heidelberg,Germany的Kollection AS-10)或使用通过采用产碱假单胞菌DIP1的细胞外CGP酶(CphEal)通过CGP的完全酶法水解产生的二肽(Sallam,A.等,已投稿待发表(2008))。
在将Klett-培养瓶插入至Eppendorf1101M分光光度计(Eppendorf,Hamburg,Germany)后,通过测量578nm处的浊度增加监测细菌生长。
在硅胶60板(Merck,Darmstadt,Germany)上应用薄层色谱(TLC)分析,HPLC的起始稀释液也用作TLC的rum缓冲液,为进行染色,应用丙酮中的20%(wt/vol)茚三酮溶液。在电泳示踪缓冲剂(Laemmli)后在11.5%(wt/vol)凝胶中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),U.K.,Nature227:680-685(1970)。蛋白和藻青素用考马斯染色法染色(Weber,K.等,J.Biol.Chem.244:4406-4412(1969)),之后用银染法染色(Heukeshoven,J.等,Electrophoresis6:103-112(1985))使得较低浓度的蛋白显现。
DNA提取和16S rRNA基因的分析:来自纯性培养物的全基因组DNA的分离如前所述进行(Rao,R.N.等,Methods Enzymol.153:166-198(1987))。16S rRNA基因通过PCR从总DNA使用标准寡核苷酸引物(MWG-BIOTECH AG,Ebersberg,Germany)进行扩增。PCR产物使用Nucleo-trap CR试剂盒(Macherey-Nagel,Duren,Germany)纯化,然后直接测序。DNA测序在临床化学和实验室医学协会(W.W.U.Munster,Germany)在毛细管测序仪(ABI Prism3730DNA分析仪)上定制进行,并且序列通过数据采集软件v3.0(均获自Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)进行分析。使用终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)根据生产厂商说明的步骤和下列的测序引物制备序列反应:
27f(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';SEQ ID NO:1),
343r(5'-CTGCTGCCTCCCGTA-3';SEQ ID NO:2),
357f(5'-TACGGGAGGCAGCAG-3';SEQ ID NO:3),
519r(5'-G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3';SEQ ID NO:4),
536f(5'-CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C-3';SEQ ID NO:5),
803f(5'-ATTAGATACCCTGGTAG-3';SEQ ID NO:6),
907r(5'-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3';SEQ ID NO:7),
1114f(5'-GCAACGAGCGCAACCC-3';SEQ ID NO:8),
1385r(5'-CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3';SEQ ID NO:9)和
1525r(5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3';SEQ ID NO:10)
(MWG-BIOTECH AG,Ebersberg,Germany)。
序列分析和比对,以及系统发育树的构建如前所述进行(Sallam,A.等,已投稿待发表(2008)):核酸序列数据用Contig汇编程序(CAP)在线软件分析。序列与以前发表的代表性菌株和其它细菌的序列使用国家生物技术信息中心(NCBI)数据库上获得的blast功能进行比对。参考序列使用ClustalX1.8软件进行比对,系统发育树使用程序TreeView1.6.5和NJplot构建。应用靴带法(Bootstraping)通过进行100次重排来评价树形布局。
以500l规模的培养:在Biostat D650不锈钢生物反应器(B.BraunBiotech International,Melsungen,Germany)中进行500l规模的培养,该反应器的总体积为650l(64cm内径和198cm高度)以及d/D值关系(搅拌器直径与容器直径的关系)为0.375。此生物反应器安装有三个搅拌器,每个含有6个桨和Funda-Foam机械消泡器(B.Braun BiotechInternational,Melsungen,Germany)。另外,多个孔用于可灭菌探头测量溶解氧(pO2)(25型;Mettler Toledo GmbH,Steinbach,Switzerland),pH(Pa/25型;Mettler-Toledo GmbH),泡沫(L300/Rd.28型;B.Braun BiotechInternational,Melsungen,Germany),温度(pt100电极;M.K.JuchheimGmbH,Fulda,Germany),和850nm处的光密度(CT6型;Sentex/MonitekTechnology Inc.)。操作由数字控制装置结合MFCS/win软件包(B.BraunBiotech International)控制和记录。培养在30℃中完成,且pO2调节至在培养基中超过40%饱和度,其自动地通过搅拌控制,通风率稳定地保持在0.7vvm(体积/体积×分钟)。培养基的初始pH为6.9且在生长期间耐受增加至7.5的pH,否则,通过加入4N HCl控制pH。
细胞分离,上清液蛋白的浓缩和脱盐:细胞通过用CEPA Z41型或Z61型连续离心机(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH,Lahr,Germany)离心收获。使用COP(截留点(cut-off point))为30kDa和带有2Plus型(Sartorius AG,Germany)不锈钢支架的错流聚醚砜-盒浓缩分子大小超过30kDa的蛋白并随后脱盐(5柱床体积的H2O)。
在不同底物上生长:在100ml带有挡板的Klett培养瓶中研究底物利用;每个培养瓶含有10ml SM培养基和1g l-1下列底物之一:乳酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油。所有底物的储备溶液通过过滤(孔径0.2um,MilliporeGmbH,Eschborn,Germany)灭菌。试验一式两份地进行,接种在相同测试条件下生长的预培养物。在30℃中24小时孵育期后通过OD578nm的增加监测生长。
藻青素的发酵生产:使用带有质粒pMa/c5-914::cphAPCC6803的大肠杆菌DH1的重组菌株以500-1规模发酵生产CGP(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))。作为底物和培养基,使用以前应用的protamylasse(Avebe,Veendam,The Netherlands)培养基,并如(Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))所述通过稀释、筛分和离心制备。
为了测定用于CGP生产的protamylasse的可利用装料的最适浓度,在浓度为4~8%(vol/vol)的protamylasse培养基上的100ml培养物在200ml带挡板的培养瓶中测试;培养基的pH为7.5,并且含有100mgl-1氨苄西林。接种后,培养瓶在37℃中孵育15h并振摇(120rpm)(G25型振荡器,New Brunswick Scientific GmbH,Nurtingen,Germany),最后,在来自每个培养瓶的50ml样品中估计CGP含量。
在发酵之前,16-l预培养物培养在2-l带挡板的培养瓶中,每个培养瓶含有1-l protamylasse培养基(7%;vol/vol,pH7.5)、100mg l-1氨苄西林和0.15%(vol/vol)含硅消泡乳液(50%;vol/vol,Wacker Silicones,Burghausen,Germany),并在30℃中孵育20h并振摇(110rpm,RC-6-W型振荡器,Adolf Kuhner AG,Birsfelden,Switzerland).
在不锈钢生物反应器(B.Braun Biotech International,Melsungen,Germany)中进行主要培养,该反应器的总体积为650l(64cm内径和198cm高度)以及d/D值关系(搅拌器直径与容器直径的关系)为0.375。该生物反应器安装有三个搅拌器,每个含有6个桨和Funda-Foam机械消泡器(B.Braun Biotech International,Melsungen,Germany)。另外,多个孔用于可灭菌探头测量溶解氧(pO2)(25型;Mettler Toledo GmbH,Steinbach,Switzerland),pH(Pa/25型;Mettler-Toledo GmbH),泡沫(L300/Rd.28型;B.Braun Biotech International,Melsungen,Germany),温度(pt100电极;M.K.Juchheim GmbH,Fulda,Germany),和850nm处的光密度(CT6型;Sentex/Monitek Technology Inc.)。操作由数字控制装置结合MFCS/win软件包(B.Braun Biotech International)控制和记录。
该生物反应器填充以400-l7%protamylasse-培养基(pH7.5)和75ml消泡溶液,原位灭菌,并在冷却至30℃后,加入100mg l-1无菌氨苄西林溶液后,接种以4%(vol/vol)预培养物。在30℃中进行第一个6h的培养,通过加入6M NaOH或6M HCl将培养基的pH保持在7.5。pO2恒定地保持20%饱和度,并自动地通过搅拌调节,通风率稳定地保持在0.17vvm(体积/体积×分钟)。6h孵育后,温度升高至37℃直至发酵结束。细胞通过用CEPA型Z61连续离心机(Carl PadbergZentrifugenbau GmbH,Lahr,Germany)离心收获。
CGP的大规模提取和纯化:为了从得到的湿生物质获得纯的CGP,应用以前优化的用于大规模提取和纯化CGP的酸提取法(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technical productionofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中))。最后,提取的CGP在-30℃中冷冻,并在BETA1-16型冻干机(Christ Gefriertrocknungsanlagen,Osterode,Germany)中冻干。
CGP的灭菌:CGP通过二乙醚灭菌或如前所述通过溶解在0.1N HCl中并过滤灭菌(Sallam,A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobicdegradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonasalcaligenes strain DIP1-Role of other three co-isolates in the mixedbacterial consortium.(反硝化细菌产碱假单胞菌DIP1株对藻青素的厌氧和需氧降解-混合细菌聚生体中其它三种共分离物的作用)已投稿待发表)。通过短暂离心(2800×g,2分钟)沉降CGP,或通过使CGP放置在4℃沉积过夜来调节储备溶液中CGP的所需浓度,然后部分弃去上清液,以获得所需浓度的CGP。
分析技术:在将Klett-培养瓶插入至Klett-光度计(Manostat Corporation,New York,USA)后,通过测量浊度变化,或通过用Libra S5光度计(Biochrom Ltd.,Camebridge,UK)测量600nm处1ml样品的OD来监测细菌生长和CGP降解。在电泳示踪缓冲剂(Laemmli)后在11.5%(wt/vol)凝胶中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),U.K.,Nature227:680-685(1970)。在(Lacks,S.A.等,J.Biol.Chem.225:7467-7473(1980))后进行蛋白的凝胶中复性。蛋白和藻青素用考马斯染色法染色(Weber,K.等,J.Biol.Chem.244:4406-4412(1969)),或用银染法染色(仅用于蛋白)(Nesterenko,M.V.等,J.Biochem.Biophys.Methods3:239-242(1994))。.总蛋白和CGP的浓度使用Bradford试剂如(Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))所述测定。从CGP-二肽中通过使用10kDa-膜Vivaspin管(Vivascience AG,Hannover,Germany)或使用带有用于较大体积的10kDa-膜(MilliporeCorporation,Bedford,USA)的Amicon-室(Amicon,Beverly,USA)通过超滤浓缩、脱盐和分离培养样品中的大尺寸蛋白。游离氨基酸和二肽通过反相HPLC(Kontron Instruments,Neufahrn,Germany)检测,在检测前它们的游离氨基用邻苯二甲醛(OPA)试剂如前所述(Aboulmagd,E.等,Arch.Microbiol.174:297-306(2000))进行柱前衍生化。对于CGP或CGP-二肽的构成氨基酸的分析,样品预先进行酸水解(6N HCl,95℃,过夜)。HPLC系统安装有B801柱(Prep Nova-Pak HR3.9x300)(KnauerGmbH,Berlin,Germany),并用起始洗脱液(81%,vol/vol,硝酸钠(50mM):19%,vol/vol,甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19-75%,vol/vol)在40℃中以1.0ml/min的流速洗脱,然后采用1046A型荧光检测仪(Hewlett Packard,Waldbronn,Germany)在330/450nm(激发/发射)下进行荧光检测。
CphE al 活性和浓度的测定:藻青素酶(CphEal)的活性通过小等分试样的浓缩酶溶液在CGP覆层琼脂板上形成降解晕来检查,为此,5ml培养物样品以2800x g离心30min(Megafuge1.0R,Heraeus Sepatech GmbH,Osterode,Germany)并且4ml所得上清液通过超滤离心100倍。对于培养样品中酶的定量测定,开发了如下的光度测定法:2μl浓缩的培养上清液加入至1ml CGP悬液(100mg l-1)中并在试管旋转器中(3rpm,502S型,Watson-Marlow GmbH,Rommerskirchen,Germany)在30℃中孵育30min。最后,测量样品的OD600nm以指示由于降解而引起的CGP量的减少;此反过来通过各自的校准曲线用来指示溶液中CphEal的浓度。
CGP降解的最适浓度和条件:使用前面使用产碱假单胞菌DIP1株(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for thetechnical production ofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中))获得的粗制CphEal粉末,并且测量CGP浓度和粗制CphEal之间关于所需降解时间的最适比率,在Eppendorf管中制备纯CGP悬液(水中,pH7.3)的系列稀释液(50~100g l-1),每个稀释液总体积为1ml,将不同量的粗制CphEal粉末[4.6%(wt/wt)CphEal含量]加入至每种制备的CGP浓度中,反应管在试管旋转器(3rpm)中在30℃中孵育以揭示用于CGP完全降解所需的孵育时间。
在含有1ml CGP悬液(100g l-1)的Eppendorf管中进行测定CGP降解的最适pH的试验,悬液的pH值为5.0~9.0,反应管含有另外的10g l-1粗制CphEal,并且在30℃中孵育30min。用于最适降解温度的反应混合物含有类似浓度的CGP(pH7.0)和CphEal并在15、20、25、30、35、37、40、50、60或70℃中孵育30min。两个试验后,所有试管中的CGP降解以百分比进行计算并一起进行比较。
通过有机溶剂和硫酸铵沉淀纯化CphE al :1ml浓度为10~100%(vol/vol)的冷乙醇、丙酮或甲醇加入至Eppendorf管中的50μl浓缩的粗制CphEal溶液(14g l-1)中,反应混合物在-20℃中孵育60min。反应管以16000x g离心5min后,片状沉淀物干燥并重悬在50μl磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。通过在10ml粗制CphEal溶液(3.5g l-1)中逐步增加硫酸铵饱和度百分比(10~100%)来进行硫酸铵分级分离,在每个步骤中,试管在室温下孵育30min并以16000x g离心10min,片状沉淀物悬浮在磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,然后通过超滤脱盐。所有蛋白沉淀物测定CGP覆层琼脂板上的CGP降解以及SDS-PAGE中的蛋白含量。
CphE al 的特异性底物纯化:根据粗提取物中的酶与其不溶性底物(CGP)的强亲和力开发CphEal的纯化方法,其中仅CphEal与CGP结合,并且因此可以通过沉淀收获。为了确定在pH7.0下酶与CGP的完全结合所需的时间,0.5ml浓缩的粗制CphEal溶液(14g l-1)加入至0.5ml CGP悬液(100g l-1)中。在每次首个10分钟孵育后,测试来自反应上清液的2μl等分试样(短暂离心后)在CGP覆层琼脂板上的降解活性,降解晕的消失指示CphEal与CGP的完全结合。实际纯化过程在类似的1ml反应混合物中进行,并且如下进行:在CphEal与CGP完全结合后,混合物离心30秒(16000x g),弃去上清液,并且片状沉淀物用10ml磷酸钠缓冲液(50mM)洗涤5次。之后,片状沉淀物悬浮在1ml磷酸盐缓冲液中,并在30℃中在旋转(3rpm)下孵育过夜直至发生CGP的完全降解。混合物离心(5min,16000x g),然后通过超滤去除CGP-二肽,并且通过SDS-PAGE分析上清液的浓缩蛋白级分的纯度。
来自产碱假单胞菌DIP1株的CphE al 的表征:为了确定纯化的CphEal的温度稳定性,10μl等分试样在不同的温度(10~80℃)下孵育20min,然后其中3μl在30℃中测试在CGP覆层琼脂板上的降解活性。对于最适降解温度,3μl等分试样的纯化CphEal溶液加入至1ml CGP悬液(50mM磷酸钠缓冲液中的100g l-1,pH7.0)并在不同的温度(10,20,30,40,45,50和60℃)下孵育20min。对于纯化CphEal对CGP的最适降解pH,3μl等分试样的纯化CphEal储备溶液加入至1ml具有不同pH值(5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5或9)的CGP悬液(50mM磷酸钠缓冲液中的100g l-1)并在30℃中孵育30min。最后,如上所述在两个试验的反应管中光度法测定CGP降解。如前所述测试纯化CphEal对下列多肽底物的底物特异性(Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004)):CGP,牛酪蛋白(Hammersten-级)(Merck,Darmstadt,Germany),牛血清白蛋白(BSA)(Roth,Karlsruhe,Germany)和聚(a,β-D/L-天冬氨酸)(Bayer AG,Leverkusen,Germany)。
为了揭示酶抑制剂对纯化CphEal的作用,50μl等分试样的纯化酶储备溶液加入至450μl磷酸钠缓冲液(50mM)并在下列基团特异性抑制剂(Group-specific inhibitors)的存在下在30℃中孵育2h:亮抑酶肽(巯基蛋白酶),EDTA(金属蛋白酶),Pefabloc(丝氨酸蛋白酶),PMSF(丝氨酸蛋白酶)或N-溴代琥珀酰亚胺(色氨酸残基)。测定每种反应混合物的5μl样品在CGP覆层琼脂板上的活性。之后,5μl等分试样的CGP储备悬液(50 g l-1)加入至反应管,孵育另外15 min,离心和经HPLC筛选降解产物。
实施例1 来自哺乳动物、禽类和鸟类肠道菌丛的样品对CGP的厌氧降 解:过滤的菌丛样品含有大量的不同细菌以及高含量的底物。为了模拟获得这些样品的消化道内的自然条件,菌丛溶液用作接种物并且同时用作营养补充剂。含有BM培养基和作为唯一底物的1 g l-1CGP的无菌厌氧Hungate管以10%的浓度接种。所有接种的厌氧管显示在这些条件下完全降解CGP。在试管中完全降解CGP所需的孵育时间为12-48 h的范围。
在肠道菌丛中筛选CGP降解细菌:为了分离CGP降解细菌,100μl等分试样的已制备的菌丛样品涂布在CGP覆层琼脂板上。在37℃中孵育几天期间,琼脂板显示CGP降解细菌的出现在不同的菌丛之间变化很大(表1)。在来自兔(埃及)、绵羊(德国)的盲肠菌丛和来自鲤鱼(德国)的消化道菌丛的情况下出现最高的发生率。降解集落的形态学特征,所需的孵育时间和由CGP降解导致的晕圈(halos)的形式和强度在不同的菌丛样品以及每个样品内的集落间变化也很大。这指示存在有具有各种各样的CGP降解能力的独特的细菌物种。
CGP降解株的分离和纯化:选择形态学上独特的CGP降解细菌集落并通过将显示降解晕的集落转移至新鲜的CGP覆层琼脂板而进一步纯化。在纯化工作期间,许多CGP降解集落丧失了其作为纯性培养物诱导降解晕的能力,并且因此被丢弃。同样,几种CGP降解群显示非常难以作为纯性培养物获得,并且也被忽略而不进行进一步的纯化步骤。另一方面,纯化阶段产生62个纯性培养物,它们显示形态学上独特的特征且保留了CGP降解的能力。如表1中所证明,CGP降解细菌分离自每种动物的沿消化道的不同部位。这与关于例如反刍动物中饮食蛋白的降解所已知的事实相符;而瘤胃是饮食蛋白的主要降解部位,未消化的蛋白(过瘤胃蛋白(bypass或escape protein))随着消化物移动至下消化道,在此其一部分被动物的酶破坏或被下消化道菌丛破坏,然后被吸收,之后剩余物被排泄。过瘤胃蛋白的降解对于特殊生理功能是很重要的,诸如产奶(Holter, J. B. 等,J. Dairy. Sci. 76:1342-1352(1993))。
纯性培养物在厌氧和需氧条件下降解:检验62个纯性培养物在液体培养基中在需氧条件下降解CGP的能力。这在含有1g l-1CGP和0.5g l-1酵母提取物的BM培养基中进行,并且显示所有纯性培养物降解CGP的能力(表1)。在除还原剂以外含有类似培养基的Hungate管中的厌氧CGP降解试验表明在62个分离株中,46个也能够厌氧性降解CGP。这些中,38个完全地降解CGP,而剩余的显示部分降解CGP。纯性培养物厌氧降解CGP所需的孵育时间的范围为在37℃中24h至7天。
CGP的降解产物:在需氧和厌氧培养中62个纯分离物对CGP完全降解后,立即通过HPLC测定培养上清液中CGP的降解产物,在HPLC测定之前如方法章节中所述用OPA试剂进行柱前衍生化。如预期的那样,HPLC分析表明所有分离物将CGP降解为构成其的二肽。对之前已经进行酸水解的上清液样品的类似分析表明存在三种构成CGP的氨基酸:天冬氨酸,精氨酸和赖氨酸。后三种氨基酸的检测依照重组CGP的已知组成,该重组CGP应用于这些试验中,其中约6Mol%的精氨酸部分用赖氨酸替换(Voss,I.等,Metabol.Eng.8:66-78(2006))。
CGP降解纯性培养物的分类学隶属关系:分离的纯性培养物的形态学特征提示约50%的分离物属于芽孢杆菌属和假单胞菌属,而其余的分离物属于其它的属包括链霉菌属和小单孢菌属。为了对检验的肠道菌丛中CGP降解细菌的系统发生提供更清楚的理解,来自62个菌株的8个菌株进一步通过16S rDNA测序鉴定。如表中所示,三种分离物:分别来自绵羊(德国)的瘤胃菌丛、火鸡(埃及)的盲肠菌丛和罗非鱼(埃及)的消化道菌丛的17,35,49,被鉴定为芽孢杆菌属的成员,它们与巨大芽孢杆菌AC46b1,巨大芽孢杆菌MPF-906和B.KoguryoaeSMC4352-2T的16S rDNA序列相似性分别超过99%。两种分离物:来自奶牛(德国)的结肠菌丛和鸽子(埃及)的盲肠菌丛的15和47发现属于短芽孢杆菌属,它们与罗伊兹氏芽孢杆菌(B.reuszeri)DSM9887T和短芽孢杆菌SE004的16S rDNA序列相似性分别超过98%。分离自兔盲肠(德国)的株31隶属为链霉菌属,其与阿维链霉菌(S.avermitilis)NCIMB12804T的序列相似性超过98%。16S rDNA序列分析还显示来自鸭盲肠(德国)的株38属于小单孢菌属,并且与小单孢菌0138种的序列相似性超过99%。最后,在鉴定的分离物中还发现了假单胞菌属的代表:来自鲤鱼(德国)的株52显示与CGP降解细菌产碱假单胞菌DIP1的16S rDNA序列相似性超过99%。
构建的系统发育树(图1)显示来自各种动物、禽类和鱼类菌丛的8个鉴定株与它们密切相关的菌株和与其它细菌之间的关系。此外,在系统发育树中证明了所有能够细胞外降解CGP的已知细菌的分类学位置。此外表2提供了对能够细胞外降解CGP的细菌的广泛分布、生活环境和系统发生的概述。
钝顶螺旋藻市售产品中的CGP:市场名称螺旋藻,其常常与几种营养益处相关,并且因此用作用于人和动物的添加剂(Narasimha,D.L.R.等,J.Sci.Food Agric.33:456-460(1982);Kihlberg,R.,A.Rev.Microbiol.26:427-466(1972);Lu,J.等,Aquaculture254:686-692(2004);Ross,E.,Poult-Sci.69:794-800(1990)))。为了研究研究这是否与CGP的存在相关,在德国市场可获得的三种螺旋藻产品检查CGP的存在。两种产品;来自Sanatur GmbH(Singen,Germany)和Greenvally GmbH(Berlin,Germany)由100%钝顶螺旋藻组成,而第三种变种来自AuricaGmbH(Schwalbach-Elm,Germany),其含有40%。通过在CGP分离之前研磨成细粉制备这三种产品的每一种的10g CDM,此对应于大约普通日剂量的两倍。三种市场变种分别0.06%,0.13%和0.15%的CGP含量。如期望的,分离的CGP的水解样品的验证性HPLC分析表明,蓝细菌CGP的典型构成性氨基酸为:天冬氨酸和精氨酸。
实施例2:开发用于从CGP生产β-二肽的最适方法:首先以小规模优化几个因素,例如;所需要的合适和经济的培养基,高度浓缩的CGP悬液,其在实践中可以被制备用于降解,和规定细胞外酶在相对短的孵育期内实现完全的CGP降解的必需量。
在CphE的制备期间,由于加入诱导物(CGP)和其随后的降解,OD600nm的变化代表CphE释放的明确迹象,因此,清亮的培养基和细胞的可控生长是必需的,这通过材料和方法章节中提及的最终培养基组成来实现。而且,在测试的底物中,产碱假单胞菌DIP1株显示在柠檬酸盐上生长最好(图3),作为唯一底物的柠檬酸盐的施用浓度(1g/l)确保合理但同时在诱导和降解阶段期间确保培养物可控的生长浊度。
为了测定用于大规模方法的降解阶段(阶段III,见下)的CGP和粗制CphE浓度之间的平衡比率,进行下列小规模试验;在Eppendorf管中制备纯CGP悬液(在水中,pH7.3)的系列稀释液(10~50g/l),每个管中的总体积为1ml。此外,对每个制备的CGP浓度测试粗制CphE的系列稀释液(1~10g/l),反应管在30℃中在试管旋转器中以3rpm的旋转速度孵育。试验显示当施用较低浓度的粗制CphE时,CGP降解时间的相对恒定的增加。最高测试浓度的CGP(50g/l)可以在2g/l粗制CphE粉末的存在下在10h内被降解(图4)。
CGP-二肽的大规模生产:为了能够常规生产大量的纯CGP-二肽,建立三阶段方法:阶段I:CGP的大规模分离和纯化,阶段II:粗制CphE粉末的大规模生产,阶段III:CGP降解为其二肽。
阶段I(CGP的大规模分离和纯化):为了获得大量的CGP,使用4776g细胞干质量的含CGP细胞,此量是以前在使用富养罗尔斯通氏菌H16-PHB-4-Δeda(pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16)的一次500l发酵期间产生的。此生物质装料的CGP含量为32%(wt/wt)(Voss,I.等,Metabol.Eng.8:66-78(2006))。另外,混合来自使用富养罗尔斯通氏菌H16-PHB-4-Δldh/Ωkm-cphA6308的实验室规模发酵的几种其它干生物质装料(总计2490g)并且被认为是第二装料。根据在材料和方法章节中提到的改良的酸提取法从每种装料中单独地提取和纯化CGP。得到的CGP湿生物质对于主要细胞装料为1948g,且对于第二装料为295g,在冻干纯化的CGP后,分别从两种装料中获得621.83g和82.17g纯CGP。对来自两种细胞装料的分离的CGP的各自氨基酸成分的HPLC分析表面,该聚合物主要由天冬氨酸和精氨酸组成,并且其含有仅少量的4.5%(mol/mol)的赖氨酸。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明两种装料中分离的CGP的分子量为约20-30kDa。然而,HPLC分析和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳指示在获得的CGP中没有任何杂质。因此,两种CGP装料可以混合在一起达到最终量为704g的纯CGP。
阶段II(粗制CphE粉末的大规模生产):为了继续开发CGP-二肽的商业生产方法,从产碱假单胞菌DIP1中生产足量的粗制CphE是必需的,因此,该菌株在Biostat D650生物反应器中以500l规模培养。产碱假单胞菌DIP1的预培养物在含有1l具有1g/l柠檬酸钠的SM培养基的2l带挡板的培养瓶中进行培养;将培养瓶在30℃中孵育12h并振摇。生物反应器充以420l含有1g/l柠檬酸钠的SM培养基,灭菌,并接种以4%(vol/vol)预培养物。初始的pH调节至6.9。在发酵期间,产碱假单胞菌DIP1株的细胞在发酵的第一个小时后开始缓慢地生长,并达到0.4的OD600nm值,从而在差不多9h后进入静止生长期。在静止生长期的第一个2h后通过加入0.25g/l无菌CGP悬液诱导CphE的分泌,诱导物(不溶的CGP)的加入将OD600nm立即从0.55增加至0.98,加入的CGP的完全降解需要2h并且通过OD600nm的减小指示达到接近诱导前的值。1h后,细胞开始缓慢地生长,这最有可能是培养基中CGP-二肽的存在所导致的。在总计14h的培养期后发酵终止(图5)。
对于包括分泌的细胞外藻青素酶的上清液中蛋白的收获、浓缩和脱盐,制备连续系统,同时进行发酵(图6);为收获,使用CEPA Z41连续离心机来分离细胞,同时将上清液收集在中央100l槽中。为了同时浓缩收集的上清液,具有30kDa盒的错流装置连接到中央槽;含有分子尺寸大于滤器盒的COP(30kDa)的蛋白的浓缩渗余物重新泵入槽中,同时直接弃去渗透物。调节错流的流速以保持槽中的体积为约50l。为冷却,将冰袋引入至中央槽中以保持溶液的温度在20℃中。在收获结束后,继续浓缩过程直至仅5l浓缩物留在槽中。为脱盐,浓缩物用5柱床体积的H2O洗涤。在前面的每个步骤期间,收集样品并检查在CGP覆层琼脂板上的CGP降解活性(图2)。最后,浓缩物冷冻在-30℃并冻干从而获得最终干重为17.5g的粗制蛋白粉末。
阶段III(纯CGP降解为其二肽):CGP至其二肽的大规模降解在250g纯CGP上并使用10g粗制CphE粉末进行,这些量代表最高的、易于制备的CGP浓度(50g/l)和充足的粗制CphE浓度(2g/l)从而却找不到12h内的完全降解,如通过小规模试验所测定的。250g CGP粉末同届在5l0.1M HCL中,中和至pH7.3,置于在4℃中沉降,并且最后通过用自来水洗涤3次脱盐,从而获得最终体积为5l的所需浓度。之后,10g粗制CphE粉末加入至CGP悬液中,并在30℃中孵育12h并轻轻搅拌。CGP完全降解后,将二肽溶液过滤除菌,使用在阶段II期间采用的相同错流系统从粗制蛋白成分中分离,在-30℃下冷冻,并且最后冻干,从而获得227.5g CGP-二肽。
为了测定对于CGP二肽的纯化是否需要进一步的纯化步骤,将几个20ml等分试样(在后面的冷冻和冻干步骤之前获取)用具有下列COP的不同膜过滤:10,5,1,和0.5kDa。过滤后,通过测定过滤之前和之后的冻干的1ml等分试样的干重以及通过HPLC分析评价CGP-二肽的损失。与初始的二肽溶液比较,过滤期间的最大干重损失为具有最小COP(0.5kDa)的膜的情况,为78.5%(wt/wt),具有1kDa的膜导致47.8%(wt/wt)的损失,而具有5kDa的膜导致11.6%(wt/wt)的损失,具有较高COP(10kDa)的滤膜显示7.4%(wt/wt)的最小损失。
从所有过滤系统获得的二肽的纯度等级通过TLC以及HPLC分析监测,所有过滤的二肽样品显示相同的高纯度等级(图7,I)。因此,对于主要二肽装料不需要进一步的过滤步骤。具有30kDa盒的错流明显也是用于回收降解的CGP溶液的蛋白部分的最实用的设备。将回收的蛋白溶液再次冷冻和冻干。回收的粉末在CGP覆层琼脂板上的活性测试显示经历所有前面提到的步骤后CphE存在并且保留了其活性(图2)。粗制粉末的回收率78%。
对于所得二肽粉末的最后质量控制,直接样品以及酸水解样品通过TLC检验;对于直接样品指示仅一个斑点(图7,I),而水解样品显示标准氨基酸天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸的典型斑点(图7,II)。此外,对酸水解样品的验证性HPLC分析表明仅有这三种构成性氨基酸的典型峰。在这些结果中,二肽粉末的纯度估计为超过99%。来自250g CGP降解的最终结果(227.5g纯二肽)表明整个方法的总效率为91%,其通过未来的优化甚至可以更高。
实施例3.以500l规模发酵生产藻青素:用于此研究的足量CGP以500-l规模发酵产生(Elbahloul,Y.等,Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))。然而,重组大肠杆菌DH1株(pMa/c5-914::cphAPCC6803)培养在7%protamylasse(vol/vol)上;在对可获得的protamylasse装料的预试验中,此浓度证明对于CGP制备是最适的。
在发酵期间(图8)和孵育的第一个6h后,温度升高至37℃以诱导CGP-合成酶(CphA)基因(Frey,K.M.等,Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002)),每h取的样品显示,如预期的那样,聚合物在细胞内进行性地积累,在13h后达到最大(显微镜估计)并且之后保持恒定(图9)。15h后OD600nm达到18.3,然后发酵终止,然后,后来的分析显示13%(wt/wt CDM)的最大CGP积累为发酵13h后,并且在收获期(15h)时其下降至10%(wt/wt CDM)。从所得的4626g湿重的细胞中提取CGP(1372g CDM)后,获得135g纯CGP粉末,CGP的HPLC分析表明除了赖氨酸(占聚合物的6.8Mol%)以外仅有构成性氨基酸天冬氨酸、精氨酸。SDS-PAGE证实CGP的纯度并且显示其分子量为25~30kDa。
产碱假单胞菌DIP1株的最适生长条件:测试含有不同浓度的柠檬酸盐(0.5~10g l-1)的SM-培养基,其以前证明是DIP1株的最适底物(Sallam,A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technicalproduction ofβ-dipeptides from cyanophycin.(用于从藻青素中工艺生产β-二肽的生物工艺方法)Under preparation.(准备中)),显示6g l-1产生最大生长(475Klett装置,在30℃中13h后)。在相同条件但具有不同的pH值(5.5~8.5)下在6g l-1柠檬酸盐上培养的DIP1株的培养物显示DIP1株具有6.5的最适生长pH,而在不同孵育温度(15~45℃)下的培养表明37℃是生长的最适温度。
用于产碱假单胞菌DIP1株的最大CphE al 产量的最适培养条件:为了判断当细胞达到静止生长期时用于DIP1株的CphEal最大产量的最适培养条件,通过加入0.25g l-1CGP诱导制备CphEal。在接下来的5h期间,将上清液样品浓缩(100倍)并筛选CGP覆层琼脂板上的降解活性以及进行光度测定。来自柠檬酸盐浓度低于0.5或高于4g l-1的培养物的上清液样品不显示任何降解活性,而对在2g l-1柠檬酸盐上生长的培养物诱导5h后监测到最大活性和随后CphEal最大产量。此外在最适生产条件下的进一步培养试验证实DIP1株的细胞在孵育约13h后达到静止生长期,并证明此时间点对于CphEal的诱导的最适的。因此,下面的条件被认为对于CphEal生产是最适的;含有2g l-1柠檬酸的SM-培养基,pH6.5,37℃,在13h后诱导,并且在孵育的第16h期间收获。
使用CGP和可选的诱导物对CphE al 的最适诱导:除了CGP以外,在DIP1株的培养中测试其它可能的诱导物;来自CGP的β-二肽形式,合成二肽(α-精氨酸-天冬氨酸,α-赖氨酸-天冬氨酸,α-鸟氨酸-天冬氨酸)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA),α-聚天冬氨酸(Bayer AG,Leverkusen,Germany),聚-ε-赖氨酸(Chisso,Tokyo,Japan),L-天冬氨酸,L-精氨酸,L-赖氨酸,L-瓜氨酸,L-鸟氨酸以及天冬氨酸类似物[N-乙酰基-天冬氨酸,脲基琥珀酸(N-氨甲酰基-天冬氨酸)]。所有诱导物首先以0.25g l-1的浓度测试,并且CphEal的产生在CGP覆层琼脂板上测定并且还经光度计测定。仅CGP,其二肽和天冬氨酸诱导显著量的CphEal。随后,在用这三种诱导物诱导的培养物中研究最适浓度和最适CphEal收获时间;对于CGP,测试0.001~3.0g l-1之间的浓度,诱导效应随着浓度增加而增加直至0.05g l-1,而较高的浓度显示相同的效率。在用0.05g l-1CGP诱导5h后获得最大CphEal产量。
在与对于CGP测试的类似条件下培养但用与其相同的浓度范围内的CGP-二肽诱导的培养物,就诱导物的浓度而言,显示类似的结果,然而,仅在诱导3h后获得最大CphEal产量。天冬氨酸还证明是合适的诱导物,其中使用4g l-1天冬氨酸在诱导5h后获得最大CphEal产量;然而,与用最适CGP浓度(0.05g l-1)诱导的培养物相比,用天冬氨酸诱导后的CphEal产量仅为三分之一。
经粗制CphE al 将CGP降解为二肽的最适条件:为了减少处理的反应体积和原始方法的第三阶段(CGP降解)所需的时间,较高CGP浓度(50-100g/l)的降解时间在30℃中测试,这显示降解时间随着粗制CphEal的浓度降低和随着CGP浓度的升高共线的增加。在10g l-1粗制CphEal的存在下,对于最低测试浓度(50g l-1)的CGP监测到最短的降解时间(4h),而需要16h降解最高测试浓度的CGP(100g l-1)。
如材料和方法章节中所述分别进行估计粗制CphEal粉末降解CGP的最适pH和温度。光度法测定反应管中剩余的CGP表明最大CGP降解(45%)发生在pH6.5,然而,5.5~7.5的pH范围显示了相近的结果。另一方面,CGP降解随着温度增加而增加,在50℃时达到最大值90%。因此,在最适参数(50℃,pH6.5)下重复CGP和CphEal的浓度之间的最适关系。对于50和100g l-1的CGP浓度,这将所需的降解时间(在10gl-1粗制CphEal的存在下)分别减少至1和4h。在最适条件下,降解时间还显示随着粗制CphEal的浓度降低和随着CGP浓度的升高的共线增加。此共线关系可以有助于在未来的工艺应用中应用最适降解参数。各个公式是对至多达100g l-1的CGP浓度并基于纯CphEal(E)的浓度计算的,为了应用粗制提取物,CphEal含量必需在使用该公式(s.u.)之前确定;
P50℃中的降解时间=17.55-29.891E[所需的纯CphEal的浓度(g/l)]
从粗制上清液粉末中纯化CphE al :为了使方法更为有效并获得关于来自产碱假单胞菌DIP1株的CGP酶的特性的更多知识,测试了用于从粗制粉末中纯化CphEal的几种工艺上适用的方法。由于回收率低和纯化效果差,使用溶剂诸如乙醇、甲醇或丙酮沉淀和分离酶不能提供令人满意的结果。然而,硫酸铵沉淀提供相当好的结果,其饱和浓度为70%,而纯度等级有点太低。
经特异性底物结合纯化CphE al :开发了一种简单的方法纯化来自产碱假单胞菌DIP1株的CGP酶。为此,如材料和方法章节中所述,不溶的CGP本身用作结合基质以特异性地结合CphEal。预试验显示在首个5min后CphEal与CGP完全结合,因此这被认为是在另外的应用中的最小结合时间。所有纯化步骤的SDS-PAGE显示酶的逐步纯化(图10A),并且前两个洗涤步骤是必需的,以去除不结合CGP的其它蛋白。在XGP基质的降解和通过超滤去除二肽后,获得高纯度等级的CphEal。CGP覆层琼脂板显示纯化CphEal的高活性,并且纯化的蛋白显示在SDS-PAGE中的表观分子量为45kDa。CphEal的性质通过凝胶内复性(in-gel-renaturation)来证实,其中其再次获得活性并且在CGP覆层琼脂板上形成降解晕。纯化CphEal的浓度为43.2μg ml-1,而初始的粗蛋白溶液中的总蛋白含量为944μg ml-1。为了更准确地检测纯化酶的纯度等级,对于较大的样品体积(三倍体积)重复进行SDS-PAGE,并且用银染色法染色较长的时间;这显示了少数的其它蛋白条带以相当低的浓度存在(图10B)。
在发酵上清液中测定CphE al 含量:如果在未来的工艺应用中需要应用纯CphEal,则首先要估计产生的上清液中CGP酶的浓度,因此,使用1ml具有固定浓度(100mg l-1)的CGP悬液开发了一种快速检测法,所述CGP悬液的OD600nm为0.215。向此溶液中加入3μl具有不同浓度(2.7~43.2μg ml-1)的纯化酶的溶液。反应在30℃中孵育60min,同时缓慢地旋转(3rpm)。最后,在600nm下经光度法测定CGP降解的程度。为了保证该检测的再现性和其公式(s.u.)的准确性,必需保持测试参数和OD600下的测量范围(0.15~0.215)。
E[粗制提取物中的CphEal含量(μg/ml)]=[0.2404-D(60min后的OD600nm)]/0.0017
CphE al 的工艺纯化所需的CGP量:为了将酶纯化步骤结合至主生产方法中,还需要确定结合(具有已知CphEal含量的上清液中的)所有CphEal所必需的CGP的量。在0.5ml的总反应体积中,将50μl具有不同浓度(1.4~19μg ml-1)的纯化的CphEal溶液加入至不同的CGP浓度(0.1~6g l-1)中。反应混合物在30℃中孵育10min,同时缓慢地旋转(3rpm)。离心(16000×g,2min)后,将反应管离心,并且筛选上清液在CGP覆层琼脂板上的活性。对于所有测试的CphEal浓度,为安全起见,不诱导降解晕的最小CGP浓度乘以3,并且然后结合至校准曲线中。得到的公式如下:
C[需要的CGP浓度(g/l)]=[E[粗制提取物中的CphEal含量(μg/ml)]-2.4392]/0.9432
纯化的CphE al 的生化表征:纯化的CphEal在50℃中显示最大CGP降解活性,而该酶的完全灭活发生在68℃中。CGP降解的最适pH范围为7-8.5,最适值为8.5。测试纯化的CphEal对CGP、BSA、牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)的底物特异性显示对CGP的最高降解活性。然而,BSA也被部分降解(与CGP相比为65%)。牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)受纯化的CphEal的酶活性的影响最小。
为了获得关于CphEal的催化机制的信息,采用不同的基团特异性抑制剂进行抑制剂试验(表1)。在CGP覆层琼脂板上和通过CGP降解产物的HPLC分析来测定CGP酶的抑制。这表明细胞外CphEal被丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)强烈地抑制。N-溴代琥珀酰亚胺(色氨酸氧化剂)也导致酶的完全抑制。相反,CphEal导致的降解晕形成不受巯基蛋白酶抑制剂亮抑酶肽或受金属蛋白酶抑制剂EDTA的影响。HPLC分析证实除了用EDTA处理的样品以外,这些结果均显示对CphEal的抑制。
实施例4.CaCo-2细胞培养物对CGP二肽的吸收:为了证明CGP二肽在营养和治疗中的潜在应用,在初步研究中使用Caco2细胞(人结肠上皮腺癌细胞)的细胞培养物测试这些高度可溶的二肽的吸收。含有20%胎牛血清(FCS)和1%2mM谷氨酰胺溶液的Dulbecco's改良伊格尔培养基(DMEM)用作培养用培养基。约7000Caco2细胞/孔散布在24孔板中并在5%CO2的气氛和约98%的湿度下在37℃中孵育。每天在显微镜下检查细胞直至大约50h后形成单层。孵育培养基用每孔新鲜的700μl相同培养基完全更换,所述培养基中补充了350μg/ml CGP二肽(90%Asp-Arg︰10%Asp-Lys)或补充了相同量的游离L-天冬氨酸、L-精氨酸和L-赖氨酸的混合物。一排孔供给以新鲜的700μl不含后面的添加物的孵育培养基并且被当作对照。在0,13,22,67和113h的孵育期后取样品,并且如Sallam和Steinbuchel(J.App.Microbiol.DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04221.x)所述通过HPLC进行分析以确定测试的二肽和氨基酸的浓度变化。
培养基样品的HPLC分析表明在孵育113h后,约60%的藻青素Asp-Arg二肽和68%的藻青素Asp-Lys二肽被吸收。另一方面,在相同的孵育期后,仅41%的游离精氨酸和51%的游离L-赖氨酸被吸收。
例外地是,L-天冬氨酸似乎以游离的形式较好地被Caco2细胞吸收,并且在约67h的较短孵育期内被完全吸收。相反,与游离精氨酸和游离赖氨酸的吸收量相比,以CGP二肽的形式多31.6%的精氨酸和多24.4%的赖氨酸被细胞吸收。因此,CGP二肽代表了两种氨基酸精氨酸和赖氨酸的更高生物利用度的来源。这些结果是CGP二肽在营养和治疗中的潜在应用的第一个直接证据并且证实了以前关于肠道菌丛降解CGP的结果(Sallam和Steinbuchel J.App.Microbiol.DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04221.x))。这些结果还与以前的体外和体内研究相一致,这些研究证明寡肽(通常)具有比游离形式的其构成性氨基酸高的生物利用度(Adibi,S.A.,J.Clin.Invest.50:2266-2275(1971);Adibi,S.A.,Gastroenterology113:332-340(1997);Dock,D.B.等,Biocell28:143-150(2004))。
表1.哺乳动物、禽类和鱼类肠道菌丛中CGP降解细菌的广泛分布、系统发生和特征
+;完全CGP降解。±;部分CGP降解
表2.以前和本研究期间分离的能够细胞外CGP降解的细菌的广泛分布、生活环境和系统发生的概述。
a,b,c,d分别来自Obst,M等,J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002);Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004);Obst,M.等,Appl.Environ.Microb的数据。e来自Sallam,A.等,已投稿待发表(2008)的数据。f来自Zine,S.,Diplom thesis,Institut fiir Molekulare Mikrobiologieund Biotechnologie,Westfalische Wilhelms-Universitat,Munster,Germany(2004)的数据。g本研究。
表3:几种基团特异性抑制剂对纯化的来自产碱假单胞菌DIP1株的CphEal的作用
a对照无抑制剂,b抑制百分比值是指对照,即,不存在抑制剂的条件下的CGP酶的活性,c值不是由抑制导致的而是由于在HPLC分析前的OPA衍生化期间形成了沉淀物。PMSF:苯甲基磺酰氟化物,4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟化物·HCl,NBS:N-溴代琥珀酰亚胺。
表4:来自产碱假单胞菌DIP1株的CphEal和以前表征的CGP酶的生化特性之间的比较。
a来自Richter,R.等,Eur.J.Biochem.263:163-169(1999)的数据,b来自Obst,M.等,J.Biol.Chem.277:250的数据c来自Obst,M.等,Biomacromolecules5:153-161(2004)的数据,d本研究。PMSF:苯甲基磺酰氟化物,:4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟化物·HCl,NBS:N-溴代琥珀酰亚胺。n.d.:未确定。
Claims (13)
1.一种药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
含有分离的通过蛋白水解方法从藻青素(CGP)的制剂酶法制备的β-二肽组合物,所述方法包括以CGP酶将所述CGP的制剂降解为β-二肽,其中所述CGP酶是作为DSM21533在DSMZ保藏的产碱假单胞菌DIP1CGP酶CphEal。
2.如权利要求1所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
(i)所述β-二肽组合物由单个β-二肽或β-二肽的混合物构成;和/或
(ii)所述β-二肽组合物由含有选自下列的氨基酸残基的β-二肽构成:天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸。
3.如权利要求2所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
所述β-二肽选自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸。
4.如权利要求1所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
还包括通过培养原核或真核生物生产细胞系制备CGP制剂。
5.如权利要求4所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
所述生产细胞系选自大肠杆菌、富养罗尔斯通氏菌、鲍氏不动杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌、酵母菌株和植物生物质。
6.如权利要求5所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
所述生产细胞系为富养罗尔斯通氏菌H16-PHB-4-Δeda(pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16)和大肠杆菌DH1(pMa/c5-914::cphAPCC6803)。
7.如权利要求4、5或6所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
还包括分离、纯化和/或化学修饰通过培养所述生产细胞系获得的所述CGP产物。
8.如权利要求1所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
还包括纯化或分离降解产物。
9.如权利要求1所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
还包括化学修饰降解产物。
10.如权利要求1所述的药物组合物、食品或饲料补充剂,其特征在于:
其含有β-天冬氨酸-精氨酸和/或β-天冬氨酸-赖氨酸。
11.权利要求1-10所述的β-二肽组合物在制备用于营养治疗的药物,或作为食品或饲料补充剂中的应用。
12.如权利要求11所述的应用,其中所述β-二肽组合物由单个β-二肽或β-二肽的混合物构成。
13.如权利要求12所述的应用,其中所述β-二肽选自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-赖氨酸。
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AHMED SALLAM ET AL.: "Anaerobic and Aerobic degradation of cyanophycin by the denitritying bacterium pseudomonas alcaligenes strain DIP1 and role og three other coisolates in a mixed bacterial consortium", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
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