CN109475483A - 用于皮肤护理和化妆品用途的天冬氨酰二肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于皮肤和/或头发护理的化妆品组合物，其包含一个或多个β‑天冬氨酰二肽或其寡聚物或其盐，其中每个所述β‑天冬氨酰二肽包含一个作为第一氨基酸残基的β‑L‑天冬氨酰基团。本发明还涉及一种用于人体皮肤和/或头发护理的方法，包括利用该组合物进行抗衰老和/或抗脱发。

Description

用于皮肤护理和化妆品用途的天冬氨酰二肽

本发明提供了一种化妆品组合物，其包含一个或多个β-天冬氨酰二肽或其寡聚物或其盐，其中每个所述β-天冬氨酰二肽包含一个作为第一氨基酸残基的β-L-天冬氨酰部分。本发明还涉及一种利用该组合物护肤和/或头发护理的方法。

背景技术

通常情况下，氨基酸广泛地应用于化妆品中。其中，基于独立来源对大约8000种组分的评估，天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸及其盐/混合物被例如由德国“促进皮肤健康机构”发起、经认证的互联网门户“化妆品分析”认为能够滋养皮肤和/或调理头发。德国“个人卫生和洗衣剂行业协会”(IKW)的“化妆品-成分-功能”一览表中，也将这些氨基酸及其盐类分类为“皮肤护理”和“头发调理”。这种氨基酸盐/混合物被整合到例如日本公司资生堂的一些高质量的化妆品中。对精氨酸和天冬氨酸进行皮肤测试显示该组合的具有防止皮肤干燥和促进皮肤再生的保护作用(参见资生堂的专利EP-B-0506956和US 5,478,560)。然而这些氨基酸的混合物/盐的效用在化妆品的应用中会受到被皮肤细胞适度摄取的限制。正如德国汉高公司对他们的一些广为人知的产品所声称的那样，精氨酸还被认为作为单独的氨基酸能够为皮肤提供类似的效果，并有助于防止脱发。此外，WO2011/126163公开了含有二肽的皮肤美白的组合物。

发明内容

现在发现β-L-天冬氨酰二肽，特别是WO2009150252中已知的那些二肽确实具有高效的皮肤和头发护理的性能，并且因此代表了在化妆品领域应用其组成型氨基酸的新形式。并且由于其独特的不接受游离氨基酸或大于三肽分子的三肽/二肽转运，从而所述二肽不受已知的游离氨基酸其摄取受限的约束(Daniel et al.Physiology 21:93-102(2006))。因此，本发明提供：

(1)一种包含一个或多个β-二肽或其寡聚物或其盐的皮肤和/或头发护理的组合物，其中每个β-二肽包含作为第一氨基酸残基的β-L-天冬氨酰；

(2)一种美容方法，包括将(1)中定义的组合物局部施用于人或动物的皮肤和/或头发上；和

(3)上述(1)中定义的组合物用于活化、调理或抗衰老治疗人或动物的皮肤和/或头发的用途。

附图说明

图1总结了全身地(systemically)孵育48小时后MTT活力测定结果的说明。

图2总结了局部(topically)施用48小时后MTT活力测定结果的说明。

图3总结了全身地孵育120小时后MTT测定结果的说明。

图4总结了局部施用120小时后MTT测定结果的说明。

图5为曝露3天后增殖的基底角质细胞的示例性说明。单独拍摄图像(蓝色和红色荧光)，并且随后合并。蓝色荧光的细胞核(暗点)是使用DAPI进行了染色。红色荧光(亮点)代表有丝分裂S期增殖的细胞核(-Edu染色)。箭头：增殖的细胞，箭：DAPI染色的细胞核，而非增殖的细胞核。

图6为在施用β-L-天冬氨酰-L-精氨酸之前(A)和之后(B)拍摄眼角鱼尾纹区域(左眼)的图像。在施用β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸4周之前(C)和之后(D)拍摄眼角鱼尾纹区域(右眼)的图像。箭：使用PRIMOS系统选择的用于皮肤表面光学三维测量的皱纹。

发明详述

本发明方面(1)所述组合物的β-二肽或β-二肽寡聚物是通过选择性水解的方式从藻青素(也缩写为CGP，Cyanophycin Granule Peptide)或藻青素样聚合物衍生而来。

在自然界中，除了几种异养细菌外，大多数蓝藻种类(蓝绿藻类)累积多肽CGP作为碳和氮的储备原料。CGP在细菌的早期稳定生长期累积，并主要由两种氨基酸组成；天冬氨酸和精氨酸。根据环境/培养条件，一种或多种结构类似于精氨酸的氨基酸例如赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和刀豆氨酸，可以部分替代CGP的精氨酸组成。

与化学合成的二肽相比，CGP-二肽是以生物技术和环境友好的方式，从生物质制备的天然的和立体特异性(结构均一)的物质。此外，CGP二肽的生产需要更少的技术费用和精力、非常少的时间以及显著更少的财务费用。由于生产过程既不使用保护基团，也不使用有害的或对环境不安全的溶剂，因此一直保证了这些二肽的生物相容性(Sallametal.2009.AEM 75:29-38)。

此类通过降解/水解获得的CGP β-二肽组合物可以由单一类型的β-二肽、或不同β-二肽的混合物、或单一类型的β单二肽寡聚物、或不同β同二肽寡聚物的混合物、或此类β类二肽和β-二肽寡聚物的混合物组成。无论如何，这些β些二肽包含的氨基酸残基优先选自天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和存在于CGP或CGP样聚合物中的其他氨基酸残基。特别优选的是，该β-二肽选自β-L-天冬氨酰-L-精氨酸和β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸。

用于CGP降解的合适的CGPase是一种来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)的藻青素酶，特别优选来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)菌株DIP1。所述CGPase(i)具有45kDa的分子量、最适温度为50℃和最适pH范围为7-8.5，并且可将CGP降解为β-Asp-Arg；和/或(ii)是产碱假单胞菌(P.alcaligenes)DIP1 CGPaseCphE_al，其是已作为DSM 21533保藏在DSMZ中的一株能够表达所述CGPase的菌株，或者是能够将CGP或CGP样聚合物切割成二肽的所述CGPase的突变体、衍生物或其片段。

所述天然CGPase的突变体、衍生物或其片段包括片段(具有天然序列的至少50个连续氨基酸残基，优选N-和/或C-端截短产物，其中至多有50个末端氨基酸残基被除去)、衍生物(特别是与功能性蛋白质和肽例如分泌肽、前导序列等的融合产物，以及与化学基团如PEG、醇、胺等的反应产物)和突变体(特别是添加、取代、颠转和缺失的突变体，在氨基酸基础上与天然酶具有至少80％，较佳地至少90％，最佳地至少95％的序列同一性，或者添加、取代，颠转和/或缺失其中的1～20个，较佳地1～10个连续的或分离的氨基酸残基；对于取代突变体，保守取代是特别优选的)，然而，前提是所述修饰的CGPase具有天然CGPase的活性。

降解过程可以在CGP或CGP样聚合物制剂的制备步骤之前，即通过培养原核或真核细胞系进行。生产细胞系可以是能够制备CGP或CGP样聚合物的任何细胞系。较佳地，生产细胞系选自大肠杆菌(Escherichia coli)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)、贝氏不动杆菌(Acinetobacterbaylyi)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌株和植物生物质。更佳地，生产细胞系是富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16–PHB–4–Δeda(pBBR1MCS–2::cphA₆₃₀₈/edaH16)和大肠杆菌DH1(pMa/c5–914::cphA_PCC6803)。

上述过程可以进一步包括分离、纯化和/或化学修饰通过培养生产细胞系获得的CGP产物的步骤。这种分离、纯化、化学修饰和隔离可以通过本领域公知的方法来实现。

然而较佳地，将通过培养生产细胞系获得的CGP产物直接地(即不经过分离或纯化)用CGP酶进行降解。

或者，降解产物可以被纯化和/或化学修饰。同样地，这种纯化、分离或化学修饰可以通过本领域中公知的方法来实现。

本发明方面(1)所述组合物中，所述一种或多种β-二肽的每一种均包含作为第一氨基酸残基的β-L-天冬氨酰基，其与第二氨基酸残基共价结合。第二氨基酸残基可以选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和刀豆氨酸。较佳地，第二氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸。此外，第二氨基酸残基可以是L-或D-构型。因此，β-二肽可以具有式I

(β-L-aspartyl-R)，

并且二肽寡聚物可以具有式II

(β-L-aspartyl-R)_n，

其中R是独立地选自上文定义的氨基酸残基，并且n是2～150的整数，优选2～30，最优选2～10。

方面(1)所述的皮肤和/或头发护理组合物可以进一步包含两个或多个上述的共价结合在一起的β-二肽，并且其中每个二肽的第二氨基酸残基是独立选择的，较佳地选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和刀豆氨酸。最佳地，第二氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸。在另一个实施例中，一种或多种二肽是通过化学修饰的。这种化学修饰包括磷酸化、法尼基化、泛素化、糖基化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、类泛素化、生物素化、N-酰化、酯化和环化。在一个优选的实施例中，方面(1)所述组合物包含重量百分比0.00001-50％的β-二肽或其寡聚物，较佳地为重量百分比0.0001-10％，更佳地为重量百分比0.01-5％。方面(1)所述组合物可以进一步包含一种或多种游离氨基酸或其盐。这些游离氨基酸较佳地选自精氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。组合物中游离氨基酸的含量优选为重量百分比0.001-10％。

β-二肽的寡聚体包括同聚(即由一种β-二肽组成)和异聚(即由两种或多种不同的β-二肽组成)结构，其中β-二肽单元彼此共价连接。

上述β-二肽产物在几种条件下都是高度稳定的，并且适合与可接受的载体以及通常用于皮肤和/或头发护理组合物中的化合物混合使用。

加入本发明组合物的皮肤病学上(以及药理学上)可接受的载体可以是本领域常规用于皮肤和/或头发护理组合物中的任何载体。其实例包括水、低级醇、高级醇、多元醇、单糖、二糖、多糖、烃油、脂肪和油、蜡、脂肪酸、硅油、非离子表面活性剂、离子表面活性剂、有机硅表面活性剂、高分子化合物、以及上述载体的水基混合物和乳液混合物。

本发明的皮肤和/或头发护理组合物可以进一步包含化妆品和药物等中常用的各种组分，这类组分的实例包括维生素A，如维生素油、视黄醇和视黄醇乙酸酯；维生素B2，如核黄素、丁酸核黄素和黄素腺嘌呤二核苷酸；维生素B6，如盐酸吡哆醇和二辛酸吡哆醇；维生素C，如L-抗坏血酸、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸钠、L-抗坏血酸磷酸酯、DL-α-生育酚-L-抗坏血酸磷酸二酯二钾；泛酸，如泛酸钙，D-泛酸醇、泛酸乙酯(panthothenyl ethyl ether)和乙酰泛酸乙酯(acetylpanthotheyl ethyl ether)；维生素D，如麦角钙化醇和胆钙化醇；烟酸类，如烟酸、烟酸酰胺和烟酸苄酯；维生素E，如α-生育酚、生育酚乙酸酯、DL-α-生育酚烟酸酯和DL-α-生育酚肉桂酸酯；维生素类，如维生素P和生物素；油类，如鳄梨油、棕榈油、花生油、牛油、米糠油、荷荷巴油、月见草油、巴西棕榈蜡、羊毛脂、液体石蜡、角鲨烷、异硬脂酸棕榈酸酯、异硬脂醇和甘油三-2-乙基己酸酯；保湿剂，如甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、1,3-丁二醇、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素和葡聚糖硫酸钠；紫外线吸收剂，如对二甲氨基苯甲酸戊酯、甲氧基肉桂酸辛酯、4-叔丁基-4-甲氧基二苯甲酰基甲烷、二对甲氧基肉桂酸甘油酯单-2-乙基己酸酯、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸钠、尿刊酸和二异丙基肉桂酸乙酯；抗氧化剂，如异抗坏血酸钠和对羟基茴香醚；表面活性剂，如十八烷基硫酸钠、二乙醇胺十六烷基硫酸盐、十六烷基三甲基铵糖精、聚乙二醇异硬脂酸酯、聚氧乙烯辛基十二烷醇、脱水山梨糖醇单异硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、花生四烯酸甘油酯、二异硬脂酸二甘油酯和磷脂；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丁酯；消炎药如甘草酸衍生物、甘草次酸衍生物、水杨酸衍生物、日扁柏醇、氧化锌和尿囊素；美容美白剂，如胎盘提取物、谷胱甘肽和虎耳草提取物；黄柏、黄连、紫草、芍药根(plonyroot)、当药、桦树、鼠尾草、枇杷、胡萝卜、芦荟、锦葵、鸢尾、葡萄、薏苡仁、丝瓜、百合、藏红花、蛇床子、生姜、贯叶金丝桃、芒柄花、迷迭香和大蒜的提取物；活化剂，如蜂王浆、光敏原理、胆固醇衍生物和胎牛血液提取物；血液流动加速剂，如γ-谷维素；抗脂溢类药物，如硫磺和二甲硫蔥；增稠剂如羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素和羧羟丙基纤维素；香料；水；酒精；着色材料，如钛镍黄、红花黄和红花红；以及粉状树脂，如聚乙烯和尼龙。

本发明的皮肤和/或头发护理组合物的剂型不受限制。其实例包括溶解的制剂如水或油制剂、美容洗液、乳液如乳状乳液和乳霜、以及软膏、分散液和粉末。

以下描述了详细的皮肤和/或头发护理组合物及其成分，但决不仅限于此(其数量不是限于特别给定的那些，并且以重量％表示)：

化妆品液体：二肽成分(5.0)；生育酚乙酸酯(0.01)；甘油(4.0)；1,3-丁二醇(4.0)；乙醇(7.0)；聚氧乙烯(50mol)油醇醚(0.5)；对羟基苯甲酸甲酯(0.2)；柠檬酸(0.05)；柠檬酸钠(0.1)；香料(0.05)和纯净水(补足余量)。柠檬酸、柠檬酸钠、甘油，1,3-丁二醇和二肽成分被溶解在纯净水中。另外地，聚氧乙烯油醇醚、生育酚乙酸酯、香料和对羟基苯甲酸甲酯被溶解在乙醇中。将得到的溶液加入到纯化水溶液中进行溶解，并将混合溶液进行过滤，得到化妆品液体。

乳霜：(1)十六十八醇混合物(3.5)；(2)角鲨烷(40.0)；(3)蜂蜡(3.0)；(4)还原羊毛脂(5.0)；(5)对羟基苯甲酸乙酯(0.3)；(6)聚氧乙烯(20mol)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(2.0)；(7)单酸甘油酯硬脂酸酯(2.0)；(8)N-硬脂酰谷氨酸钠(0.5)；(9)2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(1.0)；(10)视网膜醋酸盐(2.0)；(11)月见草油(0.05)；(12)香料(0.03)；(13)二肽成分(0.01)；(14)1,3-丁二醇(5.0)；(15)聚乙二醇1500(5.0)和(16)纯净水(补足余量)。组分(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)和(12)彼此热溶，并且将该溶液加入到组分(13)、(14)、(15)和(16)中加热至75℃并搅拌。该混合溶液用均相混合器处理以减少乳化颗粒的大小，并在搅拌下迅速冷却，得到乳霜。

乳液：硬脂酸(1.5)；十六醇(0.5)；蜂蜡(2.0)；聚乙二醇(10摩尔)单油酸酯(1.0)；甲氧基肉桂酸辛酯(2.0)；L-抗坏血酸镁磷酸盐(0.2)；二肽组分(1.0)；透明质酸钠(0.1)；三乙醇胺(0.75)；甘油(7.0)；乙醇(3.0)；对羟基苯甲酸乙酯(0.3)；香料(0.03)和纯净水(补足余量)。香料被加入到乙醇中，以溶解香料(醇相)。甘油、三乙醇胺、透明质酸钠、DL-α-生育酚-L-抗坏血酸磷酸二酯二钾和二肽加入并溶解在纯净水中，将该溶液保持在70℃(水相)。其他组分要相互混合和热溶解，然后将该溶液保持在70℃(油相)。将油相添加到水相中进行预乳化，混合溶液通过均相混合器进行均匀乳化。将乳液边搅拌边加入到醇相中，在搅拌下将混合物冷却至30℃以得到乳化的溶液。

泡沫：(1)二肽组分(0.5)；(2)1,3-丁二醇(5.0)；(3)甘油(7.0)；对羟基苯甲酸甲酯(0.1)；(5)氢氧化钾(0.15)；(6)硬脂酸(0.5)；(7)肉豆蔻酸(1.0)；(8)鲨肝醇(1.5)；(9)聚氧乙烯(60mol)-氢化蓖麻油(3.0)；(10)香料(0.05)；(11)液化石油气(6.0)；(12)二甲醚(3.0)和(13)纯化水(补足余量)。加入组分(1)、(2)、(3)、(4)和(5)并通过加热到70℃溶解于组分(13)中，并且通过加热到75℃以使组分(6)、(7)、(8)、(9)和(10)彼此溶解制备得到的溶液加至前述溶液中。将混合溶液充分搅拌然后冷却，然后将混合溶液装入容器中，最后将组分(11)和(12)装入容器中，制成泡沫面膜。

软膏：二肽组分(0.5)；生育酚乙酸酯(1.0)；视黄醇棕榈酸酯(0.5)；硬脂醇(18.0)；日本蜡(20.0)；聚氧乙烯(20mol)单油酸酯(0.25)；甘油单硬脂酸酯(0.3)；凡士林(40.0)以及纯净水(补足余量)。将二肽组分加入纯净水中，溶液保持在70℃(水相)。将剩余的组分在70℃下混合并相互溶解(油相)。将该油相加入水相中，混合溶液通过均相混合器均匀乳化，然后冷却，得到软膏。

本发明的方面(2)涉及一种美容方法，其包含将如前述方面(1)所定义的皮肤和/或头发护理组合物局部施用在人或动物的皮肤和/或头发上。在一个优选实施例中，该方法用于人体皮肤的活化或抗衰老治疗，或者是用于人或动物毛发的活化、调理或防脱发。虽然本发明的皮肤组合物的施用量没有特别限制，但是优选美容洗涤每天施用该组合物两次，每次使用1.5至2毫升，乳液每次使用1至1.5毫升，乳霜每次使用约0.2克。

本发明的方面(3)涉及如上所定义的方面(1)的皮肤和/或头发护理组合物用于人类或动物皮肤活化或抗衰老处理，和/或用于人或动物毛发的活化、调理或防脱落的用途。对于方面(3)的优选实施例，方面(2)的那些是同样适用的。

所述DIP1CGPase CphE_a1由位于德国蒙斯特柯灵斯街道3号的 Münster大学(邮编48149)保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，地址为德国布伦瑞克市英豪丰大街7B(邮编38124)，保藏编号为DSM 21533。

本发明将在以下实施例中进一步进行描述，这些实施例不应被解释为对本发明进行限制。

具体实施方式

材料和方法(体外研究；实施例1和2)：

二肽组合物的制备：在CGPase催化的CGP最终分解成二肽之前，CGP和胞外CGPase酶通过单独的发酵制备。在500L发酵体系中，使用富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)的重组菌株H16–PHB–4–Δeda(pBBR1MCS–2::cphA₆₃₀₈/edaH16)制备CGP，而CGPase是利用产碱假单胞菌(P.alcaligenes)菌株DIP1CphE_al制备，其已作为DSM 21533保藏在DSMZ。然后从制备的生物质中提取CGP并进行纯化。从培养物的上清液中纯化出CGPase。然后将制备的CGP和CGPase在特定条件下合并，在这一条件下将生物聚合物分解成其β-二肽成分。然后将β-L-天冬氨酰-L-精氨酸和β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸二肽从反应的其余部分分离出来，通过HPLC分析其纯度，并最终干燥成粉末(WO2009150252 and Sallamet al.,AEM 75:29-38(2009))。将纯的β-二肽使用中下述实验中。

测试产物的实验性应用：在该研究中，使用校准的移液管，按以下方法施用30μl5％测试物质的水溶液：

活力/生存力测试(实施例1)：局部地以及全身地每天施用一次(见表1)，用无菌水(阴性)和X-100(阳性)作为对照，并分析48小时和120小时的时间点。

基础角质形成细胞的增殖测试(实施例2)：局部施用暴露于空气的模型作为参考，并分析3天和6天后增殖速率的时间点。

应用在所有时间点重复进行(2个模型)，并在相同条件下平行培养和分析模型。

表皮的3D-表皮皮肤模型：如今的体外测试程序是动物实验的一个非常好的替代品，并且在化妆品行业变得越来越重要。对于长期使用的化妆品而言，无害的皮肤检测是高度应用安全和顾客满意度的必要先决条件。在新化妆品的开发过程中，特定活性成分或完整配方的生物效应成为化妆品关注的焦点。人类表皮皮肤模型是一个体外重建的多层上皮组织，其由正常的人角质形成细胞培养而成。与天然人体皮肤外植体相比，该模型显示出天然人体皮肤所有典型的皮肤层(基底层、棘层、颗粒层和角质层)。该模型具有有丝分裂和代谢活性，并且表达典型的分化标记，如前丝聚蛋白原(pro-fillagrin)1和细胞角蛋白(cytokeratin)1/10。此外，该模型显示了许多人类皮肤屏障的特征，因此非常适合于化妆品应用研究和体外分析(P.Haydenet al.,GTAM2011,Newark,USA(2011))。使用的3D表皮皮肤模型购自美国阿什兰的MatTek公司，并且遵循制造商的说明，在37℃，95％H₂O和5％CO₂的最佳条件下进行培养。

体外表皮活力/生存能力检测的MTT测定(实施例1)：生存能力被视为综合生活能力。这个术语概括了细胞满足其基本生长和增殖需求的所有代谢活动。MTT活力测定是一种检测细胞和组织活力的既定方法。3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物，简称为MTT，是一种黄色的水溶性盐，通过一种四氮唑环的化学还原，其在细胞内会变成紫蓝色的甲臜(T.Welsset al.,Toxicol.In VitroJ.18(3):231-43(2004)；M.V.Berridgeet al.,Biochemica 4:14-19(1996))。甲臜晶体沉淀到细胞胞质溶胶中，其中沉淀的量与一般细胞活力的定量相关。因此，MTT测定可以被认为是一个组织的活力或“健康”的指标，因为细胞过程如呼吸和能量提取会导致MTT的减少。

该实验的目的是检验测试物质活化组织的潜力。为此使用3D-表皮皮肤模型。被使用的皮肤模型在含有1mg/ml MTT溶液的测定培养基(MatTek)中于37℃，95％H₂O，5％CO₂条件下在黑暗中孵育3小时。孵育期后，用无菌擦拭物擦拭模型罐的底部，以去除过量的培养基/MTT混合物。将模型转移至新的无菌24孔板，随后加入2ml异丙基。为避免蒸发，用封口膜密封板，用锡箔覆盖，并在摇床中孵育2小时以提取甲臜晶体。在570nm处确定所有提取物释放晶体的光密度。分析和评估测量值。阴性对照(水)的OD₅₇₀必须最小为0.8。除了低于0.3的样品外，相同处理的样品的变异系数(CV)必须<30％。该活力来自于测定OD的平均值，其中经过水处理的最佳培养对照设定为100％活力[活力：100*(OD_测试物质/OD_对照)]。

表1：研究设计和实施

基础角质形成细胞增殖率的评估(实施例2)：人类皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成。表皮位于乳头状真皮上，并通过与细胞外基质蛋白一致的基底层固定，其被称为真皮-表皮连接区(F.Chehrehasaet al.,J.Neu Meth.177：122-130(2009)；A.Tuschilet al.,J.Invest.Dermatol.99：294-298(1992))。表皮具有恒定生长细胞的基底细胞层(基底角质形成细胞)。这些细胞专门用于表皮再生和组织稳态的保持。然而，新生细胞出现有丝分裂的过程并迁移到基底上层(棘层)，在此他们失去了增殖能力并且开始分化。在该过程结束时来自颗粒层的高度分化细胞角化、死亡以及构成角质层。基底层内角质形成细胞的发源补偿了从角质层脱落的细胞的损失。这会导致表皮细胞持续和均匀地更新，并维持表皮稳态的维定(H.J.Stark et al.,J.Inv.Derm.11:93-105(2006)；H.A.Rennekampffet al.,J.Surg.l Res.93:41-54(2000))。

EdU(细胞增殖测定)：使用-EdU测定(Life Technologies)特异性标记生长和增殖的基础角质形成细胞(F.Chehrehasaet al.,J.Neu Meth.177:122-130(2009))。5-乙烯基-2'-脱氧尿苷(EdU)是胸苷碱类似物，其末端甲基被替换成一个乙炔基。该乙炔基团与荧光活性叠氮化物反应，能够对在(S期)有丝分裂合成阶段内复制的DNS进行可视化分子检测。

增殖率的评估：每个使用过的皮肤模型采用6毫米打孔活检，包埋在O.C.T.^TM中，在液氮气相中冷冻保存，然后切成5-6微米的切片。对来自各部分的细胞核进行计数(蓝色荧光，DAPI)并测定增殖的细胞核的百分比(红色荧光)。

荧光显微镜检测： -EdU标记的细胞用红色进行染色(λex594nm)。用DAPI(λex358nm)将组织的整个细胞核复染成蓝色。-EdU和DAPI染色的细胞被单独记录下来，随后合并。用蔡司Axio Scope A1HAL 100进行荧光分析和记录。

表2：研究设计和实施

材料和方法(体内试验；实施例3)：

二肽组合物的制备：根据上述体外试验所述的过程制备和分析两种二肽。

小组成员：测试小组包括5名皮肤干燥、弹性低于平均水平、眼睛旁边有鱼尾纹的成年女性志愿者。在施用测试开始时，所有受试者均经过皮肤科医生检查。只有未诊断出病理性皮肤改变的受试者才能被允许参加试验。在施用测试期间，所有受试者都可以从陪同测试的主治医学专家处获得日常咨询，以防急性的皮肤刺激。通过随行测试的医生，每天都可以咨询皮肤状况。

测试产品的实验性施用：测试区域直径约3厘米。将测试产品施用于前臂掌侧(5％和10％水溶液；皮肤弹性和水合试验)以及鱼尾纹处(5％水溶液)。在整个测试期间(4周)每天两次施用该制剂。受试者已被指示不在该测试区域使用其他护理产品。未经处理的皮肤区域用作为对照。

弹力测试：用测力计MPA 580 Fa.Courage+Khazaka electronics GmbH进行测试。测量原理基于吸收/延伸原理。为了获得启动状态，该仪器被调整为450毫巴的低压。吸收时间定义为5秒。该弛缓时间(突然失去低压)固定为3秒。每个测试和对照部分的所有测量重复三次。之后从每个部分的三个独立的测量中计算获得的R2值的平均值。为了进行测量，在测试开始前调整该仪器的命名参数。文献中提及的主要使用和依赖的所有参数调整均在测量期间保持不变。在施用期间的开始和结束时进行测量。测量并分了每个受试者的R2值。

皮肤滋润度：这个方面是使用皮肤水分测试仪CM 825(Firma Courage+Khazaka)进行检测的。在施用期间，将测试产品每天两次施用于相关的预定皮肤区域上。每次测量前，测试人员在22摄氏度的温度和60％相对湿度适应45分钟，然后，在相应测试区域内的三个不同位置检测皮肤测量值。将记录的数值取平均值。使用接近测试区域的未处理皮肤作为对照测量区域。在施用之前和施用四周后进行测量。所有测量在最后一次施用以前用过的产品以及测试产品的至少10-12小时后进行。

单一皱纹深度：使用PRIMOS(Phaseshift Rapid In vivo Measurement Of Skin)紧凑便携式系统进行光学三维测量。PRIMOS紧凑便携式系统应用于40×30mm区域，并制作测量区域的数码照片。应用横向分辨率63μm和深度分辨率≥4μm来测量3D图像(测量精度≥5μm)。为x和y轴选择特定的密度点，用计算机程序在彩色屏幕上绘制一个逼真的皮肤浮雕的三维图像。最后，处理生成的测量数据然后评估。该分析包括以下阶段：1.参考区域和待比较的皮肤表面的匹配步骤。2.几何数据如深度、距离或半径的测量。利用PRIMOS软件，表皮结构的变化可以借助于各种符合DIN(Deutsche lndustrie Norm，德国工业标准)和ISO(国际标准组织)的标准化表面测量参数进行定量分类。参照相关的DIN标准进行计算，并根据多项式的需要移除长波轮廓单元。这里使用的切割视图的轮廓是为了提供单条皱纹的深度。可以通过确定距离来测量皮褶深度。

实施例1：体外表皮的活力/生存能力。

如图1所示，与水处理的模型相比，所有使用的测试物质在孵育48小时后会导致活力增加。阳性对照，1％X-100，如预期的那样将细胞活力降低至50％以下(7.12％)。观测到β-L-天冬氨酰-L-精氨酸全身地孵育48小时后的最高值(127.23％)。

测试物质的局部施用也导致了组织活力的增加(如图2)，但没有全身施用那么明显。这很可能是由于全身施用测试产品的生物利用度更高，因为他们不必通过皮肤屏障。对于物质β-L-天冬氨酰-L-精氨酸再次观察到最高值(112.36％)。

在全身孵育120小时后，观察到与48小时相比略低的值(见图3)。对于测试物质β-L-天冬氨酰-L-精氨酸再次观察到最高值(118.16％)。

在局部施用120小时后观察到比48小时的结果更高的值(见图4)。由于孵育时间较长，足够浓度的测试物质似乎到达更深的细胞层并可作用于细胞。在此，对于测试二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸，也观察到最高值(120.61％)。

目前的活力测试表明，被使用的3D-表皮皮肤模型非常好地耐受被测的物质。无论使用何种模型，48小时和120小时后每种物质都表现出对皮肤细胞的活化作用。通过全身施用时，短期施用(48小时)显示略高的活力效率，而长期孵育(120小时)，局部施用模型具有更高的活力效率。用二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸始终观察到最高值。

实施例2：基础角质形成细胞的体外增殖。

比较暴露于空气的皮肤模型与物质处理的皮肤模型就表皮基底角质形成细胞的增殖率。模型在分别孵育后被冷冻保存、组织学制备并进行特异性染色(例如，在3天后的图5)。为了评估增殖率，计数基底角质形成细胞并确定红色荧光(增殖)和蓝色荧光(非增殖)之间的关系(参见图5)。每种测试物质和每个暴露于空气的模型至少计算1500个细胞核，计算两次。该计数结果总结在表3和4中。

表3：孵育3天后对增殖细胞的总结计数

测试物质	细胞核计数	增殖型	百分比
				暴露于空气	2176	244	11.21
β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸	2591	423	16.33
				β-L-天冬氨酰-L-精氨酸	1785	553	30.98

孵育3天后，发现与暴露于空气的模型(11.21％)相比，二肽β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸(16.33％)增加了基底角质形成细胞的增殖活性，而在用二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸处理的模型中比例最高，为30.98％。

表4：孵育6天后对增殖细胞的总结计数

测试物质	细胞核计数	增殖型	百分比
				暴露于空气	1876	321	17.11
β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸	2133	472	22.12
				β-L-天冬氨酰-L-精氨酸	2047	656	32.05

6天后，二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸显示出最高增殖的增加的测定值，其证实了获得的3天后的结果。

目前的研究表明，使用的3D-表皮皮肤模型对测试物质的耐受性非常好。未观察到对组织活力或组织形态的负面影响。

每个物质对3D-皮肤模型的基底角质形成细胞的增殖具有刺激作用，其中二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸的作用最为突出。

实施例3：皮肤耐受性、弹性、水合作用和单一皱纹深度的体内试验。

耐受性：在皮肤病学和临床标准下，在为期四周的施用试验过程中，所有5名研究参与者对测试产品和所有测试浓度都能很好地耐受。在测试区域没有不希望的或病理性的皮肤反应。

皮肤弹性：β-L-天冬氨酰-L-精氨酸：在前臂掌侧的处理区域，测量5％水溶液对皮肤弹性改善率约9.11％，10％水溶液对皮肤弹性改善率约8.70％。产品施用4周后，在对照区域扣除后，前臂皮肤弹性的平均改善率为9.26％(5％水溶液)和8.85％(10％水溶液)，并且鱼尾纹区域改善率为8.08％(5％水溶液)。

β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸(5％)：在前臂掌侧的处理区域，测量到皮肤弹性改善率约6.03％。在鱼尾纹(左眼)处理区域中的平均改善率为11.06％。未经处理的对照区域的皮肤弹性的平均变化为-0.15％。在产品施用4周后，在对照区域扣除后，前臂皮肤弹性的平均改善率为6.18％，并且鱼尾纹区域的改善率为11.21％。

皮肤水合作用：β-L-天冬氨酰-L-精氨酸：在前臂掌侧的处理区域，测量到皮肤水分改善率约1.126％(5％水溶液)和0.871％(10％水溶液)。在鱼尾纹(靠近眼睛)处理区域中，测量到皮肤水分改善率约1.873％。未处理对照区域的皮肤水分平均变化为0.31％。产品施用4周后皮肤水分的平均改善率在前臂掌侧为0.82％和0.56％，在鱼尾纹处为1.56％(在对照区域扣除后)。

β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸(5％)：在前臂掌侧的处理区域，测量到皮肤水分改善率约2.05％。在鱼尾纹(眼睛旁边)处理区域，测量到皮肤水分改善率约16.10％。未处理对照区域的皮肤水分平均变化为0.31％。产品施用4周后皮肤水分的平均改善率在前臂掌侧为1.74％，在眼睛旁边为15.79％(对照区域扣除后)。

单一皱纹深度：在使用制剂四周之前和之后，对5名受试者测量单条皱纹的皱纹深度，以确定制剂5％的测试产品水溶液的效果。使用皮肤表面的扩展光学3D检测仪来测量皮肤皱纹。在处理区域，β-L-天冬氨酰-L-精氨酸的皱纹深度平均改善率为16.4％，β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸的为20.02％(见图6)。

PCT

由受理局填写

由国际局填写

Claims (15)

1.一种包含一个或多个β-二肽或其寡聚物或其盐的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，每个所述β-二肽包含一个作为第一氨基酸残基的β-L-天冬氨酰。

2.如权利要求1所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，所述第二氨基酸残基选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和刀豆氨酸。

3.如权利要求1所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，

(i)所述第二氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸；和/或

(ii)所述第二氨基酸残基具有L-或D-构型。

4.如权利要求1所述的皮肤和/或头发护理组合物，其包含所述二肽β-L-天冬氨酰-L-精氨酸和/或β-L-天冬氨酰-L-赖氨酸。

5.如权利要求1～4任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，

(i)所述寡聚物包含两个或更多个共价结合的β-二肽，和/或

(ii)一个或多个所述β-二肽是经化学修饰的。

6.如权利要求1～5任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，其包含0.00001至50重量％的β-二肽或其寡聚物，更优选0.0001至10重量％的所述二肽，并且最优从0.01至5重量％的所述二肽。

7.如权利要求1～6任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，其进一步包含一个或多个游离氨基酸或其盐。

8.如权利要求7所述的皮肤和/或头发护理组合物，其特征在于，

(i)所述游离氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，和/或

(ii)所述组合物包含0.001至10重量％的游离氨基酸。

9.如权利要求1～8任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其进一步包含通常用于皮肤和/或头发护理组合物中的选自维生素、脂肪酸、矿物质或微量元素的支持性组分，其包括维生素A、C、D、E、B5、B6、B7、B12、叶酸、ω-3、硒、锌、镁和铁。

10.如权利要求1～9任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其进一步包含皮肤和/或头发护理上可接受的载体，包括水、低级醇、高级醇、多元醇、单糖、二糖、多糖、烃油、脂肪和油、蜡、脂肪酸、硅油、非离子表面活性剂、离子表面活性剂、有机硅表面活性剂、高分子化合物、以及上述载体的水基混合物和乳液混合物、以及常规用于皮肤和/或头发护理组合物中的组分。

11.如权利要求1～10任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其是一种外部/局部适用的皮肤和/或头发护理组合物，包括化妆水、乳霜、乳液、泡沫面膜和软膏。

12.如权利要求1～11任一项所述的皮肤和/或头发护理组合物，其是一种皮肤活化、保湿、抗衰老、皮肤调理、头发调理或刺激头发生长的组合物。

13.一种美容方法，其包括向人或动物的皮肤或头发局部施用如权利要求1～11任一项所定义的组合物。

14.如权利要求13所述的方法，其用于活化、保湿、抗衰老、皮肤调理、头发调理或刺激头发生长的组合物。

15.如权利要求1～11任一项所述的组合物用于活化、保湿、抗衰老、调理皮肤、调理头发或刺激头发生长组合物的用途。