JP2016028024A - シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 - Google Patents
シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016028024A JP2016028024A JP2015145684A JP2015145684A JP2016028024A JP 2016028024 A JP2016028024 A JP 2016028024A JP 2015145684 A JP2015145684 A JP 2015145684A JP 2015145684 A JP2015145684 A JP 2015145684A JP 2016028024 A JP2016028024 A JP 2016028024A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cgp
- arginine
- cphe
- dipeptide
- degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- QCGCETFHYOEVAI-GDVGLLTNSA-N (2s)-2-[(3-amino-3-carboxypropanoyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N QCGCETFHYOEVAI-GDVGLLTNSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 229920000976 cyanophycin polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 42
- 108010031546 cyanophycin Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 title 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 124
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 118
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 118
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 53
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 39
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims abstract description 21
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 claims abstract description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 5
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims abstract description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 3
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 49
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 9
- QCGCETFHYOEVAI-WDSKDSINSA-N beta-Asp-Arg Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N QCGCETFHYOEVAI-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 60
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 120
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 101
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 100
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 69
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 69
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 54
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 49
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 46
- 101000897488 Homo sapiens Cyclin-D1-binding protein 1 Proteins 0.000 description 41
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 35
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 34
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 29
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 29
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 25
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 22
- 102100021934 Cyclin-D1-binding protein 1 Human genes 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 21
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 17
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 15
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 15
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 15
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 15
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 14
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 13
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 13
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 13
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 13
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 13
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 12
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 12
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 12
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 101150046260 cphA gene Proteins 0.000 description 11
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 10
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 10
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 10
- SUUWYOYAXFUOLX-ZBRNBAAYSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N SUUWYOYAXFUOLX-ZBRNBAAYSA-N 0.000 description 9
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 8
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 7
- 241000168225 Pseudomonas alcaligenes Species 0.000 description 7
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 description 6
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229960002223 arginine aspartate Drugs 0.000 description 6
- 244000309464 bull Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 238000012552 review Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 5
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 5
- 101000875256 Pseudomonas anguilliseptica Cyanophycinase Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 108091006594 SLC15A1 Proteins 0.000 description 5
- 102100021491 Solute carrier family 15 member 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 5
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 5
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 5
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 5
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol;(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 208000010228 Erectile Dysfunction Diseases 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 4
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 4
- 201000001880 Sexual dysfunction Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- -1 agriculture Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 4
- 239000007474 bm medium Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 108010028052 cyanophycinase Proteins 0.000 description 4
- ZOOGRGPOEVQQDX-KHLHZJAASA-N cyclic guanosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)O[P@](O)(=O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-KHLHZJAASA-N 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 4
- 238000011903 nutritional therapy Methods 0.000 description 4
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 4
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 231100000872 sexual dysfunction Toxicity 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 3
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000037007 arousal Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000018052 penile erection Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 3
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N sildenafil Chemical compound CCCC1=NN(C)C(C(N2)=O)=C1N=C2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(C)CC1 BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 235000021476 total parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 101710192124 Cyanophycin synthetase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 101710158368 Extracellular lipase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 208000005615 Interstitial Cystitis Diseases 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 208000006262 Psychological Sexual Dysfunctions Diseases 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 108091006593 SLC15A2 Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100021488 Solute carrier family 15 member 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710128940 Triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920002770 condensed tannin Polymers 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 210000005226 corpus cavernosum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000009986 erectile function Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 2
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 2
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 235000018192 pine bark supplement Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 description 2
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 2
- 239000009235 prelox Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 229940106796 pycnogenol Drugs 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- DEIYFTQMQPDXOT-UHFFFAOYSA-N sildenafil citrate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.CCCC1=NN(C)C(C(N2)=O)=C1N=C2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(C)CC1 DEIYFTQMQPDXOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011172 small scale experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZQVAUJTDKQGE-UHFFFAOYSA-N 2-ethylhydracrylic acid Chemical compound CCC(CO)C(O)=O ZMZQVAUJTDKQGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyisovaleric acid Chemical compound CC(C)(O)CC(O)=O AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010073370 Adenoid cystic carcinoma of salivary gland Diseases 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100033367 Appetite-regulating hormone Human genes 0.000 description 1
- 101710111255 Appetite-regulating hormone Proteins 0.000 description 1
- 101100388296 Arabidopsis thaliana DTX51 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014885 Arginine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 1
- SDHFVYLZFBDSQT-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N SDHFVYLZFBDSQT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 241001661600 Bacillus idriensis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010054473 Bacteria oligopeptide permease Proteins 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 description 1
- 241000534616 Brevibacillus reuszeri Species 0.000 description 1
- 241000458359 Brevibacillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 206010007733 Catabolic state Diseases 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710112287 DNA-directed RNA polymerases I and III subunit RPAC2 Proteins 0.000 description 1
- 108010010256 Dietary Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015781 Dietary Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061435 Enalapril Proteins 0.000 description 1
- 108091034120 Epstein–Barr virus-encoded small RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000956293 Fulda Species 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010073791 Glycine amidinotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000798222 Homo sapiens Antizyme inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000998969 Homo sapiens Inositol-3-phosphate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010021519 Impaired healing Diseases 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100036881 Inositol-3-phosphate synthase 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 1
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 241000408529 Libra Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000779599 Malpighia Species 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- FQWRAVYMZULPNK-BYPYZUCNSA-N N(5)-[(hydroxyamino)(imino)methyl]-L-ornithine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(=N)NO FQWRAVYMZULPNK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OTCCIMWXFLJLIA-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-DL-aspartic acid Natural products CC(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O OTCCIMWXFLJLIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTCCIMWXFLJLIA-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-aspartic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OTCCIMWXFLJLIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HLKXYZVTANABHZ-REOHCLBHSA-N N-carbamoyl-L-aspartic acid Chemical compound NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O HLKXYZVTANABHZ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HLKXYZVTANABHZ-UHFFFAOYSA-N N-carbamoylaspartic acid Chemical compound NC(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O HLKXYZVTANABHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100022397 Nitric oxide synthase, brain Human genes 0.000 description 1
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 1
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241001426341 Polydactylus virginicus Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 1
- 101710183183 Probable DNA-directed RNA polymerases I and III subunit RPAC2 Proteins 0.000 description 1
- 102100036134 Probable arginine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100034616 Protein POLR1D, isoform 2 Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 108091006167 SLC15 Proteins 0.000 description 1
- 101100215626 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027520 Somatoform disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046461 Urethral pain Diseases 0.000 description 1
- 208000025609 Urogenital disease Diseases 0.000 description 1
- 206010069055 Vulvovaginal pain Diseases 0.000 description 1
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 1
- 101000998548 Yersinia ruckeri Alkaline proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- IXUZXIMQZIMPSQ-ZBRNBAAYSA-N [(4s)-4-amino-4-carboxybutyl]azanium;(2s)-2-amino-4-hydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC[NH3+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXUZXIMQZIMPSQ-ZBRNBAAYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000005550 amino acid supplement Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000489 anti-atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000008321 arterial blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 150000001509 aspartic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000037147 athletic performance Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003222 cGMP degradation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical class OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003029 clitoris Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N enalapril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 229960000873 enalapril Drugs 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007368 endocrine function Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000066 endothelium dependent relaxing factor Substances 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012632 extractable Substances 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001752 female genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000005176 gastrointestinal motility Effects 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000260 hypercholesteremic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000544 hyperemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000000260 male genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000010339 medical test Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 206010062198 microangiopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 208000027753 pain disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007111 proteostasis Effects 0.000 description 1
- 230000004088 pulmonary circulation Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 201000007416 salivary gland adenoid cystic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035946 sexual desire Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 229960003310 sildenafil Drugs 0.000 description 1
- 229960002639 sildenafil citrate Drugs 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000037322 slow-wave sleep Effects 0.000 description 1
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 231100000527 sperm abnormality Toxicity 0.000 description 1
- 231100000469 sperm hypomotility Toxicity 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 230000008320 venous blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 229940094720 viagra Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/05—Dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/30—Dietetic or nutritional methods, e.g. for losing weight
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/15—Peptidyl-dipeptidases (3.4.15)
- C12Y304/15006—Cyanophycinase (3.4.15.6)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Description
seを用いたポリマー調製品の分解によるジペプチド組成物の酵素的製造方法、本方法に
特に適合したCGPase、およびシアノフィシン(CGP)もしくはCGP様ポリマー
またはそれらの断片、とりわけ、上に定義された方法により得られるジペプチド組成物の
、医薬組成物、医薬品または食品もしくは代用食品としての使用に関する。
ルタミン酸)(γ−PGA)およびシアノフィシン(CGP)が天然に存在することが公
知である。ポリ(アミノ酸)は、さまざまな環境に存在し、生物の生産においてさまざま
な機能を果たしている(Obst,M.ら、Biomacromolecules 5:
1166〜1176(2004年))。例えば、シアノフィシン顆粒ポリペプチド(CG
P)として公知であり、100年以上前にシアノバクテリアにおいて発見された(Bor
zi,A.、Malpighia 1:28〜74(1887年))シアノフィシン(マ
ルチ−L−アルギニル−ポリ−[L−アスパラギン酸])は、生物に窒素、炭素およびエ
ネルギーを提供する。シアノフィシンは、個々のビルディングブロックに5個の窒素原子
を含有し、その結果理想的な細胞内窒素貯蔵となっている(Mackerras,A.H
.ら、J.Gen.Microbiol.136:2057〜2065(1990年))
。ポリ(アミノ酸)の生体適合性および完全な生分解性は、生体臨床医学、農業、農芸化
学、パーソナルケアおよび薬学の分野において人生のさまざまな利用にとって理想的な候
補にする(Obst,M.ら、Biomacromolecules 5:1166〜1
176(2004年))。
の栄養源として奨励されてきた(Kihlberg,R.、A.Rev.Microbi
ol.26:427〜466(1972年))。CGPそれ自体は、シアノバクテリアに
おいて1887年に発見された。シアノバクテリアの大部分の属は、機能性のシアノフィ
シン合成酵素遺伝子(cphA)を有し、CGPを合成する(Mackerras,A.
H.ら、J.Gen.Microbiol.136:2057〜2065(1990年)
)。CphAをコードする遺伝子は、従属栄養細菌においても同定されている(Kreh
enbrink,M.ら、Arch.Microbiol.177:371〜380(2
002年);Fuser,G.ら、Macromol.Biosci.7:278〜29
6(2007年))。分岐ポリマーは、細胞質において、膜のない不溶性細胞内顆粒とし
て存在する(Allen,M.M.ら、J.Bacteriol.154:1480〜1
484(1983年))。分岐ポリマーは、個々のアスパラギン酸のβ−カルボキシル基
に、そのα−アミノ基により連結したアルギニン部分を有する、ポリ(アスパラギン酸)
(PAA)骨格の形態で配列された、当モル量のアルギニンおよびアスパラギン酸からな
る(Simon,R.D.ら、Biochim.Biophys.Acta 420:1
65〜176(1976年))。大規模製造のために、シアノバクテリアのcphA遺伝
子は、大腸菌(Escherichia coil)、コリネバクテリウム・グルタミク
ム(Corynebacterium glutamicum)、ラルストニア・ユート
ロファ(Ralstonia eutropha)およびシュードモナス・プチダ(Ps
eudomonas putida)に、異種的にクローニングされた。組換え細菌由来
のCGPは少量のリシンを含有する(Voss、I.ら、Metabol.Eng.8:
66〜78(2006年))。CGPはさまざまな自然の生息環境に広範囲に広がってお
り、細胞内または細胞外のCGPase(それぞれ、CphB、CphE)により分解さ
れる。CphEを保有する細菌は、さまざまな生息環境において発見され、CphEPa
およびCphEBmがそれぞれ、シュードモナス・アンギリセプチカ(P.angull
iseptica)BIおよび巨大菌(B.megaterium)BAC19から単離
され、特徴付けられた(Obst,M.ら、J.Biol.Chem.277:2509
6〜25105(2002年);Obst,M.ら、Biomacromolecule
s 5:153〜161(2004年))。CGPの分解は、偏性嫌気性菌または通性嫌
気性菌、例えばそれぞれ、セディメンチバクター・ホンコンエンシス(Sediment
ibacter hongkongensis)KIまたはシュードモナス・アルカリジ
ェネス(P.alcaligenes)DIP1により、嫌気性の生息環境においても起
こる(Obst,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:36
42〜3652(2005年);Sallam,A.ら、公開用に提出(2008年))
。公知のすべてのCGPaseは、CGP由来の水溶性β−ジペプチドを産生し、これら
はその後細胞に輸送され、さらに分解される(Sallam,A.ら、公開用に提出(2
008))。
、食物タンパク質の大部分は第1胃の細菌叢により、アミノ酸およびペプチドに分解され
る。アミノ酸は、微生物タンパク質に組み込まれるか、または消化管の次の部分へ通過す
るか、または胃壁を通過し直接血液に吸収されるかである(Faix,S.ら、Acta
Vet.Brno.70:243〜246(2001年))。しかし、トリペプチドお
よびジペプチドは、遊離のアミノ酸より効率的に利用され、より優れた栄養価を有し、よ
り多く吸収され(遊離のアミノ酸より最大185%)(Adibi,S.A.、J.Cl
in.Invest.50:2266〜2275(1971年))、体重増加の強化に寄
与する完全なタンパク質より多くの窒素を保有する(Dock,D.B.ら、Bioce
ll 28:143〜150(2004年))。特定のアミノ酸の輸送に遺伝的な損傷を
有する患者における吸収の研究により、ジペプチドとして投与した場合、これらのアミノ
酸の正常な吸収が示された。このことは、ジペプチドに関する特殊化された、有効な輸送
系の存在を示した(Adibi,S.A.、Gastroenterology 113
:332〜340(1997年))。したがって、加水分解タンパク質食は、飼料添加物
として頻繁に適用され、栄養失調の症例を回復させる(Dock,D.B.ら、Bioc
ell 28:143〜150(2004年))。
し、したがって多くの心臓血管、泌尿生殖器、胃腸または免疫の障害のための治療計画に
適用される(総説には、(Appleton,J.、Altern.Med.Rev.7
:512〜522(2002年)を参照されたい)。必須アミノ酸のリシンは人および動
物の食品添加物として公知であり、単純ヘルペスウィルスに対する抗ウィルス活性を有し
、小腸におけるカルシウムの吸収を改善し、したがって骨粗しょう症に対して作用する(
Cynober,L.A.、Metabolic and therapeutic a
spects of amino acids in clinical nutrit
ion、第2版、CRC Press LLC、Boca Raton、USA(200
3年))。非必須アミノ酸のアスパラギン酸は、特に、エネルギー代謝のためにL−アル
ギニンの前駆体として機能し(Voet,D.ら、Biochemistry.第3版J
ohn Wiley and Sons Inc.、New York(2004年))
、陽イオンまたは他のアミノ酸の薬剤送達に使用される(Cynober,L.A.、M
etabolic and therapeutic aspects of amin
o acids in clinical nutrition.第2版、CRC Pr
ess LLC、Boca Raton、USA(2003年))。アミノ酸は、ジペプ
チド形態でより高い生体利用効率を有するので、ジペプチドとしてのそれらの投与は臨床
的に承認されており、市販の製品で利用可能である(Duruy,A.ら、Vie.Me
d.Int.9:1589(1965年);Duruy,A.、Med.Int.1:2
03(1966年);Sellier,J.,Rev.Med.Toulouse 5:
879(1979年);De−Aloysio,D.ら、Acta Eur.Ferti
l.13:133〜167(1982年);Rohdewald,P.、Int.J.C
lin.Pharmacol.Ther.40:158〜168(2002年);Lam
m,S.ら、Eur.Bull.Drug Res.11:29〜37(2003年))
。
研究は、生分解性PAAの潜在的供給源としてのCGPにより動機付けられていた(Mo
oibroek,H.ら、Appi.Microbiol.Biotechnol.77
:257〜267(2007年))。後者は、透析膜、人工皮膚および整形外科用インプ
ラントにおける成分として、または薬剤の担体として、多くの適用可能性を有する(Ob
st,M.ら、Biomacromolecules5:1166〜1176(2004
年))。PAAもまた、非生分解性ポリアクリル酸塩の代わりにでき、そのための多くの
工業的応用が記載されている。これは、哺乳動物、鳥類および魚類の腸管内菌叢によるC
GPの生分解、ならびにその後の栄養添加物および/または治療添加物としてのCGPお
よびそのジペプチドの適用可能性についての最初の研究である。
解に関して調査された。すべてのサンプルは、37℃において12〜48時間のインキュ
ベーションにわたって、嫌気的にCGPを完全に分解した。CGP分解性細菌は、すべて
のサンプルにおいて発見され、ウサギおよびヒツジ由来の盲腸菌叢ならびにコイの消化管
菌叢において高度に濃縮されていた。総計62の純粋培養が、単離され、嫌気的にCGP
を分解し、そのうちの46は、24時間から7日間に及ぶ期間のインキュベーションを通
したCGPの嫌気的分解も行った。HPLC分析により、すべての単離株がCGPをその
構成要素となるジペプチドに分解したことが明らかになった。8株が16S rDNA配
列決定により同定され、バチルス(Bacillus)、ブレビバチルス(Brevib
acillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(
Streptomyces)およびミクロモノスポラ(Micromonospora)
の各属に関連付けられた。CGPは、0.06〜0.15%(wt/wt)のCGPを含
有する、3種の異なるスピルリナ・プラテンシス(Spirulina platens
is)の市販の製品において見出すことができる。CGPが細胞外のCGP分解で分解で
きること、消化管におけるCGPの生分解性についての最初の証拠、続いて、CGPおよ
びそのジペプチドの、アルギニン、リシン、アスパラギン酸および他のアミノ酸候補の生
物学的に高度に利用可能な供給源として、栄養および治療における適用の可能性が現在見
出されている。
ckerras,A.H.ら、J.Gen.Microbiol.136:2057〜2
065(1990年);Sherman,D.M.ら、J.Phycol.36:932
〜941(2000年))。シアノバクテリアの大部分の属は、機能性シアノフィシン合
成酵素遺伝子(cphA)を有し、CGPを合成する(Simon,R.D.1987年
。Inclusion bodies in the cyanobacteria:c
yanophychin,polyphosphate,polyhedral bod
ies,199〜225。P.FayおよびC.van Baalen(編)、The
Cyanobacteria,Elsevier、Amsterdam、The Net
herlands;Allen,M.M.ら、Methods Enzymol.167
:207〜213(1988年);Mackerras,A.H.ら、J.Gen.Mi
crobiol.136:2057〜2065(1990年);Liotenberg,
S.ら、Microbiology 142:611〜622(1996年);Wing
ard,L.L.ら、Appl.Environ.Microbiol.68:1772
〜1777(2002年))。cphA遺伝子は、さらに従属栄養細菌においても同定さ
れた(Krehenbrink,M.ら、Arch.Microbiol.177:37
1〜380(2002年);Ziegler,K.ら、Naturforsch.57c
:522〜529(2002年))。ポリマーは、細胞質において細胞内膜のない顆粒と
して存在し、中性pHおよび生理的イオン強度において不溶性である(Allen,M.
M.ら、J.Bacteriol.141:687〜693(1980年))。CGPは
、低温、低光度、リンまたはイオウの制限を含む制限条件下で蓄積される(Stepha
nら、Z.Naturforsch.55:927〜942(2000年))。シアノバ
クテリアにおいて、ポリマー鎖の分子量は、25から100kDaに及び(Simon,
R.D.、Biochim.Biophys.Acta422:407〜418(197
6年))、一方組換え鎖由来のポリマーは、低い範囲(25から30kDa)および多分
散性を示す。さらに、組換え鎖由来のポリマーが、さらなるアミノ酸成分としてリシンを
含有したことが発見された(Ziegler,K.ら、Eur.J.Biochem.2
54:154〜159(1998年);Aboulmagd,E.ら、Biomacro
molecules2:1338〜1342(2001年))。CGPは、一時的な窒素
、エネルギーおよびおそらく炭素の貯蔵として機能する(Li,H.ら、Arch.Mi
crobiol.176:9〜18(2001年);Elbahloul,Y.ら、Ap
pl.Environ.Microbiol.71:7759〜7767(2005年)
)。CGPは5個の窒素原子を個々のビルディングブロックに含有するので、完全な細胞
内窒素貯蔵としての基準を満たしている(Simon,R.D.1987.Inclus
ion bodies in the cyanobacteria:cyanophy
chin,polyphosphate,polyhedral bodies、199
〜225ページ。P.FayおよびC.van Baalen(編)、The Cyan
obacteria、Elsevier、Amsterdam、The Netherl
ands)。
B)により触媒され、β−ジペプチドの形成をもたらすα−切断機構を介して進行する(
Richter,R.ら、Eur.J.Biochem.263:163〜169(19
99年))。CGPは、CGPを蓄積できない細菌に対しても有益な基質となっている(
Obst,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:3642〜
3652(2005年);Sallam,A.およびA.Steinbuchel.20
07a)。湖沼堆積物から単離された新規な中温性、タンパク質分解性細菌である新種ク
ロストリジウム・スルフォティレデュセンス(Clostridium sulfati
reducens)は、チオ硫酸塩、イオウを還元でき、一時的に硫酸塩を還元でき、こ
のような細菌の多くはCGPをその利用可能なジペプチドに分解する、細胞外シアノフィ
シナーゼの保有を示し、これらのジペプチドは細胞に輸送され、さらに利用される得る(
Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2007b。Anaerobi
c and aerobic degradation of cyanophycin
by the denitrifying bacterium Pseudomon
as alcaligenes strain DIP1−Role of other
three co−isolates in the mixed bacteria
l consortium.公開用に提出。)。グラム陰性細菌のシュードモナス・アン
ギリセプチカ(Pseudomonas angulliseptica)、BI株由来
のCphEPaなど、これらの酵素のいくつかの例が単離され、特徴付けられた。この細
胞外酵素は、CphBと同様にCGP分解のためのα−切断機構を示す(Obst,M.
ら、J.Biol.Chem.277:25096〜25105(2002年))。
またCGPaseを分泌することが発見され(Obst,M.ら、Biomacromo
lecules 5:153〜161(2004年))、CphEPaおよびCphEB
mは双方ともセリン型の加水分解酵素として同定された。最近の研究により、細胞外CG
Pの分解は偏性嫌気性細菌および通性嫌気性細菌(例えば、それぞれセディメンチバクタ
ー・ホンコンエンシス(Sedimentibacter hongkongensis
)、KI株(Obst,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71
:3642〜3652(2005年))およびシュードモナス・アルカリジェネス(Ps
eudomonas alcaligenes)、DIP1株など)由来のCGPase
により触媒されうることが明らかになった(Sallam,A.およびA.Steinb
uchel.2007b。Anaerobic and aerobic degrad
ation of cyanophycin by the denitrifying
bacterium Pseudomonas alcaligenes strai
n DIP1−Role of other three co−isolates i
n the mixed bacterial consortium.公開用に提出。
)。すべての調査されたCGPaseは、切断産物としてβ−Asp−Argジペプチド
をもたらしたが、CphEBmの場合(Asp−Arg)2テトラペプチドもさらに検出
された(Obst,M.ら、Biomacromolecules 5:153〜161
(2004年))。
いなかった。対照的に、CGPの構造要素である(ポリマー骨格)であるポリ(アスパラ
ギン酸)(PAA)に関しては、非生分解性ポリアクリル酸塩の代替として経済的に重要
な応用が確立されている、(Schwamborn,M.,Polym.Degrad.
Stab.59:39〜45(1998年))。PAAは、製紙産業、塗料産業および石
油産業を含む多くの分野において、さらに用いることができる(Joentgen,W.
ら、2003年。Polyaspartic acids.175〜199ページ。:S
.R.FahnestockおよびA.Steinbuchel(編)、Biopoly
mers、7巻。Wiley、Weinheimによる総説)。PAAに関する生物医学
的応用もまた記載されている(Leopold,C.S.ら、J.Pharmacoki
net.Biopharm.4:397〜406(1995年);Yokoyama,M
.ら、Cancer Res.6:1693〜1700(1990年))。つい最近、C
GPジペプチドに関する生物医学的応用およびCGPそれ自体の可能性が明らかにされ、
これらの応用は、第1に、多数の調査された哺乳動物、鳥類および魚類の菌叢における驚
くほど広範囲なCGP分解細菌に依存しており、このことは、それぞれの消化管内におい
てCGPがおそらく分解可能であろうことを示し、一方、ジペプチドまたはトリペプチド
の形態で投与された場合、アミノ酸の生体利用効率が上昇することは周知の理論であり、
いくつかの治療分野において有効に応用されている。したがって、CGPおよび/または
そのβ−ジペプチドは、近い将来天然の食品添加物および/または治療添加物候補として
考えることができる(Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2007
c。Potential of cyanophycin and its β−dip
eptides as possible additives in therapy
,food and feed industries)。
た。大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダおよびアシネトバク
ター・ベイリー(Acinetobacter baylyi)ADP1株のいくつかの
細菌株を用い、後者は、約46%(wt/wt)の最大CGP収率を示した(Obst,
M.ら、167〜194ページ。J.M.Shively(編)、Inclusions
in Prokaryotes、1巻、Springer−Verlag、Berli
n、Heidelberg(2006年))。しかし、所要の基質および培養条件は、経
済的に適切なCGP産生を選択するための重要な因子でもある。
プチドで終わる経済的な大規模方法で調製できる。なぜならば、シュードモナス・アルカ
リジェネスDIP1株は、単純な発育要求で高度の酵素生産性を示すことができるからで
ある。この株は、このような工業的方法にとって理想的であることが見出された。
、完全な動的細胞内窒素貯蔵の基準を、確実に達成する(Simon,R.D.1987
.Inclusion bodies in the cyanobacteria:c
yanophycin,polyphosphate,polyhedral bodi
es、199〜225ページ。P.FayおよびC.van Baalen(編)、Th
e Cyanobacteria、Elsevier、Amsterdam、 The
Netherlands);その量的変動は、細胞の要求に従う(Carr,N.G.1
988年。Nitrogen reserves and dynamic reser
voirs in cyanobacteria、13〜21。L.J.Rogersお
よびJ.R.Gallon(編)、Biochemistry of the alga
e and cyanobacteria、Annual Proceedings o
f the Phytochemical Society of Europe、Cl
arendon、Oxford.)。ポリマーは、タンパク質合成が、対数増殖期から定
常期へと移行する間に自然に減少する時(Simon,R.D.、Arch.Micro
biol.92:115〜122(1973a))またはタンパク質生合成の阻害剤(例
えばクロラムフェニコール)の添加により減少する時のどちらかにおいて、(Ingra
m,L.O.ら、Arch.Microbiol.81:1〜12(1972年);Si
mon,R.D.,J.Bacteriol.114:1213〜1216(1973b
))シアノバクテリア中に蓄積され、ポリマーは、バランスの取れた成長が再開する時消
失する(Mackerras,A.H.ら、J.Gen.Microbiol.136:
2057〜2065(1990年))。CGPの蓄積は、リンの制限(Stephanら
、Z.Naturforsch.55:927〜942(2000年))、イオウの制限
(Arino,X.ら、Arch.Microbiol.163:447〜453(19
95年))、低温、低光度またはこれらの因子の組み合わせによってもさらに促進される
(Obst,M.ら、Biomacromolecules5:1166〜1176(2
004年))。
る方法が開発された。CGPのアルギニン含有量は、加水分解ポリマーまたは非加水分解
ポリマーのどちらかにおいて、Sakagushi試薬により比色分析的に定量化された
(Simon,R.D.、J.Bacteriol.114:1213〜1216(19
73b))。精製シアノフィシンのアミノ酸成分は、HPLCにより決定できた(Abo
ulmagd,E.ら、Arch.Microbiol.174:297〜306(20
00年))。シアノフィシンの高速かつ高感度な決定のために1H核磁気共鳴(NMR)
に基づく方法が開発された(Erickson,N.A.ら、Biochim.Biop
hys.Acta.1536:5〜9(2001年))。
し、その後これらは細胞内で、細胞代謝に携わるその構成アミノ酸に分割される。シアノ
フィシンの細胞内分解は、シアノフィシナーゼ(CphB)により触媒される。第1のシ
アノフィシナーゼは、Gupta,M.ら、J.Gen.Microbiol.125:
17〜23(1981年)により、アナベナ・シンドリカ(Anabaena cyli
ndrica)の異質細胞および栄養細胞中にあることが記載された。この酵素は、単量
体29.4kDa、セリン型であり、シアノフィシン特異的エクソペプチダーゼであり、
その主要分解産物は、α−切断機構を介したアスパラギン酸・アルギニン・ジペプチドで
あった(Richter,R.ら、Eur.J.Biochem.263:163〜16
9(1999年))。最近数年で、細胞外シアノフィシナーゼ(CphE)によりシアノ
フィシンを分解できる好気性菌および嫌気性菌が単離された(Obst,M.ら、J.B
iol.Chem.277:25096〜25105(2002年));Obst,M.
ら、Biomacromolecules5:153〜161(2004年);Obst
,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:3642〜3652
(2005年);Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2007b。
Anaerobic and aerobic degradation of cya
nophycin by the denitrifying bacterium P
seudomonas alcaligenes strain DIP1−Role
of other three co−isolates in the mixed
bacterial consortium.公開用に提出。)。CphBと同様に、す
でに細胞外CGPaseと特徴付けられた、それぞれシュードモナス・アンギリセプチカ
(Pseudomonas anguilliseptica)B1株および巨大菌BA
C19株に由来するCphEPaおよびCphEBmが、セリン型のシアノフィシン特異
的酵素として同定され、CGP−ジペプチドを分解産物として産生するが、CphEBm
の場合、(Asp−Arg)2テトラペプチドがさらに検出される。CphEPa標識研
究により、この酵素はカルボキシル末端においてCGPを加水分解し、分解されたポリマ
ー鎖の末端からβ−Asp−Argジペプチドを連続的に放出することが示された(総説
には、Obst,Mら、Biomacromolecules5:1166〜1176(
2004年)を参照されたい)。さらに、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1由
来の第3の細胞外シアノフィシナーゼ(CphEal)は、近年、CGP−ジペプチドの
工業的製造のために粗形態で用いられた(Sallam,A.およびA.Steinbu
chel.2008b。Biotechnological process for
the technical production of β−dipeptides
from cyanophycin。準備中)。
た。大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダおよびアシネトバク
ター・ベイリーのいくつかの細菌株を用いることに成功した(Obst,M.ら、Bio
macromolecules5:1166〜1176(2004年))。しかし、CG
Pのバイオテクノロジー関連は、工業的応用[例えば水処理;製紙工業および皮革工業に
分散剤として(Roweton,S.ら、J.Environ.Polym.Degra
d.5:175〜181(1997年);Mooibroek,H.ら、Appl.Mi
crobiol.Biotechnol.77:257〜267(2007年))または
ポリアクリル酸塩の生分解性代替として(Schwamborn,M.、Polym.D
egrad.Stab.59:39〜45(1998年))の高い可能性を有するポリ(
アスパラギン酸)の供給源であることに理論的に基づいている。PAAは、透析膜、人工
皮膚、整形外科用インプラントの成分として、または薬剤の担体として、生物医学的応用
可能性をさらに有する(Leopold,C.S.ら、J.Pharmacokinet
.Biopharm.4:397〜406(1995年))。
能性が明らかになり、このことは、哺乳動物および魚類の消化管内においてCGPがおそ
らく分解可能であろうことを示し、ポリマーおよびそれらのジペプチドは、近い将来天然
の食品添加物および/または治療添加物の候補であることを表した。したがって、シュー
ドモナス・アルカリジェネスDIP1株由来の粗CphEalを使用する、CGPからジ
ペプチドを製造する大規模な方法が最近構築された。この独自の方法は、3相;第I相:
CGPの大規模抽出および精製、第II相:粗CphEalの粉末の大規模製造、第II
I相:CGPのそのジペプチドへの分解を含み、前記のように構成された。この独自の方
法の、後期の2つの相は将来の応用のために大きく最適化することができることが、現在
発見されている。さらに、CphEalは、粗粉末から工業的に精製され、その生化学的
特徴が明らかにされた。
(1)CGPaseを用いたポリマー調製品の分解を含む、シアノフィシン(CGP)ま
たはCGP様ポリマー調製品からのジペプチド組成物の酵素的製造の方法、
(2)上記(1)の方法の好ましい実施形態であって、CGPaseが、
(i)分子量45kDa、至適温度50°C、至適pH範囲7〜8.5であり、CGPを
β−Asp−Argに分解する、および/または
(ii)DSM21533としてDSMZに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネ
スDIP1株のCGPaseのCphEal、またはCGpまたはCGP様ポリマーをジ
ペプチドに切断できるそれらの突然変異体、誘導体もしくは断片である実施形態、
(3)上記の(2)に定義されたCGPase、ならびに
(4)シアノフィシン(CGP)またはCGP様ポリマーまたはそれらの断片を含む、組
成物、医薬組成物、医薬品、食品補助剤または飼料補助剤、
(5)栄養療法のための医薬品を調製するため、または食品補助剤もしくは飼料補助剤と
しての、シアノフィシン(CGP)またはCGP様ポリマーまたはそれらの断片の使用、
(6)治療を必要とする患者の栄養療法のための方法であって、適切な量のシアノフィシ
ン(CGP)もしくはCGP様ポリマーまたはそれらの断片を含む組成物を患者に投与す
るステップを含む方法、
(7)組成物、医薬組成物、医薬品、食品補助剤または飼料補助剤が、CGPもしくはC
GP様ポリマーが、酵素的タンパク質分解により生じるジペプチドまたはジペプチド混合
物を含む、好ましくはこのジペプチド混合物が、β−アスパラギン酸−アルギニンおよび
β−アスパラギン酸−リシンから構成される、および/または上記の(1)または(2)
の方法により得ることができる、上記の(4)から(6)の好ましい実施形態
を提供する。
ペプチドの混合物で構成されていてよい。しかし、ジペプチドは、アスパラギン酸、アル
ギニン、リシンおよびCGP様ポリマー中に存在する他のアミノ酸残基から選択されるア
ミノ酸残基を含むことが好ましい。ジペプチドが、β−アスパラギン酸−アルギニンおよ
びβ−アスパラギン酸−リシンから選択されることが特に好ましい。
ジペプチド単位で構成されるペプチド構造であり、前記ジペプチド単位が、以下のアミノ
酸残基、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、グルタミン酸、シトルリン、オルニチン
、カネバニン(canevanine)などのうちの2つから構成されることが好ましい。
る(表2および4を参照されたい)。しかし、CGPaseは、シュードモナス・アルカ
リジェネス由来のCGPase、特にシュードモナス・アルカリジェネスDIP1株由来
のCGPaseであることが好ましい。本発明の態様(2)に従って、CGPaseは、
(i)分子量45kDa、至適温度50°Cおよび至適pH範囲7〜8.5であり、CG
Pをβ−Asp−Argに分解する;および/または(ii)DSM21533としてD
SMZに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネスDIP1株のCGPaseのCp
hEal、またはCGPまたはCGP様ポリマーをジペプチドに切断できるそれらの突然
変異体、誘導体もしくは断片である。前述の天然のCGPaseの突然変異体、誘導体も
しくは断片は、(天然配列の少なくとも50の連続したアミノ酸残基、好ましくは最大5
0、最大30または最大10の末端アミノ酸残基が除去された、Nおよび/またはC末端
の切断産物を有する)断片、誘導体(特に、分泌ペプチド、リーダー配列などの機能性タ
ンパク質およびペプチドを有する融合産物およびPEG、アルコール、アミンなどの化学
的部分を有する反応産物)および突然変異体(特に、アミノ酸ベースの天然酵素と、少な
くとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同
一性を有する付加、置換、反転および欠失した突然変異体、または1から20、好ましく
は1から10の、連続した、または個別のアミノ酸残基が、付加、置換、反転および/ま
たは欠失された突然変異体、置換突然変異体に関しては、保存的置換が特に好ましい)を
含むが、前記修飾CGPaseは、天然CGPaseの酵素活性を有する。
ることによってCGPまたはCGP様ポリマー調製品を調製するステップをさらに含むこ
とができる。産生細胞系は、CGPまたはCGP様ポリマーを産生できる任意の細胞系で
あってよい。産生細胞系が、大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、アシネトバクター・
ベイリー、コリネバクテリウム・グルタミクム、シュードモナス・プチダ、酵母株および
植物バイオマスから選択されることが好ましい。特に好ましい産生細胞系は、ラルストニ
ア・ユートロファH16−PHB−4−Δeda(pBBR1MCS−2::cphA6
308/edaH16)および大腸菌DH1(pMa/c5−914::cphAPCC
6803)である。
よび/または化学的修飾するステップをさらに含むことができる。このような単離、精製
および化学的修飾分離は、当分野において十分確立された方法によって得ることができる
。
離または精製せずにCGPaseによる分解に供することが、態様(1)および(2)の
方法にとって好ましい。
たは分離するステップおよび/または分解産物を化学的修飾するステップをさらに含む。
先と同様に、このような精製、分離または化学的修飾は、当分野において十分確立された
方法によって得ることができる。
(i)分子量45kDa、至適温度50°C、至適pH範囲7〜8.5であり、CGPを
β−Asp−Argに分解する、および/または
(ii)DSM21533としてDSMZに寄託されたシュードモナス・アルカリジェネ
スDIP1のCGPaseのCphEal、またはCGpまたはCGP様ポリマーをジペ
プチドに切断できるそれらの突然変異体、誘導体もしくは断片である、
CGPaseに関する。突然変異体、誘導体および断片に関しては、上記の定義で言及し
ている。
たは飼料補助剤は、医薬としてまたは食物として許容可能な適切な担体、結合剤などを、
さらに含有できる。それらは、それぞれの医薬的目的のための、さらなる活性化合物をさ
らに含有することができる。
るように、当然ながら組成物/医薬品内に存在するアミノ酸に依存する。重病患者の栄養
療法における最近の進歩は、病気の期間の組織タンパク質の恒常性を維持するための、特
定のアミノ酸の必要性の十分な理解を提供する(Witte,M.B.およびBarbu
l A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))。すで
に、アミノ酸は、非必須(可欠)または必須(不可欠)のどちらかとして分類されていた
。しかし、アミノ酸に関するインビボ生理学のより優れた理解により、特定のアミノ酸の
要求は条件つきで不可欠であるとして再定義する、代替の分類が提唱された(Laidl
aw,S.A.およびKopple,J.D.、Am.J.Clin.Nutr.46:
593〜605(1987年))。このことは、このようなアミノ酸の使用を、単独また
は完全な栄養計画の一部として魅力的にし、栄養転帰、免疫応答および組織回復を改善す
る。以下の項において、いずれもCGPを構築する3種のアミノ酸の生理および作用機構
に関する発見を論じる。これらのアミノ酸は、非必須のL−アスパラギン酸、半必須のL
−アルギニンおよび必須アミノ酸のL−リシンである。その生理作用の多さから、アルギ
ニンに特に重点が置かれる。
有し、ジカルボン酸アミノ酸である。大部分のL−アスパラギン酸は、タンパク質中に発
見することができ、一方、それらの少量は体液および植物中に遊離の形態で発見すること
ができる(Barrett,G.C.およびElmore D.T.Amino Aci
ds and Peptides.Cambridge University Pre
ss、Cambridge、UK(1998年))。L−アスパラギン酸は、天然バイオ
ポリマーのCGPおよび合成甘味料のアスパルテームの成分である。アスパラギン酸は、
水に溶けにくく、塩の形態でより水溶性である。食物アスパラギン酸は、能動輸送により
小腸で吸収され脈循環に進入し、その後、その大部分がタンパク質、プリン、ピリミジン
プラントに代謝される肝臓に輸送される(Barrett,G.C.およびElmore
D.T.Amino Acids and Peptides.Cambridge
University Press、Cambridge、UK(1998年))。L−
アスパラギン酸は、クエン酸サイクル中のエネルギー供給源として機能でき、したがって
疲労に対して有効であることが推定される(さらに以下を参照されたい:Asp−Arg
)。アスパラギン酸は、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+などの陽イオンまたはそれ
らの生体利用効率の増加のための他のアミノ酸の薬剤送達に使用される(Cynober
,L.A.Metabolic and therapeutic aspects o
f amino acids in clinical nutrition.第2版。
CRC Press LLC、Boca Raton、USA(2003年))。
であり、大部分のタンパク質中に発見される。L−アルギニンは、分子あたり4個の窒素
原子を含有し、したがってヒトおよび動物において、最も豊富な窒素担体である(App
leton,J.、Altern.Med.Rev.7:512〜522(2002年)
)。アルギニンは、魚にとって必須であるが(Ahmed,I.およびKhan,M.A
.、Aquacult.Nutr.10:217〜225(2004年))、一方で哺乳
動物において、アルギニンは栄養摂取を介して、または新たな合成(内因性)を介して補
われ得るので、半必須であると考えられる。腎臓において、大部分の内因性アルギニンは
、腸または肝臓におけるグルタミン代謝の副産物であるシトルリンに由来する。しかし、
アルギニンの生合成は、喪失または不適切な供給の補正を強化しないので、食物摂取(平
均的なヒトにとって、およそ5〜6g/日、Witte,M.B.およびBarbul.
A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))は依然とし
て血漿アルギニンレベルの主要な決定因子のままである。
出される。一般的に、摂取アルギニンの約半分は、主に酵素のアルギナーゼにより急速に
オルニチンに転換される(Modolell,M.ら、Eur.J.Immunol.2
5:1101〜1104(1995年);Witte,M.B.およびBarbul.A
.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))。オルニチン
は、順にグルタミン酸塩およびプロリンに、または酵素のオルニチンデカルボキシラーゼ
を介してポリアミンに代謝され得る(Boutard,V.ら、J.Immunol.1
55:2077〜2084(1995年))。残りのアルギニンは、4種の他の酵素:一
酸化窒素合成酵素(一酸化窒素になる)、アルギニン:グリシンアミジノトランスフェラ
ーゼ(クレアチンになる)、アルギニンデカルボキシラーゼ(アグマチンになる)または
アルギニル−tRNAシンテターゼ(タンパク質合成のための前駆体であるアルギニル−
tRNAになる)のうちの1種により処理される(Vodovotz,Y.ら、J.Ex
p.Med.178:605〜613(1993年))。
に関して有意な効果を有する。しかし、アルギニンがこれらの効果を発揮する正確な機序
についてはほとんど知られていない。アルギニンは、心臓血管系においてさまざまな内皮
依存性生理効果に関与する内因性メッセンジャー分子である、一酸化窒素(NO)の生物
前駆体である。(Witte,M.B.およびBarbul.A.、Wound Rep
.Reg.11:419〜423(2003年))。したがって、アルギニンの臨床効果
の多くは、内皮由来弛緩因子についてのその効果を仲介すると考えられる。NO合成酵素
は2種の変異体;構造的(cNOS)およびそのアイソフォームのeNOS(血管内皮内
膜中)とnNOS(ニューロン中)ならびにマクロファージ、白血球、繊維芽細胞、内皮
細胞およびケラチノサイトにおいて見出される誘導性変異体(iNOS)を有する(Ro
hdewald,P.およびFerrari V.、特許出願 US200413708
1(2004年)。NOの機能は、その細胞供給源とは異なることがあり、繊維芽細胞N
Oはコラーゲン合成を支持し、一方、内皮NOは血管形成に影響を及ぼし、マクロファー
ジNOは細菌に対して細胞増殖抑制性である(Rohdewald,P.およびFerr
ari V.、特許出願 US2004137081(2004年)。他方、アルギナー
ゼは、NOSの天然基質、すなわちL−アルギニンを共有し競合する。それぞれNO経路
の中間産物および最終産物であるL−ヒドロキシアルギニンおよび亜硝酸塩は、双方との
強力なアルギナーゼ阻害剤である(Hrabak,A.ら、FEBS Lett.390
:203〜206(1996年))。反対に、アルギナーゼ活性の最終産物である尿素は
、NOの形成およびNO依存性の過程を阻害する(Witte,M.B.およびBarb
ul.A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))。
病態を有する患者に投与する場合、有益であることが証明された(Appleton,J
.、Altern.Med.Rev.7:512〜522(2002年)により総説され
た)。例えば、経口によるアルギニン補給は、狭心症の患者の運動能力および耐性を劇的
に改善し(Bednarz,B.ら、Int.J.Cardiol.75:205〜21
0(2000年))、うっ血性心不全(CHF)の症例において、彼らの血流、動脈コン
プライアンスおよび腎機能を有意に改善した(Watanabe,G.H.ら、J.Hy
pertens.18:229〜234(2000年))。動物の研究により、血管拡張
の改善、プラーク形成の阻害、大動脈内膜の肥厚化の減少および高コレステロール血症の
ヒト成人の血小板凝集の正常化を含む、補足アルギニンの抗動脈硬化作用が示された(N
akaki,T.およびKato R.、Jpn J.Pharmacol.66:16
7〜171(1994年))。さらに、アルギニンの早期供給はラットおよびヒトにおい
て高血圧を改善し、腎不全を予防し(Sanders,P.W.、Am.J.Kidne
y Dis.28:775〜782(1996年))、エナラプリルなどの医薬品に対す
る高血圧患者の応答を強化した(Pezza,V.ら、Am.J.Hypertens.
11:1267〜1270(1998年))。その上、アルギニンは、間欠性跛行(Bo
ger,R.H.ら、J.Am.Coll.Cardiol.32:1336〜1344
(1998年))および子癇前症(Roberts,J.M.,Am.J.Kidney
Dis.33:992〜997(1999年))の症状を、有意に改善した。
肉の成長、脂肪燃焼および免疫系の維持に関与するが、その分泌は、ヒト体内において、
30歳から下降し始める(Dean,W.およびPryor,K.、Growth ho
rmone:amino achids as GH secretagoguesによ
り総説された−文献総説。Vit.Res.News;www.vrp.comにおいて
利用可能(2001年))。この機序は十分理解されていないが、アルギニンがGHの分
泌を強化することは公知である。さらに、臨床医は、アルギニン注入試験を日常的に使用
し、ヒトにおいてGH放出に対する下垂体の反応性を決定する(Penny,R.ら、J
.Clin.Endocrinol.29:1499〜1501(1969年))。アル
ギニンの低用量の静脈内(IV)注入は、血清中アルギニンを52%上昇させ、血清中G
Hレベルを有意に増大させる。他方、IVアルギニンとは異なり、経口アルギニンは、G
H分泌の強化の効果の無い方法であることを示唆した(Marcell,T.J.ら、J
.Gerontol.54:395〜399(1999年))、一方、高用量の経口アル
ギニン・アスパラギン酸は、夜においてのみ、成長ホルモン分泌促進剤として作用するこ
とを示唆する(Besset,A.ら、Acta Endocrinol.99:18〜
23(1982年))。魚類において、アルギニンは必須アミノ酸であり、したがって、
食物アルギニンは、最適な成長および有効な飼料利用に必須であり、その欠乏は成長率の
減少、免疫応答の低下および死亡率の増加を起こす(Ahmed,I.およびKhan,
M.A.、Aquacult.Nutr.10:217〜225(2004年))。
化窒素の製造を介した細胞のシグナル伝達およびアルギニンのオルニチンと他のポリアミ
ンとへの代謝を介した細胞増殖に密接に関与するので、多くの研究により、アルギニンの
補給が治癒にとって必須であることが示された。この効果は、投与経路に依存せず、コラ
ーゲン、NO、オルニチンおよびポリアミンの合成経路と関係があると推定されている(
Witte,M.B.およびBarbul.A.、Wound Rep.Reg.11:
419〜423(2003年))。
にとって基盤である。ラットにアルギニン非含有食餌を与えることにより、創傷治癒が低
下し、一方、ヒトおよび動物にアルギニンに富んだ食餌を与えることにより、コラーゲン
の沈着および創傷破壊強度が改善されたことが示された(Barbul,A.ら、Sur
gery108:331〜336(1990年))。iNOS阻害剤はコラーゲン沈着を
減少させ、切開創傷の治癒を遅らせるのに対してアルギニン補給後の創傷液中には高レベ
ルのNO代謝産物が発見されるので、コラーゲン合成についてのアルギニンの効果は一部
NO合成を介して仲介されることが推定される(Murrell,G.A.C.ら、In
flamm.Res.46:19〜27(1997年);Schaffer,M.R.ら
、Eur.J.Surg.165:262〜267(1999年))。創傷治癒について
のNOの効果は、:1)アルギニン非含有栄養が、創傷部位だけでなくいくつかの臓器に
おいてNO合成の誘導を阻害する;2)NOは、炎症誘導性浮腫を仲介し、細胞が肉芽腫
に浸潤することを阻害する;3)創傷治癒についてのNOの効果は、eNOSノックアウ
トマウスもまた治癒障害を示すので、iNOS仲介性だけではない;および4)iNOS
阻害剤は高濃度において高致死率を有するので、全身に仲介されることがさらに示唆され
る(Witte,M.B.およびBarbul.A.、Wound Rep.Reg.1
1:419〜423(2003年))。さらに、創傷縮小は開放創の閉合に大きく寄与す
ると同時に、切除創の閉合はiNOSの阻害により遅れ(Stallmeyer,B.ら
、J.Invest.Dermatol.113:1090〜1098(1999年))
、iNOSノックアウトマウスは、iNOS−cDNAを用いた形質移入により回復可能
な切除創の閉合の遅れを示す(Yamasaki,K.ら、J.Clin.Invest
.101:967〜971(1998年))。このデータはすべて、NOSを介したアル
ギニンの代謝が、治癒についてのアルギニンの陽性効果にとって必須であることの信憑性
をもたらす(Shi,H.P.ら、Surgery128:374〜378(2000年
))。
剰発現が、内皮細胞の増殖を強化する(Wei,L.H.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA98:9260〜9264(2001年);Witte,M.B.
およびBarbul.A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(20
03年))。アルギニンは、宿主および創傷T細胞の応答を刺激し、その後線維芽細胞の
応答を増加することによって創傷治癒を強化することが公知である(Barbul,A.
ら、Surgery108:331〜336(1990年))。健康なヒトにおいて、ア
ルギニンは末梢血リンパ球のマイトジェン活性を強化し、リンパ球の芽球化において外傷
後機能障害を大きく減少する(Daly,J.M.ら、Ann.Surg.208:51
2〜23(1988年))。アルギニンは、骨髄リンパ球の分化にとって重要であること
が示されている。T−リンパ球は正常な創傷治癒にとって必須であるので、T細胞欠損マ
ウスおよびラットは、創傷治癒が有意に低下する。他の研究により、創傷治癒についての
補給アルギニンの有益な効果は、傷付いた動物または火傷した子供にGHを投与する効果
と同様であることが示され(Jorgensen,P.HおよびAndreassen,
T.T.、Acta Chir.Scand.154:623〜626(1988年);
Herndon,D.N.ら、Ann.Surg.212:424〜9(1990年))
、このことは、下垂体および膵腺についてのアルギニンの周知の高い分泌促進活性による
。このことは、アルギニンが創傷治癒に影響を及ぼさなかった、下垂体摘出動物に関する
試験により確認された(Wei,L.H.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA98:9260〜9264(2001年);Witte,M.B.およびBarb
ul.A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))。
ルギニンが外傷後の状況において必須であることを示し、軽度の外傷を受けたアルギニン
欠乏ラットは体重減少および死亡率が有意に多かったことを示した。火傷もまた、その回
復においてアルギニンの酸化および変動を有意に増加する。しばしば使用される完全静脈
栄養(TPN)は、アルギニンのオルニチンへの転換を増加し、不可逆なアルギニンの酸
化を比例的に増加する。新たな合成に限定して、アルギニン酸化の上昇は、TPNを受け
ている重篤な火傷の患者において、アルギニンを条件付で必須にする(Yu,Y.M.ら
、Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.280:E509〜
E517(2001年))。いくつかの他の研究は、アルギニンが、火傷および外傷の患
者の入院の長さ、後天性感染、免疫障害(Appleton,J.、Altern.Me
d.Rev.7:512〜522(2002年))ならびに老年性認知症の高齢患者の脂
質過酸化反応(Ohtsuka,Y.およびNakayaJ.、Am.J.Med.1:
108〜439(2000年))を減らすことを実証した。相対的な安全性を加味して、
これらの多数の観察により、アルギニンの使用は、外傷、火傷または重篤な病気の患者の
世話にとって非常に魅力的となる(Witte,M.B.およびBarbul.A.、W
ound Rep.Reg.11:419〜423(2003年))。
異化作用状態、例えば敗血症および術後のストレスにおいて有益な効果を有することが示
された(Evoy,D.ら、Nutrition14:611〜617(1998年);
Appleton,J.、Altern.Med.Rev.7:512〜522(200
2年))。アルギニンは、HIV/AIDSの個体においてもまた有益であり得る。グル
タミン、アルギニンおよびHMB(ヒドロキシメチル酪酸)の組み合わせは、AIDSの
個体において除脂肪体重の減少を防ぐ(Swanson,B.、Nutrition18
:688〜690(2002年))。動物およびヒトの試験は、大用量のアルギニンが腫
瘍の誘導を妨げることができ、大用量のアルギニンの短期補給が化学療法期間の免疫機能
の維持を支援することを示した(Appleton,J.、Altern.Med.Re
v.7:512〜522(2002年))。糖尿病およびインスリン耐性におけるアルギ
ニン:血漿中アルギニンレベルの低下および内皮依存性弛緩の障害が、糖尿病(DM)の
ヒトおよび動物において観察される。内皮のNO欠乏は、このことのありそうな理由であ
ると推定された。したがって、アルギニン補給は、これらの病態を改善することが示唆さ
れる;IVアルギニンは、1型DMの患者において血圧および血小板の凝集を低下させ(
Giugliano,D.ら、Am.J.Physiol.273:E606〜E612
(1997年))、一方、低用量のIVアルギニンは、肥満および2型DMの患者ならび
に健康な対象においてインスリン感受性を改善した(Wascher,T.C.ら、Eu
r.J.Clin.Invest.27:690〜695(1997年))。アルギニン
はさらに脂質過酸化反応を無効にし、その結果DMの微小血管症の長期合併症を減少し得
る。さらに、二重盲検により、経口アルギニン補給が、2型DM患者の末梢および肝臓の
インスリン感受性を有意に改善することが示された(Appleton,J.、Alte
rn.Med.Rev.7:512〜522(2002年))。
、NO、ガストリンおよびポリアミンに関するアルギニンの作用は、予備研究期間の潰瘍
治癒の加速に関与する(Brzozowski,T.、J.Gastroenterol
.32:442〜452(1997年))。加えて、NOは、胃腸の運動の制御において
重要な役割を果たす。経口アルギニン補給は、食道運動障害の患者において肺の疼痛発作
の頻度および強度を有意に減少させる(Appleton,J.、Altern.Med
.Rev.7:512〜522(2002年))。同様に、L−アルギニン−NO経路は
胆嚢運動の制御に関与し、L−アルギニンの摂取は、空腹および残留胆嚢の体積を増加す
る(Luiking,Y.C.ら、Am.J.Physiol.274:984〜991
(1998年))。
から59歳の男性の31%および女性の43%が、多かれ少なかれ性機能障害を有してい
ることを示した(Christianson,D.W.、Acc.Chem.Res.3
8:191〜201(2005年))。この問題は、生理的もしくは精神的な理由または
双方を有しうる。男性において、性機能障害は勃起障害(インポテンスまたはED)とし
て簡単に記載されるが、一方、女性において性機能障害は、4種の主要なカテゴリー:性
的欲求低下、オルガスムス障害、性交痛障害および性的興奮障害に分類される(Bass
on,R.ら、J.Urol.163:888〜893(2000年))。陰核勃起およ
び生殖器の充血を含む、十分な性的興奮の達成または維持の不能として定義される後者は
、生殖器の血液循環の欠乏により起こるという点で男性のEDと類似している。このこと
は、双方の性別において、勃起したペニスまたは陰核内の血液で拡張可能な組織の筋肉性
チャンバーである海綿体の中への血流および外への血流を管理する酵素触媒反応における
生理的欠陥からもたらされ得る(Christianson,D.W.、Acc.Che
m.Res.38:191〜201(2005年))。
流出の制限に関与する血行動態過程である(Musicki,B.ら、Biol.Rep
rod.70:282〜289(2004年))。内皮性NO合成酵素(eNOS)およ
びニューロン性ペニスNO合成酵素(PnNOS)の双方により発生するNOの関与は、
ペニス勃起の主要メディエーターとして十分立証されている。NOはグアニリルサイクラ
ーゼを刺激する、隣接する標的の平滑筋組織に拡散し、海綿体の弛緩をもたらす環状グア
ノシン一リン酸(cGMP)を発生する(Ferrini,M.ら、Biol.Repr
od.64:974〜982(2001年))。反対に、勃起は、cGMP−特異的ホス
ホジエステラーゼ(PDE)がcGMPを、平滑筋の収縮をもたらす5’−GMPに加水
分解した時に終了する(Firoozi,F.ら、Br.J.Urol.Int.96:
164〜168(2005年))。したがって、L−アルギニンおよびL−アルギニン−
NO経路に作用する薬剤は、EDの治療薬として魅力的である。さらに、cGMPの分解
を阻害し、その結果勃起を延長するクエン酸シルディナフィル(Sildenafil
citrate)(バイアグラ(Viagra)(登録商標))のような、PDEの選択
的阻害剤が広く用いられている。しかしシルディナフィルは、頭痛から出発する、広範囲
の副作用をもたらす全身の血管拡張および降圧効果を有し、さらに死に達することもあり
得る(Cohen,J.S.、Ann.Pharmaco.Ther.35:337〜3
42(2001年))。
して多くの場合調査される。例えば、食物L−アルギニンの超生理学的用量を長期または
補給することにより、ラット(Moodyら、1997年)および男性において、それぞ
れ陰茎海綿体圧および勃起機能が強化された。長期L−アルギニン補給は、一酸化窒素代
謝が異常な男性においてEDを改善し(ZorgniottiおよびLizza 199
4年)、一方、女性に関する別の研究において、L−アルギニンの栄養補助剤は、被検対
象の73.5%において性生活全体の満足が改善された(Ito,T.Y.ら、J.Se
x Marital Ther.27:541〜549(2001年))。他方NOSは
、ペニスの勃起に影響を及ぼすたった1つの酵素ではなく、アルギナーゼはその唯一の基
質のアルギニンを共有し、男性および女性の生殖器において平滑筋組織でNOSと同時発
現する。したがってアルギナーゼの阻害は、性的興奮に必要なNO依存性の生理的過程を
強化することができる。多くのアルギナーゼ阻害剤が、全身の動脈圧に明らかな効果を有
さないので、性機能障害治療のための別の潜在的標的になった(Christianso
n,D.W.、Acc.Chem.Res.38:191〜201(2005年))。
って必要である(Appleton,J.、Altern.Med.Rev.7:512
〜522(2002年))。50年以上前、研究者は、成人男性にアルギニン欠乏食を9
日間与えたところ、精子数が90%減少し、非運動性精子のパーセントがおよそ10倍に
増加したことを発見した(Holt,L.E.Jr.およびAlbanese,A.A.
、Trans.Assoc.Am.Physicians 58:143〜156(19
44年))。0.5gアルギニン−HCl/日を不妊男性に数週間経口投与すると、被検
患者の過半数において精子数および運動性が著しく増加し、妊娠の成功をもたらした(T
animura,J.、Bull.Osaka Med.School 13:84〜8
9(1967年))。精子減少症および受胎率(Tanimura,J.、Bull.O
saka Med.School 13:84〜89(1967年);De−Aloys
io,D.ら、Acta Eur.Fertil.13:133〜167(1982年)
)ならびに不妊の改善に関して同様の効果が、他の予備試験において報告されている。し
かし、精子数のベースラインが1000万/ml未満であった場合、アルギニン補給は役
に立たなかった(Mroueh,A.、Fertil.Steril.21:217〜2
19(1970年);Appleton,J.、Altern.Med.Rev.7:5
12〜522(2002年))。
補給は、卵巣の反応、子宮内膜の受容性および妊娠率を改善した(Battaglia,
C.ら、Hum.Reprod.14:1690〜1697(1999年))。加えて、
子宮収縮の早すぎる女性に対する静脈内アルギニン注入(30分にわたって30g)は、
一時的に子宮収縮を減少した(Facchinetti,F.ら、J.Perinat.
Med.24:283〜285(1996年))。さらに、ヒトおよび動物の研究からの
証拠は、一酸化窒素が妊娠中に子宮収縮を阻害し、その結果早期陣痛および早産に対して
役に立ち、作用することができることを示した(Appleton,J.、Altern
.Med.Rev.7:512〜522(2002年))。
、腹痛および膣/尿道の痛みを有意に減少した。昼夜の頻尿もまた有意に減少した(Sm
ith,S.D.ら、J.Urol.158:703〜708(1997年);Appl
eton,J.、Altern.Med.Rev.7:512〜522(2002年))
。
ルを有し、生理的pHにおいて正電荷を担持する。リシンのD−立体異性体は生物学的に
活性でないが、一方L−リシンは、ヒトおよび動物にとって公知の食品添加物である(C
ynober,L.A.Metabolic and therapeutic asp
ects of amino acids in clinical nutritio
n.第2版。CRC Press LLC、Boca Raton、USA(2003年
))。摂取されたL−リシンは、能動輸送により小腸の内腔から腸細胞に吸収される。そ
の一部は腸細胞内で代謝され、残りは門脈循環を介して肝臓に輸送され、タンパク質の生
合成に加わる、またはL−α−アミノアジピン酸セミアルデヒドに代謝され、これがさら
にアセトアセチル−CoAに代謝される。肝臓において代謝されないL−リシンは、身体
のさまざまな組織に輸送される(Cynober,L.A.Metabolic and
therapeutic aspects of amino acids in c
linical nutrition。第2版。CRC Press LLC、Boca
Raton、USA(2003年))。
体として機能し、またはリシンはエネルギー生産のために直接機能する。リシンは筋肉に
おい濃縮され、骨の成長を促進し、コラーゲンの形成を強化する(Voet,D.および
Voet,J.G.、Biochemistry。第3版。John Wiley an
d Sons Inc.,New York(2004年))。コラーゲンは、結合組織
(前を参照されたい)、皮膚、軟骨および骨の基礎となるマトリックスである。リシンの
欠乏は、成長および免疫力の低下、精子の健康の損傷ならびに尿中カルシウムの増加に寄
与し得る。この最後の事実は、適切なリシンが、より多くのカルシウムの吸収および沈着
を介して骨粗しょう症の予防に役立ち得ることを示唆した(Flodin,N.W.、J
.Am.Coll.Nutr.16:7〜21(1997年))。いくつかの研究が、L
−リシンが、単純ヘルペス感染の再発率を減少させ、成長ホルモン分泌を刺激できること
を示してから、L−リシンは栄養食品補助剤として普及した(下記を参照されたい)。
存して大きく変化しうる。しかし、平均的なヒトのための必須アミノ酸のリシンの正常な
食物の必要量は、欠乏の問題を避けるために0.75〜1g/日であると推定される。臨
床研究に使用するアルギニンの用量は、精子減少症のために0.5g/日のような少量か
ら、がん、子癇前症および早すぎる子宮収縮のための30g/日のような大量まで大幅に
変化する。有意な悪影響は、この論文を通して述べたアミノ酸の補給に関して報告されて
いない。しかし、言及した臨床応用の多くは、より調節された、長期の研究により確認さ
れる必要がある。この論文はこれらのアミノ酸の効果についての、肯定的な報告だけを要
約したが、これらの効果の多くが確認されなかった、反対の報告もまた存在する(完全な
総説のために、Flodin,N.W.、J.Am.Coll.Nutr.16:7〜2
1(1997年);Appleton,J.、Altern.Med.Rev.7:51
2〜522(2002年);ならびにDean,W.およびPryor,K.、Grow
th hormone:amino acids as GH secretagogu
es文献の総説。Vit.Res.News;www.vrp.comで利用可能(20
01年)を参照されたい)。
物:アスパラギン酸およびアルギニンは、ジペプチドまたは混合物として好んで一緒に投
与され、アミノ酸双方のより高い生体利用効率を提供し、その結果低用量におけるそれら
の有効性を増加する。双方のアミノ酸の投与は、さまざまな生理的障害の治療のためのい
くつかの研究において調査された。一般的に、双方のアミノ酸は、遊離のアミノ酸に関す
る上記すべての応用のために、ジペプチド形態で投与することができる。以下の項は、併
用投与形態について具体的に報告された調査結果を要約する。これらの報告は、創傷治療
、GH分泌障害および運動能力の強化としての内分泌の病態または勃起障害ならびに男性
および女性の不妊を含む泌尿生殖器の病態に関する研究から明らかになった。
めて臨床的に試験され(Duruy,A.およびBaujat,J.P.,Vie.Me
d.Int.9:1589(1965年))、陽性効果が後に確認された(Duruy,
A.、Med.Int.1:203(1966年))。他の研究は、アルギニン−アスパ
ラギン酸の長期投与が、好気的エネルギー代謝および能力を改善することを示した(Se
llier,J.、Rev.Med.Toulouse5:879(1979年);Sc
hmid,P.ら、Leistungssport 10:486〜495(1980年
))。アルギニン−アスパラギン酸の補給は、創傷治癒およびT細胞の免疫機能を強化し
た(Barbul,A.ら、Surgery108:331〜336(1990年))。
運動能力についての他の陽性効果も報告されており、例えば脂質代謝に関してわずか2週
間のアルギニンの取り込みが、総コレステロール濃度の低下を起こした(Hurson,
M.ら、J.Parenter.Enteral Nutr.19:227〜230(1
995年))。したがって、L−アルギニン−L−アスパラギン酸(Sargenor(
登録商標))は、運動選手および患者により広く使用され、トレーニング効果および運動
耐容能を増加する。この分野において運動の持続に関する印象的な効果が、L−アルギニ
ン−L−アスパラギン酸の長期にわたる取り込みの後に報告されており、最大下運動にお
ける血中乳酸濃度および心拍の低下ならびに作業負荷の増大による酸素摂取量の増加を起
こす(Schmid,P.ら、Leistungssport 10:486〜495(
1980年);Sellier,J.、Rev.Med.Toulouse 5:879
(1979年);Burtscher,M.ら、J.Sports.Sci.Med.4
:314〜322(2005年))。
物補給すると、創傷のコラーゲン蓄積が有意に強化された(Witte,M.B.および
Barbul.A.、Wound Rep.Reg.11:419〜423(2003年
))。250mg/kg/日の経口アルギニン・アスパラギン酸を、20から35歳の5
例の健康な対象に7日間投与した場合、徐波睡眠中にGHの60%の上昇が起こった(B
esset,A.ら、Acta Endocrinol.99:18〜23(1982年
))。別のグループの研究者は、12例の正常な成人を、経口アルギニン・アスパラギン
酸の単回の大用量(37.5g)を用いて処理した後で、血清hGHの少量だが有意な放
出を起こす、期待できる結果を得た(Elsair 1987年)。このことは、アルギ
ニン・アスパラギン酸を、hGHの同化作用を巧みに利用したいボディビルダーにとって
興味深いものとした(Macintyre,J.G.、Sports Med.4:12
9〜142(1987年))。
て陽性効果を誘導することも報告された。例えば、経口投与されたL−アルギニン−L−
アスパラギン酸は、マウスにおいて唾液腺の腺様嚢胞癌に対して、肺の転移巣形成の阻害
および生存期間の延長を伴う抗転移効果を誘導した。さらに、インビトロおよびインビボ
実験において、これらの結果は確認された(Li,F.ら、Chin.J.Stomat
ol.36:464〜466(2001年);Li,F.ら、Chin.J.Stoma
tol.37:87〜89(2002年);Appleton,J.、Altern.M
ed.Rev.7:512〜522(2002年))。
クが、そのマトリックス内に特定のサイズおよび形状のペプチドを受容することが発見さ
れた。さらに、1つまたは複数がアルギニンである2−4アミノ酸単位のペプチドは、希
釈から保護されてプラーク内に保存され、口内pHを非齲蝕レベル(6.1またはそれ以
上)に有効に回復することが示された。さらに、これらのオリゴマーは、糖質と同時に提
供された場合でさえ、有効である。このことは、歯磨きペーストおよびチューイングガム
などの一般的なデンタルケア製品中へのこのようなペプチドの包含を示唆した(Klei
nberg,I.、特許出願 US4225579(1980年))。
た。EDは、中程度の勃起障害を有する45から70歳の男性の25%および重篤な勃起
障害の10%において一般的である(Kernohan,A.F.B.ら、Br.J.C
lin.Pharmacol.59:85〜93(2004年))。近年、「L−アルギ
ニルアスパラギン酸」が、男性のEDの治療用のいくつかの医薬品、例えばPrelox
(登録商標)の成分として使用された(Lamm,S.ら、Eur.Bull.Drug
Res.11:29〜37(2003年))。Prelox(登録商標)の成分に関す
る臨床研究は、1gの「L−アルギニルアスパラギン酸」(Sargenor(登録商標
))を単独で、またはPycnogenol(登録商標)(NOSの分泌を刺激する)と
一緒に、3回の投与後(毎日1.7gのアルギニン)、それぞれEDの40例の男性の5
%および92%が勃起機能を改善したことを示した(Stanislavov,R.およ
びNikolova,V.、J.Sex Marit.Ther.29:207〜213
(2003年))。長期研究の期間、EDを有し、精液の量が低下し、精子の運動性が減
少し、精子の形態異常を有する、45から60歳の50例の男性を、まずSargeno
r(登録商標)単独で1ヶ月治療した。これらの男性の10%が正常な勃起を経験した。
2ヶ月の治療にPycnogenol(登録商標)を加えた後で、正常に勃起した男性の
パーセントは80%に上昇した。治療を1年の間継続し、その間精子の質が有意に改善さ
れ、カップルの42%が妊娠を達成した(Stanislavov,R.およびNiko
lova,V.、Int.J.Impot.Res.14(4):S65(2002年)
;Lamm,S.ら、Eur.Bull.Drug Res.11:29〜37(200
3年))。その後の観察により、アルギニン−アスパラギン酸の使用に関する、数ヶ月の
補給により精子の数および質が上がる(Tanimura,J.、Bull.Osaka
Med.School 13:84〜89(1967年);Schellen,T.M
.およびDeclerq,J.A.、Dermatol.Monatsschr,164
:578〜80(1978年);De−Aloysio,D.ら、Acta Eur.F
ertil.13:133〜167(1982年))ならびに不妊が改善される(Sch
acter,A.ら、J.Urol.110:311〜13(1973年);Schac
ter,A.ら、Int.J.Gynaecol.Obstet.11:206〜209
(1973年))という先行する研究が確認された。
が大量に利用できないためほとんど存在しない。しかし、リシンのこのジペプチド形態は
、遊離のリシンもしくはその塩に関して公知の応用分野(前を参照されたい)において、ま
たは単に遊離のリシンより高い生体利用効率のヒトおよび動物用の食品添加物として、遺
伝的にリシン輸送体が欠乏したヒトにおいて有効であり得る。
uminski,R.R.ら、Int.J.Sport Nutr.7:48〜60(1
997年))、ヒトおよび動物の栄養においてそれらの濃度は非常に重要である(Ahm
ed,I.およびKhan,M.A.、Aquacult.Nutr.10:217〜2
25(2004年))。リシン:アルギニン比が低いと、コレステロール低下効果を有し
(Sanchez,A.ら、Nutr.38:229〜238(1998年))、したが
って特許は、心臓血管疾患を有する患者に使用するタンパク質混合物のArg:Lys比
が少なくとも5.5:1で実施された(Radha,C.ら、特許出願 7091001
(2006年))。対照的に、単純ヘルペスウィルスのタンパク質はL−アルギニンに富
んでいるので、食物中でアルギニンに対するリシンの比が高いと、ウィルスの複製、治癒
時間および発生期間の細胞病原性の低下に役立つことが公知である(Griffith,
R.S.ら、Dermatologica 156(5):257〜267(1978年
))。したがって、ヘルペスの予防および治療において、アルギニンに富んだ食品を避け
、リシンに富んだ食品をより多く食べることが役立つことが示唆される。
の改善において、L−リシンおよびL−アルギニンを一緒に使用する療法が有用であり、
おそらくアルギニン/オルニチンの併用よりもさらに優れていることを示唆している。1
5例の15から20歳の健康な男性対象において、1.2gのアルギニンピログルタミン
酸とL−リシン塩酸塩との併用は、アミノ酸混合物の消費後、GHレベルが2から8倍、
有意に上昇した(Isidori,A.ら、Curr.Med.Res.Opin.7:
475〜481(1981年))。別の研究は、静止状態下で摂取した1.5gのアルギ
ニンおよび1.5gのリシンの摂取が、GHの分泌の急激な増加を起こすことを示した(
Suminski,R.R.ら、Int.J.Sport Nutr.7:48〜60(
1997年))。
気性フンゲート(Hungate)チューブ中の接種材料としておよび栄養食品補助剤と
して使用した。すべてのチューブにおいてCGPが完全に分解されたことは、CGPが消
化管の嫌気性環境のような、このような嫌気性環境において容易に分解され得ることを示
す。このことは、偏性嫌気性および通性嫌気性のCGP分解細菌に関する先に観察された
短期分解期間に類似した短期分解期間によってもさらに確認された(Obst,M.ら、
Appl.Environ.Microbiol.71:3642〜3652(2005
年);Sallam,A.ら、公開用に提出(2008年))。
分布していることが、初めて実証された(表1、2)。精製手順において観察されたCG
P分解コロニー間、およびその後得られた純粋培養間の形態的多様性もまた、環境サンプ
ルについての先行研究により示され、これにより原核生物中のCGP分解菌の広範囲の分
布が示された(表2)。他方、CGPを分解する能力は、特定の属の種においてより多く
分布しているように思われ、;今日までの細胞外CGP分解についての調査は、CGP分
解菌が、シュードモナス属およびバチルス属に広範囲に分布していることを示す(Obs
t,M.ら、J.Biol.Chem.277:25096〜25105(2002年)
;Obst,M.ら、Biomacromolecules 5:153〜161(20
04年);Sallam,A.ら、公開用に提出(2008年)、本研究)。しかし、こ
のことは、これらの細菌に有利にされた、用いられた実験室条件に関係する、または単純
に自然におけるこれらの細菌属の優勢のためと思われる。加えて、シュードモナス属およ
びバチルス属の菌株とは異なる多くのCGP分解細菌は、CGP分解能を損なうことなく
純粋培養することが非常に難しく(Obst,M.ら、Appl.Environ.Mi
crobiol.71:3642〜3652(2005年);Krug,A.、Dipl
om thesis、Institut fur Molekulare Mikrob
iologie and Biotechnologie,Westfalische
Wilhelms−Universitat、Munster、Germany(200
1年))、普通は無視される。
株のうち8株のみに観察された。このことに関する妥当な理由は、それらの天然環境にお
けるようなこれらの菌株と他の菌株との間の、それぞれ、多くの場合制限されたまたは必
要な物質の蓄積または枯渇をもたらす天然の相互作用の欠落である。このことは、成長お
よびCGP利用がその同時単離されたシトロバクター・アマロナティクス(Citrob
acter amalonaticus)G株の存在下で大幅に強化された、偏性嫌気性
芽胞形成菌のセディメンチバクター・ホンコンエンシスKI株に関する先行する観察に一
致する(Obst,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:3
642〜3652(2005年))。
れらはバチルスまたはシュードモナスなどの、好気性であることが公知の属に属する。し
かし、枯草菌(B.subtilis)および巨大菌(B.megaterium)の菌
株は、嫌気的に成長することが公知であり、一部は硝酸塩を還元することが公知である(
Glaser,P.ら、J.Bacteriol.177:1112〜1115(199
5年))。同様に、シュードモナス属のメンバーの嫌気的成長および硝酸塩還元も十分調
査されている(Sallam,A.ら、Submitted for publicat
ion(2008年))。ミクロモノスポラ(Micromonospora)、ストレ
プトマイセス(Streptomyces)およびブレビバチルス(Brevibaci
llus)の種もまた通性嫌気性であることが公知である(Cochrane,V.W.
、Annu.Rev.Microbiol.15:1〜26(1961年);Borod
ina,I.ら、Genome Res.15:820〜829(2005年);Bae
k,S.H.ら、Int.J.Syst.Evol.Microbiol.56:266
5〜2669(2006年))。一般的に、CGP分解に関する最近の調査は、通性嫌気
性菌の中にCGP分解細菌が広範囲に分布していることを指摘している。
究は、これらの物質を市場にもたらすことを要求される。本研究において試験した個々の
哺乳動物、鳥類または魚類の腸内細菌叢のおけるCGP分解細菌の広範囲な分布は、経口
投与されたCGPが少なくとも微生物的に高速で容易に分解されるであろうという第1の
証拠を提供する。さまざまな動物および鳥類の下部消化管に由来するこのような細菌(表
1)の単離は、CGPの分解が上部消化管で完了しなかった場合、下部において継続され
る可能性があることを示す。
あったことが明らかになった。(β−Asp−Arg)2テトラペプチドなどの高次のジ
ペプチドオリゴマーは、CGPから作製されなかった。このことは、シュードモナス・ア
ンギリセプチカBI株(Obst,M.ら、J.Biol.Chem.277:2509
6〜25105(2002年))、セディメンチバクター・ホンコンエンシスKI株(O
bst,M.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:3642〜3
652(2005年))およびシュードモナス・アルカリジェネスDIP1株(Sall
am,A.ら、公開用に提出(2008年))由来のCGPaseの効果と一致する。巨
大菌BAC19株の場合だけ、高次のこのようなオリゴマーが検出された(Obst,M
.ら、Biomacromolecules 5:153〜161(2004年))。ス
ピルリナは、何世紀にもわたってその栄養効果および治療効果が公知であり、今日まで、
多くの国において食品として消費されている。スピルリナのタンパク質含有量は、60%
以上に達することが公知である(Narasimha,D.L.R.ら、J.Sci.F
ood Agric.33:456〜460(1982年))。スピルリナ・プラテンシ
ス(Spirulina platensis)の市販の製品中のCGPの存在は、CG
Pが、スピルリナの定期的な消費のウェルビーイング効果に加わることができることを示
す。しかし、分析されたサンプル中の決定されたCGP含有量は、大きく変動し、相対的
に低かった。このことは、シアノバクテリアにおけるCGPの蓄積についての先行する研
究と一致し、CGPの蓄積が多くの因子により影響され、したがって変動することは公知
である(Elbahloul,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol
.71:7759〜7767(2005年))。さらに、市販のスピルリナ製品は、商業
化が許可される前に、多くの臨床試験および毒性試験を確実に通過してきた。このことは
、抽出されたCGPおよびCGP−ジペプチドが、経口摂取した場合毒性効果を誘導しな
いことを示す。さらに、CGPジペプチドは、細菌において成長のために普通に取り込ま
れ、利用され、標的調査の間に静菌効果または殺菌効果を全く示さなかった(データ非掲
載)。一般的に、スピルリナの公知の効果および応用はアルギニンに関して証明された効
果および応用と非常に類似しており、このことは、実際にこれらの効果の一部が、CGP
の含有量を含む、そのアルギニン含有量(約6%)によると思われることを示唆している
。
送体の大型のファミリーに属するオリゴペプチド透過酵素(Opp)およびジペプチド透
過酵素(Dpp)、ならびにPTR(Peptide TRansporter)ファミ
リーに属するジペプチドおよびトリペプチドのための輸送体である。最後の系だけが、酵
母から出発する高等真核生物において保存されている(Daniel,H.ら、Phys
iology 21:93〜102(2006年))。哺乳動物において、ジペプチドお
よびトリペプチドPEPT(SLC15ファミリー)のための輸送系は2種の変異体:腸
内PEPT1(SLC15A1)および腎性イソ型PEPT2(SLC15A2)を含む
。それらは、L−αアミノ酸およびそれらの誘導体を優先する立体選択的手段で、ほぼす
べての可能なジペプチドおよびトリペプチドを輸送する。D−アミノ酸だけ、または4個
以上のアミノ酸を含むペプチドは受容されない。PEPT1は、小腸を通し、その高い輸
送能力により優勢な発現を有するので、PEPT1のすべての薬剤基質は優れた経口利用
の可能性を有し、したがってPEPT1は薬剤送達の第1の標的となっている(Dani
el,H.ら、Physiology 21:93〜102(2006年))。CGPジ
ペプチドの構成L−アミノ酸である、Asp−ArgおよびAsp−Lys(組換えCG
P)は、α−βペプチド結合を介して連結される。この型の結合およびCGPジペプチド
の立体構造は、PEPT系の基質として作用し、摂取された場合、哺乳動物の腸内腔から
輸送され得ることが、強く想定される。したがって、CGPおよび/またはそのジペプチ
ドの使用は、治療薬および/または栄養剤としての構成アミノ酸の経口投与にとって理想
的な取り組みであると思われる。
その構造にさらに統合することが可能な、シトルリン、オルニチン、カナバニンまたはグ
ルタミン酸塩などのアミノ酸を含むアミノ酸の栄養的価値および臨床的価値は、何世紀に
もわたって公知である。これらのアミノ酸の合成オリゴマーの組み合わせは、遊離のアミ
ノ酸より高い生体利用効率を有することが証明されており、したがって、頻繁に調査され
、栄養および治療に用いられていた(前を参照されたい)。CGPは、遊離の形態のその
構成アミノ酸より低用量でより有効であることが期待できる、このようなオリゴマーの理
想的な天然供給源を表す。したがって、CGPおよびそのジペプチドの吸収、安全性およ
び効果は、現在調査中である。さらに、CGPに統合する他のアミノ酸に関する研究によ
り、期待できる結果が示された(データ非掲載)。得られたジペプチドは、いくつかの治
療分野、例えばアスパラギン酸−オルニチンを肝臓疾患の治療において用いることができ
る(Kircheis,G.ら、Hepatology 25:1351〜1360(1
997年))。その結果として、CGP構造における任意の将来の改変が、CGPジペプ
チドの範囲を広げ、その後、治療薬および/または栄養食品補助剤などのそれらの応用範
囲を拡大すると思われる。
に確立された。第I相は、バイオマスからCGPを工業的に単離するための、最適化され
た酸抽出方法に基づき、総計704gの純粋CGPを得、アスパラギン酸、アルギニンお
よび少量のリシンが構造的に含有された。第II相は、細胞外CGPase(CphE)
の醗酵性製造を表し、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1株から、500l規模
で、単一基質として1g/lのクエン酸塩を使用して酵素を生産し、17.5gの粗タン
パク質粉末を得、CGPに対して高い分解活性を示した。第III相は、CphEを介し
たCGPの分解を含み、250gのCGPを、99%以上の純度(TLC、HPLC)の
β−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンのジペプチドに分解
した。第III相の全体の効率は、91%であり、使用したCphE粉末の78%(wt
/wt)が回収され、CGPに対する持続性の活性を示した。確立された方法は、工業基
準の材料および設備に依存し、あらゆる所望の規模に適用可能である。
成長し、それらの最小量を必要とすることが公知である。このような菌株の高い酵素産生
力も、細胞外リパーゼの醗酵性製造にそれらを用いる主な理由である(WO95/307
44;Gerritse、G.ら、Appl.Environ.Microbiol.6
4:2644〜2651(1998年);Moore,E.R.B.ら、Mai1999
年。Pseudomonas:Nonmedical.Mooreら、(編)、The
Prokaryotes:An Evolving Electronic Resou
rce for the Microbiological Community、第3
版、release 3.0、Springer−Verlag、New York))
。DIP1株由来のCGPaseの高い安定性および活性(Sallam,A.およびA
.Steinbuchel.2007b。Anaerobic and aerobic
degradation of cyanophycin by the denit
rifying bacterium Pseudomonas alcaligene
s strain DIP1−Role of other three co−iso
lates in the mixed bacterial consortium。
公開用に提出。)に加えて、これらの特徴は、この菌株を設計した工業的方法にとって理
想的であると考える主要な因子であった。
よって、同じ目標を達成するためにいくつかの試験を実施したが、その戦略は成長細胞に
よってCGP−ジペプチドが急速に消費されるためあまり有効ではなく、この問題を、D
IP1株の細胞を排除して定義した三相性方法の手順において避けた。さらに、直接培養
により得られたジペプチド溶液は大量であり、したがって、操作が非常に困難であり、さ
らに得られたジペプチド溶液中の少量のタンパク質および塩の存在が、その戦略の別の欠
点を表した。対照的に、三相方法によるCGPの分解濃度および分解時間は完全に調節可
能である。その結果、得られたジペプチド溶液は少量に制限され容量を操作しやすい。最
も高い試験濃度(50g/l)は、将来の応用のためにさらに最適化でき、本方法を経済
的により有効にする態様の1つである。
適化および基質利用において得られた結果は満足のいくものであり、工業的な量において
安価な基質であり、単一基質として、用いられる菌株にとって理想的であったクエン酸塩
は、細胞外リパーゼの醗酵性製造にすでに用いられていた(Gerritse,G.ら、
Appl.Environ.Microbiol.64:2644〜2651(1998
年))、しかし、粗CphE(第II相)の製造相のために最適化された培地の必要が、
醗酵期間、特に誘導および分解相の期間の濁度グレードの正確なモニタリングの必要を介
して浮上する。実験的CGP分解による先の経験により、不透明な培地および細胞の力強
い成長は誤解を招く恐れがあり得、加えて、細胞のより望ましい成長は細胞外CGPas
eのより多い製造を本質的に意味しなかった(非公開データ)ことを示した。
on.Microbiol.68:3377〜3384(2002年)のCGP酸抽出方
法は、バイオマスの任意の工業的な量から純粋なCGPを単離するために適切になるよう
に最適化された。もともとの方法の最も有効な変化は、溶解したCGPの滅菌ろ過ステッ
プであり、この手順は、希HClに溶解しないいかなる細胞デブリも完全に除去すること
を保証した。対照的に、希釈酸および水を用いる増加した精製ステップは、CGPの損失
を不必要に増加する恐れがあり、このことは、得られたCGPと抽出量との差を説明する
。CGPの損失およびその抽出に必要な時間は、CGPを4℃に静置する代わりに、CG
Pを遠心分離機にかけることによって最小化できる。
合、大幅に増加でき、この場合、単離するCGPの分子サイズより、一方は大きく他方は
小さい、2つの異なるCOPを備えた2つのカセットが必要であり、この2つのカセット
は、それぞれ、溶解状態および沈殿状態のCGPにおいてCGPの交互のろ過に用いるこ
とができる。しかし、このような限外ろ過カセットの比較的高い価格およびさらに限られ
た寿命により、それらの適用はコストの問題となる。
の製造を保証し、濁度変化と培地中のCGP量とを排他的に参照するために定常期に用い
る。
調節したが、これは、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1株の細胞によるアンモ
ニアの放出のためである可能性が最も高い。この菌株に関する類似の生理的挙動が、CG
P分解についての先行調査に記録されていた(Sallam,A.およびA.Stein
buchel.2007b。Anaerobic and aerobic degra
dation of cyanophycin by the denitrifyin
g bacterium Pseudomonas alcaligenes stra
in DIP1−Role of other three co−isolates
in the mixed bacterial consortium.公開用に提出
。)。
に、もともとのジペプチド溶液中の不純物の最初の欠乏による。このことは、細菌細胞を
用いた直接培養戦略と比較した、定義された酵素的方法の適用に関する別の有利性を表す
。他方、ろ過によるジペプチドの量的損失が予想され、不運なことに避けられない;ろ過
材料、カットオフ点、および/またはろ過する物質それ自体の特徴を含む、いくつかの一
般因子がこのような損失を起こすことが公知である。このことは、分解相期間(第III
相)のCGPの9%および粗CphEの22%の損失も説明する。その上、新しいろ過膜
(0.5−10kDa、COP)だけを試験し、その結果CGP−ジペプチドの損失量は
、飽和まで膜表面に付着する可能性が最も高い。
能であり、したがって最適化の途中であり、これらの態様は、粗CphEのより高い生産
力、CphEの工業的精製戦略の可能性および分解相のより有効な条件を含む(非公開デ
ータ)。CGP−ジペプチドの商業的価値は、CGPそれ自体の製造コストに直接関係す
るが、この数年にわたって、CGPの製造は、いくつかの細菌株を使用して重点的に調査
され、最適化され、その結果、CGP含有量の増大が、新規のより適した経済的な基質を
使用して達成され、これらの進歩は商業的CGP製造の方向に移動したと思われ(上を参
照されたい)、この方法はさらに、他の公知な細菌性ポリ(アミノ酸)例えばポリ(グル
タミン酸)およびポリ(ε−リシン)により、技術および食品応用のために商業化される
ことが必要であった(Oppermann−Sanio F.B.ら、Naturwis
senschaften 89:11〜22(2002年);Obst,M.ら、Bio
macromolecules 5:1166〜1176(2004年)により総説され
た)。その時まで、CGP−ジペプチドの生物医学的価値は、CGPの実際の製造コスト
とのバランスの取れた関係を実際に提供できるであろう。したがって、CGP−ジペプチ
ドの生物医学的効果は現在調査中であるSallam,A.およびA.Steinbuc
hel.2007c。Potential of cyanophycin and i
ts β−dipeptides as possible additives in
therapy,food and feed industries)。
たバイオテクノロジー的方法を最適化した;もともとの方法は、3相:第I相:バイオマ
スからの純粋CGPの大規模抽出;第II相:シュードモナス・アルカリジェネスDIP
1株からの粗シアノフィシナーゼ(CphEal)の大規模製造、第III相:CGPの
そのジペプチドへの分解からなった。最適な培養条件は、第II相のために決定した;2
g l−1のクエン酸塩、pH6.5および培養温度37℃。CphEalのインデュー
サーとしてのCGPの最適濃度は50g l−1であり、これは以前に適用した濃度の1
/5を表す。最大酵素濃度は誘導5時間後に得た。CGP−ジペプチドの同じ濃度は、わ
ずか3時間後に同様の誘導効率を示した。さらに、最適条件の4g l−1のL−アスパ
ラギン酸はCphEalを誘導したが、CGPと比較して1/3の効率であった。Cph
Ealは、CGPに対する基質特異的結合を介して精製した。精製された酵素を特徴付け
、50℃およびpH7〜8.5において最大活性を有するセリンプロテアーゼであるとい
う結果になった。もともとの方法の第III相の条件(CGP分解);50g l−1の
CGP、10g l−1の粗CphEalおよびインキュベーションは30℃において1
0時間を、100g l−1のCGP、10g l−1の粗CphEalおよびインキュ
ベーションは50℃においてわずか4時間に最適化できた。CGPは、純度99%以上(
HPLC)のβ−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンジペプ
チドに分解された。これらの最適化により、コスト、時間および労力がより有効な工業的
方法が得られた。
の利用可能なチャージについての予備試験により、CGP製造にとって7%(vol/v
ol)が最適であることが明らかになったが、プロタミラスの前のチャージについてのE
lbahloul,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:7
759〜7767(2005年)の先行する研究において、最適濃度が6%(vol/v
ol)であることが見出された。このことは、工業的デンプン製造の残留化合物であるプ
ロタミラスは、チャージごとに変動しうる組成物を含む複合培地であり、したがって培養
培地として適用前に調整されなければならない。
活性化するために温度を37℃に上昇させ、その結果CGP−シンテターゼ(CphA)
遺伝子の誘導を可能にした。この時点で、組換え大腸菌株の細胞は、すでに2時間対数増
殖期であった。この醗酵経過が、CGP−シンテターゼの誘導およびCGPの最大の細胞
内蓄積に最適であることが証明された(Frey,K.M.ら、Appl.Enviro
n.Microbiol.68:3377〜3384(2002年))。
。このことは、37℃への温度上昇に加えて強力な細胞成長のための培地中の酸素の減少
により説明できる。明らかに、培地中の酸素含有量はあらかじめ調整した最小値より低下
し、攪拌の自動増加を起こし、これが順に泡および気泡の高度の形成をもたらし、その後
OD850nm値が不正確になった。消泡剤の手動の添加は、濁度の急速な低下を起こし
、正常なレベルに達した。
酵を終了させた。しかし、醗酵サンプルの後の分析により、より良い取得時間が13時間
のインキュベーション後であったことが示された。その時点において、CGP含有量は約
13%(CDMのwt/wt)であり、一方15時間後に10%(CDMのwt/wt)
に下降した。この損失は、明らかに、CGP含有量の、醗酵期間中に唯一可能な方法であ
った顕微鏡予測の不正確さのためであった。さらに、CGP含有量の減少は、インキュベ
ーション中の時間に発生するプラスミドの損失の可能性が最も高い(Elbahloul
,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:7759〜7767
(2005年))。ポリマーの抽出および精製後、HPLC分析により、CGPの高純度
および3種のアミノ酸:アスパラギン酸(47.7mol%)、アルギニン(45.6m
ol%)およびリシン(6.8mol%)からなることが明らかになった。SDS−PA
GEにより、CGPが25〜30kDaの分子サイズを有することが示された。これらの
特徴は、いくつかの培地上の同じ菌株により以前に産生されたCGPの特徴と非常に一致
する(Frey,K.M.ら、Appl.Environ.Microbiol.68:
3377〜3384(2002年);Elbahloul,Y.ら、Appl.Envi
ron.Microbiol.71:7759〜7767(2005年))。
モナス・アルカリジェネスDIP1株からの、CphEalの大規模製造に適用された。
この培地は、その単純でコストのかからない組成物のため、ならびに使用する菌株に対し
て適切であるため好ましい(Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2
008b。Biotechnological process for the te
chnical production of β−dipeptides from
cyanophycin。準備中)。しかし本研究の期間中、成長に最適なクエン酸塩濃
度は6g l−1にもかかわらず、このような培養においてCphEalは産生されなか
った。CphEalの最大の製造は2g l−1のクエン酸塩で成長する培養において起
こった;このことは、この酵素が基質の制限下においてのみ誘導されることを示した。温
度およびpHの最適条件に関する他の実験は、37℃および5.5〜7.5のpH範囲を
示し、DIP1株およびCphEalの製造にとって最適な最適条件は6.5であった。
これは、はじめに1g l−1のクエン酸塩、pH7.5およびインキュベーション温度
30℃を適用した製造方法の効率を強化した(Sallam,A.およびA.Stein
buchel.2008b。Biotechnological process fo
r the technical production of β−dipeptid
es from cyanophycin。準備中)。
l−1)のわずか1/5(50mg l−1)が、同じ効果をもたらすために十分であ
ったことを明らかにした。さらに、CGP−ジペプチドは、同じ効率でCphEalを誘
導するためには同じ濃度(50mg l−1)で十分であった。しかし、ジペプチドによ
り誘導される培養液を取得するまでに必要な短時間のインキュベーション期間(3時間)
は、CGP−ジペプチドが、CphEalの実際のインデューサーであり、CGPそれ自
体ではないことを示す。加えて、アスパラギン酸は、CGP−ジペプチド以外のCphE
alの良好なインデューサーであり、4g l−1の濃度および5時間のさらなるインキ
ュベーション期間がCphEalの最大の製造に必要であり、これは、CGPまたはその
ジペプチドの製造効率のわずか1/3のCphEalの製造効率であったことを表した。
したがって、将来の適用におけるインデューサーの選択は、依然として状況およびコスト
依存性のままである。
℃の代わりに50℃においてより有効であることが見出された。この最適化は、30℃に
おいて1/4の分解時間で容易に分解可能にするために、CGP濃度をはるかに高くする
(最大100g l−1)。このことは、温度が10ケルビン(10℃)上昇すると反応
速度が2倍になるというVan’t Hoffの方程式に一致する。さらに、分解混合物
の体積および分解混合物の汚染の危険性がこのような温度上昇において最小化される。イ
ンキュベーション温度30℃および50℃の双方において、分解時間は、粗CphEal
濃度の減少およびCGP濃度の増加と共線性増加を示した。したがって、得られた式は、
将来の方法適用において最適な分解パラメーターの適用に役立ち得る。分解相の効率は5
0℃において非常に高いので、式は50℃における適用に関して計算し、その結果、最大
100g l−1のCGP濃度に適している。
率が提供された。逆に、CGPに対する特異的結合による開発された手順は、高度に有効
であることが証明され、単一の基質(CGP)を使用する粗溶液中の他のタンパク質から
、CphEalを分離する有利性を有する。精製方法は、CGPマトリックスをそのジペ
プチドに分解することで終了し、これらは同時にこの方法の価値のある最終産物であり、
したがってさらに主要な製造流に向かうことができる(材料の損失はない)。精製方法は
、容易に規模を拡大でき、所望であれば将来の方法の適用に統合される。
能性を上げるために、2つの式を作り出した。第1の式(s.a.)は、CphEalの
測光分析に基づき、粗上清中のCphEal含有量の高速決定を可能にする。CphEa
lの決定された濃度は、その後第2の式に統合することができ、結合するCGPの必要量
を評価し、その結果純度、上清中のCphEalの完全な含有量を評価する。このスキー
ムは、それらのタンパク質組成が大きく異なり得る粗CphEalの将来の製造チャージ
のための信頼できる道具を提供する。
解されたが、含有量は低かった。このことは、シュードモナス・アルカリジェネスDIP
1株由来のCGPaseが、それぞれ、以前に特徴付けられた、シュードモナス・アンギ
リセプチカB1株および巨大菌BAC19株由来のCphEPaおよびCphEBmほど
特異的ではないと思われることを示している。この非特異的効果に関するより妥当な説明
は、精製酵素溶液中にわずかな他のタンパク質が存在することである。これらのタンパク
質が、高度に濃縮されたサンプルにおいてのみ、SDS−PAGEにおいて集中的な硝酸
銀染色により可視化されたにもかかわらず、非特異的プロテアーゼの最少量は、CGP以
外の被検基質にこのような効果を生み出すと思われる。
アーゼ阻害剤のペファブロック(Pefabloc)(登録商標)およびPMSF双方に
より大きく阻害された。このことは、このCGPaseがセリン型のプロテアーゼに属す
る可能性が最も高いことを示す。このことは、以前に特徴付けられたCGPase;Cp
hB、CphEPaおよびCphEBmに関する結果と一致する。さらに、CphEal
はトリプトファン酸化剤のN−ブロモコハク酸イミドにより完全に阻害され、トリプトフ
ァン残基が酵素の触媒機序に関連していると思われることを示す。また、このことは、C
phEalおよび細胞外CphEPaおよびCphEBmの間の高い類似性を指摘する。
ロイペプチンまたはEDTAを用いて処理されたCphEalサンプルは、CGP重層寒
天プレートにおいて阻害活性を示さなかったが、EDTAを用いて処理されたサンプルの
HPLC分析は、約75%のCGPaseの阻害を示した。このことは、OPA誘導体化
の間に大量の沈殿が形成されたためであり、酵素が阻害されたためではない。(Obst
,M.ら、J.Biol.Chem.277:25096〜25105(2002年);
Obst,M.ら、Biomacromolecules 5:153〜161(200
4年))。以前に特徴付けられた、それぞれ、シネコシスティス属(Synechocy
stis)種PCC6803、シュードモナス・アンギリセプチカB1株および巨大菌B
AC19株由来のCphB、CphEPaおよびCphEBmと比較した、シュードモナ
ス・アルカリジェネスDIP1株のCphEalの生化学的特徴を、表3に表示した。精
製CphEalのいくつかの特徴はCphEPaおよびCphEBmの特徴と比較的類似
していたが、関連する違い、例えば分子サイズおよび至適温度を観察することができる。
後者はCphEalに関して50℃であり、これは公知のCGPaseすべてに関して最
も高い至適温度であり、その結果、純粋および粗形態でこの酵素を適用することの大きな
利益を提供する。精製酵素は、至適pH範囲7〜8.5、最適は8.5を示し、これは粗
酵素(5.5〜7.5、最適は6.5)に関して決定された至適pH範囲から移行する。
このことは、複合環境を表す粗抽出物中に多くの他のタンパク質が存在し、このような環
境内の相互作用が、順に、CGPaseの構造および/または特性に影響を及ぼし得るこ
とによる可能性が最も高い。細胞系、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1は、2
008年6月10日に、DMSZ、Deutsche Sammlung von Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH、Masc
heroder Weg 1b、38124 Braunschweig、German
yに受託番号DSM 21533として寄託された。
解釈するべきではない。
サンプリングおよびサンプルの調製:腸内細菌叢のサンプルを、新鮮に解体された健康
な標本から採取した(表1)。反芻動物を除いて(授乳歴が決定できない)、選択された
すべての動物、鳥類および魚類は、少なくとも部分的に自由に生活し、自由に食餌をして
いた。サンプルは、個々の供給源の動物の消化管に沿って、完全に満たされた50mlの
滅菌ファルコンチューブにより、いくつかの部位から採取され(表1)、使用まで4℃に
維持された。サンプルを滅菌標準生理食塩水で希釈し(表1)、その後滅菌条件下で固体
材料からろ過した(ひだ折フィルター(folded filter)、Schleicher & S
chuell、Dassel、Germany)。糞サンプルを滅菌食塩水中で刻み、上
記のようにろ過した。
用した:1.0gのNH4Cl、3.0gのKH2PO4、3.0gのK2HPO4、0
.1gのKCl、0.5gのMgCl2・6H2O、0.1gのCaCl2・2H2O、
0.5gのNaCl、0.5gのシステイン−HCl、0.5gの酵母エキス(テキスト
に指示がない限り)、10mlのSL10の微量成分溶液および1mgのレザズリン/l
蒸留水。pHを、KOHを用いて7.0に調整した。培地を沸騰させ、Na2S・9H2
Oを、最終濃度0.04%(wt/vol)になるように加えた後で、早急にフォルミエ
ガス(Formier gas)(N2:H2、95:5%、vol/vol)雰囲気を含有する嫌
気性チャンバー(A型−手動気密室;Coy Inc.、Grass Lake、MI、
USA)に移した。室温に冷却後、10mlのアリコートをフンゲイトチューブに分注し
、密閉し、嫌気性チャンバーから取り出し、その後、オートクレーブで121℃において
20分間滅菌した。好気培養を、還元剤のシステイン−HClおよびNa2S・9H2O
を欠いたBM培地を含有する100mlのKlettフラスコにおいて実施した。
,J.ら、Molecular cloning:a Laboratory Manu
al、第2版。Cold Spring Harbor、NY:Cold Spring
Harbour Laboratory(1989年))を、CGP分解細菌の精製お
よび生存培養の維持のために使用した。
.ら、Macromolecules 31:6426〜6433(1998年)の変法
無機培地(SM培地)を使用した;1.0gのNH4Cl、5.0gのKH2PO4、1
gのMgSO4・7H2O(個別に滅菌および添加)、および10mlの微量成分ストー
ク(stalk)溶液/l水道水。微量成分ストック溶液は、ニトリロ三酢酸(70mM、p
H6.5)、FeSO4・7H2O(5g/l)、MnCl2・4H2O(0.85g/
l)、CoCl2・6H2O(0.14g/l)、CuCl2・2H2O(0.085g
/l)、H3BO3(0.17g/l)、ZnSO4・7H2O(0.9g/l)および
Na2MoO4・2H2O(0.09g/l)を含有した。培地のpHを7・0に調整し
、その後オートクレーブで121℃において20分間滅菌した。
用し、Pilotshake RC−4/6−W 水平振とう機(Kuhner AG、
Birsfelden、Switzerland)において150rpmでインキュベー
トした。CGP重層寒天プレートを調製するために、1.2%(wt/vol)のバクト
アガー(bacto−agar)をCGP懸濁液(1〜2g/l)に加え、この混合物を
その後、オートクレーブで121℃において20分間滅菌し、45℃に冷却後、すでに調
製されたSM寒天プレート上に薄層として注いだ。
をCGP懸濁液(1〜2g l−1)に加え、この混合物をその後、オートクレーブで1
21℃において20分間滅菌し、45℃に冷却後、すでに調製されたSM寒天プレート上
に薄層として注いだ。
−PHB−4−Δeda(pBBR1MCS−2::cphA6308/edaH16)
(Voss,I.ら、Metabol.Eng.8:66〜78(2006年))の凍結
乾燥細胞から単離し、改良酸抽出方法(Frey,K.M.ら、Appl.Enviro
n.Microbiol.68:3377〜3384(2002年))に従って精製した
。CGPを、スピルリナの市販の製品から、先にシアノバクテリアに関して記載した方法
(Simon,R.D.ら、Biochim.Biophys.Acta420:165
〜176(1976年))に従って単離した。
rey,K.M.ら、Appl.Environ.Microbiol.68:3377
〜3384(2002年));CGP含有乾燥質量を水道水に懸濁し、最終濃度0.1g
/mlとした。pHを、濃HCl(32%)を用いて1まで下げ、一晩攪拌した。懸濁液
を、CEPA Z61連続遠心分離機(CEPA、Carl Padberg Zent
rifugenbau GmbH、Lahr、Germany)を用いて17000rp
mにおいて遠心分離し、ペレットを20lのHCl 0.1Nに再懸濁し、1時間攪拌し
、再度遠心分離し、上清を第1のチャージに加え、一方ペレットは廃棄した。CGP含有
上清を、CGPが沈殿するように30lのガラス瓶においてNaOH(50%)を用いて
中和(pH7.3)した。上清を廃棄する前に、乳状懸濁液を4℃において一晩放置した
。希HCLに不溶なすべての不純物を取り除くために、3回以上CGPを繰り返し溶解し
、中和した。得られたCGPを30lのHCL 0.1Nに溶解し、0.2μmのSar
tobran−Pフィルターユニット00型(Sartorius AG、Gottin
gen、Germany)を通した。溶液を、NaOHを用いて再度中和し(pH7.3
)、一晩放置し、上清を廃棄した。あらゆる水溶性の不純物および脱塩CGPを除去する
ために、ペレットを、5倍のベッドボリュームの蒸留水を用いて3回連続して洗浄した。
最終的に、CGPのペレットを20000rpmにおいて遠心分離し(CEPA Z41
連続遠心分離機)、−30℃において凍結し、BETA1−16型凍結乾燥機(Chr
ist Gefriertrocknungsanlagen、Osterode、Ge
rmany)において凍結乾燥した。
:1(vol/wt)の割合でCGPに加えた。15分後、溶媒を廃棄し、完全に蒸発し
た後、CGPを滅菌0.1NのHClに溶解することで微粒子の懸濁液を得、その後、p
H7.3において、等量の滅菌0.1NのNaOHを加えることによりポリマーを沈殿さ
せた。または、CGPをまず0.1NのHClに溶解し、フィルターを通し(細孔径0.
2μm、Millipore GmbH、Eschborn,Germany)、最終的
に上記のように再沈殿させた。ストック溶液中のCGPの濃度を、短時間の遠心分離(3
500×g、2分間)でCGPを沈降させることによって、もしくは単純に、CGPを4
℃において一晩沈降させることによって調整した。双方の場合において、その後上清を部
分的に廃棄し、最終的に所望のCGP濃度を得た。嫌気性のCGP分解に関する実験を、
嫌気的に調製した、0.5gl−1の酵母抽出物を含む、または含まない10mlのBM
を含有するフンゲートチューブにおいて実施した。滅菌CGP懸濁液を、嫌気的に調製し
たBMフンゲートチューブに、最終濃度1g l−1になるように直接注入した。チュー
ブ内のCGPの視覚的消失は、その分解を示した。CGP重層寒天プレートの調製のため
に、1.2%(wt/vol)のバクトアガー(bacto−agar)をCGP懸濁液
に加え、この混合物をその後、オートクレーブで121℃において20分間滅菌し、45
℃に冷却後、すでに調製されたBM寒天プレート上に薄層として注いだ。
ンプルを得た場所の生息環境の自然条件を刺激するために、調製サンプルを、接種材料お
よび栄養食品補助剤として、同時に使用した。BM培地(酵母抽出物非含有)中の1g
l−1のCGPを含有する滅菌嫌気性フンゲートチューブに、最終濃度10%になるよう
に接種し、37℃においてCGP分解が起こるまでインキュベートした。
製菌叢サンプルの100μlのアリコートを、好気的に調製された、CGPを重層したB
M寒天プレートにスプレッドした。37℃において数日間インキュベートした間に、プレ
ートを、CGP分解細菌のコロニーにより起こるハローの出現に関して検査した。さらに
、インキュベーションの間、コロニー計測手順を用い、CGP分解細菌のコロニーと非分
解細菌のコロニーとの割合を決定した。
ーを示すコロニーから、新鮮なCGP重層寒天プレートに、連続3世代の間材料を移すこ
とによって選択し、さらに精製した。純粋培養をCGP重層寒天プレートにおいて試験し
、それらがCGP分解能を保有していたことを確認する前に、さらに、3ステップの精製
をLB寒天プレートにおいて適用した。
件下で異なる培地において培養することによって、定期的に確認した。
うなo−フタルジアルデヒド(phtaldialdehyde)(OPA)試薬を用いた、それらの遊離
のアミノ基の予備カラム誘導体化(Aboulmagd,E.ら、Arch.Micro
biol.174:297〜306(2000年))後に、逆相HPLC(Kontro
n Instruments、Neufahrn、Germany)によって検出した。
CGPサンプルの分析のために、ポリマーをあらかじめ酸加水分解に供した(6N HC
l、95℃、一晩)。同様に、酸加水分解をジペプチド構成アミノ酸の定性的確認および
定量的確認に適用した。HPLC系はB801カラム(Prep Nova−Pak H
R 3.9×300)(Knauer GmbH、Berlin、Germany)を備
えており、初期溶出剤(81%、vol/vol、酢酸ナトリウム(50mM):19%
、vol/vol、メタノール)を用いて平衡化した。アミノ酸のOPA誘導体を、40
℃において流速1.0ml/分でメタノール勾配(19〜75%、vol/vol)によ
り溶出し、その後330/450nm(励起/発光)において、モデル1046A 蛍光
検出器(Hewlett Packard、Waldbronn、Germany)を用
いて蛍光分析的に検出した。較正のために、クロマトグラフィー的に純粋なアミノ酸を使
用した(Serva Feinbiochemica、Heidelberg、Germ
anyによるKollection AS−10)またはシュードモナス・アルカリジェ
ネスDIP1(CphEal)の細胞外CGPaseを用いるCGPの総酵素的加水分解
によって作製されたジペプチドを使用した(Sallam,A.ら、公開用に提出(20
08年))。
Eppendorf、Hamburg、Germany)に挿入後、578nmにおける
濁度の増加を測定することによってモニターした。
rck,Darmstadt,Germany)に適用し、HPLCの初期溶出をTLC
にもラン(rum)バッファーとして使用し、染色のために、アセトン中20%(wt/vo
l)ニンヒドリン溶液を適用した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(SDS−PAGE)を、Laemmli、U.K.、Nature227:68
0〜685(1970年)に倣って、11.5%(wt/vol)のゲルにおいて実施し
た。タンパク質およびシアノフィシンを、クマシー(Coomassie)染色方法(W
eber,K.ら、J.Biol.Chem.244:4406〜4412(1969年
))により染色し、その後銀染色法(Heukeshoven,J.ら、Electro
phoresis 6:103〜112(1985年))により染色し、タンパク質を低
濃度で可視化する。
ノムDNAの単離を実施した(Rao,R.N.ら、Methods Enzymol.
153:166〜198(1987年))。16S rRNA遺伝子を、全DNAから標
準オリゴヌクレオチドプライマー(MWG−BIOTECH AG、Ebersberg
、Germany)を使用してPCRにより増幅した。PCR産物をNucleo−tr
ap CRキットを使用して精製し(Macherey−Nagel、Duren、Ge
rmany)、その後直接配列決定した。DNAの配列決定を、臨床科学および医学的検
査のための機関(W.W.U.Munster、Germany)において、キャピラリ
ーシーケンサー(ABI Prism 3730 DNA アナライザー)において通常
通り実施し、配列を、データ収集ソフトウェアv3.0(双方ともApplied Bi
osystems、Darmstadt、Germanyによる)により分析した。配列
反応を製造業者により示された手順に従って、BigDye(登録商標)ターミネーター
v3.1サイクル配列決定キット(Applied Biosystems、Darms
tadt、Germany)および以下の配列決定プライマーを使用して、調製した:
27f (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 配列番号1),
343r (5'-CTGCTGCCTCCCGTA-3'; 配列番号2),
357f (5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'; 配列番号3),
519r (5'-G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3'; 配列番号4),
536f (5'-CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C-3'; 配列番号5),
803f (5'-ATTAGATACCCTGGTAG-3'; 配列番号6),
907r (5'-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3'; 配列番号7),
1114f (5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'; 配列番号8),
1385r (5'-CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3'; 配列番号9)および
1525r (5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'; 配列番号10)
(MWG−BIOTECH AG、Ebersberg、Germany)。
llam,A.ら、公開用に提出(2008年)):核酸配列データを、Contig
Assembly Program(CAP)オンラインソフトウェアを用いて分析した
。配列を、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center
for Biotechnology Information)(NCBI)のデー
タベースにおいて利用可能なブラスト機能を使用して、代表的菌株および他の細菌のすで
に公開された配列とアライメントした。参照配列を、ClustaIX 1.8ソフトウ
ェアを使用してアライメントし、系統樹をTreeView 1.6.5およびNJpl
otプログラムを使用して構築した。ブートストラップを、100回のリゼンブリング(
resemblings)を実施することによって、樹のトポロジーを評価するために適用した。
高さ198cm)を有し、d/D値の関係(攪拌器の直径対攪拌槽の直径との関係)が0
.375である、Biostat D650ステンレススチールのバイオリアクター(B
.Braun Biotech International、Melsungen、G
ermany)において実施した。このバイオリアクターは、3つの攪拌器を装備してお
り、それぞれが6個のパドルおよびFunda−Foamの機械的破泡装置(B.Bra
un Biotech International、Melsungen、Germa
ny)を含む。さらに、ポートを滅菌可能なプローブとして使用し、溶解酸素(pO2)
(モデル25;Mettler Toledo GmbH、Steinbach,Swi
tzerland)、pH(モデルPa/25;Mettler−Toledo Gmb
H)、泡(モデルL300/Rd.28;B.Braun Biotech Inter
national、Melsungen、Germany)、温度(pt100電極;M
.K.Juchheim GmbH、 Fulda、Germany)および850nm
における吸光度(モデルCT6;Sentex/Monitek Technology
Inc.)を測定した。操作を、デジタル調節ユニットとMFCS/winソフトウェ
アパッケージ(B.Braun Biotech International)との併
用によって調節し、記録した。培養は30℃において実施し、pO2を倍地中で飽和の4
0%を超えるように調整し、攪拌によって自動的に調節され、通気速度は0.7vvm(
体積/体積×分)で一定であった。培地の最初のpHは6.9であり、成長が耐えられる
pHの上昇は最大7.5であり、そうでない場合、4NのHClを添加することによって
pHを調節した。
続遠心分離機(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH、
Lahr、Germany)を用いて遠心分離により細胞を取得した。分子サイズ30k
Daを超えるタンパク質を濃縮し、その後、30kDaのCOP(カットオフポイント)
およびSartocon(登録商標)2Plus型(Sartorius AG,Got
tingen,Germany)のステンレススチールホルダーを有するクロスフローS
artocon(登録商標)ポリエーテルスルホン・カセットを使用して、脱塩した(5
倍のベッドボリュームのH2O)。
スコにおいて調査し、個々のフラスコは、10mlのSM培地および以下の基質の1種を
1g l−1で含有した:乳酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、
グルコン酸塩、グルコース、フルクトース、スクロースおよびグリセリン。すべての基質
のストック溶液を、ろ過(細孔径0.2μm、Millipore GmbH、Esch
born、Germany)によって滅菌した。実験は2重に実施し、同じ試験条件下で
成長した前培養から接種した。成長を、30℃において24時間のインキュベーション期
間後、OD578nmにおける増加によってモニターした。
Apcc6803を有する組換え大腸菌DH1株を使用して500l規模の醗酵で生産し
た(Frey,K.M.ら、Appl.Environ.Microbiol.68:3
377〜3384(2002年))。基質および培地として、すでに適用したプロタミラ
ス(Avebe,Veendam,The Netherlands)培地を使用し、(
Elbahloul,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:
7759〜7767(2005年))により記載されたように希釈し、篩過し、遠心分離
することによって調製した。
4〜8%(vol/vol)の間の濃度のプロタミラス培地における100mlの培養を
、200mlのバッフル付きフラスコにおいて試験した;培地のpHは7.5であり、1
00mg l−1のアンピシリンを含有した。接種後、フラスコを、37℃において15
時間、振とう(120rpm)しながらインキュベートした(振とう器G25型、New
Brunswick Scientific GmbH、Nurtingen、Ger
many)。最終的に、CGP含有量を、個々のフラスコからの50mlのサンプルにお
いて測定した。
ol、pH7.5)、100mg l−1のアンピシリンおよび0.15%(vol/v
ol)のシリコン系消泡剤(50%;vol/vol、Wacker Silicone
s、Burghausen、Germany)を含有する2lのバッフル付きフラスコに
おいて培養し、30℃において20時間、振とう(110rpm、振とう器RC−6−W
型、Adolf Kuhner AG、Birsfelden、Switzerland
)しながらインキュベートした。
攪拌器の直径対攪拌槽の直径)が0.375である、Biostat D650ステンレ
ススチールのバイオリアクター(B.Braun Biotech Internati
onal、Melsungen、Germany)において実施した。このバイオリアク
ターは、3つの攪拌器を装備しており、それぞれが6個のパドルおよびFunda−Fo
amの機械的消泡装置(B.Braun Biotech International
、Melsungen、Germany)を含む。さらに、ポートを滅菌可能なプローブ
として使用し、溶解酸素(pO2)(モデル25; Mettler Toledo G
mbH、Steinbach,Switzerland)、pH(モデルPa/25;
Mettler−Toledo GmbH)、泡(モデルL300/Rd.28;B.B
raun Biotech International、Melsungen、Ger
many)、温度(pt100電極;M.K.Juchheim GmbH、 Fuld
a、Germany)および850nmの吸光度(モデルCT6;Sentex/Mon
itek Technology Inc.)を測定した。操作を、デジタル調節ユニッ
トとMFCS/winソフトウェアパッケージ(B.Braun Biotech In
ternational)との併用によって調節し、記録した。
mlの消泡剤溶液で満たし、インサイツで滅菌し、30℃に冷却後、100mg l−1
の滅菌アンピシリン溶液を添加し、その後4%(vol/vol)の前培養を接種した。
培養を最初の6時間は30℃において実施し、培地のpHを、6MのNaOHまたは6M
のHClを添加することによって7.5に維持した。pO2は、20%に一定に維持し、
攪拌によって自動的に調整し、通気速度は0.17vvm(体積/体積×分)で一定であ
った。発泡は、機械的破泡装置によって、または消泡剤(50%、vol/vol)の滅
菌溶液の添加によって自動的に調節した。インキュベーション6時間後、醗酵が終了する
まで温度を37℃に上昇させた。細胞を、CEPA Z61型連続遠心分離機(Carl
Padberg Zentrifugenbau GmbH、Lahr、German
y)を用いて、遠心分離により取得した。
ために、CGPの大規模抽出および精製のためにすでに最適化された酸抽出方法を適用し
た(Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2008b。Biotec
hnological process for the technical pro
duction of β−dipeptides from cyanophycin
。準備中)。最終的に、抽出CGPを−30℃において凍結し、BETA 1−16型凍
結乾燥機(Christ Gefriertrocknungsanlagen、Ost
erode、Germany)において凍結乾燥した。
のHClに溶解し、滅菌ろ過することによって滅菌した(Sallam,A.およびA.
Steinbuchel.2007b。Anaerobic and aerobic
degradation of cyanophycin by the denitr
ifying bacterium Pseudomonas alcaligenes
strain DIP1−Role of other three co−isol
ates in the mixed bacterial consortium.公
開用に提出。)。ストック溶液中のCGPの所望の濃度を、短時間の遠心分離(2800
×g、2分間)でCGPを沈降させることによって、もしくは、CGPを4℃において一
晩静置することによって沈降させることによって調整し、その後上清を部分的に廃棄し、
所望のCGP濃度を得た。
anostat Corporation、New York、USA)に挿入後、濁度
の増加を測定することによって、または600nmにおいて1mlのサンプルのODを、
Libra S5光度計(Biochrom Ltd.、Camebridge、UK)
を用いて測定することによってモニターした。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を、Laemmli、U.K.、Nature2
27:680〜685(1970年)に倣って、11.5%(wt/vol)のゲルにお
いて実施した。タンパク質のゲルにおける復元を、(Lacks,S.A.ら、J.Bi
ol.Chem.225:7467〜7473(1980年))に倣って適用した。タン
パク質およびシアノフィシンを、クマシー(Coomassie)染色方法(Weber
,K.ら、J.Biol.Chem.244:4406〜4412(1969年))によ
り染色し、または銀染色法(タンパク質に関してのみ)(Nesterenko,M.V
.ら、J.Biochem.Biophys.Methods 3:239〜242(1
994年))により染色した。総タンパク質およびCGPの濃度を、(Elbahlou
l,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol.71:7759〜776
7(2005年))により記載のように、ブラッドフォード(Bradford)試薬を
使用して決定した。培養サンプル中の高サイズタンパク質を、濃縮し、脱塩し、10kD
aの膜のビバスピン(Vivaspin)チューブ(Vivascience AG、H
annover、Germany)を使用して、または大容量のために、アミコン(Am
icon)チャンバー(Amicon、Beverly、USA)および10kDaの膜
(Millipore Corporation、Bedford、USA)を使用して
、限外ろ過によってCGP−ジペプチドから分離した。
)試薬を用いた、それらの遊離のアミノ基の予備カラム誘導体化(Aboulmagd,
E.ら、Arch.Microbiol.174:297〜306(2000年))後に
、逆相HPLC(Kontron Instruments、Neufahrn、Ger
many)によって検出した。CGPまたはCGP−ジペプチドの構成アミノ酸の分析の
ために、サンプルをあらかじめ酸加水分解に供した(6N HCl、95℃、一晩)。H
PLC系はB801カラム(Prep Nova−Pak HR 3.9×300)(K
nauer GmbH、Berlin、Germany)を備えており、初期溶出剤(8
1%、vol/vol、酢酸ナトリウム(50mM):19%、vol/vol、メタノ
ール)を用いて平衡化した。アミノ酸のOPA誘導体を、40℃において流速1.0ml
分−1でメタノール勾配(19〜75%、vol/vol)により溶出し、その後33
0/450nm(励起/発光)において、モデル1046A 蛍光検出器(Hewlet
t Packard、Waldbronn、Germany)を用いて蛍光分析的に検出
した。
、濃縮酵素溶液の少量のアリコートによるCGP重層寒天プレートにおける分解ハローの
形成によって検査し、このために、5mlの培養サンプルを、2800×gにおいて30
分間遠心分離し(Megafuge 1.0R、Heraeus Sepatech G
mbH、Osterode、Germany)、得られた上清の4mlを限外ろ過によっ
て100倍に濃縮した。培養サンプル中の酵素の定量的決定のために、以下のように測光
的方法を開発した;2μlの濃縮した培養上清を、1mlのCGP懸濁液(100mg
l−1)に加え、30℃において30分間チューブローテーターにおいてインキュベート
した(3rpm、502S型、Watson−Marlow GmbH、Rommers
kirchen、Germany)。最終的に、サンプルのOD600nmを測定し、分
解によるCGP量の減少を示し、順に、これを使用し、溶液中のCphEalの濃度を、
それぞれの較正曲線を介して示した。
1株(Sallam,A.およびA.Steinbuchel.2008b。Biote
chnological process for the technical pr
oduction of β−dipeptides from cyanophyci
n。準備中)を用いた、上記の500lの醗酵期間に得られた粗CphEal粉末を使用
して、必要な分解時間と関係したCGP濃度と粗CphEalとの間の最適な割合を決定
するために、純粋CGP懸濁液(水中、pH7.3)の段階希釈(50〜100g l−
1)を、それぞれ全体積1mlのエッペンドルフチューブに調製し、さまざまな量の粗C
phEal粉末[CphEal含有量4.6%(wt/wt)]を個々に調製されたCG
P濃度に加え、反応チューブをチューブローテーター(3rpm)において30℃でイン
キュベートし、CGPの完全な分解に必要なインキュベーション期間を明らかにした。
である1mlのCGP懸濁液(100g l−1)を含有するエッペンドルフチューブに
おいて実施し反応チューブはさらに10g l−1の粗CphEalを含有し、30℃に
おいて30分間インキュベートした。最適な分解温度のための反応混合物は、同様の濃度
のCGP(pH7.0)およびCphEalを含有し、15、20、25、30、35、
37、40、50、60または70℃において30分間インキュベートされた。双方の実
験後、すべてのチューブにおけるCGPの分解を、パーセントで計算し、一緒に比較した
。
(vol/vol)の間の冷エタノール、アセトンまたはメタノールの1mlを、エッペ
ンドルフチューブ中の50μlの濃縮粗CphEal溶液(14g l−1)に加え、反
応混合物を、−20℃において60分間インキュベートした。反応チューブを16000
×gにおいて5分間遠心分離した後で、ペレットを乾燥させ、50μlのリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.0)に再懸濁した。硫酸アンモニウム分画を、10mlの粗CphE
al溶液(3.5g l−1)における硫酸アンモニウムの飽和に対するパーセントの段
階的増加(10〜100%)により適用し、各ステップにおいてチューブを室温で30分
間インキュベートし、16000×gにおいて10分間遠心分離し、ペレットをリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁し、その後、限外ろ過によって脱塩した。すべて
のタンパク質ペレットを、CGP重層寒天プレートにおけるCGP分解に関して、および
SDS−PAGEにおけるタンパク質含有量に関して分析した。
不溶性基質(CGP)に対する強力な親和性によって開発し、CphEalはCGPにだ
け結合し、したがって沈降により取得できる。pH7.0において、酵素がCGPに完全
に結合するために必要な時間を決定するために、0.5mlの濃縮粗CphEal溶液(
14g l−1)を、0.5mlのCGP懸濁液(100g l−1)に加えた。最初の
10分のインキュベーションごとに、(短時間の遠心分離の)反応上清からの2μlのア
リコートを、CGP重層寒天プレートにおける分解活性に関して試験し、分解ハローの減
少が、CphEalのCGPに対する完全な結合を示した。実際の精製方法を、類似の1
mlの反応混合物において実施し、以下のように進めた:CphEalのCGPに対する
完全な結合後、混合物を30秒間(16000×g)遠心分離し、上清を廃棄し、ペレッ
トを10mlのリン酸ナトリウム緩衝液(50mM)を用いて5回洗浄した。その後、ペ
レットを1mlのリン酸緩衝液に懸濁し、回転させながら(3rpm)、CGPの完全な
分解が起こるまで、30℃において一晩インキュベートした。混合物を遠心分離し(5分
、16000×g)、その後、CGP−ジペプチドを限外ろ過により取り出し、上清の濃
縮タンパク質分画をSDS−PAGEにより純度に関して分析した。
phEalの温度安定性を決定するために、10μlアリコートを、さまざまな温度(1
0〜80℃)において20分間インキュベートし、その後その3μlを、30℃における
CGP重層寒天プレートでの分解活性に関して試験した。最適分解温度のために、3μl
アリコートの精製CphEal溶液を、1mlのCGP懸濁液(50mMのリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH7.0中に100g l−1)に加え、さまざまな温度(10、20、
30、40、45、50および60℃)において20分間インキュベートした。精製Cp
hEalによるCGPの最適分解pHのために、精製CphEalストーク(stalk)溶
液の3μlアリコートを、さまざまなpH値(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8
、8.5または9)の1mlのCGP懸濁液(50mMのリン酸ナトリウム緩衝液中に1
00g l−1)に加え、30℃において30分間インキュベートした。最終的に、CG
P分解を、上記のような双方の実験の反応チューブにおいて測光的に決定した。精製Cp
hEalの基質特異性を、以下のポリペプチド基質について、前記のように試験した(O
bst、M.ら、Biomacromolecules 5:153〜161(2004
年)):CGP、ウシカゼイン(Hammersten−grade)(Merck、D
armstadt、Germany)、ウシ血清アルブミン(BSA)(Roth、Ka
rlsruhe、Germany)およびポリ(α,β−D/L−アスパラギン酸)(B
ayer AG、Leverkusen、Germany)。
ートの精製酵素ストーク(stalk)溶液を、450μlのNa−リン酸緩衝液(50mM
)に加え、以下の基特異的阻害剤の1つの存在下で30℃において2時間インキュベート
した;ロイペプチン(チオール−プロテアーゼ)、EDTA(メタロプロテアーゼ)、ペ
ファブロック(Pefabloc)(セリン−プロテアーゼ)、PMSF(セリン−プロ
テアーゼ)またはN−ブロモコハク酸イミド(トリプトファン残基)。個々の反応混合物
の5μlのサンプルを、CGP重層寒天プレートにおける活性に関して分析した。その後
、5μlアリコートのCGPストーク(stalk)懸濁液(50g l−1)を反応チュー
ブに加え、さらに15分間インキュベートし、遠心分離し、HPLCを介して分解産物に
関してスクリーニングした。
過した菌叢サンプルは、多くのさまざまな細菌および高含有量の基質を含有した。これら
のサンプルを得た消化管内部の自然条件を刺激するために、菌叢溶液を接種材料として、
および栄養食品補助剤として同時に使用した。BM培地および1g l−1のCGPを単
一基質として含有する滅菌嫌気性フンゲートチューブに、10%濃度で接種した。すべて
の接種嫌気性チューブは、これらの条件下で完全なCGP分解を示した。チューブ内でC
GPの完全な分解に必要なインキュベート期間は、12から48時間に及んだ。
00μlアリコートの調製菌叢サンプルを、CGP重層寒天プレート上にスプレッドした
。37℃において数日間インキュベーションの間、プレートは、CGP分解細菌の出現が
、さまざまな菌叢の中で大きく変化したことを示した(表1)。最も高い発生は、ウサギ
(エジプト)、ヒツジ(ドイツ)の盲腸の菌叢およびコイの消化管の菌叢(ドイツ)の場
合であった。さらに、分解コロニーの形態的特徴、必要なインキュベーション期間、CG
Pの分解により起こるハローの形態および強度もまた、さまざまな菌叢サンプルの中で、
および個々のサンプル内のコロニーの中で大きく変化した。このことは、CGP分解の多
様な能力を有する独特の細菌種の存在を示した。
、分解ハローを示すコロニーを、新鮮なCGP重層寒天プレートに移すことによって、さ
らに精製した。精製作業の間、多くのCGP分解コロニーが、それらの純粋培養として分
解ハローを誘導する能力を失い、したがって無視された。同様に、いくつかのCGP分解
コンソーシアは、純粋培養を得ることが非常に困難であり、さらなる精製手順からも省か
れた。他方、精製相は、形態的に異なる特徴を示し、CGP分解の能力を保有する62種
の純粋培養をもたらした。表1に実証されるように、CGP分解細菌は、個々の動物の消
化管に沿ったさまざまな部位から単離された。このことは、例えば反芻動物における食物
タンパク質の分解について公知の事実と一致する;第1胃は食物タンパク質の主要な分解
部位であるが、未消化のタンパク質(バイパスタンパク質またはエスケープタンパク質)
は消化物と一緒に下部消化管に移動し、そこでそれらの一部は、動物の酵素によって、ま
たは下部腸内細菌叢によって破壊され、その後、残りが排泄される前に吸収される。バイ
パスタンパク質の分解は、ミルク製造などの特定の生理的機能にとって重要である(Ho
lter,J.B.ら、J.Dairy.Sci.76:1342〜1352(1993
年))。
条件下で液体培地においてCGPを分解する能力に関して試験した。これを、1g l−
1のCGPおよび0.5g l−1の酵母抽出物を含有するBM培地に適用し、すべての
純粋培養のCGPを分解する能力を表した(表1)。還元剤に加えて同様の培地を含有す
るフンゲートチューブにおける嫌気性CGP分解実験により、62種の単離株のうち、4
6種は、同様に嫌気的にCGPを分解できることを明らかにした。当然のことながら、3
8種はCGPを完全に分解したが、残りは部分的にCGPの分解を示した。純粋培養によ
る嫌気的CGP分解に必要なインキュベーション期間は、37℃において24時間から7
日間に及んだ。
Pが完全に分解された直後、培養上清中のCGPの分解産物を、方法の項に述べたように
OPA試薬を用いたカラムの予備誘導体化の後で、HPLCにより決定した。期待したよ
うに、HPLC分析により、すべての単離株CGPをその構成ジペプチドに分解すること
が明らかされた。酸加水分解の前に供された上清サンプルに関する同様の分析により、3
種のCGP構成アミノ酸;アスパラギン酸、アルギニンおよびリシンの存在が明らかにな
った。終わりの3種のアミノ酸の検出は、これらの実験に適用された、アルギニン部分の
およそ6Mol%がリシンで置き換えられた組換えCGPの公知の組成に一致する(Vo
ss,I.ら、Metabol.Eng.8:66〜78(2006年))。
50%がバチルス属およびシュードモナス属に属し、一方残りの単離株は、ストレプトマ
イセス属およびミクロモノスポラ属を含む他の属に属することを示唆した。試験した腸内
細菌叢におけるCGP分解細菌の系統発生についてのより明確な洞察を提供するために、
62種から8種の菌株を、16S rDNA配列決定によりさらに同定した。表1に示す
ように、3種の単離株;それぞれ、ヒツジの第1胃の細菌叢(ドイツ)、七面鳥の盲腸の
細菌叢(エジプト)およびテラピアの消化管の細菌叢(エジプト)に由来する17、35
、49は、バチルス属のメンバーとして同定され、それぞれ巨大菌AC46b1、巨大菌
MPF−906およびバチルス・コグリョ(B.Koguryoae)SMC4352−
2Tと99%を超える16S rDNA配列類似性を有した。2種の単離株;牝牛の結腸
の細菌叢(ドイツ)およびハトの盲腸の細菌叢(エジプト)由来の15および47は、ブ
レビバチルス(Brevibacillus)属に属することが発見され、それぞれ、ブ
レビバチルス・レウスゼリ(B.reuszeri)DSM9887Tおよびブレビバチ
ルス属種SE004と、98%を超える16S rDNA配列類似性を有した。ウサギの
盲腸から単離された菌株31(ドイツ)は、ストレプトマイセス属に所属し、ストレプト
マイセス・アベルミティリス(S.avermitilis)NCIMB 12804T
と98%を超える配列類似性を有した。16S rDNA配列分析は、アヒルの盲腸由来
の菌株38(ドイツ)は、ミクロモノスポラ属に属し、ミクロモノスポラ属種0138と
、99%を超える配列類似性を有することをさらに示した。最終的に、シュードモナス属
の代表もまた、同定された単離株の中に発見された;コイ由来の菌株52(ドイツ)CG
P分解細菌のシュードモナス・アルカリジェネスDIP1と99%を超える16S rD
NA配列類似性を示した。
同定株間と、それらの密接に関連する菌株および他の細菌との関係を示す。さらに、細胞
外CGP分解が可能なすべての公知の細菌の分類学的位置が、系統樹において実証される
。さらに表2は、細胞外CGPの分解が可能な細菌の、広範囲な生息環境および系統発生
についての要約を提供する。
場合いくつかの栄養的利益を伴い、したがってヒトおよび動物のための添加物として使用
される(Narasimha,D.L.R.ら、J.Sci.Food Agric.3
3:456〜460(1982年);Kihlberg,R.、A.Rev.Micro
biol.26:427〜466(1972年);Lu,J.ら、Aquacultur
e 254:686〜692(2004年);Ross,E.、Poult−Sci.6
9:794〜800(1990年)))。これは、CGPの存在を伴うかどうかを調査す
るために、ドイツの市場で利用可能な3種のスピルリナ製品を、CGPの存在に関して検
査した。;from Sanatur GmbH(Singen、Germany)およ
びGreenvally GmbH(Berlin、Germany)による2種の製品
は100%スピルリナ・プラテンシスからなり、一方、Aurica GmbH(Sch
walbach−Elm、Germany)による第3の変異体は、それらの40%を含
有する。通常の日用量のおよそ2倍に相当する、3種の製品それぞれの10gのCDMを
、CGPの単離前に微粉に挽くことによって調製した。3種の市販の変異体は、それぞれ
、0.06%、0.13%および0.15%のCGP含有量を示した。単離CGPの加水
分解サンプルの確認HPLC分析は、期待したように、シアノバクテリアのCGPの典型
的な構成アミノ酸;アスパラギン酸およびアルギニンを明らかにした。
ば要求される適切かつ経済的な培地、分解のために実用的に調製できる高度に濃縮された
CGPの懸濁液および比較的短時間のインキュベーションにおいて完全なCGP分解を達
成するための細胞外酵素の必要量の規定、をまず小規模に最適化した。
OD600nmにおける変化は、CphEの放出の明確な兆候を表し、したがって、透き
通った培地および細胞の調節された成長が必要であり、このことは、材料と方法の項にお
いて述べた最終的培地組成物を介して達成された。さらに、被検基質の中で、シュードモ
ナス・アルカリジェネスDIP1株は、クエン酸塩において最も優れた成長を示し(図3
)、単一基質としてのクエン酸塩の適用濃度(1g/l)は、誘導および分解相中妥当な
培養物の成長濁度を保証したが、同時に培養物の成長濁度を調節した。
phE濃度の間のバランスの取れた比率を決定するために、以下の小規模実験を実施した
;純粋CGP懸濁液(水中、pH7.3)の段階希釈(10〜50g/l)を、個々に全
体積1mlのエッペンドルフチューブに調製し、さらに、粗CphEの段階希釈(1〜1
0g/l)を、個々の調製CGP濃度について試験し、反応チューブを、回転速度3rp
mで、チューブローテーター中で30℃においてインキュベートした。実験により、低濃
度の粗CphEを使用した場合、CGPの分解は比較的一定な増加を示した。CGPの最
も高い被検濃度(50g/l)は、2g/lの粗CphE粉末の存在下で10時間以内に
分解できた(図4)。
するために、三相性の方法を実施した;第I相:CGPの大規模単離および精製、第II
相:粗CphE粉末の大規模製造、第III相:CGPのそのジペプチドへの分解。
胞の4776gの細胞の乾燥質量を使用し、この量は、ラルストニア・ユートロファH1
6−PHB−4−Δeda(pBBR1MCS−2::cphA6308/edaH16
)を用いた、一回の500l醗酵の間にすでに製造された。このバイオマスチャージのC
GP含有量は、32%(wt/wt)であった(Voss,I.ら、Metabol.E
ng.8:66〜78(2006年))。加えて、ラルストニア・ユートロファH16−
PHB−4−Δ/dh/Ωkm−cphA6308を用いた、実験室規模の醗酵由来のい
くつかの他の乾燥バイオマスチャージを混合し(総計2490g)、第2のチャージと考
えた。CGPを、材料と方法の項において述べた改良酸抽出法に従って個々のチャージか
ら別々に抽出および精製した。得られたCGPの湿潤質量は、主要細胞チャージに関して
は1948gおよび第2のチャージに関しては295gであり、精製CGPの乾燥凍結後
、双方のチャージから得られた純粋CGPはそれぞれ621.83gおよび82.17g
であった。
、このポリマーが主にアスパラギン酸およびアルギニンで構成されており、リシンはわず
か4.5%(mol/mol)含有されることが明らかになった。SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、双方のチャージ中の単離CGPが分子量約20〜30kDaを
有することが明らかになった。さらに、HPLC分析およびSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の双方により、得られたCGP中にはいかなる不純物も無いことが示された。
したがって、双方のCGPチャージは一緒に混合でき、純粋CGPの最終量は704gで
あった。
発を継続するために、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1からの粗CphEの十
分量の製造が必要であり、したがって、この菌株を、Biostat D650バイオリ
アクターにおいて500l規模で培養した。シュードモナス・アルカリジェネスDIP1
の前培養を、1lのSM培地および1g/lのクエン酸ナトリウムを含有する、2lのバ
ッフル付きフラスコにおいて培養した;このフラスコを振とうしながら30℃に置いて1
2時間インキュベートした。バイオリアクターを、1g/lのクエン酸ナトリウムを含有
する420lのSM培地で満たし、滅菌し、4%(vol/vol)の前培養を接種した
。最初のpHは6.9に調整した。醗酵中、シュードモナス・アルカリジェネスDIP1
株の細胞は、最初の醗酵時間の直後に成長し始め、OD600nm値が0.4に達し、ほ
ぼ9時間後に定常期に入った。CphEの排出は、0.25g/l滅菌CGP懸濁液を、
定常期の最初の2時間後に添加することによって誘導され、インデューサー(不溶性CG
P)の添加によりOD600nmは急速に0.55から0.98に増加し、加えたCGP
の完全な分解には2時間を要し、それは、OD600nmの減少を示し、誘導前の値に近
い値に達した。1時間後、細胞はわずかに成長し始め、これは、培地中のCGP−ジペプ
チドの存在による可能性が最も高い。醗酵は、全培養期間が14時間で終了した(図5)
。
塩のために、醗酵を実行しながら連続系を調製した(図6);取得のために、中央の10
0lタンクにおいて上清を回収しながら、CEPA Z41連続遠心分離を使用して、細
胞を分離した。同時に回収した上清を濃縮するために、30kDaのカセットを有するク
ロスフローユニットを中央タンクに連結した;フィルターカセット(30kDa)のCO
Pより分子サイズの大きいタンパク質を含有する濃縮保持液を、タンクに再度ポンプで送
り、一方透過液は直接廃棄した。クロスフローの流速を調整し、タンク中の体積を約50
lに維持した。冷却のために、中央タンクにアイスバッグを導入し、溶液の温度を20℃
以下に維持した。取得終了後、濃縮過程を、5lの濃縮液だけがタンク内に残るまで継続
した。脱塩のために、濃縮液を5倍のベッドボリュームのH2Oを用いて洗浄した。先の
ステップの個々の間に、サンプルを回収し、CGP重層寒天プレートにおけるCGP分解
活性に関して確認した(図2)。最終的に、濃縮液を−30℃において凍結し、凍結乾燥
し、最終乾燥重量17.5gの粗タンパク質粉末を得た。
模分解を250gの純粋CGPおよび10gの粗CphE粉末を使用して適用し、これら
の量は最も高い、調製しやすいCGP濃度(50g/l)および小規模実験により決定さ
れた12時間以内の完全な分解を確実にするために十分な粗CphE(2g/l)の濃度
を表す。250gのCGP粉末を、5lの0.1M HCLに溶解し、pH7.3に中和
し、4℃において沈殿させ、最終的に水道水を用いて3回洗浄することによって脱塩し、
所望の濃度の全体積5lを得た。その後、10gの粗CphE粉末を、CGP懸濁液に加
え、ゆっくり攪拌しながら、30℃において12時間インキュベートした。CGPの完全
な分解後、ジペプチド溶液を滅菌ろ過し、第II相中に使用した同じクロスフロー系を用
いて、粗タンパク質成分から分離し、−30℃において凍結し、最終的に凍結乾燥し、2
27.5gのCGPジペプチドを得た。
に、いくつかの20mlアリコート(後の凍結ステップおよび凍結乾燥ステップの前に採
取した)を、以下のCOPを有するさまざまな膜を用いてろ過した;10、5、1および
0.5kDa。ろ過後、CGP−ジペプチドを、ろ過前後の凍結乾燥の1mlアリコート
の乾燥重量を決定することによって、並びにHPLC分析によって評価した。もともとの
ジペプチド溶液と比較して、ろ過中の乾燥重量の最大損失は、最もCOPが小さい(0.
5kDa)膜の場合78.5%(wt/wt)であり、1kDaの膜では47.8%(w
t/wt)の損失が生じ、一方、5kDaの膜では11.6%(wt/wt)の損失が生
じ、より大きいCOP(10kDa)を有するろ過膜は、最小の損失である7.4%(w
t/wt)を示した。
ニターし、すべてのろ過したジペプチドサンプルは、同じ高グレードの純度を示した(図
7、I)。したがって、主要ジペプチドチャージにはさらなるろ過系ステップは必要なか
った。30kDaのカセットを有するクロスフローは、明らかに分解されたCGP溶液の
タンパク質部分を回収するためにも最も実践的な道具であった。回収されたタンパク質溶
液を、再度凍結し、凍結乾燥した。CGP重層寒天プレートにおける回収した粉末に関す
る活性試験は、前述のすべての手順においてCphEが生存しており、その活性を保有し
ていたことを示した(図2)。粗粉末の回復率は78%であった。
ンプルを、TLCにより試験した;直接サンプルでは1つのスポットだけが示され、(図
7、I)、一方加水分解サンプルは、標準アミノ酸のアスパラギン酸、アルギニンおよび
リシンに関する典型的なスポットが示された(図7、II)。さらに、酸加水分解サンプ
ルに関する確認HPLC分析は、これらの3種の構成アミノ酸に関する典型的なピークだ
けを明らかにした。これらの結果を手がかりに、ジペプチド粉末の純度は99%を超える
と評価された。250gのCGPの分解からの最終結果(227.5gの純粋ジペプチド
)は、全方法の全体の効率は91%を示し、これは将来の最適化を介してさらに増加させ
ることができる。
(Elbahloul,Y.ら、Appl.Environ.Microbiol.71
:7759〜7767(2005年))に従って500l規模の醗酵で製造した。しかし
、組換え大腸菌DH1株(pMa/c5−914::cphApcc6803)を、7%
のプロタミラス(vol/vol);において培養した。この濃度は、プロタミラスの利
用可能なチャージに関する予備実験中に、CGP製造のために最適であることが証明され
た。
、CGP−シンテターゼ(CphA)遺伝子の誘導を可能にした(Frey,K.M.ら
、Appl.Environ.Microbiol.68:3377〜3384(200
2年))。各々の時間に採取したサンプルは、期待通りにポリマーの漸進的な細胞内蓄積
を示し、13時間後に最大に達し(顕微鏡的に評価)、その後も一定のままであった(図
9)。OD600nmは、15時間後に18.3に達し、その後醗酵は終了したが、その
後の分析により醗酵13時間後に最大のCGP蓄積は13%(CDMのwt/wt)であ
り、取得時間(15時間)には10%に低下した(CDMのwt/wt)ことが明らかに
なった。得られた4626gの湿潤細胞塊(1372gのCDM)からのCGPの抽出後
、135gの純粋CGP粉末を得た。CGPのHPLC分析は、構成アミノ酸のポリマー
の6.8Mol%を表すリシンに加えてアスパラギン酸、アルギニンだけを示した。SD
S−PAGEにより、CGPの純度が確認され、分子量25〜30kDaが示された。
って最適な基質であることがすでに証明された(Sallam,A.およびA.Stei
nbuchel.2008b。Biotechnological process f
or the technical production of β−dipepti
des from cyanophycin。準備中)クエン酸塩をさまざまな濃度(0
.5〜10g l−1)で含むSM−培地を試験することにより、6g 1−1が最大の
成長を起こすことが示された(30℃において13時間後、475 Klett単位)。
pH値が異なる(5.5〜8.5)以外は同じ条件下で、6g l−1のクエン酸塩にお
いて培養されたDIP1株の培養は、DIP1株はpH6.5において最適成長を示し、
一方さまざまなインキュベーション温度(15〜45℃)における培養により、成長のた
めの最適温度が37℃であることが明らかにされた。
最適培養条件:DIP1株によるCphEalの最大製造のための最適培養条件を結論付
けるために、細胞を、最適成長条件下でさまざまな濃度のクエン酸塩において培養した;
細胞が定常期に達したときに、0.25g l−1のCGPの添加によりCphEal製
造を誘導した。
活性および測光的にスクリーニングした。クエン酸塩濃度が0.5g 1−1未満または
4g 1−1を超える培養物からの上清サンプルは、分解活性を全く示さず、一方、最大
活性およびその後の最大CphEal製造は、2g l−1のクエン酸塩において成長し
た培養物を誘導してから5時間後にモニターされた。最適製造条件下のさらなる培養実験
により、DIP1株の細胞はインキュベーションの約13時間後に定常期に達することが
確認され、この時点がCphEalの誘導にとって最適であることが証明された。したが
って、以下の条件がCphEal製造にとって最適であると考えられた;2g l−1ク
エン酸を含むSM−培地、pH6.5、37℃、13時間後の誘導および、インキュベー
ション16時間目の取得。
のインデューサー候補を、DIP1株の培養物において試験した;(CGP由来β−ジペ
プチド、合成ジペプチド(α−アルギニン−アスパラギン酸、α−リシン−アスパラギン
酸、α−オルニチンアスパラギン酸)(Sigma−Aldrich、St.Louis
、Missouri、USA)、α−ポリアスパラギン酸(Bayer AG、Leve
rkusen、Germany)、ポリ−ε−リシン(Chisso、Tokyo、Ja
pan)、L−アスパラギン酸、L−アルギニン、L−リシン、L−シトルリン、L−オ
ルニチンならびにアスパラギン酸類似体[N−アセチル−アスパラギン酸、ウレイドコハ
ク酸(N−カルバモイル−アスパラギン酸)]。すべてのインデューサーを、まず、0.
25g l−1の濃度において試験し、CphEal製造を、CGP重層寒天プレートに
おいて、およびさらに測光的に分析した。CGP、そのジペプチドおよびアスパラギン酸
だけが、有意な量のCphEalを誘導した。その後、最適濃度および最適CphEal
取得時間を、これらの3種のインデューサーを用いて誘導した培養物において調査した;
CGPに関しては、0.001〜3.0g l−1の濃度で試験し、0.05g l−1
までの濃度は誘導効果が増加したが、それ以上の濃度になると同じ効率を示した。最大C
phEal製造は、0.05g l−1のCGPにより、誘導から5時間後に得られた。
様の条件下で培養した培養物は、インデューサーの濃度に関しては同様の結果を示したが
、最大CphEal製造は、誘導のわずか3時間後に得られた。さらに、アスパラギン酸
は、4g l−1のアスパラギン酸により誘導5時間後に最大CphEal製造が得られ
たので、適切なインデューサーであることを証明したが、最適なCGP濃度(0.05g
l−1)により誘導した培養物と比較して、アスパラギン酸による誘導後のCphEa
l製造は3番目でしかなかった。
反応体積およびもともとの方法の第III相(CGPの分解)に必要な時間を減少させる
ために、より高いCGP濃度(50〜100g/l)の分解時間を30℃において試験し
、これは、分解時間と粗CphEal濃度の減少、および分解時間とCGP濃度の増加と
が共線的増加を示した。10g l−1の粗CphEalの存在下で、最も短い分解期間
(4時間)が、CGPの最も低い被検濃度(50g l−1)に関してモニターされ、一
方最も高いCGPの被検濃度(100g l−1)を分解するためには16時間が必要で
あった。
実験を、材料および方法の項に記載のように、別々に実施した。反応チューブにおける残
留CGPの測光的決定により、最大CGP分解(45%)は、pH6.5において起こる
ことが示されるが、pH範囲5.5から7.5では、結果が近いことが明らかになった。
他方、50℃において最大の90%に達するまでは温度の上昇に伴って、CGP分解が増
加する。したがって、CGPの濃度とCphEalとの間の最適な関係に関する実験を、
最適なパラメーター(50 ℃、pH 6.5)のもとで反復した。これにより、CGP
濃度50および100g 1−1に関する必要な分解時間(10g l−1の粗CphE
alの存在下)は、それぞれ1および4時間に減少した。さらに、最適条件下で、分解時
間は、粗CphEalの濃度の減少およびCGP濃度の増加と共線的増加を示した。この
共線的関係は、将来の方法適用において、最適分解パラメーターを適用するために役立ち
得る。それぞれの式を、100g l−1までのCGP濃度に関して計算し、純粋Cph
Eal(E)の濃度に基づき、粗抽出物適用のために、CphEal含有量は式を使用す
る前に決定されるべきである(s.u.);
P50℃における分解時間=17.55−29.891E[純粋CphEalの所望の濃
度(g/l)]
およびシュードモナス・アルカリジェネスDIP1株由来のCGPaseの特徴について
のより優れた知見を得るために、いくつかの、工業的に適用可能な方法を、粗粉末からC
phEalを生成するために試験した。溶媒、例えば、エタノール、メタノールまたはア
セトンを使用する酵素の沈降および精製は、低い回収率および低い精製効果のため満足の
いく結果を提供できなかった。しかし、硫酸アンモニウムによる沈降は、飽和濃度の70
%の比較的優れた結果を提供したが、純度はいまだ低すぎた。
P1株からCGPaseを精製するための単純な方法を開発した。このために、不溶性C
GPそれ自体を、材料および方法の項に記載のように、CphEalを特異的に結合する
ための結合マトリックスとして使用した。予備試験は、最初の5分後にCphEalがC
GPに完全に結合することを示し、したがって、これは、さらなる適用において最小の結
合時間と考えられる。すべての精製ステップにおいて、SDS−PAGEは、酵素の段階
的精製(図10A)および最初の2回の洗浄ステップは、CGPに結合しなかった他のタ
ンパク質を除去するために必要であることを示した。CGPマトリックスの分解および限
外ろ過によるジペプチドの除去後、高純度のCphEalを得た。CGP重層寒天プレー
トは、精製CphEalの高い活性を示し、精製タンパク質は、SDS−PAGEにおい
て、45kDaの見かけの分子量を示した。CphEalの同一性を、ゲル内再生(in
−gel−renaturation)により確認し、CphEalは活性を回復し、C
GP重層寒天プレートにおける分解ハローを形成した。精製CphEal濃度は、43.
2μg ml−1であり、一方、最初の粗タンパク質溶液中の全タンパク質含有量は94
4μg ml−1であった。精製酵素の純度をより正確に検出するために、SDS−PA
GEを、より大量のサンプル(3倍量)に関して反復し、銀染色によりより長い時間染色
した;このことにより、比較できるほどの非常に低濃度の、少数の他のタンパク質のバン
ドの存在が明らかになった(図10B)。
適用が望まれる場合、CGPaseの濃度は、まず製造された上清中で評価されなければ
ならず、したがって、1mlの、OD600nmが0.215である固定濃度(100m
g l−1)のCGP懸濁液を使用する高速試験を開発した。この溶液に、3μlのさま
ざまな濃度(2.7〜43.2μg ml−1)の精製酵素を含む溶液を加えた。反応液
を、低速(3rpm)で回転しながら30℃において60分間インキュベートした。最終
的に、CGP分解の範囲を、600nmにおいて測光的に決定した。試験の再現性および
その式(s.u.)の正確性を保証するために、試験パラメーターおよびOD600にお
ける測定範囲(0.15−0.215)を順守しなければならない。
E[粗抽出物中のCphEal含有量(μg/ml)]=[0.2404−D(60分
後のOD600nm]/0.0017
するために、(既知のCphEal含有量を含む上清中の)全CphEalに結合するた
めに必要なCGP量もまた、決定されなければならない。全反応体積の0.5mlにおい
て、さまざまな濃度の(1.4〜19μg ml−1) 50μlの精製CphEal溶
液を、さまざまな濃度(0.1〜6g l−1)のCGPに加えた。反応混合物を、低速
(3rpm)で回転しながら30℃において10分間インキュベートした。遠心分離(1
6000×g、2分)後、反応チューブを遠心分離にかけ、上清を、CGP重層寒天プレ
ートにおける活性に関してスクリーニングした。すべての被検CphEal濃度に関して
、分解ハローを誘導しなかった最小CGP濃度を、安全のために3回掛け、その後較正曲
線に統合した。得られた式は以下のようであった:
C[必要なCGP濃度(g/l)]−[E[粗抽出物中のCphEal含有量(μg/m
l)]−2.4392]/0.9432
解活性を示し、一方、68℃において酵素の完全な不活性化が発生した。CGP分解にと
っての最適pH範囲は7〜8.5であり、8.5において最適であった。CGP、BSA
、ウシカゼインおよびポリ(アスパラギン酸)に対する精製CphEalの基質特異性を
試験すると、CGPに対して最も高い分解活性を示した。しかし、BSAもまた、部分的
に分解された(CGPと比較して65%)。ウシカゼインおよびポリ(アスパラギン酸)
は、精製CphEalの酵素活性によりごくわずかしか影響を受けなかった。
いた阻害剤実験を実施した(表1)。CGPaseの阻害は、CGP重層寒天プレートに
おいて、およびCGP分解産物のHPLC分析によって分析した。このことは、細胞外C
phEalは、セリンプロテアーゼ阻害剤のペファブロックおよびフッ化フェニルメチル
スルホニル(PMSF)により強く阻害されることが明らかにされた。さらに、N−ブロ
モコハク酸イミド(トリプトファン酸化剤)は、酵素の全阻害をもたらした。対照的に、
CphEalによる分解ハローの形成は、チオールプロテアーゼ阻害剤のロイペプチンに
よって、またはメタロプロテアーゼ阻害剤のEDTAによって影響されなかった。HPL
C分析により、CphEalの阻害を示したEDTAにより処理したサンプルを除いて、
これらの結果が確認された。
Pジペプチドの適用可能性を証明するために、これらの高度に可溶性のジペプチドの吸収
を、予備研究においてCaco2細胞(ヒト結腸上皮腺がん細胞)の細胞培養物を使用し
て試験した。20%のウシ胎児血清(FCS)および1%の2mMグルタミン溶液を含有
するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)を培養培地として使用した。約7000の
Caco2細胞/ウェルを、24−ウェルプレートに播種し、5%CO2雰囲気および約
98%の湿度下で、37℃においてインキュベートした。細胞を、ほぼ50時間後に単層
が形成されるまで毎日顕微鏡的に確認した。インキュベーション培地を、350μg/m
lのCGPジペプチド(90%Asp−Arg:10%Asp−Lys)または遊離のL
−アスパラギン酸、L−アルギニンおよびL−リシンの等量混合物を補給した新鮮な70
0μl/ウェルの同じ培地に、完全に置き換えた。ウェルの列に後の添加剤を含まない新
鮮な700μlのインキュベーション培地を補給し、対照として考えた。サンプルを、0
、13、22、67および113時間のインキュベーション期間後に採取し、Salla
mおよびSteinbuchelにより記載のように(J.App.Microbiol
.DOI:10.1111/j.1365−2672.2009.04221.x)、H
PLCにより分析し、被検ジペプチドおよびアミノ酸の濃度の変更を決定した。
ノフィシンAsp−Argジペプチドおよび68%のシアノフィシンAsp−Lysジペ
プチドの吸収が明らかになった。他方、わずか41%の遊離のアルギニンおよび51%の
遊離のL−リシンは、同じインキュベーション期間にわたって吸収された。例外的に、L
−アスパラギン酸は、Caco2細胞により遊離の形態で吸収され、約67時間の短いイ
ンキュベーション期間内に完全に吸収されたと思われる。対照的に、遊離のアルギニンお
よび遊離のリシンの吸収量と比較して、31.6%のより多くのアルギニンおよび24.
4%のより多くのリシンが、CGPジペプチドの形態で細胞より吸収された。したがって
、CGPジペプチドは、双方のアミノ酸、アルギニンおよびリシンの、より高い生体利用
可能な供給源を表す。これらの結果は、栄養および治療におけるCGPジペプチドの適用
可能性についての第1の直接の証拠であり、腸内細菌叢によるCGPの分解についての先
の結果を確認する(SallamおよびSteinbuchel J.App.Micr
obiol.DOI:10.1111/j.1365−2672.2009.04221
.x)。結果は、一般的に、オリゴペプチドは、遊離の形態のそれらの構成アミノ酸より
高い生体利用効率を有するという、以前のインビトロおよびインビボの研究とも一致する
(Adibi,S.A.、J.Clin.Invest.50:2266〜2275(1
971年);Adibi,S.A.、Gastroenterology 113:33
2〜340(1997年);Dock,D.B.ら、Biocell 28:143〜1
50(2004年))。
Claims (5)
- アスパラギン酸、アルギニン、リシン、グルタミン酸、シトルリン、オルニチンおよびカナバニンの2種から構成される1種または複数種のβ−ジペプチド単位を本質的に含むペプチド構造であるシアノフィシン(CGP)またはCGP様ポリマーから、酵素性タンパク質分解によって得られた単離β−ジペプチドまたは単離β−ジペプチド混合物を含む、ジペプチド組成物であって、前記組成物は、CGPをβ−Asp−Argにしてβ−ジペプチドに分解するシュードモナス・アルカリジェネス由来の、分子量45kDa、至適温度50℃および至適pH範囲7から8.5のCGPaseで、前記CGPもしくはCGP様ポリマーの調製品を分解することにより得られる、組成物。
- β−アスパラギン酸−アルギニンおよびβ−アスパラギン酸−リシンを含む、請求項1に記載のジペプチド組成物。
- 栄養療法に用いられる、請求項1または2に記載のジペプチド組成物を含む医薬品。
- 請求項1または2に記載のジペプチド組成物を含む医薬組成物。
- 請求項1または2に記載のジペプチド組成物を含む食品補助剤もしくは飼料補助剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP08158205.8 | 2008-06-13 | ||
EP08158205.8A EP2133419B1 (en) | 2008-06-13 | 2008-06-13 | Uses of cyanophycin beta-dipeptides |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011513006A Division JP5785075B2 (ja) | 2008-06-13 | 2009-06-15 | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016028024A true JP2016028024A (ja) | 2016-02-25 |
JP6244336B2 JP6244336B2 (ja) | 2017-12-06 |
Family
ID=39895026
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011513006A Active JP5785075B2 (ja) | 2008-06-13 | 2009-06-15 | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
JP2015145684A Active JP6244336B2 (ja) | 2008-06-13 | 2015-07-23 | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011513006A Active JP5785075B2 (ja) | 2008-06-13 | 2009-06-15 | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8980845B2 (ja) |
EP (2) | EP2133419B1 (ja) |
JP (2) | JP5785075B2 (ja) |
CN (2) | CN102066559B (ja) |
DK (2) | DK2133419T3 (ja) |
ES (2) | ES2701727T3 (ja) |
HK (1) | HK1193357A1 (ja) |
PL (1) | PL2133419T3 (ja) |
WO (1) | WO2009150252A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021532800A (ja) * | 2018-08-01 | 2021-12-02 | シサル ゲーエムベーハー | 最適な栄養補給のためのベータ−ジペプチドとアミノ酸との組合せ |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL2133419T3 (pl) * | 2008-06-13 | 2019-02-28 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Zastosowania beta-dipeptydów cyjanoficyny |
CN108347970A (zh) * | 2015-10-21 | 2018-07-31 | 凯塞尔股份有限公司 | 用于水产养殖的天冬氨酰-二肽 |
WO2017099475A1 (ko) * | 2015-12-09 | 2017-06-15 | 씨제이제일제당 (주) | 반추위 보호 펩타이드 유도체 및 그 용도 |
US11020337B2 (en) * | 2016-03-24 | 2021-06-01 | Cysal Gmbh | Aspartyl-dipeptides for skin care and cosmetic use |
CN108882728B (zh) * | 2016-04-07 | 2023-04-04 | 凯塞尔德国有限公司 | 用于缓慢喂养水生生物的藻青素 |
CN107488210B (zh) * | 2016-06-13 | 2021-03-30 | 首都医科大学 | 华法林-4-o-乙酰-二肽,其合成,活性和应用 |
WO2021037383A1 (en) | 2019-08-30 | 2021-03-04 | Symrise Ag | COSMETIC USE OF β-L-ASPARTYL-L-ARGININE |
CN113373077B (zh) * | 2021-02-07 | 2023-02-07 | 南宁海关技术中心 | 一种氯霉素高效降解菌、高效降解菌剂及其应用 |
CN113683661B (zh) * | 2021-09-01 | 2022-03-11 | 济宁医学院 | 一种双重响应二肽超分子聚合物及其制备方法和应用 |
CN115746292B (zh) * | 2022-05-03 | 2023-12-22 | 湘潭大学 | 一种活性污泥中藻青素的提取方法 |
CN116948939B (zh) * | 2023-09-18 | 2023-12-12 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种提高粪便样本挑菌多样性的方法和培养基及其用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0782299A (ja) * | 1993-09-10 | 1995-03-28 | Miyagi Kagaku Kogyo Kk | ペプチド組成物とその製造法 |
JP5785075B2 (ja) * | 2008-06-13 | 2015-09-24 | ヴェスト フェリッシェ ウェルヘルムス ウニベルジテート ミュンスター | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4225579A (en) | 1979-02-27 | 1980-09-30 | Israel Kleinberg | Means and method for improving defenses against caries |
AU2524695A (en) | 1994-05-04 | 1995-11-29 | Genencor International, Inc. | Lipases with improved surfactant resistance |
DE19813692A1 (de) * | 1998-03-27 | 1999-09-30 | Norddeutsche Pflanzenzucht Han | Cyanophycinsynthetasegene zur Erzeugung von Cyanophycin oder Cyanophycinderivaten, und ihre Verwendung |
US20040137081A1 (en) | 2003-01-13 | 2004-07-15 | Peter Rohdewald | Attaining sexual wellness and health of the sexual vascular system with proanthocyanidins |
AU2001283962A1 (en) * | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Method for improved production of cyanophycin and the secondary products thereof |
US7091001B2 (en) | 2004-07-30 | 2006-08-15 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the preparation of high arginine peptides |
CN108347970A (zh) | 2015-10-21 | 2018-07-31 | 凯塞尔股份有限公司 | 用于水产养殖的天冬氨酰-二肽 |
-
2008
- 2008-06-13 PL PL08158205T patent/PL2133419T3/pl unknown
- 2008-06-13 DK DK08158205.8T patent/DK2133419T3/en active
- 2008-06-13 ES ES08158205T patent/ES2701727T3/es active Active
- 2008-06-13 EP EP08158205.8A patent/EP2133419B1/en active Active
-
2009
- 2009-06-15 ES ES09761813.6T patent/ES2619952T3/es active Active
- 2009-06-15 US US12/995,762 patent/US8980845B2/en active Active
- 2009-06-15 DK DK09761813.6T patent/DK2283128T3/en active
- 2009-06-15 EP EP09761813.6A patent/EP2283128B1/en active Active
- 2009-06-15 WO PCT/EP2009/057382 patent/WO2009150252A2/en active Application Filing
- 2009-06-15 JP JP2011513006A patent/JP5785075B2/ja active Active
- 2009-06-15 CN CN200980122099XA patent/CN102066559B/zh active Active - Reinstated
- 2009-06-15 CN CN201310343230.3A patent/CN103520700B/zh active Active
-
2014
- 2014-07-07 HK HK14106855.5A patent/HK1193357A1/zh unknown
-
2015
- 2015-02-11 US US14/619,161 patent/US9877996B2/en active Active
- 2015-07-23 JP JP2015145684A patent/JP6244336B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0782299A (ja) * | 1993-09-10 | 1995-03-28 | Miyagi Kagaku Kogyo Kk | ペプチド組成物とその製造法 |
JP5785075B2 (ja) * | 2008-06-13 | 2015-09-24 | ヴェスト フェリッシェ ウェルヘルムス ウニベルジテート ミュンスター | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021532800A (ja) * | 2018-08-01 | 2021-12-02 | シサル ゲーエムベーハー | 最適な栄養補給のためのベータ−ジペプチドとアミノ酸との組合せ |
JP7469813B2 (ja) | 2018-08-01 | 2024-04-17 | シサル ゲーエムベーハー | 最適な栄養補給のためのベータ-ジペプチドとアミノ酸との組合せ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5785075B2 (ja) | 2015-09-24 |
WO2009150252A3 (en) | 2010-02-18 |
ES2701727T3 (es) | 2019-02-25 |
US8980845B2 (en) | 2015-03-17 |
JP2011522557A (ja) | 2011-08-04 |
EP2133419B1 (en) | 2018-09-19 |
HK1193357A1 (zh) | 2014-09-19 |
EP2283128A2 (en) | 2011-02-16 |
JP6244336B2 (ja) | 2017-12-06 |
WO2009150252A2 (en) | 2009-12-17 |
CN102066559B (zh) | 2013-11-06 |
US9877996B2 (en) | 2018-01-30 |
CN103520700B (zh) | 2016-03-09 |
CN103520700A (zh) | 2014-01-22 |
DK2133419T3 (en) | 2019-01-14 |
US20150231194A1 (en) | 2015-08-20 |
DK2283128T3 (en) | 2017-04-24 |
US20110118177A1 (en) | 2011-05-19 |
PL2133419T3 (pl) | 2019-02-28 |
EP2283128B1 (en) | 2017-01-04 |
EP2133419A1 (en) | 2009-12-16 |
ES2619952T3 (es) | 2017-06-27 |
CN102066559A (zh) | 2011-05-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6244336B2 (ja) | シアノフィシンジペプチドのバイオテクノロジー的製造 | |
Sallam et al. | Dipeptides in nutrition and therapy: cyanophycin-derived dipeptides as natural alternatives and their biotechnological production | |
RU2599422C2 (ru) | Макромолекулярный комплекс бактериального происхождения и его применение для предотвращения или лечения ревматоидного артрита | |
AU2007260592B2 (en) | Formulation comprising whey protein and hydrolysates for improving muscle recovery | |
JP5128760B2 (ja) | ダイエタリー製品において栄養補助剤として使用するためのγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA、H体)及びγ−ポリグルタメート | |
KR20100057630A (ko) | 아미노산 및 펩티드 제품 | |
CN103221531A (zh) | 具有高蛋白质水解活性的瑞士乳杆菌细菌 | |
TWI284537B (en) | Blood-viscosity reducing agent | |
US20200046772A1 (en) | Cartilage regeneration-promoting agent | |
WO2014130007A1 (en) | Proteolytic compositions for rapidly and extensively degrading protein supplements | |
JP2004357535A (ja) | 免疫賦活活性及びγ−アミノ酪酸産生能を有する新規乳酸菌、及びその利用。 | |
CN112654362A (zh) | 用于优化营养补充的β-二肽和氨基酸的组合 | |
YOON-HO et al. | Effect of High-Molecular-Weight Poly-$\gamma $-Glutamic Acid from Bacillus subtilis (chungkookjang) on Ca Solubility and Intestinal Absorption | |
CN110506105B (zh) | 新型双歧杆菌属细菌 | |
TWI299257B (en) | γ-POLYGLUTAMIC ACID (γ-PGA, H FORM), γ-POLYGLUTAMATES AND γ-POLYGLUTAMATE HYDROGEL FOR USE AS NUTRITION SUPPLEMENTS IN DIETARY PRODUCTS | |
JP5292633B2 (ja) | 腎不全予防剤 | |
JP2020162584A (ja) | 腸内環境改善組成物 | |
TWI414305B (zh) | 腎衰竭預防劑 | |
JP2000239180A (ja) | カルシウム結晶化抑制作用を有する細菌の菌体から得られるタンパク質を有効成分とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤及びこれを含有してなる飲食物並びに飼料 | |
Pan | Peptides can be utilized as amino acid sources for protein accretion and cell proliferation by cultured animal cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161003 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170307 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170707 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20170710 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170822 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20170907 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171031 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171113 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6244336 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |