CN101627700B - 蛹虫草固体菌种培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛹虫草固体菌种培育方法。本发明中，蛹虫草菌种接种到斜面固体培养基中后，在23～25℃下遮光培养3天，将温度降低至20～23℃，继续遮光暗激发培养4天，再在自然散光照射下培养24小时。根据本发明方法培育的蛹虫草固体菌种，气生菌丝更发达，气生菌丝较普通方法培育的粗大1.5倍以上，且分枝更多，不易断裂；菌苔更结实、肥厚，颜色鲜黄；孢子个体更大，菌种的活性高，对杂菌的抵抗力更强。由经扩增成液体菌种，单位液体培养基中菌丝含量更高，活性高，长期静置不易分层，分布性好，使用方便。液体菌种接种到生产培养基后，菌落生长快，转色所用时间短，能缩短生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛹虫草固体菌种培育方法。
背景技术
虫草是一种珍稀的中药材，具有很高的药用和滋补功效。野生虫草资源有限，过量开采会破坏环境。人工培育的虫草，有效成分与野生虫草相近，部分成分甚至超过野生虫草，现在普遍采用人工培育蛹虫草的方法获取虫草。
在蛹虫草的人工培育中，性能优良的菌种是蛹虫草高产和高质量的保证。因此，固体菌种的培育是蛹虫草人工培育中一个至关重要的环节。现在普遍采用的固体菌种培育方法是：接种完成后，在20～25℃恒温条件下，交替自然光照培养至孢子成熟。这样培育的蛹虫草固体菌种孢子较小，活性低，对杂菌的抵抗力差，由此蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种，单位液体培养基中菌丝含量，活性一般，长期静置容易发生分层，接种时难以保证接种量的一致性，液体菌种接种到生产培养基后，菌落生长慢，转色所用时间长。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供一种具有高活性和抗性的蛹虫草固体菌种培育方法。
本发明所采取的技术方案是：
蛹虫草固体菌种培育方法，其培育过程包括以下步骤：
1) 制备普通斜面固体培养基；
2) 接种蛹虫草菌种；
3) 暗激发培养：将接种好的菌种在23～25℃下遮光培养3天，将温度降低至20～23℃，继续遮光培养4天；
4) 光激发：将经过暗激发培养的菌种在自然散光下培养24小时，孢子成熟，完成蛹虫草固体菌种的培育；
其中，斜面固体培养基的配比为：
水：7500g 马铃薯：1400g 葡萄糖：180g 磷酸氢二钾：15g 硫酸镁：5g 蛋白胨：20g 蚕蛹粉：18g 琼脂粉：75g，或
水：9000g 马铃薯：1700g 葡萄糖：200g 磷酸氢二钾：20g 硫酸镁：7g 蛋白胨：26g 蚕蛹粉：20g 琼脂粉：90g，或
水：8500g 马铃薯：1650g 葡萄糖：195g 磷酸氢二钾：19g 硫酸镁：6.5g 蛋白胨：25g 蚕蛹粉：21g 琼脂粉：87.5g。
本发明的有益效果是：与普通方法培育的蛹虫草固体菌种相比，经过暗激发培养的蛹虫草固体菌种气生菌丝更发达，菌苔更结实、肥厚，颜色鲜黄；孢子个体更大；气生菌丝粗大1.5倍以上，且分枝更多，不易断裂；菌种的活性高，对杂菌的抵抗力更强。使用经过暗激发培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种，单位液体培养基中菌丝含量更高，活性高，长期静置不易分层，静置120～140h没有出现分层现象，分布性好。使用该液体菌种接种量均匀，方便了液体菌种的使用。液体菌种接种到生产培养基后，菌落生长快，转色所用时间短，能缩短生产周期。
附图说明
图1是实施例1和对照例1的气生菌丝对比图。
具体实施方式
下面结合实例，进一步说明本发明。
实施例1
选用的蛹虫草菌种为Cm001，购自中国农业大学生物学院食用菌研究室，培育过程包括以下步骤：
1) 制备普通斜面固体培养基，培养基的配比为： 水：7500g 马铃薯：1400g 葡萄糖：180g 磷酸氢二钾：15g 硫酸镁：5g 蛋白胨：20g 蚕蛹粉：18g 琼脂粉：75g，将配制好的培养基分装好，在121℃，压力1.05kg/cm2条件下灭菌40分钟，冷却至常温，备用；
2) 接种：无菌条件下，在冷却至常温的培养基中接入Cm001菌种；
3) 暗激发培养：将接种好的菌种在23℃下遮光培养3天，将温度降低至20℃，继续遮光培养4天；
4) 光激发：将经过暗激发培养的菌种在自然散光下培养24小时，孢子成熟，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种气生菌丝的平均直径为12~13μm，孢子的平均大小为6.5~7.5μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种接种到液体培养基中，每160ml液体培养基中加入约2.5g固体菌种(鲜重)，扩增成液体菌种。液体培养基的配比为： 水：9000ml 马铃薯：1700g 葡萄糖：200g 磷酸氢二钾：20g 硫酸镁：7g 蛋白胨：32g，避光条件下，23-25℃，150转/min摇床培养48h，液体菌种培养完成。
经检验，液体菌种培养完成后，每100ml液体菌种中的干物质量为12.8g，静置122h后出现分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，52h后出现直径3mm的菌落，给与光照12h后，培养基转色。
对照例1
斜面固体培养基的制备和接种的菌种同实施例1，接种后在25℃下，交替自然光照培养7天，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种菌丝的平均直径为7.5~8μm，孢子的平均大小为5.5~6μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种按实施例1中所述的条件扩增成液体菌种，经检验每100ml培养液中和干物质量为8.7g，静置84h后分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，77h后出现直径2.5mm的菌落，给与光照15h后，培养基转色。
实施例2
选用的蛹虫草菌种为北虫草C-2，购自山东省鱼台县食用菌研究所，培育过程包括以下步骤：
1) 制备普通斜面固体培养基，培养基的配比为：
水：9000g 马铃薯：1700g 葡萄糖：200g 磷酸氢二钾：20g 硫酸镁：7g 蛋白胨：26g 蚕蛹粉：20g 琼脂粉：90g； 将配制好的培养基分装好，在121℃，压力1.05kg/cm2条件下灭菌40分钟，冷却至常温，备用；
2) 接种：无菌条件下，在冷却至常温的培养基中接入北虫草C-2菌；
3) 暗激发培养：将接种好的菌种在24℃下遮光培养3天，将温度降低至21℃，继续遮光培养4天；
4) 光激发：将经过暗激发培养的菌种在自然散光下培养24小时，孢子成熟，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种气生菌丝的平均直径为11.5~12μm，孢子的平均大小为6.0~6.5μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种接种到液体培养基中，每160ml液体培养基中加入约2.5g固体菌种(鲜重)，扩增成液体菌种。液体培养基的配比为：水：7500gml 马铃薯：1400g 葡萄糖：180g 磷酸氢二钾：15g 硫酸镁：5g 蛋白胨：28g，避光条件下，23-25℃，150转/min摇床培养48h，液体菌种培养完成。
经检验，液体菌种培养完成后，每100ml液体菌种中的干物质量为12.3g，静置126h后出现分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，58h后出现直径2.5mm的菌落，给与光照11h后，培养基转色。
对照例2
斜面固体培养基的制备和接种的菌种同实施例1，接种后在25℃下，交替自然光照培养7天，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种气生菌丝的平均直径为7~7.5μm，孢子的平均大小为4.5~5μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种按实施例1中所述的条件扩增成液体菌种，经检验每100ml培养液中和干物质量为8.8g，静置92h后分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，74h后出现直径2.5mm的菌落，给与光照16h后，培养基转色。
实施例3
选用的菌种为C311，购自华南农业大学食品学院石木标教授，培育过程包括以下步骤：
1) 制备普通斜面固体培养基，培养基的配比为： 水：8500g 马铃薯：1650g 葡萄糖：195g 磷酸氢二钾：19g 硫酸镁：6.5g 蛋白胨：25g 蚕蛹粉：21g 琼脂粉：87.5g；
2) 配制好的培养基分装好，在121℃，压力1.05kg/cm2条件下灭菌40分钟，冷却至常温，备用；
3) 接种：无菌条件下，以常规方法在冷却至常温的培养基中接入C311菌；
4) 暗激发培养：将接种好的菌种在25℃下遮光培养3天，将温度降低至23℃，继续遮光培养4天；
5) 光激发：将经过暗激发培养的菌种在自然散光下培养24小时，孢子成熟，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种气生菌丝的平均直径为11~11.5μm，孢子的平均大小为6~6.5μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种接种到液体培养基中，每160ml液体培养基中加入约2.5g固体菌种(鲜重)，扩增成液体菌种。液体培养基的配比为：水：8500g 马铃薯：1650g 葡萄糖：195g 磷酸氢二钾：19g 硫酸镁：6.5g 蛋白胨：31g，避光条件下，23-25℃，150转/min摇床培养48h，液体菌种培养完成。
经检验，液体菌种培养完成后，每100ml液体菌种中的干物质量为12.4g，静置132h后出现分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，49h后出现直径2mm的菌落，给与光照13h后，培养基转色。
对照例3
斜面固体培养基的制备和接种的菌种同实施例1，接种后在25℃下，交替自然光照培养7天，完成蛹虫草固体菌种的培育。
经检验，该蛹虫草固体菌种气生菌丝的平均直径为7~7.5μm，孢子的平均大小为5.5~6μm。
将培养完成的蛹虫草固体菌种按实施例1中所述的条件扩增成液体菌种，经检验每100ml培养液中和干物质量为9.2g，静置94h后分层。
将培养完成的液体菌种接种到生产培养基中，68h后出现直径2mm的菌落，给与光照15h后，培养基转色。
由以上各实施例中，与普通方法培养的蛹虫草固体菌种相比，经过本发明培养的蛹虫草固体菌种，肉眼可见菌苔更结实、肥厚、颜色鲜黄；普通方法培养的蛹虫草固体菌种，菌苔较稀疏，单薄、颜色苍白；二者对比如图1所示；显微镜下观察，与普通方法培养的蛹虫草固体菌种相比，本发明培养的蛹虫草固体菌种气生菌丝平均要粗大1.5倍以上，且分枝更多，不易断裂；孢子个体平均要大1.09倍以上，这些情况表明，经过本发明培养后，蛹虫草固体菌种的活性更强，对杂菌的抵抗力高。
相同条件下，由本发明培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种，每100ml液体菌种内的干物质量在12.3～12.8g之间，静置分层时间在120h以上；而经普通方法培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种，每100ml液体菌种内的干物质量仅为8.7～9.2g之间，静置分层时间不超过100h；通过本发明培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种，单位体积内的干物质含量更多，意味着其中的菌丝含量更高，菌丝增殖更快，活性更高。与此同时，该液体菌种的稳定性更好，更有利于操作。
以上两种液体菌种分别接种到生产培养基后，相同培养条件下，由本发明培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种在生产培养基上生长更快，表现在出现同样大小的菌斑时，本发明培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种所用的时间更短，一般为49～58h，相比而言，普通方法培养的蛹虫草固体菌种扩增的液体菌种需要更长的时间，一般为68～77h，可见，经本发明培养的蛹虫草固体菌种，能够缩短蛹虫草培养的周期。
以上的优点表明，经过本发明培养的蛹虫草固体菌种，性能有了很大的提高，有利于蛹虫草的人工培养，本发明是一种值得推广的蛹虫草固体菌种培养方法。
Claims (1)
1.蛹虫草固体菌种培育方法，其特征在于：其培育过程包括以下步骤：
1) 制备普通斜面固体培养基；
2) 接种蛹虫草菌种；
3) 暗激发培养：将接种好的菌种在23～25℃下遮光培养3天，将温度降低至20～23℃，继续遮光培养4天；
4) 光激发：将经过暗激发培养的菌种在自然散光下培养24小时，孢子成熟，完成蛹虫草固体菌种的培育；
其中，斜面固体培养基的配比为：
水：7500g 马铃薯：1400g 葡萄糖：180g 磷酸氢二钾：15g 硫酸镁：5g 蛋白胨：20g 蚕蛹粉：18g 琼脂粉：75g，或
水：9000g 马铃薯：1700g 葡萄糖：200g 磷酸氢二钾：20g 硫酸镁：7g 蛋白胨：26g 蚕蛹粉：20g 琼脂粉：90g，或
水：8500g 马铃薯：1650g 葡萄糖：195g 磷酸氢二钾：19g 硫酸镁：6.5g 蛋白胨：25g 蚕蛹粉：21g 琼脂粉：87.5g。
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Application publication date: 20100120 Assignee: Heshan Zhongchun Biotechnology Co., Ltd. Assignor: Zheng Jiehui|Xiang Kun Contract record no.: 2014440000012 Denomination of invention: Method for culturing solid cordyceps militars strain Granted publication date: 20110406 License type: Exclusive License Record date: 20140122 |
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