CN101625348A - 驴胶补血制剂及其原料、中间体的指纹图谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种驴胶补血制剂及其原料、中间体的指纹图谱测定方法。该方法包括步骤：定量称取驴胶补血制剂/原料/中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到驴胶补血制剂/原料/中间体的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

Description

驴胶补血制剂及其原料、中间体的指纹图谱测定方法

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱的测定方法，更具体地说，是涉及用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱方法来测定驴胶补血制剂及其原料、中间体的化学成分的方法。

背景技术

全球约有30亿人患有不同程度的贫血，每年因患贫血引致各类疾病而死亡的人数上千万。近年来，随着现代生活的发展，环境大气污染，化学合成品的增多等因素使上述病症的发生有明显增长趋势。据流行病学调查表明，仅在1529名育龄妇女中，贫血患病率为31.2％，而在经济水平中下的县(市)农村儿童贫血发生率高达39.1％。此外，苯、有机磷农药长期接触以及药源性所致贫血、白细胞、血小板减少可见于多种职业中。驴胶补血制剂(如冲剂)是由阿胶、黄芪、党参、熟地黄、白术、当归经提取加工制成，具有滋阴补血，健脾益气，调经活血之功效，用于久病体虚，气虚血亏型月经不调。临床广泛应用于贫血症、白细胞减少症、血小板减少症和月经病等的治疗，疗效确切(余三红.驴胶补血冲剂的临床应用概述.湖南中医杂志.1999，(1)：40)。其中，驴胶补血颗粒制剂的配方和质量控制方法已经收入在中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十一册(WS3-B-2159-96)和中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十六册(WS3-B-3062-98)。由于其质量控制方法不够全面，难以全面表征它们的物理化学特征，因此，对驴胶补血颗粒制剂的提取精制方法、质量控制方法进行改进成为人们积极研究的课题。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industry：Botanical Drug(Draft).2000 August)。

随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量，现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(Astragaloside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的指标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。

驴胶补血制剂是由阿胶、黄芪为主要原料制成的制剂，临床上用于治疗贫血症、白细胞减少症、血小板减少症和月经病等各类疾病，其治疗效果已经得到临床的验证，而是否能够保证药物的质量以及驴胶补血制剂中有效成分的含量，是决定驴胶补血制剂疗效的基础。在产品质量控制方面，以前主要控制指标是性状、理化试验、含氮量、水分等，后面增加了薄层鉴别、含量测定等定性或定量指标，但作为一个中药复方制剂，如果用一、二种黄芪的活性成分来说明驴胶补血制剂的内在质量，具有一定的片面性，更不用说无药效的指标成分了。要控制驴胶补血制剂的功效，只针对其一、二个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征中药质量。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。现在，对黄芪中活性成分如黄芪甲苷等的测定方法较多，但如何能够从更宏观的角度对驴胶补血制剂中化学组分的宏观指纹图谱的建立方法却未见报道。

因此，本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以进一步全面控制驴胶补血制剂及其原料、中间体的质量的一种中药指纹图谱检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种驴胶补血制剂指纹图谱的测定方法。

本发明的另一个目的是提供上述驴胶补血制剂的原料药材的指纹图谱的测定方法。

本发明的再一个目的是提供上述驴胶补血制剂的中间体的指纹图谱的测定方法。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：

一种驴胶补血制剂指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤：

(a)供试品溶液的制备：定量称取驴胶补血制剂，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到驴胶补血制剂的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

上述高效液相色谱的检测波长优选270nm；色谱柱的柱温为20～28℃，优选25℃；流动相A中乙腈和甲醇的体积比为10∶1～1∶10，优选9∶1。

上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：

0～30分钟时，流速为0.50～1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100～2∶98；

31～50分钟时，流速为1.00～0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98～20∶80；

51～90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80～0∶100。

优选下述的梯度洗脱程序：

0分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100；

30分钟时，流速为1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98；

50分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80；

65分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝45∶55；

80分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝55∶45；

90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100。

一种驴胶补血制剂的原料药材的指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤：

(a)原料药材供试品溶液的制备：定量称取原料药材，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到原料药材化学成分的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

上述高效液相色谱的检测波长优选270nm；色谱柱的柱温为20～28℃，优选25℃；流动相A中乙腈和甲醇的体积比为10∶1～1∶10，优选9∶1。

上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：

0～30分钟时，流速为0.50～1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100～2∶98；

31～50分钟时，流速为1.00～0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98～20∶80；

51～90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80～0∶100。

优选下述的梯度洗脱程序：

0分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100；

30分钟时，流速为1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98；

50分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80；

65分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝45∶55；

80分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝55∶45；

90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100。

一种驴胶补血制剂的中间体的指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤：

(a)驴胶补血制剂的中间体供试品溶液的制备：定量称取驴胶补血制剂的中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到驴胶补血制剂的中间体化学成分的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

上述高效液相色谱的检测波长优选270nm；色谱柱的柱温为20～28℃，优选25℃；流动相A中乙腈和甲醇的体积比为10∶1～1∶10，优选9∶1。

上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：

0～30分钟时，流速为0.50～1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100～2∶98；

31～50分钟时，流速为1.00～0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98～20∶80；

51～90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80～0∶100。

优选下述的梯度洗脱程序：

0分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100；

30分钟时，流速为1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98；

50分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80；

65分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝45∶55；

80分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝55∶45；

90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100。

本发明提供了一种驴胶补血制剂及其原料、中间体的指纹图谱测定方法。本发明是在大量实验基础上所得到的切实可行的方法，具有可重复性。在本发明中，通过高效液相色谱法，在相同测试条件下所获取的驴胶补血制剂(如颗粒剂)的高效液相指纹图谱、驴胶补血制剂中间体的高效液相指纹图谱以及驴胶补血制剂的原料药材(如黄芪)指纹图谱的重合性好，测定重复性好。因此可通过将上述测定方法建立的驴胶补血制剂指纹图谱作为制剂的标准指纹图谱，上述测定方法可以作为驴胶补血制剂的质量控制标准，该方法能够客观的反映产品内在成分的有无与含量，可以全面控制产品的质量。此外，上述测定方法还可以作为含有阿胶、黄芪、地黄制剂的有效成分测定的指纹图谱测定方法，以鉴别其有效成分。

本发明具有如下的优点：

(1)建立的驴胶补血制剂标准指纹图谱代表着驴胶补血制剂大部分药理活性，能有效地表征驴胶补血制剂的质量，从而实现对驴胶补血制剂的大部分化学成分进行检测，可以从整体上、宏观上控制驴胶补血制剂的质量。

(2)以驴胶补血制剂中各有效成分指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定驴胶补血制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价驴胶补血制剂的质量提供了新的对照标准，将为提高驴胶补血制剂及其他以阿胶、黄芪、地黄为主要成分的成方制剂的质量及疗效控制提供参考依据。

(3)本发明方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。可用于鉴别驴胶补血制剂的真伪，为我国药品行业产品质量的监控提供示范。

(4)可用于生产工艺稳定性和产品稳定性的考察，有利于对中药质量的全方面监控。

附图说明

图1是本发明实施例中驴胶补血颗粒中间体的代表性指纹图谱。

图2是本发明实施例中驴胶补血颗粒制剂的代表性指纹图谱。

图3是本发明实施例中黄芪药材的代表性指纹图谱。

图4是本发明实施例中5-羟甲基糠醛标准品D1的指纹图谱。

图5是本发明实施例中芒柄花素标准品D2的指纹图谱。

图6是本发明实施例中驴胶补血颗粒S2及其中间体S1、原料药材黄芪S3的代表性指纹图谱的对照图。

具体实施方式

下面将列举具体的实施例对本发明进行详细的说明，下述实施例仅用于说明本发明，对本发明并不构成限制。

实施例一(中间体、制剂的制备)

称取阿胶216g、黄芪180g、党参180g、熟地黄120、白术90g、当归60g六味，取当归、白术进行蒸馏，收集蒸馏液备用，残渣与黄芪、党参、熟地黄加水煎煮三次，第一次1.5小时，第二、三次各1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.10(75～80℃)的清膏，冷却后，加乙醇使含醇量为50～55％，搅匀，冷却，静置，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25的浸膏，备用。

将阿胶粉碎成细粉，与蔗糖粉1800g混匀，加入上述浸膏、蒸馏液，混匀，制成颗粒，干燥，过筛，即得。

实施例二(中间体、制剂的制备)

称取阿胶80g、黄芪100g、党参100g、熟地黄80g、白术50g、当归50g六味药材，取当归、白术进行蒸馏，收集蒸馏液备用，残渣与黄芪、党参、熟地黄加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.10(75～80℃)的清膏，冷却后，加乙醇使含醇量为50～55％，搅匀，冷却，静置，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25的浸膏，备用。

将阿胶粉碎成细粉，加入上述浸膏、蒸馏液和适量辅料，混匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。

实施例三(中间体、制剂的制备)

称取阿胶200g、黄芪190g、党参190g、熟地黄120g、白术90g、当归70g六味药材，取当归、白术进行蒸馏，收集蒸馏液备用，残渣与黄芪、党参、熟地黄加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.10(75～80℃)的清膏，冷却后，加乙醇使含醇量为50～55％，搅匀，冷却，静置，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25的浸膏，备用。

将阿胶粉碎成细粉，加入上述浸膏、蒸馏液和适量辅料，混匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，即得。

实施例四(指纹图谱测定)

1、仪器与试剂

仪器：采用Waters 2695液相色谱，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，PDA检测器，柱温箱，Empower2工作站；CP225D电子天平(北京塞多利斯公司)、数显恒温水浴锅(天津长风有限公司)、KQ-300DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、合成纤维过滤膜(孔径0.45μm)(上海兴亚净化材料厂)；

试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，上海陆都化学试剂厂)，自制超纯水。

2、供试品溶液的制备：

驴胶补血颗粒中间体供试品溶液的制备：取实施例一各批次浸膏1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

驴胶补血颗粒供试品溶液的制备：取实施例一各批次驴胶补血颗粒，研细，取约2～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

黄芪药材供试品溶液的制备：取粉碎的黄芪药材5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀甲醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为乙腈∶甲醇溶液(9∶1)；B相为水。检测波长270nm，柱温25℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度如下表1。

表1色谱流动相的洗脱梯度

化学成分名称：

4、数据分析

共计对10批驴胶补血颗粒中间体分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表2。

表2驴胶补血颗粒中间体的指纹图谱部分

所述指纹图谱中，驴胶补血颗粒中间体指纹图谱(见图1)吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为13.89分钟，RSD为0.75％，峰面积为9988.71，RSD为6.43％；2号峰平均保留时间RT为23.41分钟，RSD为0.58％，峰面积为17756.12，RSD为5.96％。

共计对10批驴胶补血颗粒分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表3。

表3驴胶补血颗粒指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照驴胶补血颗粒指纹图谱(见图2)吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为13.97分钟，RSD为0.45％，峰面积为6927.03，RSD为15.91％；2号峰平均保留时间RT为23.51分钟，RSD为0.86％，峰面积为15672.90，RSD为7.67％。

共计对10批黄芪药材分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表4。

表4黄芪药材指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照黄芪药材指纹图谱(见图3)吸收峰有4个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有4个，它们是1号峰平均保留时间RT为57.85分钟，RSD为0.48％，峰面积为2677.72，RSD为6.89％；2号峰平均保留时间RT为62.76分钟，RSD为0.29％，峰面积为931.52，RSD为12.31％；3号峰平均保留时间RT为66.19分钟，RSD为0.37％，峰面积为2036.90，RSD为7.24％；4号峰平均保留时间RT为73.32分钟，RSD为0.56％，峰面积为1439.82，RSD为8.15％。

实施例五(指纹图谱测定)

1、仪器与试剂(同实施例四)

2、供试品溶液的制备：

驴胶补血片中间体供试品溶液的制备：取实施例二各批次浸膏1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

驴胶补血片供试品溶液的制备：取实施例二各批次驴胶补血片，研细，取约2～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

黄芪药材供试品溶液的制备：取粉碎的黄芪药材5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为乙腈∶甲醇溶液(10∶1)；B相为水。检测波长260nm，柱温20℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度见下表5。

表5色谱流动相的洗脱梯度

4、数据分析

共计对10批驴胶补血片中间体分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表6。

表6驴胶补血片中间体的指纹图谱部分

所述指纹图谱中，驴胶补血片中间体指纹图谱吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为10.02分钟，RSD为0.42％，峰面积为15437.23，RSD为7.98％；2号峰平均保留时间RT为19.87分钟，RSD为0.70％，峰面积为20882.05，RSD为4.57％。

共计对10批驴胶补血片分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表7。

表7驴胶补血片指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照驴胶补血片指纹图谱吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为9.98分钟，RSD为0.50％，峰面积为13303.80，RSD为4.95％；2号峰平均保留时间RT为19.76分钟，RSD为0.49％，峰面积为22772.58，RSD为5.64％。

共计对10批黄芪药材分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表8。

表8黄芪药材指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照黄芪药材指纹图谱吸收峰有4个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有4个，它们是1号峰平均保留时间RT为54.16分钟，RSD为0.51％，峰面积为3340.36，RSD为6.12％；2号峰平均保留时间RT为59.15分钟，RSD为0.48％，峰面积为1242.21，RSD为9.58％；3号峰平均保留时间RT为62.98分钟，RSD为0.64％，峰面积为2683.07，RSD为7.16％；4号峰平均保留时间RT为70.05分钟，RSD为0.39％，峰面积为1715.76，RSD为11.03％。

实施例六(指纹图谱测定)

1、仪器与试剂(同实施例四)

2、供试品溶液的制备：

驴胶补血胶囊中间体供试品溶液的制备：取实施例三各批次浸膏1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

驴胶补血胶囊供试品溶液的制备：取实施例三各批次驴胶补血胶囊，研细，取约2～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

黄芪药材供试品溶液的制备：取粉碎的黄芪药材5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀甲醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为乙腈∶甲醇溶液(1∶10)；B相为水。检测波长275nm，柱温28℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度见下表9。

表9色谱流动相的洗脱梯度

4、数据分析

共计对10批驴胶补血胶囊中间体分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表10。

表10驴胶补血胶囊中间体的指纹图谱部分

所述指纹图谱中，驴胶补血胶囊中间体指纹图谱吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为20.01分钟，RSD为0.38％，峰面积为13712.97，RSD为4.12％；2号峰平均保留时间RT为30.12分钟，RSD为0.44％，峰面积为21450.62，RSD为5.78％。

共计对10批驴胶补血胶囊分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表11。

表11驴胶补血胶囊的指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照驴胶补血胶囊指纹图谱吸收峰有6个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为20.23分钟，RSD为0.42％，峰面积为10117.92，RSD为15.91％；2号峰平均保留时间RT为30.59分钟，RSD为0.69％，峰面积为19222.74，RSD为7.67％。

共计对10批黄芪药材分别进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总在下表12。

表12黄芪药材的指纹图谱部分

在对照指纹图谱的建立中，照高效液相色谱法测定所获得的对照黄芪药材指纹图谱吸收峰有4个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，它们是1号峰平均保留时间RT为64.12分钟，RSD为0.27％，峰面积为3262.18，RSD为5.14％；2号峰平均保留时间RT为70.07分钟，RSD为0.58％，峰面积为1220.22，RSD为9.61％；3号峰平均保留时间RT为73.54分钟，RSD为0.71％，峰面积为2961.44，RSD为10.12％；4号峰平均保留时间RT为80.59分钟，RSD为0.35％，峰面积为1805.90，RSD为6.75％。

应该理解，对于本领域的技术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进。例如，使用不同的检测仪器所获得的测定结果可能有所不同，但只要使用本发明所述的质量控制方法，均在本发明保护范围之内。另外，驴胶补血制剂的制备方式可以有很多种，本领域的技术人员根据公知技术可以很容易想到除本发明制备实施例外的多种实施例，显然这样的实施例都会落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种驴胶补血制剂指纹图谱的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)供试品溶液的制备：定量称取驴胶补血制剂，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到驴胶补血制剂的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

2.一种驴胶补血制剂的原料药材的指纹图谱的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)原料药材供试品溶液的制备：定量称取原料药材，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到原料药材化学成分的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

3.一种驴胶补血制剂的中间体的指纹图谱的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)驴胶补血制剂的中间体供试品溶液的制备：定量称取驴胶补血制剂的中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到驴胶补血制剂的中间体化学成分的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈和甲醇的混合溶液，流动相B为水，流动相中流动相A与流动相B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为260～275nm。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测波长为270nm。

5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20～28℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃。

7.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相A中乙腈和甲醇的体积比为10∶1～1∶10。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相A中乙腈和甲醇的体积比为9∶1。

9.根据权利要求1至3任一项所述所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：

0～30分钟时，流速为0.50～1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100～2∶98；

31～50分钟时，流速为1.00～0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98～20∶80；

51～90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80～0∶100。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：

0分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100；

30分钟时，流速为1.00毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝2∶98；

50分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝20∶80；

65分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝45∶55；

80分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝55∶45；

90分钟时，流速为0.50毫升/分钟，流动相A∶流动相B＝0∶100。

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