CN101619319A - 人工改造合成的抗草甘膦基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种在植物中能高效表达的抗草甘膦基因，本发明利用棉花优化密码子设计合成了5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶(EPSPS)基因并构建其植物表达载体，将三个融合抗除草剂基因植物表达载体导入棉花中获得了转基因棉花。转基因棉花经抗除草剂测试，三种转基因棉花中均可筛选到抗浓度为0.2％草甘膦的转基因棉花植株。

Description

人工改造合成的抗草甘膦基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种人工改造合成的抗草甘膦基因以及其构建的植物表达载体及其在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：(1)减少除草剂总用量，使杂草防治费用下降，增加农产品的经济效益；(2)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于保水，减轻土壤侵蚀及石油耗量少的少耕与免耕体系，减少机械耕作作业，大大节省能源；(3)解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛、大果田菁；小麦田的雀麦(Bromus spp)、莎草(Cyperus spp)；大豆田的鸭趾草、蓟、苣荬菜、纯叶决明以及寄生杂草。(6)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。

将编码EPSPS的基因在植物体中过量表达、或选用对草甘膦不敏感的EPSPS(如从根癌农杆菌CP4菌株中克隆的CP4-EPSPS编码基因)、或对EPSPS的氨基酸序列进行修饰或点突变，或导入降解草甘膦的基因(如编码草甘膦氧化还原酶的gox基因)、或导入氮乙酰转移酶(GAT基因)使草甘磷乙酰化等，可使植物获得对草甘膦的抗性。目前国际上除抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、棉花和苜蓿已商业化外，抗草甘膦的转基因小麦、甜菜和匍匐剪股颖(Creeping bentgrass，牧草)也已获得。我国抗草甘膦转基因作物的研发相对滞后，赵福永等(2005)、王景雪等(2005)曾将aroAM12基因转入棉花和油菜，分别获得了抗草甘膦的转基因棉花和油菜，迄今国内尚未见具有自主知识产权的抗草甘膦作物成功商业化的报道。中国发明专利CN200610052573.4公开了一种来源于假单胞杆菌(Pseudomonas sp G3)的抗草甘膦基因(EPSPS基因)，但由于其来源于细菌，细菌密码子偏好性与植物有较大差异，将来自细菌的EPSPS基因直接转化植物，其表达效率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在植物中能高效表达的抗草甘膦基因，可以提高转基因植物的抗除草剂能力。

为解决上述技术问题而提供的一种人工改造合成的抗草甘膦基因，其是根据一种来源于细菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，利用植物密码子偏好性进行设计改造后用人工合成的方法而获得的，设计过程中去除了多聚腺苷酸加尾信号、切割加工序列、植物稀有密码子、非预期产生的限制性内切酶识别位点，并设计了便于进一步实施利用的限制性内切酶切位点结构，该基因命名为BHR2，具有SEQ ID NO：1中3-1325所示的核苷酸序列。

在上述人工改造合成的抗草甘膦基因核苷酸序列5’端融合了一段编码叶绿体导肽的核苷酸序列。

融合棉花来源编码叶绿体导肽(PTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为PTP-BHR2，具有SEQ ID NO：2中10-1563所示的核苷酸序列。

融合拟南芥来源编码叶绿体导肽(ATP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为ATP-BHR2，具有SEQ ID NO：3中10-1560所示的核苷酸序列。

融合矮牵牛来源编码叶绿体导肽(CTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为CTP-BHR2，具有SEQ ID NO：4中10-1548所示的核苷酸序列。

构建流程为：在导肽基因CTP、ATP和PTP的两端分别加上BamH I和Nco I酶切位点，在BHR2两端加上Nco I和Sac I位点，利用连接Nco I位点连接两基因，获得融合基因PTP-BHR2、ATP-BHR2和CTP-BHR2。

叶绿体导肽的作用是将在植物中表达的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶定位至叶绿体中。

本发明的第二个目的在于提供一种含有所述抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因的植物表达载体。

构建方法：利BamH I和Sac I两个酶切位点将融合基因克隆到植物表达载体中pBI121，获得植物表达载体pBI121-PTP-BHR2、pBI121-ATP-BHR2和pBI121-CTP-BHR2。

用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。

本发明的第三个目的在于提供抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因在培育抗除草剂植物品种中的应用，尤其是在培育抗除草剂棉花中的应用。

本发明设计、改造后而人工合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，使该基因转录出来的mRNA在植物体内能高效翻译，并可以构建植物表达载体。转基因棉花鉴定结果表明所设计合成的EPSPS基因能在棉花内高效表达，获得的转基因棉花具有极显著的抗除草剂能力。

附图说明

图1是ATP基因的重叠PCR扩增示意图；

图2是PTP基因的重叠PCR扩增示意图；

图3是植物表达载体pBI121-CTP-BHR2构建示意图；

图4是植物表达载体pBI121-ATP-BHR2构建示意图；

图5是植物表达载体pBI121-PTP-BHR2构建示意图。

具体实施方式

实施例1  BHR2基因的优化及合成

原始基因密码子用法中在编码Leu的47个密码子中存在一个CTA密码子，在编码Ala的43个密码子中存在9个GTG密码子，这10个密码子在植物中为罕见密码子，对基因在植物中表达的翻译效率造成较大程度的不利影响。而且20种氨基酸密码子的用法与植物，尤其是棉花密码子的用法差异巨大。因此，实施例1中利用生物学软件DNA2.0Tool Gene Designer对该基因的序列进行密码子优化，利用生物软件DNAMAN对优化后的序列作限制性酶切分析，对含有常见酶切位点的密码子进行同义修饰，消除常用酶切位点。将BHR2基因第二个密码子上的天冬酰胺(AAT)替换为丙氨酸(GCT)，使其5’端含Nco I位点，在基因的3’端加上SacI酶切位点，便于后续载体的构建，基因序列如表SEQ ID No：1所示。该基因经重新设计后按植物密码子偏好性合成，与野生基因核苷酸同源性为72.79％。该基因的密码子用法见下表：

注：上表中各密码子所编码氨基酸符号后的三个数字分别表示：密码子数量/在蛋白中的出现频率(‰)/密码子用法(％)

合成后的BHR2基因克隆在pUC57载体中。

实施例2  叶绿体导肽基因的克隆

根据NCBI上的序列，直接合成棉花叶绿体导肽CTP基因，在该基因的5’端加BamHI酶切位点，3’端加Nco I酶切位点。

对NCBI上已报道的拟南芥和矮牵牛绿体导肽基因ATP和PTP的DNA序列进行密码子分析，经同义替换消除APT和PTP中的稀有密码了子，根据修饰后的序列设计合成引物AST1、AST2、AST3、AST4、AST5、AST6及PST1、PST2、PST3、PST4、PST5、PST6，引物序列如下：

AST 1：5’GAGGATCCCTTATGGCCCAAGTTAGCAGAATCTGCAATGGTGTGCAGAACCCATCTC3’

AST2：5’GGAGATTTTCGTTGACTGGATTTAGAGAGATTGGAGATAAGAGATGGGTTCTGCACAC3’

AST3：5’TCCAGTCAACGAAAATCTCCCTTATCGGTTTCTCTGAAGACACAGCAGCATCCACGAG3’

AST4：5’CACTCTTCTTCAATCCCCAAGACGAGGAAATCGGATAAGCTCGTGGATGCTGCTGTG 3’

AST5：5’TTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATGACGTTAATTGGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAG3’

AST6：5’TGCCATGGAAGCAGTGGAAACAGAAGACATGACCTTAAGAGGACGAAGCTCAG 3’

PST 1：5’GAGGATCCCTTATGGCACAAATTAACAACATGGCTCAAGGGATACAAACCCTTAATCC3’

PST2：5’GATTTAGGAACTTGGGGTTTATGGAAATTGGAATTGGGATTAAGGGTTTGTATCCCT 3’

PST3：5’TAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTCCTTGTTTTCGGATCTAAGAAGCTGAA 3’

PST4：5’AATCTTTCTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAATTTTTCAGCTTCTTAGATCCGA 3’

PST5：5’ATGTTGGTTTTGAAGAAAGATTCAATTTTCATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGAT 3’

PST6：5’TGCCATGGATGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGGAACAAAACTTT 3’

其中AST1和AST6，PST1和PST6为外引物(out primer)，其余均为内引物(innerprimer)。利用重叠PCR技术扩增得到ATP和PTP序列。重叠PCR技术原理如图1、图2，ATP和PTP基因序列如表SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示。

重叠PCR反应体系：

out primer 1(30μM)：1μl

out primer 2(30μM)：1μl

inner primer mixture(30μM)：0.5μl

10×buffer：5μl

Pfu DNA polymerase：1μl

dNTPs(2.5mM each)：2μl

补水至50μl

重叠PCR扩增条件：

扩增得到的ATP和PTP序列克隆到pMD-18T载体中，进行测序。测序结果正确后，设计引物AST5’、AST3’及PST5’、PST3’分别对这两个基因进行扩增，使其5’端加BamH I酶切位点，3’端加Nco I酶切位点，引物序列如下：

AST5’：5’-ATGGCCCAAGTTAGCAGAAT-3’

AST3’：5’-AAGCAGTGGAAACAGAAGAC-3’

PST5’：5’-ATGGCACAAATTAACAACATG-3’

PST3’：5’-ATGCTGTAGCCACTGATGC-3’

将带酶切位点的ATP和PTP基因克隆到pMD-18T载体中，经测序正确后保存备用。

实施例3  抗草甘膦融合基因植物表达载体的构建

将含导肽序列的载体用BamHI和Nco I酶切处理回收目的片段，构建到用相同内切酶处理的含BHR2基因的pUC57载体中，分别获得含三个融合基因的载体pUCCTP-BHR2、pUCATP-BHR2和pUCPTP-BHR2。利用导肽序列5’端BamH I酶切位点和BHR2基因3’端的Sac I酶切位点切下三个融合基因，回收后构建到用同样酶切处理的植物表达载体pBI121中，获得三个抗草甘膦整合基因的植物表达载体pBI121-CTP-BHR2、pBI121-ATP-BHR2和pBI121-PTP-BHR2，具体构建流程如图3，4，5。

实施例4  利用农杆菌介导的转化法获得抗草甘膦烟草

用75％酒精浸泡烟草种子30s，再用0.1％升汞浸泡8min，进行表面消毒。将消过毒的烟草种子置于MS培养基(加蔗糖30g/L)上无菌发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L BA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取DNA后进行PCR鉴定，用0.2％的草甘膦喷PCR鉴定为阳性的烟草叶片，2周后观察实验结果。转3个不同基因的转基因烟草均能正常生长，而非转基因烟草生长显著受抑制，叶片不同程度发黄、萎蔫。

以上结果表明，转PTP-BHR2、ATP-BHR2和CTP-BHR2基因的烟草具有较好的草甘膦抗性。

实施例5  利用农杆菌介导法转化棉花获得抗除草剂转基因棉花

农杆菌介导法是本领域科研人员熟知的植物遗传转化方法。具体操作程序为：

1.菌株培养

将所构建的杀虫基因植物表达载体电击转化到农杆菌菌株LBA4404中，农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)25mg/L的LB或YEB液体培养基中。28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4～6h，将菌液稀释至OD600值0.3～0.35。

2.无菌苗制备

(1)棉花种子用硫酸(H₂SO₄)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇对种子进行表面消毒1min，再用10％～15％过氧化氢(H₂O₂)处理2～4h，用无菌水冲洗2～3次；

(2)在无菌水中浸泡18～24h，待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS+琼脂6g/L，pH 6.8)中；

(3)25℃～28℃光培养3～5d时备用。

3.棉花外植体与农杆菌的共培养

取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入稀释好的菌液中5～10min，然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2.4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L，pH5.0，表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22℃～25℃共培养2天。

4.诱导愈伤组织及抗性愈伤组织的筛选

(1)愈伤组织的诱导

经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+MgCl20.91g/L+Gelrite 2.0g/L+Km 50～100mg/L+Cef 500mg/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)，在常规条件下(25℃)培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。

(2)抗性愈伤组织的检测

无菌条件下挑取愈伤组织少许进行选择标记基因nptII的ELISA检测或报告基因gus的检测，检测结果为阳性的愈伤组织继续继代，非阳性的愈伤组织淘汰。通过对nptII或gus基因表达的检测，获得棉花抗性愈伤组织的频率为50％～76％。

5.愈伤组织的增殖继代

诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)中，常规条件下(25℃)培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。

6.愈伤组织的分化及转基因苗移栽

愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天门冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91～1.35g/L+Gelrite 2.0～3.0g/L+葡萄糖20～30g/L，pH 5.8)，进一步分化成胚状体，胚状体长成为小植株后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉株根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足营养液。栽好的再生棉苗放入控温22℃、控湿80～85％的人工培养箱中5～7d，再在温室中培养10～20d后移栽到土盆或大田中。

利用上述方法，分别将三个融合抗除草剂基因植物表达载体导入棉花中获得了转基因棉花。转基因棉花经抗除草剂测试，三种转基因棉花中均可筛选到抗浓度为0.2％草甘膦的转基因棉花植株。

SEQUENCE LISTING

<110>创世纪转基因技术有限公司

     浙江大学

<120>人工改造合成的抗草甘膦基因与应用

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<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1331

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccatggctgc taacgacttg atttttcttg cccaacctgg gggtagactt aatggaagaa

60

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120

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180

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240

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300

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360

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420

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480

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540

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600

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660

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780

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1020

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ggagcacaac tgaaaggtat cgatattcct gaggctttag taccgcttgc catcgacgaa

1200

tttccagtgt tatttgttgc tgctgcatgt gcagaaggtc gtacagttct ccgtggggct

1260

gaagaacttc gagttaaaga atctgaccgt attcaagtta tggccgacgg tcttattact

1320

ctcggcataa aatgcgagcc aacccctgat ggcattatca ttgacggagg acaacttggt

1380

ggcggtgaag tgcatggcca cggtgaccac aggatcgcta tggcattttc ggtagccagt

1440

cttcgggctt ctgccccaat tagaatccac gattgtgcaa acgtggccac ctcattcccc

1500

aactttttgg cattgtgtgc tgaagttggg atcagggttg ctgaggaggg aaaatcctga

1560

gagctc

1566

<210>4

<211>1554

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggatccctta tggcacaaat taacaacatg gctcaaggga tacaaaccct taatcccaat

60

tccaatttcc ataaacccca agttcctaaa tcttcaagtt tccttgtttt cggatctaag

120

aagctgaaaa attcagcaaa ttctatgttg gttttgaaga aagattcaat tttcatgcaa

180

aagttttgtt cctttaggat ttcagcatca gtggctacag catccatggc tgctaacgac

240

ttgatttttc ttgcccaacc tgggggtaga cttaatggaa gaatccgggt gcctggggat

300

aagtccatta gtcatcggag tatcatgctt ggttctcttg ctgagggcac tacggaggta

360

gagggcttcc tcgaagggga agatgcatta gcaacattgc aagccttccg tgatatgggg

420

gttgtgattg agggtcccaa ccacggaaga gttacgattc acggcgtggg tttacatggg

480

ttgaagccac ctcctggacc cttatacgta ggtaactctg ggacatctat gaggcttttg

540

tccgggctgc ttgctggaca gtcttttgac gtgactatga ctggtgatgc ctccctttcg

600

aagaggccca tgaacagagt cgctaatccc cttcgagaga tgggagctgt agttgaaact

660

ggtccggagg gcagaccccc tcttacaatc agaggaggcc ataaacttaa gggacttact

720

tatactctcc caatggccag tgcccaagta aagagttgtc tgcttttggc agggttgtat

780

gccgaaggta agactactgt gaccgagcct gcacctacga gagatcatac agagaggatg

840

ctgagagggt ttggatatag cgttgagtct aacggtcctg ttgcatcttt acaatccggg

900

ggaaaactta ctgcaactag gatcgaagtt ccagctgata taagcagcgc agctttcttt

960

ttggttgctg ccagtatcgc cgaaggctca gaattagtgc tcgaacatgt cggtataaat

1020

ccaactagga caggcgtgat cgacatactt aggctcatgg gtggcgatat aactcttgaa

1080

aaccaacgag aggtaggagg agaacctgtt gctgatttgc gagttcgagg agcacaactg

1140

aaaggtatcg atattcctga ggctttagta ccgcttgcca tcgacgaatt tccagtgtta

1200

tttgttgctg ctgcatgtgc agaaggtcgt acagttctcc gtggggctga agaacttcga

1260

gttaaagaat ctgaccgtat tcaagttatg gccgacggtc ttattactct cggcataaaa

1320

tgcgagccaa cccctgatgg cattatcatt gacggaggac aacttggtgg cggtgaagtg

1380

catggccacg gtgaccacag gatcgctatg gcattttcgg tagccagtct tcgggcttct

1440

gccccaatta gaatccacga ttgtgcaaac gtggccacct cattccccaa ctttttggca

1500

ttgtgtgctg aagttgggat cagggttgct gaggagggaa aatcctgaga gctc

1554

Claims (8)

1、一种人工改造合成的抗草甘膦基因，具有SEQ ID NO：1中3-1325所示的核苷酸序列。

2、一种人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQ ID NO：2中10-1563所示的核苷酸序列。

3、一种人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQ ID NO：3中10-1560所示的核苷酸序列。

4、一种人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQ ID NO：4中10-1548所示的核苷酸序列。

5、含有权利要求1至4中任一项所述抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因的植物表达载体。

6、用权利要求5所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。

7、权利要求6所述的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株在培育抗除草剂植物品种中的应用。

8、根据权利要求7所述的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株在培育抗虫植物品种中的应用，其特征在于所述植物为棉花。

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