CN102511374A - 一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的新型化学杀雄制种方法。本方法适合于以转EPSPS-G6基因的转基因抗甘膦除草剂陆地棉种质系为母本，另一陆地棉品种或种质系为父本配制的杂交棉组合。选择隔离条件良好的适合于棉花生长的制种地，将制种的杂交双亲在相邻地块种植（父母本种植比例1:6）。母本植株见蕾后用20mM的草甘膦溶液对母本棉花植株进行第一次化学杀雄，之后每隔15天化学杀雄1次，整个生长期共化学杀雄4次。第一次化学杀雄20天后，母本棉花植株开出的花朵均为不育，表现为雄蕊不散粉、散粉推迟和花粉不正常，镜检花粉粒100%不育时，可开始进行杂交制种。本发明化学杀雄效果稳定，持续时间长，安全可靠。

Description

一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法

技术领域

本发明公开了一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的新型化学杀雄制种方法，具体涉及到杂交棉亲本、化学杀雄剂、化学杀雄剂处理的浓度、化学杀雄时间和方法、棉花化学杀雄制种技术等方法。

背景技术

棉花是我国最重要的经济作物，是出口创汇的主要农作物之一。随着我国农业产业结构的调整，高科技、高产出、高效益的新型农业势必将取代传统的种植业。如何提高进一步提高我国的棉花产量和品质，增加植棉的经济效益是棉花科技界最紧迫的任务。杂种优势利用是提高棉花单位面积产量、改善原棉品质的最有效途径之一，也是控制棉花种子质，实现种子产业化的主要途径。近年来，我国的杂交棉生产获得了飞跃的发展，杂交棉种植面积逐年增加。然而，目前我国棉花杂交种子的制种手段还较落后，主要采用的是人工去雄授粉法制种。很明显，这种原始的高成本的制种手段与现代的杂种优势利用是十分不相称的，而这种不相称性在劳力紧缺的地区更显突出，并直接制约着杂交棉生产的进一步发展。因此，提高杂交棉的制种效率，降低杂交棉制种成本已成为棉花杂种优势利用的关键问题。

利用细胞质雄性育系配制“三系”杂交棉是棉花杂种优势利用的有效途径。Meyer（1975）、Thomber等（1979）、贾占昌（1979）、周世象（1992）和Stewart（1992）分别从哈克尼西棉（G.harknessii）、陆地棉（G.hirsutum）、海岛棉（G.barbadense）和三裂棉（G.trilobum）中得到棉花细胞质雄性不育系，并将其细胞质不育基因通过核置换法转育到陆地棉。该细胞质雄性不育系的保持系非常普遍，一般陆地棉品种（系）均是其保持系，但能恢复该不育基因的恢复基因资源极少，只有在哈克尼西棉等少数棉种中发现有恢复基因。通过棉花遗传育种家的努力，已将哈克尼西棉的恢复基因转育到陆地棉品种，实现了“三系”配套。遗憾的是，由于不育基因和恢复均来源于哈克尼西野生棉种，均存在着难于克服的不利性状的连锁。此外，恢复基因对不育系的育性恢复力不够强，配制成的杂种F₁因花粉生活力偏低而导致大量棉铃脱落，以及带有“裂根”及“矮生扭曲顶叶”等不良性状，因此，三系杂交棉的优势不明显而很难在生产上利用。化学杀雄是作物杂种优势利用的有效途径之一。但由于棉花花期长（2个月），杀雄剂效果稳定性等问题，棉花化学杀雄技术仍未在生产上应用。

转基因抗除草剂棉花品种最早由美国孟山都公司于1997年商业化。浙江大学农学院从抗草甘膦的假单胞杆菌中克隆了抗草甘膦的EPSPS-G6基因（GenBank: EU169459.1）。通过花粉管通道技术，将该基因导入棉花品种-中棉所49，创造了转基因的抗草甘膦棉花种质，为培育和推广具有我国自主知识产权的抗草甘膦棉花品种奠定了基础。在对转基因抗除草剂种质进行除草剂抗性鉴定时发现，花蕾期喷洒除草剂会造成该转基因抗除草剂棉花材料雄性不育。我们围绕转EPSPS-G6基因花蕾期喷施草甘膦导致雄性不育的特点，开展了利用该特性进行杂交棉化学杀雄制种方法的研究，建立一种棉花杂种优势利用的新途径。

发明内容

本发明的目的是针对当前棉花杂种优势利用中的问题，提供一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法。

基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法的步骤如下：

1）转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系及其衍生品种为母本配制的陆地棉品种间杂交组合，其中EPSPS-G6基因是浙江大学从抗草甘膦的假单胞杆菌中克隆的高抗草甘膦基因，转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系是浙江大学通过花粉管通道技术获得的转基因抗草甘膦棉花种质，以陆地棉种质系为父本；

2）选择有良好隔离条件、地势较高、排泄方便，并适合于棉花生长的地块，父本与母本植株相邻种植，父本与母本植株种植比例为1：6；

3）采用20mM的草甘膦溶液作为转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花的化学杀雄剂，草甘膦选自“农达”或95%草甘膦原药，市售10%草甘膦水溶液对转基因棉花的生长发育有显著的影响，不能用于化学杀雄。“农达”用水稀释至化学杀雄浓度，95%草甘膦原药先用1M NaOH溶液溶解，再用水稀释至化学杀雄浓度； 

4）选择无风或微风天气进行化学杀雄，避免将化学杀雄剂喷到父本上，母本植株见蕾后进行第一次化学杀雄，第一次化学杀雄后每隔15天化学杀雄1次，整个生长期共化学杀雄4次；每次化学杀雄时，将草甘膦溶液均匀地喷到母本的每株棉花，确保母本棉花植株100%花粉败育；

5）第一化学杀雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉败育，摘除之前开放的花朵和所结的棉铃，田间鉴定母本100%的花朵和100%的花粉败育时即可进行杂交制种；

6）杂交制种方法是取父本棉花植株上的花粉对母本花朵直接授粉，不需对母本进行剥花去雄； 

7）收取母本植株的棉花，轧出种子即为杂交棉种子。

本发明使用方便、安全可靠。与人工去雄制种相比，该方法可节省杂交棉制种的人工去雄步骤，大幅减轻杂交棉制种的用工50%以上，降低杂交棉种子生产成本50%以上。

附图说明

图1是草甘膦处理后的雄蕊示意图，未处理的雄蕊；B. 草甘膦处理后20天的雄蕊不散粉；

图2（a）是草甘膦未处理的花粉粒示意图；

图2（b）是草甘膦处理后20天的花粉粒示意图；

图3是草甘膦处理间隔期为15天对转基因抗除草剂棉花粉育性的影响示意图；

图4是草甘膦处理间隔期为25天对转基因抗除草剂棉花粉育性的影响示意图；

图5是整个生育期只进行一次草甘膦处理对转基因抗除草剂棉花粉育性的影响示意图。

具体实施方式

基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法的步骤如下：

1）转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系及其衍生品种为母本配制的陆地棉品种间杂交组合，其中EPSPS-G6基因是浙江大学从抗草甘膦的假单胞杆菌中克隆的高抗草甘膦基因，转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系是浙江大学通过花粉管通道技术获得的转基因抗草甘膦棉花种质，以陆地棉种质系为父本；

2）选择有良好隔离条件、地势较高、排泄方便，并适合于棉花生长的地块，父本与母本植株相邻种植，父本与母本植株种植比例为1：6；

3）采用20mM的草甘膦溶液作为转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花的化学杀雄剂，草甘膦选自“农达”或95%草甘膦原药，市售10%草甘膦水溶液对转基因棉花的生长发育有显著的影响，不能用于化学杀雄。“农达”用水稀释至化学杀雄浓度，95%草甘膦原药先用1M NaOH溶液溶解，再用水稀释至化学杀雄浓度； 

4）选择无风或微风天气进行化学杀雄，避免将化学杀雄剂喷到父本上，母本植株见蕾后进行第一次化学杀雄，第一次化学杀雄后每隔15天化学杀雄1次，整个生长期共化学杀雄4次；每次化学杀雄时，将草甘膦溶液均匀地喷到母本的每株棉花，确保母本棉花植株100%花粉败育；

5）第一化学杀雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉败育，摘除之前开放的花朵和所结的棉铃，田间鉴定母本100%的花朵和100%的花粉败育时即可进行杂交制种；

6）杂交制种方法是取父本棉花植株上的花粉对母本花朵直接授粉，不需对母本进行剥花去雄； 

7）收取母本植株的棉花，轧出种子即为杂交棉种子。

实施例

为了验证本发明化学杀雄的效果，以及化学杀雄剂对雌配子的影响，在实验室前期试验工作的基础上，我们于2009年对本发明进行了再次验证：试验在浙江大学试验农场进行，以本实验室培育的转EPSPS-G6基因抗草甘膦棉花种质系为母本，以本实验室常年自交保存的鸡脚叶（显性性状）棉花为父本，相邻种植于浙江大学华家池校区棉花试验地中，父母本种植比例1:6，种植前试验地安装了防虫网，隔离条件良好，且排水方便。现蕾后，我们在2009年7月24日对母本进行了第一次化学杀雄，所用草甘膦溶液为浙江新安化工生产的95%草甘膦原药粉剂用浓度为1M的NaOH溶解后稀释至20mM。

我们在化学杀雄处理后20-40天内，进行花粉育性鉴定，结果表明，雄蕊不散粉（图1），100%的花粉为不育（图2）；20mM草甘膦溶液化学杀雄后20-40天采用强迫自交和用带鸡脚叶性状（显性性状）棉花作父本对未去雄的母本花朵进行授粉，并统计结铃率。结果表明，自交结铃率为0，而杂交结铃率达80%以上，证明经草甘膦化学杀雄后，雄配子高度不育而雌配子发育正常。所结种子（F1），同年前往海南南繁基地种植。观察F1植株的叶型分离结果表明，所有统计的F1植株的叶片均为双亲的中间型（半鸡脚叶），说明用草甘膦化学杀雄后，雄配子完全不育。研究结果表明本发明的化学杀雄效果和制种效果优良。

与此同时，我们对不同浓度和不同化学杀雄间隔时间进行了试验。结果表明，间隔15天，10mM以上浓度100%的花粉粒败育（图3），而间隔25天，20mM以下浓度个别时间仍有少量的花粉可育（图4），而只进行1次化学杀雄，30mM以下浓度在喷施后40天恢复育性（图5）。对不同浓度化学杀雄进行授粉杂交，20mM以及以下浓度的结铃率与未处理对照无差异，而30mM及其以上浓度的草甘膦化学杀雄，其杂交结铃率随浓度增加而显著降低。考虑到材料、药剂、使用浓度，以及气候因素等可能出现的差异， 20mM的草甘膦浓度，间隔15天（可延5天）为本发明的最佳化学杀雄浓度和化学杀雄间隔时间。

 化学杀雄剂为草甘膦除草剂，英文名为glyphosate，学名为N-膦酰基甲基甘氨酸，N-膦酰基甲基氨基乙酸，分子式为(HO)2P(O)CH2NHCH2COOH，作为杀雄剂的草甘膦除草剂包括但不限于以下两种：“农达”或95%草甘膦原药。其中“农达”根据商品的浓度直接用水稀释至化学杀雄浓度,95%草甘膦原药难溶于水，需用1M NaOH溶液溶解，再用水稀释至化学杀雄浓度。不用市售的10%草甘膦水溶液；

制种地双亲的种植方式包括但不限于：父母本分开种植，母本与父本种植比例为6：1。

 第一次化学杀雄时间包括但不限于：见蕾期。喷施20天后母本株上开的花雄均为雄性不育。考虑到操作者首次确定喷施时间的差异和棉株间的生育进程的差异，如首次喷施草甘膦后20天内母本植株有开放花朵则必须摘除，以确保制种的纯度。

喷施间隔时间和次数包括但不限于：每15天喷一次，连续喷4次。

杀雄用草甘膦喷施浓度包括但不限于20mM。

喷施方法和药量包括但不限于：喷雾法，大多叶片喷湿即可。选择晴天或微风天气喷施，避免将草甘膦到父本上，如遇连续阴雨等特殊天气可在规定时间5天内，即前次喷后20天内抢晴天喷施，喷施后2小时内下雨则需补喷；如前次喷后20天仍未喷药，应在最后一次有效化学杀雄后40天内停止采用该方法制种。如确仍需在该制种地制种，可采用人工去雄方法去雄补救。

Claims (1)

1.一种基于转基因抗草甘膦杂交棉花的化学杀雄制种方法，其特征它的步骤如下：

1）转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系及其衍生品种为母本配制的陆地棉品种间杂交组合，其中EPSPS-G6基因是浙江大学从抗草甘膦的假单胞杆菌中克隆的高抗草甘膦基因，转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花种质系是浙江大学通过花粉管通道技术获得的转基因抗草甘膦棉花种质，以陆地棉种质系为父本；

2）选择有良好隔离条件、地势较高、排泄方便，并适合于棉花生长的地块，父本与母本植株相邻种植，父本与母本植株种植比例为1：6；

3）采用20mM的草甘膦溶液作为转EPSPS-G6转基因抗草甘膦棉花的化学杀雄剂，草甘膦选自“农达”或95%草甘膦原药，市售10%草甘膦水溶液对转基因棉花的生长发育有显著的影响，不能用于化学杀雄，“农达”用水稀释至化学杀雄浓度，95%草甘膦原药先用1M NaOH溶液溶解，再用水稀释至化学杀雄浓度； 

4）选择无风或微风天气进行化学杀雄，避免将化学杀雄剂喷到父本上，母本植株见蕾后进行第一次化学杀雄，第一次化学杀雄后每隔15天化学杀雄1次，整个生长期共化学杀雄4次；每次化学杀雄时，将草甘膦溶液均匀地喷到母本的每株棉花，确保母本棉花植株100%花粉败育；

5）第一化学杀雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉败育，摘除之前开放的花朵和所结的棉铃，田间鉴定母本100%的花朵和100%的花粉败育时即可进行杂交制种；

6）杂交制种方法是取父本棉花植株上的花粉对母本花朵直接授粉，不需对母本进行剥花去雄； 

7）收取母本植株的棉花，轧出种子即为杂交棉种子。

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