CN104012398B - 筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法，所述方法包括步骤：(1)采用0.09％和0.15％的草甘膦对半野生棉自然群体进行局部处理，在群体中识别出高抗0.15％草甘膦的半野生棉材料，对选择出的高抗草甘膦半野生棉材料喷施0.1％的草甘膦，进一步选出高抗单株；(2)选出的高抗单株进行自交，分株收摘、装袋、分轧、分贮；(3)进入“单株播种、出苗-药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的程序，如此循环5次，最后从半野生棉自然群体中筛选到稳定的高抗草甘膦的材料。

Description

筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法

技术领域

本发明涉及植物抗除草剂领域，具体涉及筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法。

背景技术

草甘膦是60年代后期由美国孟山都公司的StLouis发现，并于1974年商品化，是迄今最优秀的除草剂。抗草甘膦作物的研发一直是关注焦点，至今对草甘膦抗性最好的基因是CP4-EPSPS，由孟山都公司发现，相应抗草甘膦转基因棉花于1997年商品化。转基因安全问题一直存在很多争议，因此，从棉花本身寻找对草甘膦具有自然抗性的优异基因源用于育种是理想途径。

半野生棉(semiwildcotton)是未经驯化的陆地棉，起源于太平洋、加勒比海和墨西哥湾的高原地带，起源地复杂的地理条件和多变的气候及棉花的常异花授粉特性，使其成为具有丰富变异类型的复杂群体，蕴藏着许多栽培种不具备的优良基因。从半野生棉中筛选抗草甘膦材料应用于棉花育种，不仅可以有效利用抗草甘膦这一目标性状，还能改善目前棉花品种遗传基础狭窄的现状，且不存在转基因环境安全问题，不失为最优途径。

目前常用筛选抗草甘膦材料的方法中，对一定苗龄棉花喷施设定浓度的草甘膦，接近大田生产，但易使植株致死，丢失珍贵材料；种子萌发法鉴定，消耗种子量大；蕾期生长点点涂法，生长点不足以代表整株生长水平；叶片棉球定位鉴定，精准有效，但处理方式与田间除草有距。目前，用越来越高浓度除草剂的选择压加速了杂草的除草剂抗性进化，考虑生产和食品安全，世界各地的杂草科学家都在追求低浓度除草剂除草，本发明的发明人注意到，草甘膦对常规棉和杂草的致死浓度一致，可用该致死浓度和推荐杀草浓度，对棉花材料进行局部处理，初步鉴定出抗性植株，对其自交、收种，播种、出苗后喷施致死浓度的草甘膦，继续筛选，循环处理几代，即可获得稳定的抗草甘膦棉株。

发明内容

本发明的目的是提供筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法。

本发明首先采用草甘膦在半野生棉自然群体中进行处理，识别出群体中高抗的单株，自交并分收自交铃，然后进入“播种出苗-药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的循环程序，最后从半野生棉自然群体中筛选出高抗草甘膦的材料，结果表明：三株阔叶棉6B是高抗草甘膦的半野生棉材料。

根据本发明的具体实施方式，筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法具体包括以下关键步骤：

(1)采用0.006％、0.03％、0.09％、0.15％、0.2％的草甘膦，分别对常规棉品种中棉所12、中棉所16、中棉所49、中棉所79和阳性对照美草抗进行局部涂抹药液处理和整株喷施处理，发现局部处理时，常规棉品种在0.09％的草甘膦浓度下出现药害，整株喷施该浓度的草甘膦则致死。同时，美草抗在局部处理和喷施处理时无明显反应，且草甘膦实验杀草浓度为0.1％。

(2)采用0.09％和0.15％的草甘膦对半野生棉自然群体进行局部处理，在群体中识别出高抗0.15％草甘膦的半野生棉材料。对选择出的高抗草甘膦半野生棉材料喷施0.1％的草甘膦，进一步选出高抗的单株。

(3)选出的单株进行自交，分株收摘、装袋、分轧、分贮。

(4)而后进入“单株播种、出苗-药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的程序，如此循环5次，最后从半野生棉自然群体中筛选到稳定的高抗草甘膦的材料。

本发明草甘膦实验杀草浓度为0.1％，推荐杀草浓度为0.15％-0.2％。对半野生棉群体及对照进行局部处理，筛选出的三株阔叶棉6B可抗0.15％-0.2％的草甘膦，中棉所12出现反应的浓度为0.09％，美草抗无反应，对筛选出的材料进行喷施处理，苗期可抗0.1％的草甘膦，蕾期可抗0.15％的草甘膦，花铃期可抗0.25％的草甘膦，但均出现受害症状，同期同浓度施于中棉所12则致死，施于美草抗则无明显反应。故筛选出的三株阔叶棉6B抗性低于转基因抗草甘膦棉花，适宜作为非转基因棉花种质资源抗草甘膦鉴定的阳性对照，为棉花种质资源高抗草甘膦材料的筛选提供参照标准。

同时，可以通过测定其莽草酸含量、鲜重/干重、叶绿素含量、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性等研究其抗性机制。通过一定的杂交设计和联合分析方法研究其抗性遗传规律。也可以将其作为抗源材料，通过传统的杂交、回交方法，并结合分子标记辅助育种，实现抗草甘膦基因的高效转育，培育抗性新品种。半野生棉抗性亲本的利用，可以拓宽目前栽培品种的遗传基础，而且因其抗性基因来自棉花本身，不存在转基因安全问题，属环境友好型。

本发明在优化棉球定位鉴定和评价半野生棉对草甘膦自然抗性的基础上，结合大田喷施除草剂除草，既可大大减少鉴定工作量，又避免了α错误(无中生有)和β错误(失之交臂)的出现，同时联系实际生产，且结果精确可靠；本发明也为棉花

对草甘膦抗性鉴定提供了阳性对照，还为棉花抗草甘膦遗传研究与创制抗草甘膦育

种材料提供了抗源亲本。

附图说明

图1局部施药处理棉叶，棉叶上1-4除草剂浓度依次为0.09％、0.09％、0.15％、0.15％。

图2局部施药处理棉叶结果，a阔叶棉6B抗性单株，高抗材料，施药0.15％无反应；b.襄抗，阳性对照材料，施药0.15％无反应；c.中棉所12，施药0.09％有反应。

图3棉花喷施草甘膦结果，d.阔叶棉6B抗性单株；e.中棉所12；f.美草抗。

具体实施方式

实施例1筛选高抗草甘膦半野生棉

1材料和方法

1.1实验材料

实验材料是半野生棉，由中国农业科学院棉花研究所野生棉课题组于2006年引自美国国家棉花种质库，共388份(详见表1)，具体包括33份尖斑棉、43份莫利尔棉、4份尤卡坦棉、11份雷奇蒙地棉、86份玛利加琅特棉、199份阔叶棉和12份帕默尔棉。阳性对照美草抗为美国转基因抗草甘膦棉花品种，阴性对照为中棉所12，均由中国农业科学院棉花研究所提供。除草剂草甘膦为孟山都公司生产的草甘膦异丙胺盐溶液，有效成分含量为41％。

表1实验材料编号和名称

1.2试验方法

1.2.1草甘膦药液准备(母液以1.23L为例，工作液以1L为例)

1)母液配制：母液浓度为0.2％。取6ml草甘膦异丙胺盐原药，定容至1L，再加入230ml水，混匀，静置至充分混匀，待用。

2)工作液配制：分别取30ml、150ml、450ml、750ml、1000ml于合适烧杯中，定容至1L，配制成0.006％、0.03％、0.09％、0.15％、0.2％的草甘膦工作液，混匀，静置，待用。

1.2.2筛选过程：

(1)用0.006％、0.03％、0.09％、0.15％、0.2％的草甘膦工作液，对常规棉品种中棉所12、中棉所16、中棉所49、中棉所79和阳性对照美草抗，进行局部涂抹药液处理和整株喷施处理，调查结果为：常规棉品种在0.09％的草甘膦浓度下出现药害，整株喷施该浓度的草甘膦则致死。同时，美草抗在局部处理和喷施处理时无明显反应，且草甘膦实验杀草浓度为0.1％。

(2)用0.09％和0.15％的草甘膦工作液局部施药，处理半野生棉自然群体，共388份，筛选出抗草甘膦材料4份：玛利加朗特棉41、玛丽加郎特棉88、阔叶棉6B和阔叶棉27A，进一步整株喷施0.1％的草甘膦，识别出三株阔叶棉6B单株是高抗草甘膦材料。

(3)选出的单株进行自交，分株收摘、装袋、分轧、分贮，并按照单株播种，同时种植阳性对照美草抗，阴性对照中棉所12。

(4)出苗后以杀死中棉所12的草甘膦浓度，对三株抗草甘膦的阔叶棉6B材料实施“药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的程序。

(5)“单株播种-出苗-药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的程序，循环5次，最后从半野生棉自然群体中筛选到稳定的高抗草甘膦的材料。

根据实施例1的技术方案，在步骤(2)中用0.09％和0.15％的草甘膦工作液局部施药，处理半野生棉自然群体，共388份，筛选出抗草甘膦材料4份。实验杀草浓度和杀死常规棉花品种的浓度为0.1％，喷施0.09％的草甘膦不能有效筛选目标材料，而喷施0.15％草甘膦则易将有效目标材料杀死，易出现α错误(无中生有)和β错误(失之交臂)。而若继续选择用草甘膦局部处理目标材料，与棉农施药方式相差较大，且局部处理与喷施处理浓度有差异，也易出现α错误(无中生有)和β错误(失之交臂)。故进一步整株喷施0.1％的草甘膦，识别出高抗草甘膦单株阔叶棉6B材料(阔叶棉6BG.hirsutumracelatifolium6B)。

Claims (1)

1.筛选高抗草甘膦半野生棉材料的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)采用质量分数为0.15%的草甘膦对半野生棉自然群体进行局部处理，在群体中识别出高抗0.15%草甘膦的半野生棉材料，对选择出的高抗草甘膦半野生棉材料喷施0.1%的草甘膦，进一步选出高抗单株；

(2)选出的高抗单株进行自交，分株收摘、装袋、分轧、分贮；

(3)进入“单株播种、出苗-药剂处理-抗性识别-单株选择-自交-分收”的程序，如此循环5次，最后从半野生棉自然群体中筛选到稳定的高抗草甘膦的材料。