CN101587076A - 定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒 - Google Patents

定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒，该方法包括步骤：S1.配制不同浓度的肌氨酸溶液，向溶液中加入反应试剂使肌氨酸、过氧化氢反应完全；S2.分别测定S1中反应产物荧光二聚体的荧光发射谱，绘制肌氨酸浓度－荧光强度关系曲线；S3.采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸样品发生如S1中所述的反应，测量反应产物的荧光发射谱得到荧光强度数据，对比肌氨酸浓度－荧光强度关系曲线得出未知肌氨酸样品含量。本发明反应试剂盒组分包括对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液，肌氨酸氧化酶，过氧化物酶，以及碱性缓冲液。采用本发明方法，非常适合于尿样或血样中微量肌氨酸的大批量分析检测。

Description

定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒
技术领域
本发明涉及一种定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒，尤其涉及一种酶催化荧光法定量检测肌氨酸含量的方法，以及用于该肌氨酸含量检测方法的反应试剂盒。
背景技术
目前，测定肌氨酸的含量一般采用液-气色谱并联用质谱来进行测定，这种方法使用的仪器昂贵，且操作复杂，不便于大规模推广应用。另外，一种临床实验室酶法测定血和尿中肌酐的分光光度法，是利用肌酐在肌酐氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶和水、氧及显色剂的共同作用下生成色原物质，在特定波长下测定色原物质的吸光度，其吸光度值的大小和样品中肌酐的含量成正比的原理而设计的，该方法经重新组合后也可以用于测定肌氨酸含量。但是分光光度法的检测限比较高，不适用于进行较低浓度肌氨酸含量的测定。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种定量检测肌氨酸含量的方法，旨在解决现有检测方法不适用于进行较低浓度肌氨酸含量测定的问题。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于上述检测肌氨酸含量方法的反应试剂盒。
本发明实施例的定量检测肌氨酸含量的方法，包括如下步骤：
S1配制不同浓度的肌氨酸溶液，向溶液中加入碱性缓冲液、肌氨酸氧化酶催化剂，对甲基酚或对羟基苯乙酸，以及过氧化物酶催化剂，所述碱性缓冲液将溶液的pH值控制为8～11，所发生的如下化学反应(1)和(2)中肌氨酸、过氧化氢反应完全：
(1)肌氨酸+氧+水  肌氨酸氧化酶  过氧化氢+甲醛+甘氨酸；
(2)过氧化氢+对甲基酚  过氧化物酶  荧光二聚体；或
   过氧化氧+对羟基苯乙酸  过氧化物酶  荧光二聚体；
S2分别测定S1中反应产物荧光二聚体在激发光激发下产生的荧光发射谱，用荧光发射峰强度数值与肌氨酸的浓度绘制肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线；
S3采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸样品发生如S1中所述的反应，测量反应产物的荧光发射谱得到荧光强度数据，对比肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线得出未知肌氨酸样品含量。
本发明实施例的用于上述定量检测肌氨酸含量方法的反应试剂盒包含浓度如下的各组分：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液  1×10-7～1×10-3mol/L
肌氨酸氧化酶                10～20000units/L
过氧化物酶                  20～60000units/L
碱性缓冲液                  0.05-0.5mol/L。
与现有技术相比，上述技术方案由于采用荧光分析法进行定量检测肌氨酸含量，一般而言，荧光分析法灵敏度可超过分光光度法二至三个数量级，采用本发明方法，不仅灵敏度高、检测限低、重复性好，而且方法快速、简便，干扰少，非常适合于复杂样品(如尿样或血样)中微量肌氨酸的大批量分析检测。本发明能检测极低浓度的肌氨酸含量，例如浓度为0.1×10-9～1×10-4mol/L的肌氨酸溶液，可以方便快速、灵敏、低成本的测定尿样或血样中肌氨酸含量。
附图说明
图1是本发明实施例1中荧光二聚体的荧光激发谱；
图2是本发明实施例1提供的不同浓度肌氨酸溶液的荧光发射谱；
图3是本发明实施例1提供的荧光峰强度-肌氨酸浓度关系曲线；
图4是本发明实施例1提供的未知肌氨酸样品的荧光发射谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种与现有检测方法相比，能检测浓度为0.1×10-9～1×10-4mol/L(尿样或血样中可能存在的肌氨酸含量范围)这种低浓度的肌氨酸溶液中肌氨酸含量的定量检测方法，当然，该方法也能用于检测更高含量的肌氨酸溶液。
该定量检测肌氨酸含量的方法，包括如下步骤：
S1配制不同浓度的肌氨酸溶液，向溶液中加入碱性缓冲液、肌氨酸氧化酶催化剂，对甲基酚或对羟基苯乙酸，以及过氧化物酶催化剂，所述碱性缓冲液将溶液的pH值控制为8～11，所发生的如下化学反应(1)和(2)中肌氨酸、过氧化氢反应完全：
(1)肌氨酸+氧+水  肌氨酸氧化酶  过氧化氢+甲醛+甘氨酸；
(2)过氢化氧+对甲基酚  过氧化物酶  荧光二聚体；或
   过氧化氢+对羟基苯乙酸  过氧化物酶  荧光二聚体；
S2分别测定S1中反应产物荧光二聚体在激发光激发下产生的荧光发射谱，用荧光发射峰强度数值与肌氨酸的浓度绘制肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线；
S3采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸样品发生如S1中所述的反应，测量反应产物的荧光发射谱得到荧光强度数据，对比肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线得出未知肌氨酸样品含量。
更具体的，其中，S1和S3中下列反应试剂浓度分别为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    1×10-7～1×10-3mol/L
肌氨酸氧化酶                  10～20000units/L
过氧化物酶                    20～60000units/L
碱性缓冲液                    0.05-0.5mol/L。
其中，S1和S3中下列反应试剂浓度优选为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-6～2×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  3000～15000units/L
过氧化物酶                    10000～50000units/L。
碱性缓冲液                    0.1-0.25mol/L
更优选为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-5～1×10-4mol/L
氨酸氧化酶                    5000～10000units/L
过氧化物酶                    20000～30000units/L。
碱性缓冲液                    0.15-0.2mol/L
更具体的，本实施例的检测方法中，S2中激发光波长为300～360nm。优选激发光波长为320nm(其激发光光谱参见图1中曲线)。
更具体的，本实施例的检测方法中，缓冲溶液的pH值范围为8～11，缓冲液可以是NH3-NH4Cl缓冲溶液、Tris缓冲溶液、硼酸缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液等，但不仅限于这些缓冲液。
本发明实施例还提供一种用于上述反应检测方法的反应试剂盒，包含浓度如下的各组分：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液  1×10-7～1×10-3mol/L
肌氨酸氧化酶                10～20000units/L
过氧化物酶                  20～60000units/L
碱性缓冲液                  0.05-0.5mol/L。
上述各组分浓度优选为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-6～2×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  3000～15000units/L
过氧化物酶                    10000～50000units/L
碱性缓冲液                    0.1-0.25mol/L
更优选为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-5～1×10-4mol/L
氨酸氧化酶                    5000～10000units/L
过氧化物酶                    20000～30000units/L
碱性缓冲液                    0.15-0.2mol/L
其中，缓冲液可以是NH3-NH4Cl缓冲溶液、Tris缓冲溶液、硼酸缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液等，但不仅限于这些缓冲液。
实施例1
1、a.配制0.5ml浓度为1.0×10-6mol/L的肌氨酸溶液，温度控制为30℃，加入用pH＝10.4的NH3-NH4Cl缓冲溶液(0.2mol/L)配制的4.49ml 3.0×10-5mol/L对甲基酚溶液，0.005ml肌氨酸氧化酶溶液(10000units/L)和0.005ml过氧化物酶溶液(20000units/L)，混合均匀(最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为0.1×10-6mol/L)，反应20分钟后，用荧光分光光度计测量体系的荧光发射谱(最佳激发波长λex 320nm，发射谱扫描范围350-550nm)。其荧光发射谱参见图2中C1。
b.配制0.5ml浓度为1.0×10-5mol/L的肌氨酸溶液，其余条件同a。最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为1.0×10-6mol/L，其荧光发射谱参见图2中C2。
c.配制0.5ml浓度为3.0×10-5mol/L的肌氨酸溶液，其余条件同a。最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为3.0×10-6mol/L，其荧光发射谱参见图2中C3。
d.配制0.5ml浓度为5.0×10-5mol/L的肌氨酸溶液，其余条件同a。最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为5.0×10-6mol/L，其荧光发射谱参见图2中C4。
e.配制0.5ml浓度为7.0×10-5mol/L的肌氨酸溶液，其余条件同a。最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为7.0×10-6mol/L，其荧光发射谱参见图2中C5。
f.配制0.5ml浓度为10.0×10-5mol/L的肌氨酸溶液，其余条件同a。最终反应混合液中肌氨酸实际浓度为10.0×10-6mol/L，其荧光发射谱见图2中C6。
2、绘制该反应条件下的荧光峰强度-肌氨酸浓度关系曲线，参见图3。
3、取0.5ml待测肌氨酸样品溶液(取自尿样)，温度控制为30℃，加入用pH＝10.4的NH3-NH4Cl缓冲溶液(0.2mol/L)配制的4.49ml 3.0×10-5mol/L对甲基酚溶液，0.005ml肌氨酸氧化酶溶液(10000units/L)和0.005ml过氧化物酶溶液(20000units/L)，混合反应20分钟后，用荧光分光光度计测量体系的荧光发射谱(最佳激发波长λex 320nm，发射谱扫描范围350-550nm)，得到该未知样品的荧光发射谱，参见图4。取其荧光峰强度值并与图3对照，可知该样品中肌氨酸含量为4.01×10-6mol/L。由于本测试方法对原始溶液稀释了10倍，故待测肌氨酸样品原始浓度为所测得浓度的10倍，即：4.01×10-5mol/L。
实施例2
所用溶液pH值为9，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，1×10-7mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自尿样的肌氨酸，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为0.1×10-9mol/L。
实施例3
所用溶液pH值为10.4，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，1×10-5mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自尿样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为5.43×10-7mol/L。
实施例4
所用溶液pH值为10.8，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，5×10-5mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为4.04×10-6mol/L。
实施例5
所用溶液pH值为9，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为7.14×10-5mol/L。
实施例6
所用溶液pH值为10.4，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为3.05×10-6mol/L。
实施例7
所用溶液pH值为11，把工作试剂按下列浓度要求混合(对甲基酚，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为2.06×10-8mol/L。
实施例8
所用溶液pH值为8，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-5mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自尿样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为4.04×10-6mol/L。
实施例9
所用溶液pH值为10.4，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为1.04×10-5mol/L。
实施例10
所用溶液pH值为10.8，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-4mol/L；肌氨酸氧化酶，10units/L；过氧化物酶，20units/L；取自尿样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为8.54×10-6mol/L。
实施例11
所用溶液pH值为9，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-5mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为9.36×10-8mol/L。
实施例12
所用溶液pH值为10.4，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为8.09×10-6mol/L。
实施例13
所用溶液pH值为10.8，把工作试剂按下列浓度要求混合(对羟基苯乙酸溶液，1×10-3mol/L；肌氨酸氧化酶，20000units/L；过氧化物酶，60000units/L；取自血样的肌氨酸)，反应20分钟，使肌氨酸、过氧化氢反应完全，用荧光光谱仪测定其荧光激发谱，得到荧光强度。由肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线求出肌氨酸浓度为1×10-4mol/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1、一种定量检测肌氨酸含量的方法，包括如下步骤：
S1配制不同浓度的肌氨酸溶液，向溶液中加入碱性缓冲液、肌氨酸氧化酶催化剂，对甲基酚或对羟基苯乙酸，以及过氧化物酶催化剂，所述碱性缓冲液将溶液的pH值控制为8～11，所发生的如下化学反应(1)和(2)中肌氨酸、过氧化氢反应完全：
(1)肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶过氧化氢+甲醛+甘氨酸；
(2)过氧化氢+对甲基酚过氧化物酶荧光二聚体；或
过氧化氢+对羟基苯乙酸过氧化物酶荧光二聚体；
S2分别测定S1中反应产物荧光二聚体在激发光激发下产生的荧光发射谱，用荧光发射峰强度数值与肌氨酸的浓度绘制肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线；
S3采用如S1中所述的方法，使未知肌氨酸样品发生如S1中所述的反应，测量反应产物的荧光发射谱得到荧光强度数据，对比肌氨酸浓度-荧光强度关系曲线得出未知肌氨酸样品含量。
2、如权利要求1所述的方法，其中，S1和S3中下列反应试剂浓度分别为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    1×10-7～1×10-3mol/L
肌氨酸氧化酶                  10～20000units/L
过氧化物酶                    20～60000units/L
碱性缓冲液                    0.05-0.5mol/L。
3、如权利要求2所述的方法，其中，S1和S3中下列反应试剂浓度分别为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-6～2×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  3000～15000units/L
过氧化物酶                    10000～50000units/L
碱性缓冲液                    0.1～0.25mol/L。
4、如权利要求3所述的方法，其中，S1和S3中下列反应试剂浓度分别为：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-5～1×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  5000～10000units/L
过氧化物酶                    20000～30000units/L
碱性缓冲液                    0.15-0.2mol/L。
5、如权利要求1所述的方法，其中，S2中激发光波长为300～360nm。
6、如权利要求5所述的方法，其中，S2中激发光波长为320nm。
7、如权利要求1～6任一项所述的方法，其中，碱性缓冲液为NH3-NH4Cl缓冲溶液、Tris缓冲溶液、硼酸缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。
8、一种用于如权利要求1所述方法的反应试剂盒，包含浓度如下的各组分：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    1×10-7～1×10-3mol/L
肌氨酸氧化酶                  10～20000units/L
过氧化物酶                    20～60000units/L
碱性缓冲液                    0.05～0.5mol/L。
9、如权利要求8所述的反应试剂盒，包含浓度如下的各组分：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-6～2×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  3000～15000units/L
过氧化物酶                    10000～50000units/L
碱性缓冲液                    0.1～0.25mol/L。
10、如权利要求9所述的反应试剂盒，包含浓度如下的各组分：
对甲基酚或对羟基苯乙酸溶液    5×10-5～1×10-4mol/L
肌氨酸氧化酶                  5000～10000units/L
过氧化物酶                    20000～30000units/L
碱性缓冲液                    0.15-0.2mol/L。
11、如权利要求8～10任一项所述的反应试剂盒，其中，碱性缓冲液为NH3-NH4Cl缓冲溶液、Tris缓冲溶液、硼酸缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。
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