CN113504206A - 一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法和由此构建的传感探针及其应用 - Google Patents

一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法和由此构建的传感探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法，其包括提供具有连续可调的介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子；将肌氨酸氧化酶装载到固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子中，肌氨酸氧化酶通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架纳米粒子的介孔孔道内，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架传感探针。本发明还提供由此构建的传感探针及其应用。本发明通过固定肌氨酸氧化酶作为肌氨酸的识别中心，发光检测具有高度特异性，在复杂生物样本中对肌氨酸的发光定量检测不受干扰。适用于临床尿样中肌氨酸癌标物的特异性检出，提供了一种便捷、快速、特异性的发光检测技术，用于前列腺癌患者的筛查和诊断。

Description

一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法和由此构建 的传感探针及其应用
技术领域
本发明涉及酶固定化和分析化学，更具体地涉及一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法和由此构建的传感探针及其应用。
背景技术
前列腺癌是严重影响男性健康的常见癌症之一(Int J Mol Sci.2013,14,13893-13908)。对于大多数患者来说，早期没有明显的临床症状，因此前列腺癌的早期筛查对提高患者的生活质量和降低死亡率至关重要。肌氨酸被证实是早期前列腺癌的一种临床生物标志物，尿液中肌氨酸的水平可用于简单无创的早期诊断(Nature 2009,457,910-914)。相比于传统的前列腺特异性抗原检测法，发光检测技术具有灵敏度高、操作简单、反应时间快、无需复杂的预处理等优点，非常适用于肌氨酸等小分子代谢标志物的临床检测(ACSSens.2017,2,31-45)。一般来说，肌氨酸在健康人群的尿液样本中浓度为1 3×10-6mol·L-1，而前列腺癌患者的尿液中肌氨酸水平会明显升高，但增加量不超过一个数量级(EXCLIJournal 2018,17,467-478)。
然而，发光探针通常容易受临床样本中大量生物分子的多种干扰(Anal.Chem.2018,90,14578-14585)。因此，很难精确区分生物标志物的微小浓度变化，从而导致假阳性/阴性诊断的风险。因此，发展高度灵敏和特异性的发光检测技术，精确区分肌氨酸标志物在实际临床样本中的微小浓度变化，是实现前列腺癌患者精准筛选的关键。
发明内容
本发明公开了一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法和由此构建的传感探针及其应用，通过发光定量检测临床尿样中肌氨酸的含量，提供了一种简便、可靠、特异的检测方法来筛选前列腺癌患者。
本发明提供一种的分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法，其包括步骤：S1，将氧敏分子固定到分级多孔金属有机骨架纳米粒子中，得到具有介孔孔道的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子，其中，氧敏分子通过共组装一步合成法固定到分级多孔金属有机骨架纳米粒子的孔壁中，得到的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子(TCPP-Pt@HMUiO)具有连续可调的介孔孔径；S2，将肌氨酸氧化酶(SOX)通过吸附装载到固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子(TCPP-Pt@HMUiO)的介孔孔道中，得到固定有SOX酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)。
优选地，氧敏分子为铂(II)内消旋四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP-Pt)。
优选地，所述步骤S1包括：S11，利用嵌段共聚物PEO106PPO70PEO106(F127)为模板剂来提供金属有机骨架(Metal organic Framework，MOFs)前驱体溶液，利用1,3,5-三甲苯(TMB)为扩孔剂，与氧敏分子通过溶剂热生成具有可调介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架前驱体(TCPP-Pt@HMUiO-as)；S12，通过活化和去模板得到固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子(TCPP-Pt@HMUiO)。更优选地，通过调控TMB/F127的投料比在0-0.349之间，得到的TCPP-Pt@HMUiO的介孔孔径尺寸在6.4-12.1nm之间连续可调。在优选的实施例中，TMB/F127的投料比为0，0.043，0.087，0.173，0.262和0.349，TCPP-Pt@HMUiO的孔径分别为6.4nm，8.3nm，9.8nm，10.9nm，11.9nm和12.1nm。更优选地，将嵌段共聚物F127和TMB搅拌溶解于去离子水中，添加高氯酸钠和乙酸，超声溶解；然后添加ZrO(NO3)2·2H2O、2-氨基对苯二甲酸和TCPP-Pt，搅拌分散；在40℃下搅拌反应24h；经过离心分离、洗涤、活化、干燥后得到固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)。具体地，将50mg的F127溶解于3mL去离子水中，然后将不同量的TMB(0，2.5，5，10，15和20μL)分散于上述F127溶液中；将0.4mL乙酸和200mg NaClO4·H2O搅拌分散于上述溶液中；此后，将40mg的2-氨基对苯二甲酸、8mg TCPP-Pt和115.6mg的ZrO(NO3)2·2H2O搅拌分散于上述溶液中；然后，将混合液体在40℃下搅拌反应24h；离心分离混合物得到固体产物；接着用去离子水、N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇洗涤材料，并将材料在60℃下浸泡于无水乙醇中48h，期间不断更换乙醇，将材料孔道中的F127全部去除，经洗涤干燥后，最后得到尺寸为80-120nm的固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)。本发明利用嵌段共聚物F127为模板，利用不同投料量的TMB为扩孔剂，合成出具有6.4-12.1nm左右的固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)，合成步骤简单、制备周期短。
优选地，所述步骤S2包括：将具有肌氨酸催化功能的肌氨酸氧化酶(SOX)溶解于去离子水中，添加固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)，通过吸附法固定酶，得到固定有SOX酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)。具体地，将2mg SOX搅拌溶解于2mL HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)，添加5mg固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)，在25℃下搅拌3h，并通过离心收集产物，接着用去离子水洗涤材料三次，得到固定有SOX酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)。以介孔尺寸为12.1nm的固定有SOX酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)为例，肌氨酸氧化酶(SOX)的装载量为187mg g-1，制备过程条件温和、操作简便。
本发明还提供一种上述制备方法得到的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)，其中，肌氨酸氧化酶和氧敏分子偶联固定在分级多孔金属有机骨架纳米粒子的载体上。
本发明又提供一种上述分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)的应用，其对肌氨酸具有发光传感响应。据此，分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)通过肌氨酸氧化酶(SOX)和氧敏分子(TCPP-Pt)构建的联级响应体系用于肌氨酸的特异性识别。
优选地，分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)对肌氨酸显示出特异性发光增强，而对其他氨基酸干扰分子没有发光响应。
优选地，分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)分散在HEPES缓冲液中形成探针溶液，将肌氨酸溶液加入探针溶液中孵育，利用荧光光谱仪测其发光强度。
优选地，在肌氨酸溶液为0～100μM的浓度范围内，利用分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)对肌氨酸进行发光响应，并将探针的发光强度和肌氨酸浓度进行线性拟合分析。据此，分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)可用于肌氨酸的定量分析。
优选地，肌氨酸溶液的检测下限为2.1μM。
据此，本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)可用于临床检测应用，其能够直接发光定量检测临床尿样中肌氨酸的含量，来筛选前列腺癌患者。其中，分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)在尿样中作标准曲线，将不同前列腺癌患者或健康人的尿样加入探针溶液中孵育，利用荧光光谱仪测其发光强度，通过标准曲线，将发光强度转化为肌氨酸浓度，实现临床尿样中的肌氨酸定量。
本发明将氧敏分子通过原位固定的方式，固定在分级多孔金属有机骨架的孔壁中，其分级多孔结构能够将氧敏发光分子分隔固定在金属节点上，避免了发光分子的聚集淬灭；并将SOX酶通过后吸附法装载到分级多孔金属有机骨架(TCPP-Pt@HMUiO)的介孔孔道内，金属有机骨架材料坚固的外骨骼保护了酶的蛋白结构，改善SOX酶的稳定性；同时，TMB作为扩孔剂，通过调控不同投料量的TMB，能够连续调控分级多孔金属有机骨架(TCPP-Pt@HMUiO)的介孔尺寸，更大的介孔孔径有利于SOX酶的固定化和肌氨酸的快速扩散和反应；检测过程中利用联级反应，即肌氨酸氧化酶与肌氨酸之间的酶催化反应，等摩尔量地消耗溶液中的溶解氧，氧敏分子(TCPP-Pt)能迅速响应溶解氧的变化，从而对肌氨酸的含量作出间接的发光响应，通过利用荧光分光光度计进行检测，达到肌氨酸定量检测的目的。本发明通过固定肌氨酸化酶作为识别中心，可以高灵敏性、高特异性对肌氨酸进行识别与含量分析。该方法合成方法便捷，制备条件温和，仪器操作方便，技术要求低，分析灵敏度高、特异性强、抗干扰能力优异。本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针在HEPES缓冲溶液中可以对肌氨酸在100μM以下的低浓度范围内对肌氨酸进行线性测定，且具有低检测限(2.1μM)、高灵敏性、强特异性、抗干扰能力优异；并且这种发光响应探针能够提供一种简便、可靠、特异的检测方法，通过测定尿样中的肌氨酸水平，成功地用于前列腺癌患者的筛查。
附图说明
图1是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法的工艺流程图；
图2是在不同TMB/F127的投料比下，合成的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的DLS粒径分布图，其中，TMB/F127的投料比为(a)0、(b)0.043、(c)0.087、(d)0.173、(e)0.262和(f)0.349；
图3是XRD图谱，其中，A是模拟MOF材料UiO-66结构的XRD图谱，B是在不同TMB/F127的投料比下，合成的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的XRD图谱；
图4是根据本发明的具有不同介孔孔径的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的氮气吸附图(A)及其孔径分布图(B)；
图5示出了TMB/F127的投料比和合成材料的介孔孔径之间的非线性拟合；
图6是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的扫描电镜图像；
图7是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的投射电镜图像；
图8是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的扫描投射电镜图像和对应的元素分布图像；
图9是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的UV-Vis图谱；
图10是根据本发明的氧敏分子TCPP-Pt的定量标准曲线图；
图11是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的消解上清液的核磁共振氢谱图；
图12是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的配体2-氨基对苯二甲酸的核磁共振氢谱图；
图13是根据本发明的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的氧敏分子TCPP-Pt的核磁共振氢谱图；
图14是根据本发明的肌氨酸氧化酶SOX的定量标准曲线图；
图15是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的介孔孔径与肌氨酸氧化酶SOX负载量之间的关系图；
图16是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针对肌氨酸的发光响应动力学图；
图17是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的氧敏分子TCPP-Pt泄露实验图；
图18是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的肌氨酸氧化酶SOX泄露实验图；
图19是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的长期保存后，发光响应稳定性图；
图20是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的长期保存后，结构稳定性图；
图21是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针对肌氨酸的发光滴定(A)和线性拟合(B)图谱；
图22是根据本发明的具有不同介孔孔径的分级多孔金属有机骨架传感探针，在有氧和无氧环境下，对肌氨酸的发光响应图谱；
图23是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针抗干扰、选择性检测结果图像；
图24是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针在尿样中，对肌氨酸的发光滴定校准曲线和对应的线性拟合图；
图25是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针对前列腺癌患者、健康男性和健康女性尿液样本的发光响应图；
图26是是根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针在尿样中，对肌氨酸的发光定量的回收率测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
如图1所示，根据本发明的分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法包括步骤：提供氧敏分子(TCPP-Pt)、金属有机骨架(MOFs)前驱体溶液和扩孔剂(1,3,5-三甲苯，1,3,5-Trimethylbenzene，TMB)，通过溶剂热生成具有可调介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔MOFs前驱体(TCPP-Pt@HMUiO-as)，通过活化和去模板，得到具有可调介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔MOFs(TCPP-Pt@HMUiO，也被称为可调介孔尺寸的MOFs荧光纳米粒子或固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔MOFs纳米颗粒)，其中，1,3,5-三甲苯作为扩孔剂，连续调控分级多孔金属有机骨架的介孔孔径，氧敏分子(TCPP-Pt)通过共组装一步合成法，固定在分级多孔MOFs(TCPP-Pt@HMUiO)的孔壁中。随后，将肌氨酸氧化酶(SOX)固定到固定有氧敏分子的分级多孔MOFs(TCPP-Pt@HMUiO)上，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)，其中，肌氨酸氧化酶(SOX)通过吸附装载在固定有氧敏分子的分级多孔MOFs(TCPP-Pt@HMUiO)的介孔孔道中。
实施例1
1.1固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP- Pt@HMUiO)的合成
在室温条件下，将50mg的F127溶解于3mL去离子水中，然后将不同体积量的TMB(0，2.5，5，10，15和20μL)分散于上述F127溶液中；随后，将体积量为0.4mL的乙酸和质量为200mg的NaClO4·H2O搅拌分散于上述溶液中；此后，将质量为40mg的2-氨基对苯二甲酸、8mgTCPP-Pt和115.6mg的ZrO(NO3)2·2H2O搅拌分散于上述溶液中；然后，将混合液体在40℃下搅拌反应24h；离心分离混合物得到固体产物；接着用去离子水、N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇洗涤材料，并将材料在60℃下浸泡于无水乙醇中48h，期间不断更换乙醇，将材料孔道中的F127全部去除，经洗涤干燥后，最后得到尺寸为80-120nm的固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)。
图2是在不同TMB/F127投料比下(TMB/F127投料比为(a)0、(b)0.043、(c)0.087、(d)0.173、(e)0.262和(f)0.349)，合成的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)的动态光散射测试，证实了材料都具有纳米级的颗粒尺寸和良好的分散性。图3是TCPP-Pt@HMUiO的XRD图谱，可以看出在不同TMB/F127投料比下，合成的TCPP-Pt@HMUiO都具有良好的结晶性，保持着UiO-66晶体的特征峰以及高结晶度。图4是在不同TMB/F127投料比下，合成的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒TCPP-Pt@HMUiO的氮吸附等温线(图4A)和对应的BJH孔径分布曲线(图4B)。可以看到，合成的TCPP-Pt@HMUiO都具有典型I型和IV型吸附等温线，随着TMB/F127投料比的增加，相对压力向高压方向移动，对应的介孔孔径分别为6.4，8.3，9.8，10.9，11.9，12.1nm，证明介孔孔径的不断扩大。进一步增加TMB/F127的投加比不会明显增大介孔尺寸。图5针对TMB/F127投料比与介孔孔径进行了非线性拟合，这有助于精确制备特定介孔尺寸的TCPP-Pt@HMUiO。下表1中给出了在不同TMB/F127投料比下，合成的TCPP-Pt@HMUiO的孔结构参数。图6是在不同TMB/F127投料比下，合成的TCPP-Pt@HMUiO的扫描电子显微镜图。图7是在不同TMB/F127投料比下，合成的TCPP-Pt@HMUiO的透射电子显微镜图，表明所有的TCPP-Pt@HMUiO都具有规整的介孔孔道结构，粒径在80nm～120nm，并且随着TMB/F127投料比的增加，材料的介孔孔径也扩大。图8是具有12.1nm介孔孔径的TCPP-Pt@HMUiO的扫描透射电子显微镜及对应的元素分布图，可以看到Pt元素均匀分布在整个纳米颗粒中，证明氧敏分子TCPP-Pt均匀地固定在TCPP-Pt@HMUiO载体内。图9是TCPP-Pt@HMUiO的紫外-可见吸收光谱图，在401nm，512nm和538nm处观察到TCPP-Pt的特征吸收峰，证明TCPP-Pt成功地固定在材料内。通过图10为氧敏分子TCPP-Pt的标准定量曲线，定量得出TCPP-Pt@HMUiO中氧敏分子TCPP-Pt的实际含量约为0.055mmol/g。图11-图13分布为消解后的TCPP-Pt@HMUiO样品、2-氨基对苯二甲酸和氧敏分子TCPP-Pt的H-NMR图谱，可以计算出材料中TCPP-Pt/2-氨基对苯二甲酸的比例为0.014。
表1
TMB/F127 孔径(nm) 孔容(cm<sup>3</sup>/g) 比表面积(m<sup>2</sup>/g)
0 6.4 0.68 1573
0.043 8.3 0.93 1369
0.087 9.8 1.02 1221
0.173 10.9 1.11 1155
0.262 11.9 1.26 1077
0.349 12.1 1.29 1016
1.2固定肌氨酸氧化酶(SOX)得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架传感探针 (TCPP-Pt/SOX@HMUiO)
将质量为2mg的肌氨酸氧化酶搅拌溶解于2mL HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)，添加质量为5mg的固定有氧敏分子的介孔尺寸可调的分级多孔金属有机骨架纳米颗粒(TCPP-Pt@HMUiO)，在25℃下搅拌3h，并通过离心收集产物，接着用去离子水洗涤材料三次，得到固定有SOX酶的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)。
图14为肌氨酸氧化酶SOX的标准定量曲线，用于定量材料中酶的负载量。图15为在分级多孔金属有机骨架传感探针TCPP-Pt/SOX@HMUiO中，肌氨酸氧化酶的负载量与介孔孔径间的关系，可以看到随着介孔孔径从6.4增加到12.1nm，肌氨酸氧化酶的负载量从41增加到187mg g-1。因此具有较大介孔孔径(12.1nm)的TCPP-Pt/SOX@HMUiO能够提供足够大的孔道空间，有利于酶的高负载，并且促使肌氨酸在孔道内自由扩散。
1.3分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)对肌基酸的发光响应 动力学
将质量为10mg的TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针材料分散在2mL去离子水中形成5000mgL-1的探针溶液，将体积量为100μL的上述探针溶液加入到含有不同浓度肌氨酸的HEPES缓冲液(20mM，pH 7.4)，在避光条件下于25℃孵育反应。然后，在固定的时间间隔下，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。图16可以看出TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针对肌氨酸具有发光传感响应，发光信号随着时间快速增强，并且在1h达到响应平衡。
1.4分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)对肌基酸的定量分析
将质量为10mg的TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针材料分散在2mL去离子水中形成5000mgL-1的探针溶液，将体积量为100μL的上述探针溶液，加入到体积量为1.9mL含有不同浓度肌氨酸的HEPES缓冲液(20mM，pH 7.4)，在避光条件下于25℃孵育反应1h至响应平衡。然后，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。将测得的发光强度和肌氨酸浓度进行线性拟合，得到肌氨酸定量的标准曲线。
图17为TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针在HEPES缓冲溶液中保存不同时间后的上清液的发光光谱，证明氧敏分子TCPP-Pt牢固地固定在探针中，没有发生染料泄露。图18为TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针在HEPES缓冲溶液中保存不同时间后的上清液的紫外吸收光谱，证明肌氨酸氧化酶SOX牢固地固定在探针中，没有发生酶的泄露。图19为TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针在4℃下保存不同天数后，对肌氨酸的发光响应效率，证明探针具有出色的稳定性，在15天内对肌氨酸的发光响应效率不变。图20为TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针在4℃下保存不同天数后，探针的XRD图谱，证明载体在15天内结晶性不变，具有出色的结构稳定性。图21的A可以看出当探针加入到肌氨酸溶液后，探针的发光强度随着肌氨酸浓度的增加而有规律地增强，B为肌氨酸定量的标准曲线，在0～100μM的浓度范围内，探针可以对肌氨酸进行线性分析，相关系数高达0.995，且具有较低的检测限LOD(2.1μM)，探针的线性检测范围能够满足对前列腺癌患者尿样中的肌氨酸水平进行检测。
1.5具有不同介孔孔径的分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO) 对肌基酸的定量分析
将质量为10mg的具有不同介孔孔径的TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针材料分散在2mL去离子水中形成5000mg L-1的探针溶液，将体积量为100μL的上述探针溶液，加入到体积量为1.9mL含有不同浓度肌氨酸的HEPES缓冲液(20mM，pH 7.4)，在空气饱和或者无氧的溶液环境下，避光条件下于25℃孵育反应1h至响应平衡。然后，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。
图22可以看出在无氧条件下，探针几乎没有任何发光变化，证明溶解氧在肌氨酸的定量检测中起着重要作用；在溶解氧存在下，探针的介孔尺寸从8.3增加到12.1nm，探针对肌氨酸的发光响应幅度更大，证明较大的介孔有利于更多肌氨酸氧化酶的负载，有利于肌氨酸的快速扩散，因此更快地消耗溶解氧达到平衡，从而证明具有12.1nm介孔孔径的TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针更适于肌氨酸的快速检测。
1.6分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)在干扰物共存的情况 下对肌氨酸的发光传感检测
将不同浓度的干扰物质(酪氨酸(Tyr)，组氨酸(His)，丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)，丝氨酸(Ser)，尿酸(UA))溶解于探针溶液中，平衡响应1h，对探针溶液进行发光测定，得到λ＝665nm处的发光强度。此外，将100μM浓度的干扰物质(酪氨酸(Tyr)，组氨酸(His)，丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)，丝氨酸(Ser)，尿酸(UA))溶解于探针溶液中，并在加入不同浓度的肌氨酸，平衡响应1h，对探针溶液进行发光测定，得到λ＝665nm处的发光强度。图23显示上述干扰物质在0-100μM的浓度范围内，对探针本身发光特性的影响可以忽略不计。图24显示上述干扰物质存在于待检测混合溶液中时，对肌氨酸的定量检测结果没有影响。
应用例1
2.1分级多孔金属有机骨架传感探针(TCPP-Pt/SOX@HMUiO)用于前列腺癌患者临 床尿样中肌氨酸的定量检测
尿液样本由上海瑞金医院提供，来自于3例前列腺癌患者和6例健康人的尿液样本。首先，利用健康志愿者的尿样构建校准曲线，向健康志愿者的尿样中添加一定量的肌氨酸，使得尿样中的肌氨酸浓度为0、10、25、50、75和100μM。将质量为10mg的TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针材料分散在2mL去离子水中形成5000mg L-1的探针溶液，将体积量为100μL的上述探针溶液，加入到体积量为1.9mL含有不同浓度肌氨酸的尿液样本，在避光条件下于25℃孵育反应1h至响应平衡，每个样本设置三个平行样。然后，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。将测得的发光强度和肌氨酸浓度进行线性拟合，得到肌氨酸定量的校准曲线。
为了测定不同人的尿液样本中肌氨酸的浓度，将体积量为100μL的上述探针溶液，加入到体积量为1.9mL尿液样本中，在避光条件下于25℃孵育反应1h至响应平衡，每个样本设置三个平行样。然后，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。通过肌氨酸定量的校准曲线，将发光强度转化成肌氨酸浓度。
为了测定探针在尿液样本中肌氨酸的回收率，向前列腺癌患者的尿样中添加一定量的肌氨酸，使得尿样中的肌氨酸浓度为30、50和70μM，将体积量为100μL的上述探针溶液，加入到体积量为1.9mL含有特定肌氨酸浓度的尿液样本，在避光条件下于25℃孵育反应1h至响应平衡，每个样本设置三个平行样。然后，利用荧光光谱仪，以415nm作为激发波长，检测混合物在λ＝665nm处的发光强度。通过肌氨酸定量的校准曲线，将发光强度转化成测定的肌氨酸浓度，将测定的肌氨酸浓度和添加的浓度进行比较，得到探针在尿样中检测肌氨酸的回收率。
图25为探针在尿样中的肌氨酸定量校准曲线。图26采用TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针测定6例健康志愿者(男3例，女3例)和3例前列腺癌患者尿样中的尿肌酸水平，可以看到，来自前列腺癌患者的尿液样本导致探针的发光强度显著增加，而健康人的尿液样本对探针的发光强度几乎没有影响，证明探针可以有效地对尿液样本中的肌氨酸作出发光响应。通过将探针的发光强度转换为肌氨酸浓度，确定前列腺癌患者尿液样本的平均肌氨酸浓度约为16.9μM，比正常人的肌氨酸浓度高8倍，证明该探针能有效、准确地为前列腺癌患者提供肌氨酸标志物的阳性诊断。通过探针在尿液样本中肌氨酸的回收率测试，可以看到当添加额外的30μM肌氨酸后，探针的发光强度进一步增强，计算得出的肌氨酸浓度与额外添加的肌氨酸量很好地匹配。下表2的结果验证了TCPP-Pt/SOX@HMUiO探针在尿液样本下对肌氨酸的回收率测试结果。
表2
样品序号 额外添加浓度(μM) 测定浓度(μM)±σ 回收率(％)
1 0 21.25±3.5 -
2 30 50.69±3.3 98.91±0.06
3 50 72.63±2.7 101.94±0.04
4 70 91.93±4.3 100.75±0.05
本发明利用嵌段共聚物F127模板和1,3,5-三甲苯TMB扩孔作用，通过共组装一步合成法，将氧敏分子固定到材料载体中，合成出具有可调介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架材料。并通过后吸附的方式，将肌氨酸氧化酶装载进入分级多孔金属有机骨架材料的孔道中，从而实现肌氨酸的特异性识别和定量分析。此方法具有便捷、快速和特异性，适用于临床尿样中肌氨酸癌标物的特异性检出，用于前列腺癌患者的筛查和诊断。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种分级多孔金属有机骨架传感探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
S1，将氧敏分子固定到分级多孔金属有机骨架纳米粒子中，得到具有介孔孔道的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子，其中，氧敏分子通过共组装一步合成法固定到分级多孔金属有机骨架纳米粒子的孔壁中，得到的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子具有连续可调的介孔孔径；
S2，将肌氨酸氧化酶通过吸附装载到固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子的介孔孔道中，得到固定有肌氨酸氧化酶的分级多孔金属有机骨架传感探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，氧敏分子为铂(II)内消旋四(4-羧基苯基)卟啉。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
S11，利用嵌段共聚物PEO106PPO70PEO106为模板剂来提供金属有机骨架前驱体溶液，利用1,3,5-三甲苯为扩孔剂，与氧敏分子通过溶剂热生成具有可调介孔孔径的固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架前驱体；
S12，通过活化和去模板得到固定有氧敏分子的分级多孔金属有机骨架纳米粒子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，分级多孔金属有机骨架纳米粒子的介孔孔径在6.4-12.1nm之间连续可调。
5.一种根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法得到的分级多孔金属有机骨架传感探针，其特征在于，肌氨酸氧化酶和氧敏分子偶联固定在分级多孔金属有机骨架纳米粒子的载体上。
6.根据权利要求5所述的分级多孔金属有机骨架传感探针的应用，其特征在于，该分级多孔金属有机骨架传感探针对肌氨酸具有发光传感响应。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，分级多孔金属有机骨架传感探针对肌氨酸显示特异性发光增强，而对其他氨基酸干扰分子没有发光响应。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，分级多孔金属有机骨架传感探针分散在HEPES缓冲液中形成探针溶液，将肌氨酸溶液加入探针溶液中孵育，利用荧光光谱仪测其发光强度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在肌氨酸溶液为0～100μM的浓度范围内，利用分级多孔金属有机骨架传感探针对肌氨酸进行发光响应，并将探针的发光强度和肌氨酸浓度进行线性拟合分析。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，肌氨酸溶液的检测下限为2.1μM。
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