CN101586089A - 一种用于高密度培养大肠杆菌的复合有机氮源 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于高密度培养大肠杆菌的复合有机氮源，该复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成，并控制复合有机氮源中对所培养的大肠杆菌的高密度培养起关键性作用的嘌呤、嘧啶和/或氨基酸的含量。使用本发明提供的复合有机氮源配制获得复配发酵培养基同现在通常使用的发酵培养基相比，由于控制了培养基中嘌呤、嘧啶和氨基酸的含量，有效的保证了发酵水平，同时能够明显的降低成本，对于大规模工业化生产十分有益。
Description
发明领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种用于高密度培养大肠杆菌的复合有机氮源。
背景技术
大肠杆菌是工业生产上应用最为广泛的菌种，人们采用各种大肠杆菌来生产各种产品，如各种蛋白质，核酸类，以及小肽等。大肠杆菌在生长发育过程中，需要各种营养物质，这些营养物质由培养基中的成分来提供。根据提供营养物质的类型，培养基的成分大致可分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。其中，有机氮源是发酵培养基中的重要成分，其作用不仅提供氮源，更能提供大肠杆菌高密度生长以及产物高表达分泌所需的嘌呤、嘧啶和氨基酸，这些物质对大肠杆菌的生长发育作用很大，故应控制培养基内嘌呤、嘧啶和氨基酸处于合适的范围内。
目前大肠杆菌发酵培养基中有机氮源的设计研究工作一般不涉及有机氮源中嘌呤、嘧啶的具体作用。忽略这些物质的重要作用，客观上造成了无法对有机氮源中这些物质提出针对性的品控要求，进而导致由于原材料产地、加工方法等因素的变化，使这些物质的含量发生变化，最终对发酵结果产生不良的影响。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于高密度培养大肠杆菌的复合有机氮源。
本发明提供的复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成，并控制复合有机氮源中对所培养的大肠杆菌的高密度培养起关键性作用的嘌呤、嘧啶和/或氨基酸的含量。
根据本发明，天然氮源选自：胰蛋白胨、胰酪胨、牛肉胨、大豆胨、鲜鱼胨、酵母粉、酵母膏。
根据本发明，进行的复配是基于所针对的大肠杆菌以及天然氮源中嘌呤及嘧啶的含量，其中，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的含量，分别如下：
腺嘌呤为1-200mg/L；鸟嘌呤为1-200mg/L；胞嘧啶为1-200mg/L；胸腺嘧啶为1-200mg/L；尿嘧啶为1-200mg/L。
根据本发明，复配是基于天然氮源中的缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸，其含量分别如下：
缬氨酸为10-5000mg/L；苏氨酸为10-5000mg/L；甲硫氨酸为10-5000mg/L；精氨酸为10-5000mg/L；天冬氨酸为10-5000mg/L；甘氨酸为10-5000mg/L；酪氨酸为10-5000mg/L；苯丙氨酸：10-5000mg/L；亮氨酸：10-5000mg/L；异亮氨酸：10-5000mg/L；丙氨酸：10-5000mg/L；丝氨酸：10-5000mg/L；组氨酸：10-5000mg/L；半胱氨酸：10-5000mg/L；酪氨酸：10-5000mg/L。
使用本发明提供的用于大肠杆菌发酵生产的复合有机氮源，由于在控制含氮量的同时，也控制了氮源中对发酵有重要影响的嘌呤、嘧啶的含量。同现在通常使用的有机氮源相比，由于控制了这些对发酵有重要影响的物质的含量，从而可以避免发酵水平波动的问题；同时也能降低氮源的成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
在本发明的实施例中，采用的大肠杆菌及重组质粒分别为：
产嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌BL21(DE3)：通过使用常规方法将pET28质粒(具有卡那霉素抗性，购于introgen公司)转入大肠杆菌BL21(DE3)(购于introgen公司)获得。
产核酸疫苗的大肠杆菌(DH5α)：通过使用常规方法将质粒pVAX-44(卡那霉素抗性，购自海归生物有限公司)转入大肠杆菌DH5α(购于introgen)公司获得。
产人白细胞介素-3(IL-3)的大肠杆菌YK512：通过使用常规方法将质粒pSBHL-1(氨卞青霉素抗性)转入大肠杆菌JM109(购于introgen公司)获得，其中，质粒pSBHL-1参考杨立红，陈长庆，苏成芝等，人白细胞介素-3在大肠杆菌中的高效表达(生物化学与生物物理学报，1994年9月，第5期第26卷)的方法构建。
产α-乙酰乳酸脱羧酶的大肠杆菌TG2：通过使用常规方法将质粒pETGAU-10(氨卞青霉素抗性)转入大肠杆菌JM109(购于introgen公司)获得，其中，质粒pETGAU-10参考苟帮超，杨玉等，产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达(四川师范大学学报，2006年11月，第6期第29卷)的方法构建。
进行检测的方法如下：
大肠杆菌菌液浓度测定：发酵液经合适倍数的稀释后，用752-C型分光光度计在600nm测其光吸收值，乘稀释倍数后即为细胞密度。
目的蛋白占总蛋白含量测定：SDS-PAGE电泳测定，具体如下：超声破碎细胞后，离心得到上清液，取0.5ml上清液，加入0.5ml 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，10000rpm离心，得到上清液，用于SDS-PAGE电泳，其中，分离胶为12.5％，浓缩胶为4.5％，进行灰度分析，得到酶蛋白占总蛋白的含量。
嘌呤核苷磷酸化酶的酶活的测定：取20μL浓度为100g/L的菌液，放入200μL含3μmol肌苷的磷酸钠缓冲液中，于37℃，pH7.0反应1h，然后于100℃煮沸5min后，13000rpm离心1min，取上清稀释10倍，进行高效液相色谱测定次黄嘌呤的含量。高效液相色谱条件为：流动相10％甲醇，C-18柱，柱温为40℃，检测波长为254nm。
在pH7.0，37℃条件下，每h转化生成1μmol次黄嘌呤的酶量为1个酶活力单位。
α-乙酰乳酸脱羧酶活力测定：发酵液8000rpm离心10min，取上清液测乙酰乳酸脱羧酶活力，具体如下：取20μl经适当稀释的酶液，与80μl乙酰乳酸溶液(含0.02mmol乙酰乳酸)、300μl MES缓冲液(含0.05mol/L MES、1.0mmol/L MgCl2、0.2％Triton X-100、0.5mol/LNaCl，pH6.0)混合，在30℃反应20min。加入4.6ml显色剂(3％α-奈酚、0.3％肌酸、3mol/LNaOH按1∶1∶1混合)，30℃显色40min，在522nm处测其光吸收值。在乙偶姻标准曲线上读出其乙偶姻浓度。
在pH6.0，30℃条件下，每分钟水解出1μmol乙偶姻的酶量为1个酶活单位。
IL-3包涵体蛋白量的测定：将离心得到的菌体按1∶10(W/V)悬浮于STE(20mmol/LTris-HCl pH8.5，1mmol/LEDTA，0.3mol/L蔗糖)，于0℃冰浴中反复超声15次，每次90s，每次间隔3.5min，10000rpm离心12min，收集包涵体；将包涵体按1∶20(w/v)悬浮于洗涤液中(20mmol/L Tris-HCl pH8.5，1mmol/L EDTA.0.2％Triton X-100)，于冰浴中超声10次，每次60s，每次间隔3.5min，离心，收集包涵体；将包涵体悬浮在TE中(20mmol/L Tris-HClpH8.5，1mmol/LEDTA)超声洗涤10次，离心收集包涵体。采用Bradford法测蛋白浓度。取菌液10mL，5000rpm离心15min得菌体，清洗两次，超声10次，每次60s，破菌后，取样按Bradford标准方法测蛋白含量。
将包涵体溶解在8mol/L尿素中，按同方法测蛋白含量，得包涵体的总蛋白量，最终得到IL-3占总蛋白含量。
质粒浓度的比较：取40mL发酵液于离心管内，8000rpm冷冻离心20min，弃上清液，得到湿菌体。将湿菌体在离心管中用一定量的TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重悬成混浊液，使菌体浓度为100mg/mL。然后加入与TE缓冲液等体积的碱裂解液(1％SDS，200mmol/LNaOH)，慢慢混匀。裂解6min后再加入同样体积的3mol/L醋酸钾溶液(pH5.2)，慢慢混匀后冰浴30min。然后，12000rpm离心15min，取出上清液，加入上清液体积0.7倍的异丙醇，混匀，使质粒DNA沉淀。静置5min，12000rpm离心10min，倒去上清得DNA沉淀，将沉淀用1ml TE缓冲液溶解，-20℃保存。
用TBE缓冲液配制0.8％琼脂糖凝胶，将提取出的样品在110V电压下电泳40min，用溴化乙锭染色，在凝胶成像仪下扫描出电泳图。
质粒产量的测定：取一定量离心所得到的湿菌体，用海规生物有限公司的质粒提取试剂盒作分离纯化，测定260nm处吸光度，计算纯化后质粒的浓度(mg/mL)以及质粒含量。
嘌呤、嘧啶的高压液相色谱分析：采用C-18反相柱，于260nm处检测，其中，流动相为乙腈与0.1mol/l KH2PO4(H3PO4调pH至4.05)的混合溶液，其中，乙腈∶KH2PO4＝2∶98(体积比)。
氨基酸分析：日立L-8800氨基酸自动分析仪分析。
虽然在本发明中，只使用了有限种不同来源的氮源，但本领域的技术人员能明了，在本发明中对天然氮源的来源实际上是没有任何限定的，只需要其能满足复合有机氮源/复配后的复配培养基中的相应嘧啶、嘌呤和/或氨基酸含量在相应的范围内即可。
实施例1、复合有机氮源制备：
1.1、用于大肠杆菌BL21高密度发酵的复合有机氮源1.1-1.5的制备
按表1.1.1所示，使用酵母膏，酵母粉，胰蛋白胨和大豆胨，分别制备复合有机氮源1.1-1.5。
表1.1.1、复合有机氮源1.1-1.5配方
| 酵母膏 | 酵母粉 | 胰蛋白胨 | 大豆胨 | |
| 复合有机氮源1.1 | 0％ | 30％ | 50％ | 20％ |
| 复合有机氮源1.2 | 20％ | 20％ | 30％ | 30％ |
| 复合有机氮源1.3 | 20％ | 15％ | 40％ | 25％ |
| 复合有机氮源1.4 | 10％ | 25％ | 25％ | 40％ |
| 复合有机氮源1.5 | 20％ | 27％ | 21％ | 32％ |
发明人研究发现，对于大肠杆菌BL21而言，鸟嘌呤、胱氨酸、缬氨酸的含量在高密度发酵中起关键性作用，因此，测定了复合有机氮源1.1-1.5中的鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸含量，结果如表1.1.2所示。
表1.1.2、复合有机氮源1.1-1.5中鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸含量
| 鸟嘌呤(mg/g) | 胱氨酸(mg/g) | 缬氨酸(mg/g) | |
| 复合有机氮源1.1 | 0.62 | 12.032 | 34.068 |
| 复合有机氮源1.2 | 0.83 | 15.267 | 37.059 |
| 复合有机氮源1.3 | 0.79 | 14.878 | 36.225 |
| 复合有机氮源1.4 | 0.81 | 16.035 | 36.258 |
| 复合有机氮源1.5 | 1.024 | 18.016 | 44.332 |
1.2、用于大肠杆菌TG2发酵的复合有机氮源2.1-2.5的制备
按表1.2.1所示的比例，使用酵母膏，胰蛋白胨、牛肉胨，分别制备复合有机氮源2.1-2.5。
表1.2.1、复合有机氮源2.1-2.5配方
| 酵母膏 | 胰蛋白胨 | 牛肉胨 | |
| 复合有机氮源2.1 | 31％ | 26％ | 43％ |
| 复合有机氮源2.2 | 39％ | 30％ | 31％ |
| 复合有机氮源2.3 | 35％ | 45％ | 20％ |
| 复合有机氮源2.4 | 40％ | 34％ | 26％ |
| 复合有机氮源2.5 | 30％ | 38％ | 32％ |
发明人研究发现，对于大肠杆菌TG2而言，胸腺嘧啶和甲硫氨酸的含量在高密度发酵中起关键性作用，因此，测定了复合有机氮源2.1-2.5中的胸腺嘧啶和甲硫氨酸含量，结果如表1.2.2所示。
表1.2.2、复合有机氮源2.1-2.5中胸腺嘧啶和甲硫氨酸含量
| 胸腺嘧啶(mg/g) | 甲硫氨酸(mg/g) | |
| 复合有机氮源2.1 | 0.267 | 19.84 |
| 复合有机氮源2.2 | 0.335 | 21.354 |
| 复合有机氮源2.3 | 0.331 | 21.285 |
| 复合有机氮源2.4 | 0.342 | 20.939 |
| 复合有机氮源2.5 | 0.417 | 23.36 |
1.3、用于大肠杆菌YK512发酵的复合有机氮源3.1-3.5的制备
按表1.3.1所示的比例，分别使用酵母粉、酵母膏、鲜鱼胨、牛肉胨制备复合有机氮源3.1-3.5。
表1.3.1、复合有机氮源3.1-3.5配方
| 酵母粉 | 酵母膏 | 鲜鱼胨 | 牛肉胨 | |
| 复合有机氮源3.1 | 35％ | 20％ | 25％ | 20％ |
| 复合有机氮源3.2 | 34％ | 12％ | 36％ | 18％ |
| 复合有机氮源3.3 | 36％ | 29％ | 15％ | 20％ |
| 复合有机氮源3.4 | 20％ | 23％ | 27％ | 30％ |
| 复合有机氮源3.5 | 32％ | 21％ | 21％ | 26％ |
发明人研究发现，对于大肠杆菌YK512而言，腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸的含量在高密度发酵中起关键性作用，因此，测定了复合有机氮源3.1-3.5中的腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸含量，结果如表1.3.2所示。
表1.3.2、复合有机氮源3.1-3.5中腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸含量
| 腺嘌呤(mg/g) | 胞嘧啶(mg/g) | 甘氨酸(mg/g) | |
| 复合有机氮源3.1 | 0.41 | 0.45 | 20.11 |
| 复合有机氮源3.2 | 0.51 | 0.614 | 25.36 |
| 复合有机氮源3.3 | 0.498 | 0.623 | 25.236 |
| 复合有机氮源3.4 | 0.513 | 0.609 | 25.325 |
| 复合有机氮源3.5 | 0.64 | 0.79 | 30.42 |
1.4、用于产核酸疫苗的大肠杆菌(DH5α)发酵的复合有机氮源4.1-4.5的制备
按表1.4.1所示的比例，分别使用胰蛋白胨、胰酪胨、酵母粉、酵母膏，制备复合有机氮源4.1-4.5。
表1.4.1、复合有机氮源4.1-4.5配方
| 酵母粉 | 酵母膏 | 胰蛋白胨 | 胰酪胨 | |
| 复合有机氮源4.1 | 30％ | 17％ | 23％ | 30％ |
| 复合有机氮源4.2 | 20％ | 23％ | 25％ | 32％ |
| 复合有机氮源4.3 | 34％ | 22％ | 20％ | 24％ |
| 复合有机氮源4.4 | 27％ | 29％ | 23％ | 21％ |
| 复合有机氮源4.5 | 22％ | 36％ | 18％ | 24％ |
发明人研究发现，对于大肠杆菌YK512而言，胸腺嘧啶和酪氨酸的含量在高密度发酵中起关键性作用，因此，测定了复合有机氮源4.1-4.5中的胸腺嘧啶和酪氨酸含量，结果如表1.4.2所示。
表1.4.2、复合有机氮源4.1-4.5中胸腺嘧啶和酪氨酸含量
| 胸腺嘧啶(mg/g) | 酪氨酸(mg/g) | |
| 复合有机氮源4.1 | 0.526 | 7.22 |
| 复合有机氮源4.2 | 0.725 | 8.236 |
| 复合有机氮源4.3 | 0.718 | 8.458 |
| 复合有机氮源4.4 | 0.727 | 8.856 |
| 复合有机氮源4.5 | 0.917 | 10.14 |
实施例2、复合有机氮源1-4用于菌种发酵
2.1、复合有机氮源1.1-1.5用于产嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌(BL21)的发酵
2.1.1、培养基制备
种子培养基：LB培养基。
对照发酵培养基：15.6g KH2PO4，28.3g K2HPO4·3H2O，37.6g甘油，20g蛋白胨，10g酵母粉，15g NH4Cl，3g MgSO4·7H2O，定容至2L。
对照补料培养基：15g蛋白胨，5g酵母粉，100g甘油，定容至400ml。
复配发酵培养基1.1-1.5：15.6g KH2PO4，28.3g K2HPO4·3H2O，37.6g甘油，28g复合有机氮源1.1、1.2、1.3、1.4或1.5，15g NH4Cl，3g MgSO4·7H2O，定容至2L。
复配补料培养基1.1-1.5：30g复合有机氮源1.1、1.2、1.3、1.4或1.5，100g甘油，定容至400ml。
以上培养基中各加入卡那霉素，最终浓度为50μg/ml。
经测定，上述复配发酵培养基中的鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸含量分别如表2.1.1所示。
表2.1.1、复配发酵培养基中鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸含量
| 鸟嘌呤(mg/L) | 胱氨酸(mg/L) | 缬氨酸(mg/L) | |
| 复配发酵培养基1.1 | 15.5 | 300.8 | 851.7 |
| 复配发酵培养基1.2 | 20.75 | 381.675 | 926.475 |
| 复配发酵培养基1.3 | 19.75 | 371.95 | 905.625 |
| 复配发酵培养基1.4 | 20.25 | 400.875 | 906.45 |
| 复配发酵培养基1.5 | 25.6 | 450.4 | 1108.3 |
2.1.2、发酵培养及检测
取大肠杆菌(BL21)加入种子培养基中，于200rpm，37℃培养12h，制得种子液。
各取50ml种子液，分别加入含2L对照发酵培养基或复配发酵培养基的5L发酵罐中，37℃培养，搅拌转速不断调整，以控制溶氧在30％左右；从发酵培养4小时后开始连续补料，控制每h补20％的补料液，补料2h后，加入诱导剂IPTG至最终浓度为0.1mmol/l，再培养3h，分别获得对照发酵液和复配发酵液。
分别测定获得的对照发酵液和复配发酵液的BL21的吸光度(600nm)，酶蛋白表达含量，以及测定PNP酶活，结果如表2.1.2所示。
表2.1.2、对照和复配发酵液检测结果
| 复配1.1 | 复配1.2 | 复配1.3 | 复配1.4 | 复配1.5 | 对照 | |
| 酶活(U/mg) | 1.8 | 2.2 | 2.4 | 2.5 | 1.76 | 1.6 |
| 酶蛋白表达含量(％) | 28.40 | 38.35 | 36.50 | 40.00 | 28.70 | 30.00 |
| OD600 | 51.70 | 63.8 | 64.5 | 70.6 | 46.80 | 50 |
根据表2.1.2结果，在鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸的含量分别控制在19.75-20.75mg/l、371.95-400.875mg/l和905.625-926.475mg/l的复配发酵培养基2-4中培养获得的BL21培养液，其OD600，酶活和酶蛋白含量与对照相比分别提高了27.6-41.2％、37.5-56.25％、21.67-33.3％，而在鸟嘌呤、胱氨酸和缬氨酸的含量为15.5mg/l、300.8mg/l、851.7mg/l和25.6mg/l、450.4mg/l、1108.3mg/l的复配发酵培养基培养获得的BL21培养液与对照相比，各指标没有任何提高，甚至比对照更低。
同时，经计算，对照发酵培养基的成本约为18.1元/L，而复配发酵培养基1.2-1.4的成本分别约为13.2元、12.8元、10.0元，降低了约37％-45％。
2.2、复合有机氮源2.1-2.5用于产α-乙酰乳酸脱羧酶大肠杆菌(TG2)的高密度发酵
2.2.1、培养基制备
一级、二级种子培养基均为LB培养基。
三级种子培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 5g/l，麦芽糖5g/l。
对照发酵培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NH4Cl 2g/l，K2HPO4 8g/l，KH2PO4 4g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，CaCl2·2H2O 0.07g/l，麦芽糖10g/l和微量元素，其中，微量元素在培养基中浓度为：
Al2(8O4)3·7H2O 0.04g/l，H3PO4 0.004g/l，NiCl2·6H2O 0.004g/l，ZnSO4·7H2O 0.02g/l，CoCl2·2H2O 0.032g/l，MnCl2·H2O 0.08g/l，NaMoO4 0.02g/l。
对照补料培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，麦芽糖50g/l。
复配发酵培养基：复合有机氮源2.1、2.2、2.3、2.4或2.5 15g/l，NH4Cl 2g/l，K2HPO48g/l，KH2PO4 4g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，CaCl2·2H2O 0.07g/l，麦芽糖10g/l和微量元素溶液。
微量元素在培养基中浓度：与对照培养基中微量元素浓度相同。
复配补料培养基：复合有机氮源2.1、2.2、2.3、2.4或2.515g/l，麦芽糖50g/l。
以上培养基中各加入终浓度为100μg/ml的氨卞青霉素。
经测定，上述对照培养基和复配培养基中的胸腺嘧啶和甲硫氨酸含量分别如表2.2.1所示。
表2.2.1、各复配发酵培养基中胸腺嘧啶和甲硫氨酸含量
| 胸腺嘧啶(mg/L) | 甲硫氨酸(mg/L) | |
| 复配发酵培养基2.1 | 8.0 | 595.4 |
| 复配发酵培养基2.2 | 10.05 | 640.62 |
| 复配发酵培养基2.3 | 9.93 | 638.55 |
| 复配发酵培养基2.4 | 10.26 | 628.17 |
| 复配发酵培养基2.5 | 12.5 | 700.8 |
2.2.2、发酵培养及检测
取经一级和二级培养后获得的大肠杆菌TG2二级种子液，按1％接种量加入20L三级种子培养基中，于35℃，180rpm培养6h(通气量为2m3/h)，制得三级种子液。
取三级种子液，接入含2000L起始培养基的发酵罐中，于37℃，110rpm，培养2小时(通气量为160m3/h)后开始，培养0.5h后，补加发酵液体积的0.5％的补料，并以NH3·H2O调节发酵液，使其pH保持在7.0左右，37℃培养6h后，加入3.0mol半乳糖进行诱导，然后每隔0.5h补加7.5％的补料，并以0.2mol/l的H2SO4调节pH，以保持在6.0左右，诱导培养5h后结束，分别获得对照发酵液和复配发酵液。
分别测定获得的对照发酵液和复配发酵液OD600和α-乙酰乳酸脱羧酶酶活，结果如表2.2.2所示。
表2.2.2、对照和复配发酵液检测结果
| 复配2.1 | 复配2.2 | 复配2.3 | 复配2.4 | 复配2.5 | 对照 | |
| OD600 | 34.3 | 48.6 | 45.8 | 51.2 | 29.3 | 30.5 |
| 酶活(U/ml) | 786.00 | 980.00 | 945.00 | 963.00 | 825.00 | 800.00 |
根据表2.2.2的结果，使用胸腺嘧啶和甲硫氨酸的含量分别控制在9.93-10.26mg/l、628.17-640.62mg/l的复配发酵培养基2.2-2.4培养获得培养液，其OD600，酶活与对照相比分别提高了50.16-67.8％、18.1-22.5％，而胸腺嘧啶和甲硫氨酸含量为8mg/l、595.4mg/l和12.5mg/l、700.8mg/l的复配发酵培养基培养获得的培养液与对照相比，各指标提高较少甚至比对照更低。
同时，经计算，对照发酵培养基的成本约为20.7元/L，而复配发酵培养基2.2-2.4的成本分别约为18.7元、19.2元、20.6元/L，略低于对照。
2.3、复合有机氮源3.1-3.5用于大肠杆菌(YK512)的高密度发酵
2.3.1、培养基制备
一级种子培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 5g/l。
二级种子培养基：蛋白胨16g/l，酵母粉10g/l，NaCl 5g/l。
对照发酵培养基：蛋白胨15g/l，酵母粉6g/l，K2HPO4 8g/l，NaH2PO4·12H2O 16g/l，(NH4)2SO4 1.2g/l，NH4Cl 2g/l和微量元素，其中，微量元素在培养基中浓度为：
MgSO4·7H2O 0.001g/l，CoCl2·6H2O 0.004g/l，NaMoO4 0.002g/l，ZnCl2 0.002g/l，CuSO4·5H2O 0.001g/l，FeSO4·7H2O 0.02g/l，H3BO4 0.0005g/l，CaCl2·2H2O 0.04g/l，MgSO4·7H2O 0.3g/l。
对照补料培养基：甘油170g/l，酵母粉71g/l，MgSO4.7H2O 5.7g/l，pH7.0。
复配发酵培养基：复合有机氮源3.1、3.2、3.3、3.4或3.5 12g/l，K2HPO4 8g/l，NaH2PO4·12H2O 16g/l，(NH4)2SO4 1.2g/l，NH4Cl 2g/l和微量元素，其浓度与对照培养基相同。
复配补料培养基：甘油170g/l，复合有机氮源3.1、3.2、3.3、3.4或3.5 28g/l，MgSO4·7H2O5.7g/l，pH7.0。
以上培养基中均加入氨卞青霉素至其终浓度为100μg/ml。
经测定，上述复配发酵培养基中的腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸含量分别如表2.3.1所示。
表2.3.1、各复配发酵培养基中腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸含量
| 腺嘌呤(mg/L) | 胞嘧啶(mg/L) | 甘氨酸(mg/L) | |
| 复配发酵培养基3.1 | 16.4 | 18.3 | 804.6 |
| 复配发酵培养基3.2 | 20.4 | 23.56 | 1014.4 |
| 复配发酵培养基3.3 | 19.928 | 24.92 | 1009.44 |
| 复配发酵培养基3.4 | 20.52 | 25.36 | 1013 |
| 复配发酵培养基3.5 | 25.6 | 31.7 | 1216.8 |
2.3.2、发酵培养及检测
取经一级和二级培养后获得的大肠杆菌YK512的二级种子液，按4％接种量接入50ml二级种子培养基中，于30℃，220rpm培养6h，以用于后续发酵。
向5L全自动发酵罐(购自上海国强生化装备有限公司)中分别加入2L对照发酵培养基和复配发酵培养基，以2.5％接种量接种种子液进行发酵培养，发酵温度为30℃，培养11h，然后于42℃诱导培养4-5h，自动流加氨水，pH控制在7.0，通气量为7.0L/min，最低搅拌转速为200rpm，当溶氧在40％以下时，每30s提高10rpm，若溶氧在60％以上时，则自动降10rpm，当达到最大转速为900rpm，则通入纯氧，溶氧控制在30％左右。流加补料分三个阶段进行，其中，前4h不补料，4-10h补进含50g甘油的料，10-15h补入含70g甘油的料。发酵结束后分别获得对照发酵液和复配发酵液。
分别测定获得对照发酵液和复配发酵液的OD600、IL-3占总蛋白含量和IL-3浓度，结果如表2.3.2所示。
表2.3.2、对照和复配发酵液检测结果
| 复配3.1 | 复配3.2 | 复配3.3 | 复配3.4 | 复配3.5 | 对照 | |
| OD600 | 21.3 | 31.2 | 29.4 | 26.3 | 22.8 | 24.5 |
| IL-3占总蛋白含量(％) | 21.00 | 26.40 | 27.40 | 28.00 | 22.00 | 20.00 |
| IL-3浓度(g/l) | 0.80 | 0.936 | 0.987 | 0.924 | 0.81 | 0.813 |
根据表2.3.2结果，使用腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸的含量分别控制在19.928-20.52mg/l、23.56-25.36mg/l、1009.44-1014.4mg/l的复配发酵培养基2-4培养获得的培养液，其OD600，IL-3占总蛋白含量和IL-3浓度与对照相比分别提高了7-27.3％、32-40％、13.5-21.4％，而腺嘌呤、胞嘧啶和甘氨酸含量为16.4mg/l、18.3mg/l、804.6mg/l和25.6mg/l、31.7mg/l、1216.8mg/l的复配发酵培养基培养获得的培养液与对照相比，各指标没有任何提高，甚至比对照更低。
同时，经计算，对照发酵培养基的成本约为23.56元/L，而复配发酵培养基2-4的成本分别约为8.90元、11.78元、11.30元，降低了约50％-62％。
2.4、复合有机氮源4.1-4.5用于产核酸疫苗的大肠杆菌(DH5α)的发酵
2.4.1、培养基制备
种子培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 5g/l。
对照发酵培养基：蛋白胨20g/l，NaCl 5g/l，酵母粉12g/l，葡萄糖10g/l，K2HPO4 8g/l，KH2PO4 3.5g/l。
复配发酵培养基：复合有机氮源4.1、4.2、4.3、4.4或4.5 26g/l，NaCl 5g/l，K2HPO4 8g/l，KH2PO4 3.5g/l。
经测定，上述对照培养基和复配培养基中的胸腺嘧啶和酪氨酸含量分别如表2.4.1所示。
表2.4.1、各培养基中胸腺嘧啶和酪氨酸含量
| 胸腺嘧啶(mg/L) | 酪氨酸(mg/L) | |
| 复配发酵培养基4.1 | 8.43 | 115.67 |
| 复配发酵培养基4.2 | 11.6 | 131.776 |
| 复配发酵培养基4.3 | 11.488 | 135.328 |
| 复配发酵培养基4.4 | 11.632 | 141.696 |
| 复配发酵培养基4.5 | 14.67 | 162.3 |
2.4.2、发酵培养及检测
将DH5α菌种接入5ml种子培养基中，在37℃，220rpm培养12h，获得种子液。
以1％的接种量将种子液接入30ml培养基中，于37℃，220rpm培养8h后，于42℃诱导培养4h，分别获得对照发酵液和复配发酵液。
分别检测对照发酵液和复配发酵液的OD600，并分析各发酵液内质粒的浓度，结果如表2.4.2所示。
表2.4.2、对照和复配发酵液检测结果
| 复配4.1 | 复配4.2 | 复配4.3 | 复配4.4 | 复配4.5 | 对照 | |
| OD600 | 3.9 | 4.5 | 4.6 | 4.8 | 3.98 | 4.3 |
| 质粒浓度(mg/L) | 56.00 | 78.00 | 82.00 | 75.00 | 59.00 | 60.00 |
根据表2.4.2结果，使用胸腺嘧啶和酪氨酸的含量分别控制在11.488-11.632mg/l、131.776-141.696mg/l的复配发酵培养基4.2-4.4培养获得的培养液，其OD600与对照相差不大，但其质粒浓度(mg/l)与对照相比提高了25-36.7％，而胸腺嘧啶和酪氨酸含量为8.43mg/l、115.67mg/l和14.67mg/l、162.3mg/l的复配发酵培养基培养获得的培养液与对照相比，各指标没有任何提高，甚至比对照更低。
同时，经计算，对照发酵培养基的成本约为8.90元/L，而复配发酵培养基4.2-4.4的成本分别约为4.2元、6.23元、5.40元/L，降低了约50％-62％。
综上所述，使用本发明提供的复合有机氮源配制获得复配发酵培养基同现在通常使用的发酵培养基相比，由于控制了培养基中嘌呤、嘧啶和氨基酸的含量，有效的保证了发酵水平，同时能够明显的降低成本，对于大规模工业化生产十分有益。
Claims (8)
1、一种用于高密度培养大肠杆菌的复合有机氮源，其特征在于，所述复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成，并控制所述复合有机氮源中对大肠杆菌的高密度培养起关键性作用的嘌呤、嘧啶和/或氨基酸的含量。
2、如权利要求1所述的有机氮源，其特征在于，所述天然氮源选自：胰蛋白胨、胰酪胨、牛肉胨、大豆胨、鲜鱼胨、酵母粉、酵母膏。
3、如权利要求1所述的复合有机氮源，其特征在于，所述复配是基于所针对的大肠杆菌以及天然氮源中嘌呤及嘧啶的含量。
4、如权利要求3所述的复合有机氮源，其特征在于，所述微生物包括：所有用于生产的大肠杆菌。
5、如权利要求4所述的复合有机氮源，其特征在于，对于所有用于生产的大肠杆菌，所述复配是基于天然氮源中以下嘌呤、嘧啶的含量：
嘌呤：腺嘌呤、鸟嘌呤；
嘧啶：胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶。
6、如权利要求5所述的复合有机氮源，其特征在于，所述复合有机氮源中的嘌呤、嘧啶含量范围如下：
腺嘌呤：1-200mg/L；鸟嘌呤：1-200mg/L；
胞嘧啶：1-200mg/L；胸腺嘧啶：1-200mg/L；尿嘧啶：1-200mg/L。
7、如权利要求4所述的复合有机氮源，其特征在于，对于所有用于生产的大肠杆菌，所述复配是基于天然氮源中氨基酸的含量：
氨基酸：缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸。
8、如权利要求7所述的复合有机氮源，其特征在于，所述复合有机氮源中氨基酸的含量范围如下：
缬氨酸：10-5000mg/L；苏氨酸：10-5000mg/L；甲硫氨酸：10-5000mg/L；
精氨酸：10-5000mg/L；天冬氨酸：10-5000mg/L；甘氨酸：10-5000mg/L；
酪氨酸：10-5000mg/L；苯丙氨酸：10-5000mg/L；亮氨酸：10-5000mg/L；
异亮氨酸：10-5000mg/L；丙氨酸：10-5000mg/L；丝氨酸：10-5000mg/L；
组氨酸：10-5000mg/L；半胱氨酸：10-5000mg/L；酪氨酸：10-5000mg/L。
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|---|---|---|---|---|
| CN111254103A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-06-09 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基及发酵工艺 |
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|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20091125 |