CN102399706B - 一种小链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027及其在生产达托霉素中的应用。该菌株性状稳定，能满足工业化规模生产菌种的产量稳定性要求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种小链霉菌CGMCC No.4027，以及该菌株在生产达托霉素中的应用。
背景技术
二十世纪80年代初美国礼莱公司的科学家从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)提取出一组具有强烈抑制革兰阳性菌的活性物质A21978C。这组脂肽类物质具有共同的环肽母核和由一个N-酰基连接的不同的脂肪酸侧链组成。其中，具有癸酸侧链的化合物LY146032具有显著的抗MRSA活性，从而被开发成为新型的抗菌药物达托霉素(Daptomycin)。达托霉素具有在体外抗绝大多数的临床革兰阳性菌的作用。主要用于治疗耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)引发的感染。目前，对于这些耐药菌感染可选择的抗生素很少，因此达托霉素具有良好的市场前景和研究价值。目前达托霉素主要是通过玫瑰孢链霉菌发酵提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于生产达托霉素的新型菌株。
本发明的小链霉菌(Streptomyces parvus)，于2010年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏，保藏号为：CGMCC No.4027。用于制备达托霉素。
采用本发明的小链霉菌CGMCC No.4027在发酵培养基中发酵制备达托霉素，所述发酵培养基的碳源选自：糊精、可溶性淀粉、柠檬酸盐、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、糖原、水杨苷、苦杏仁苷、丙酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、苹果酸钠，含量为1.0～8.0％；
氮源选自：酵母粉、黄豆饼粉、花生饼粉，含量为0.5～5.0％；
发酵温度为20～40℃，搅拌转速100～450r/min，发酵pH6～7.5，空气流量0.5～1.5vvm，发酵时间为6～7天，且在发酵20～30h后，补加癸酸/油酸甲酯混合料液，补料速率为0.25～0.35ml/h·L。
根据本发明，优选的发酵培养基含有可溶性淀粉4.0～6.0％，葡萄糖1.0～.2.0％，黄豆饼粉3.0～4.5％，硫酸亚铁铵0.01～0.03％。
根据本发明，另一优选的发酵培养基含有糊精1.0～3.0％，葡萄糖1.0～5.0％，黄豆饼粉0.2～1.0％，花生饼粉2.0～4.0％，硫酸亚铁铵0.01～0.03％。
根据本发明，优选的发酵温度为29～30℃，发酵pH为6.5。
本发明提供的达托霉素产生菌株小链霉菌(Streptomyce sparvus)的原始培养株系分离自采集到的自然环境土壤样品，经反复自然选育以及培养基和培养条件优化，每公升发酵液达托霉素产量可达1000mg左右，且菌株性状稳定，能满足工业化规模生产菌种的产量稳定性要求，具有产业化应用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明公开的达托霉素产生菌株的原始培养株系分离自采集到的自然环境土壤样品，经反复自然选育，经鉴定该菌株为小链霉菌(Streptomyces parvus)，于2010年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏，保藏号为：CGMCC No.4027。采用国际链霉菌计划(ISP)和《链霉菌鉴定手册》推荐的培养基，将CGMCC No.4027菌种在接种后于28℃培养5-7天，其培养形态特征如表1所示。显微观察显示其孢子丝直、柔曲，孢子呈椭圆形和柱形。
表1本发明的小链霉菌的形态特征
| 培养基 | 气生菌丝 | 基内菌丝 | 可溶性色素 |
| 察氏培养基 | 白色 | 浅乳黄色 | 无 |
| 葡萄糖天冬素培养基 | 蛎肉色 | 乳黄色 | 无 |
| 甘油天冬素培养基 | 略带紫的灰色 | 略带紫的棕色 | 无 |
| 无机盐淀粉培养基 | 乳白色 | 乳黄色 | 无 |
| ISP-2培养基 | 白色 | 栗棕色 | 无 |
| 燕麦粉培养基 | 略粉的白色 | 褐黄色 | 无 |
| 高氏1号培养基 | 白色 | 乳黄色 | 无 |
| 桑塔氏培养基 | 略粉的白色 | 略棕的紫色 | 无 |
本发明的菌株CGMCC No.4027明胶液化反应、淀粉酶反应、酪氨酸酶反应呈阳性，可胨化和凝固牛奶。
采用国际链霉菌计划推荐的方法，碳源利用实验以ISP9为基础培养基，28℃培养7-30天。得到该菌株的碳源利用特征如下：可利用的碳源有：半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、淀粉、糖原、甘露醇、水杨苷、甘油、苦杏仁苷、柠檬酸钠、丙酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、苹果酸钠。对棉籽糖、松三糖、蔗糖、菊糖、山梨糖、卫矛醇、内消旋赤藓糖、丙二酸钠、马尿酸钠、酒石酸钠不能利用。
实施例1
菌种斜面培养物挖块接种到装有种子培养基的三角摇瓶，种子培养基的成分见表2，于29℃、220r/min转速摇床上培养48小时。种子培养液以5％(v/v)转种量接种到装有4.5L发酵培养基的玻璃发酵罐中，发酵培养基配方见表3。发酵罐设定条件：温度30℃、搅拌转速400r/min，空气流量1vvm，用氨水在线控制pH 6.5。培养26小时起开始补加由癸酸∶油酸甲酯＝1∶1(v/v)组成的料液，补料速率为0.3ml/h·L，培养168小时结束发酵。HPLC分析达托霉素量为970mg/L。
表2种子培养基成分
| 种子培养基组成 | 含量％(质量体积比) |
| 糊精 | 2.0 |
| 葡萄糖 | 2.0 |
| 黄豆饼粉 | 0.5 |
| 酵母浸出粉 | 2.0 |
| KH2PO4 | 0.02 |
| MgSO4.7H2O | 0.02 |
| NaCl | 0.5 |
| pH | 6.5 |
表3发酵培养基配方
| 发酵培养基组成 | 含量％(质量体积比) |
| 可溶性淀粉 | 5.0 |
| 葡萄糖 | 2.0 |
| 黄豆饼粉 | 4.0 |
| 硫酸亚铁铵 | 0.02 |
| pH | 7.5 |
表4发酵培养基配方
| 发酵培养基组成 | 含量％(质量体积比) |
| 糊精 | 2.0 |
| 葡萄糖 | 4.5 |
| 黄豆饼粉 | 0.5 |
| 花生饼粉 | 3.0 |
| 硫酸亚铁铵 | 0.02 |
| pH | 7.5 |
实施例2
同实施例1方式培养种子，并将种子液转种至装有4.5L发酵培养基的玻璃发酵罐中，发酵培养基配方见表4。发酵罐的设定培养条件：培养温度30℃、搅拌转速300r/min，空气流量1vvm，用氨水在线控制pH 6.5，培养20小时起开始补加由癸酸∶油酸甲酯＝1∶1(v/v)组成的料液，补料速率为0.3ml/h·L，培养150小时左右结束发酵。HPLC分析达托霉素量为940mg/L
实施例3
同实施例1方式培养摇瓶种子，并转种至装有15L相同种子培养基的种子罐中，种子罐设定培养条件：温度29℃、搅拌转速200r/min，空气流量1vvm，培养40小时后以10％的转种量接种装有50L发酵培养基的发酵罐(培养基配方同表4)。培养条件：培养温度29℃、搅拌转速150r/min，空气流量1vvm，用氨水在线控制pH 6.5，培养20小时起开始补加由癸酸∶油酸甲酯＝1∶1(v/v)组成的料液，补料速率为0.3ml/h·L，培养168小时结束发酵。HPLC分析达托霉素量为1045mg/L。
实施例4
发酵液达托霉素含量测定：HPLC法。
取1ml发酵液与2ml甲醇混匀，12000r/min离心5min，收集上清液用于进样。
分析系统：Agilentl100型液相色谱仪，自动进样器，VWD检测器；
色谱柱：十八烷基硅烷键和反相柱
检测波长：210nm
流动相：含有0.5％磷酸二氢铵的乙腈+水混合液。采用梯度洗脱，洗脱方式如表5所示。
流速：1.5ml/min
柱温：35℃
进样量：20μl
表5梯度洗脱方式
| 0min | 15min | 17min | |
| 乙腈∶水＝10∶90 | 25％ | 0％ | 0％ |
| 乙腈∶水＝45∶55 | 75％ | 100％ | 100％ |
实施例5菌株稳定性考察
用群体传代(斜面传斜面)的方法考察CGMCC No.4027的遗传稳定性，将此菌株在高氏1号斜面上连续传五代，每一代斜面均进行发酵产量检测，发酵培养过程参见实施例1，结果见表6。
表6菌株CGMCC No.4027的传代稳定性
从表6的结果可以看出，菌株CGMCC No.4027经过连续五代斜面传接后，其产生达托霉素产物的量波动很小，说明菌种基本没有出现退化现象，能满足工业化规模生产菌种的产量稳定性要求。
Claims (6)
1.一种小链霉菌(Streptomycesparvus)，保藏号为：CGMCC No.4027。
2.如权利要求1所述的小链霉菌在制备达托霉素中的应用。
3.一种采用权利要求１所述的小链霉菌CGMCC No.4027制备达托霉素的方法，其特征在于，所述小链霉菌CGMCC No.4027在发酵培养基中发酵制备所述达托霉素，其中，所述发酵培养基的碳源选自：糊精、可溶性淀粉、柠檬酸盐、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、水杨苷、苦杏仁苷、丙酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、苹果酸钠，含量为1.0～8.0％；
氮源选自：酵母粉、黄豆饼粉、花生饼粉，含量为0.5～5.0％；
发酵温度为20～40℃，搅拌转速100～450r/min，发酵pH6～7.5，空气流量0.5～1.5vvm，发酵时间为6～7天，且在发酵20～30h后，补加癸酸/油酸甲酯混合料液，补料速率为0.25～0.35ml/h·L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有可溶性淀粉4.0～6.0％，葡萄糖1.0～.2.0％，黄豆饼粉3.0～4.5％，硫酸亚铁铵0.01～0.03％。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有糊精1.0～3.0％，葡萄糖1.0～5.0％，黄豆饼粉0.2～1.0％，花生饼粉2.0～4.0％，硫酸亚铁铵0.01～0.03％。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为29～30℃，发酵pH为6.5。
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