CN101578294A - 丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents
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Abstract
公开了具有通式(I)的大环肽，其中描述了R3、R'3、R4、R6、R'、X、Q和W。还公开了包含该化合物的组合物和使用该化合物抑制HCV的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2006年11月1日提交的美国临时申请系列号60/863,857的权益。
发明领域
本公开大体上涉及抗病毒化合物，更具体涉及抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(本文中也称作“丝氨酸蛋白酶”)机能的化合物，包含这类化合物的组合物和抑制NS3蛋白酶机能的方法。
发明背景
HCV是主要的人类病原体，其在世界范围内感染估计一亿七千万人——1型人免疫缺陷病毒感染人数的大致5倍。这些HCV感染个体中的相当一部分发展成严重的进行性肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。
目前，最有效的HCV疗法采用α-干扰素和利巴韦林的组合，在40％患者中产生持久效力。最近的临床结果表明，作为单一疗法，聚乙二醇化的(pegylated)α-干扰素优于未改性的α-干扰素。但是，即使使用包括聚乙二醇化α-干扰素和利巴韦林的组合的实验治疗方案，相当一部分患者的病毒载量也没有持续降低。因此，开发用于治疗HCV感染的有效疗法是明显的长期需求。
HCV是正链RNA病毒。基于推导的氨基酸序列的比较和5’未转译区中的广泛相似性，HCV已经被归为黄病毒科中的单独一类。黄病毒科的所有成员都包裹着含有通过单一的未中断开放阅读框的转译来编码所有已知病毒特异性蛋白质的正链RNA基因组的病毒粒子。
在整个HCV基因组中，在核苷酸与编码的氨基酸序列内发现显著的多样性。已经表征了至少六种主要基因型，并且已经描述了多于50种亚型。HCV的主要基因型的全球分布不同，且HCV的基因多样性的临床重要性仍难以捉摸，尽管在基因型对发病机理和治疗的可能影响方面作出了许多研究。
单链HCV RNA基因组为大约9500个核苷酸长度并具有为大约3000个氨基酸的单个大聚合蛋白质编码的单一开放阅读框(ORF)。在感染的细胞中，这种聚合蛋白质在多个位置被细胞和病毒蛋白酶分裂而产生结构性和非结构性(NS)蛋白。在HCV的情况下，通过两种病毒蛋白酶实现成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的生成。第一种被认为在NS2-NS3接点处分裂；第二种是包含在NS3的N-末端区域中的丝氨酸蛋白酶并介导NS3下游的所有后继分裂，既包括顺式(在NS3-NS4A分裂位点)也包括反式(对于其余NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点而言)。NS4A蛋白质看似发挥多重功能——充当NS3蛋白酶的辅因子，并可能有助于NS3和其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A的复合物形成看起来是加工事件所必须的，从而提高所有位点处的蛋白水解效率。该NS3蛋白也表现出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是参与HCV复制的RNA依赖型RNA聚合酶。
发明概述
本公开提供了下式的大环化合物：
其中：
(a)R4是氢；C1-6烷基；C3-7环烷基；烷氧基；-C(O)-R5；C(O)-N(R5)2；C(O)-OR5；C7-14烷芳基；或C3-7环烷基，其中烷基和环烷基任选被卤素取代；且其中各R5独立地选自C1-9烷基，其中烷基任选被C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、羟基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基或(C1-6)羧基酯取代；
(b)R6是氢、C1-6烷基或C3-7环烷基；
(c)R3和R’3各自独立地为氢或甲基；
(d)Q是C3-9饱和或不饱和链，任选包含1-3个独立地选自O和S(O)m的杂原子；其中m是0、1或2；
(e)W是-NH-SO2-R2；其中R2是C6-10芳基、杂环基或-NRbRc；其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-7烷基)、C1-7环烷基、C1-7环烷基(C1-7烷基)、卤代C1-7烷基、杂环基和杂环基(C1-7烷基)；
(f)X是O、S、SO、SO2、OCH2、CH2O或NH；
(g)R′是Het、C6-10芳基或C7-14烷芳基，各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代；或C3-9环烷基或C1-7烷基，其中环烷基和烷基任选被卤素、氰基、烷氧基和二烷基氨基中相同或不同的1至5个成员取代；
条件是-XR’不同于：
(h)Ra是C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、单-或二-卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、烷酰基、NO2、SH、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基磺酰胺、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基或5-7元单环杂环。
本公开也提供了包含该化合物或其可药用盐和可药用载体的组合物。特别地，本公开提供了可用于抑制HCV NS3蛋白酶的药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的化合物，或其可药用盐和可药用载体。
本公开进一步提供了治疗HCV感染患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的本公开的化合物或其可药用盐。另外，本公开提供了通过使NS3蛋白酶与本公开的化合物接触来抑制HCV NS3蛋白酶的方法。
利用本公开，现在可以提供可有效治疗HCV感染患者的包含本公开的化合物的药物。具体而言，本公开提供了可抑制NS3蛋白酶机能(例如与NS4A蛋白酶结合)的肽化合物。此外，本公开能够对患者施以联合疗法，由此有效抑制HCV NS3蛋白酶的根据本公开的化合物可以与另一具有抗-HCV活性的化合物，例如有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCVNS4B蛋白质、HCV进入(entry)、HCV装配体(assembly)、HCV出去(egress)、HCV NS5A蛋白质、IMPDH和核苷类似物的靶的功能的化合物一起施用以治疗HCV感染。
详述
本文所用的立体化学定义和惯例总的说来遵照McGraw-HillDictionary of Chemical Terms，S.P.Parker，Ed.，McGraw-Hill BookCompany，New York(1984)和Stereochemistry of Organic Compounds，Eliel，E.和Wilen，S.，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1994)。许多有机化合物以旋光活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述旋光活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示该分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和1或(+)和(-)用于指示该化合物造成的平面偏振光的旋转信号，(-)或1意味着该化合物是左旋的，(+)或d意味着该化合物是右旋的。对于给定的化学结构，被称作立体异构体的这些化合物是相同的，只不过它们是彼此的镜像。镜像对的具体立体异构体也可以被称作对映体，且这类异构体的混合物通常被称作对映体混合物。对于使用(R)或(S)的情况，其是针对整个化合物而非针对单独的取代基指定取代基的绝对构型。
除非本文中明确地另行指明，下述术语具有下列定义。
术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指无旋光活性的两种对映体类型的等摩尔混合物。
术语“手性”是指具有镜像应对物(partner)的不重叠性的分子，而术语“非手性”是指可重叠在其镜像应对物上的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但在原子或基团的空间布置方面不同的化合物。
术语“非对映体”是指不是对映体的立体异构体，例如具有两个或更多手性中心且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映体具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映体的混合物可以在高分辨率分析程序，如电泳和色谱法下分离。
术语“对映体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此的不可重叠镜像。
术语“可药用盐”旨在包括由含有碱性或酸性部分的化合物通过传统化学法合成的无毒盐。通常，这类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的名单可见于Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990，第1445页。本公开的化合物可以以游离碱或酸形式或以其可药用盐形式使用。所有形式都在本公开的范围内。
术语“治疗有效量”是指足以表现出有意义的患者获益(例如病毒载量的持续降低)的各活性组分总量。当用于单独给药的单个活性成分时，该术语是指单独的该成分。当用于组合时，该术语是指产生治疗效果的活性成分总量，无论是联合、相继还是同时给药。
术语“本公开的化合物”和同等术语意在包括式I的化合物及其可药用对映体、非对映体和盐。类似地，提到中间体时意在包括其盐和溶剂合物，只要文中允许如此。提到本公开的化合物时，也包括优选化合物，例如式II的化合物。
术语“衍生物”是指化学改性化合物，其中改性被普通化学家认为是常规的，如酸的酯或酰胺、保护基，如用于醇或硫醇的苄基，和用于胺的叔丁氧基羰基。
术语“患者”包括人和其它哺乳动物。
术语“药物组合物”是指包含本公开的化合物以及至少一种附加药物载体，即辅助剂、赋形剂或媒介物，如稀释剂、防腐剂、填料、流动调节剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、增香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂(取决于给药模式和剂型)的组合物。可以使用例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1999)中列出的成分。
术语“可药用”在本文中用于表示在合理医疗判断范围内适合与患者组织接触使用而没有过度毒性、刺激、过敏响应或其它问题或并发症的与合理的风险/获益比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“治疗”是指：(i)预防可能容易患上疾病、失调症和/或症状但尚未被诊断为患病的患者体内出现该疾病、失调症或症状；(ii)抑制疾病、失调症或症状，即阻止其发展；和(iii)缓解疾病、失调症或症状，即逆转该疾病、失调症和/或症状。
除非明确地另行指明，本文所用的术语“取代的”包括在核心(如有机基团)上的一个至最大数量的可能键合位置(取代基键合到其上)上的取代，例如，单-、二-、三-或四-取代。
除非明确地另行指明，用于描述有机基团的术语，例如烃和取代烃，通常遵循本领域中已知的标准术语。除非明确地另行指明，基团的组合，例如烷基烷氧基胺或芳烷基，包括所有可能的稳定构型。下面以举例说明为目的指定某些基团和组合。
本文所用的术语“卤代”是指选自溴、氯、氟或碘的卤素取代基。术语“卤烷基”是指被一个或多个卤素取代基取代的烷基。
本文所用的术语“烷基”是指具有指定碳原子数的无环、直链或支链烷基取代基，并包括例如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基。因此，C1-6烷基是指具有1至6个碳原子的烷基。术语“低碳烷基”是指具有1至6个，优选1至4个碳原子的烷基。术语“烷基酯”是指另外含有酯基团的烷基。通常，所示碳数范围，例如C2-6烷基酯包括该基团中的所有碳原子。
本文所用的术语“烯基”是指含有至少一个双键的烷基，例如乙烯基和烷基。
本文所用的术语“烷氧基”是指连接到氧原子上的带有所示碳原子数的烷基。烷氧基包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1，1-二甲基乙氧基。后一基团在本领域中被称作叔丁氧基。术语“烷氧基羰基”是指另外含有羰基的烷氧基。
本文所用的术语“环烷基”是指含有所示碳原子数的环烷基取代基，并包括例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和螺环基团，如螺环丙基或螺环丁基。本文所用的术语“环烷氧基”是指连接到氧原子上的环烷基，如环丁氧基或环丙氧基。术语“烷基环烷基”是指连接到烷基上的环烷基。除非明确地另行指明，所指定的碳数范围包括该基团中的总碳数。因此，C4-10烷基环烷基可以在烷基中含有1-7个碳原子和在环中含有3-9个碳原子，例如环丙基甲基或环己基乙基。
本文所用的术语“芳基”是指含有所示碳原子数的芳族部分，例如但不限于，苯基、2，3-二氢化茚基或萘基。例如，C6-10芳基是指具有6至10个碳原子的芳族部分，其可以为单环或双环结构形式。本文所用的术语“卤芳基”是指被一个或多个卤素原子单取代、二取代或三取代的芳基。术语“烷芳基”、“芳基烷基”和“芳烷基”是指被一个或多个烷基取代的芳基。除非指定各基团的碳范围，否则所示范围适用于整个取代基。因此，C7-14烷芳基可以对于单环芳基在烷基中具有1-8个碳原子和对于稠合芳基在烷基中具有1-4个碳原子。该基团与分子上键合位点的连接可以在芳基或烷基处。除非指明特定芳基(例如氟苯基)或该基团被规定为未取代的，否则芳基包括被本领域技术人员已知的典型取代基，例如卤素、羟基、羧基、羰基、硝基、磺基、氨基、氰基、二烷基氨基卤烷基、CF3、卤烷氧基、硫烷基、烷酰基、SH、烷基氨基、烷基酰胺、二烷基酰胺、羧基酯、烷基砜、烷基磺酰胺和烷基(烷氧基)胺取代的那些。烷芳基的实例包括苄基、丁基苯基和1-萘基甲基。
本文所用的术语“烷酰基”是指含有所示数量的碳原子的直链或支链的1-氧代烷基，并包括，例如，甲酰基、乙酰基、1-氧代丙基(丙酰基)、2-甲基-1-氧代丙基、1-氧代己基和类似基团。
本文所用的术语“烷基酰胺”是指被烷基单取代的酰胺，如
本文所用的术语“杂环”，也被称作“Het”是指7-12元双环杂环和5-7元单环杂环。
优选的双环杂环是含有1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的7-12元稠合双环体系(两个环共享相邻的原子对)，其中该杂环的两个环都完全不饱和。氮和硫杂原子可以任选氧化。该双环杂环可以在一个或两个环中含有杂原子。除非指明特定杂环(例如氟化7-12元双环杂环)或该杂环被规定为未取代的，否则杂环包括被本领域技术人员已知的典型取代基取代的那些。例如，该双环杂环也可以在任一环碳原子上含有取代基，例如1至3个取代基。合适的取代基的实例包括C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、单-或二-卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、烷酰基、NO2、SH、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基磺酰胺、C1-6烷基亚砜、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基和5-7元单环杂环。当两个取代基连接到双环杂环的连位碳原子上时，它们可以连接形成环，例如含有最多2个选自氧和氮的杂原子的5、6或7元环体系。该双环杂环可以在该环中的任何原子处和优选在碳处连接到该分子，例如式I中的R’上。
双环杂环的实例包括，但不限于，下列环体系：
优选的单环杂环是在环中含有1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的5-7元饱和、部分饱和或完全不饱和环体系(后一子集在本文中也被称作不饱和杂环)，其中硫和氮杂原子可以任选被氧化。除非指明特定杂环(例如C1-6烷氧基取代的5-7元单环杂环)或该杂环被规定为未取代的，否则杂环包括被本领域技术人员已知的典型取代基取代的那些。例如，单环杂环也可以在任何环原子上含有取代基，例如1至3个取代基。合适的取代基的实例包括C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、单-或二-卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、烷酰基、NO2、SH、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基亚砜、C1-6烷基磺酰胺、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基和其它5-7元单环杂环。该单环杂环可以在该环中的任何原子处连接到所述分子，例如式I中的R’上。
单环杂环的实例包括，但不限于，下列(和它们的互变异构体)：
本领域技术人员会认识到，本公开的化合物中所用的杂环应该稳定。通常，稳定化合物是可以在该化合物不降解的情况下使用本领域技术人员已知的技术合成、分离和配制的那些。
与氨基酸或氨基酸衍生物相关的术语“取代基”是指衍生自相应α-氨基酸的基团。例如，取代基甲基、异丙基和苯基分别代表氨基酸丙氨酸、缬氨酸和苯基甘氨酸。
当用于命名本公开的化合物时，本文所用的标号“P1’、P1、P2、P3和P4”描绘了相对于天然肽分裂底物的结合点，蛋白酶抑制剂结合的氨基酸残基的相对位置。在天然底物中在P1和P 1’之间发生分裂，其中不带“’”的位置是指从肽天然分裂位点的C-末端开始向N-末端延伸的氨基酸；而带“’”的位置源自分裂位点名称的N-末端并向C-末端延伸。例如，P1’是指远离分裂位点的C-末端的右手侧的第一位置(即N-末端第一位置)；而P1从C-末端分裂位点的左手侧开始计数，P2：从C-末端起第二位，等等。(参见Berger A.& Schechter I.，Transactions of the Royal Society London series(1970)，B257，249-264)。
优选地，X为O、S、OCH2、CH2O或NH。更优选地，X是O或OCH2。最优选X为O。
在本公开的另一方面中，R`选自下列杂环：
另一方面，R’选自
各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代。
在本公开的另一方面中，X-R`选自下列：
一方面，W是-NH-SO2-R2；其中R2是-NRbRc；且Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C1-7环烷基和C1-7环烷基(C1-7烷基)。
一方面，Q是任选含有1至3个独立地选自O和S(O)m的杂原子的C5-7(优选C6)饱和或不饱和链；其中m是0、1或2。在一方面，Q不饱和。在另一方面，Q具有6个碳原子。在一方面，Q具有选自下列的结构：
其中P是任选含有一个独立地选自O、S(O)m的杂原子的C3饱和链；其中m是0、1或2。
另一方面，R2是-NRbRc；其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-7烷基)、C1-7环烷基、C1-7环烷基(C1-7烷基)、卤代C1-7烷基、杂环基和杂环基(C1-7烷基)。
另一方面，R4是-C(O)-R5、C(O)-NHR5或C(O)-OR5；其中R5是任选被卤素、烷氧基或氰基取代的C1-6烷基。在一方面，R5是任选被卤素取代的C1-6烷基。另一方面，R5是C1-6烷基。
在一方面，R3和R’3各自独立地为氢或甲基。
在本公开的一方面中，本公开的化合物具有式II的结构：
其中：
(a)R4是C(O)-OR5，其中R5是任选被C1-6烷氧基、氰基或卤素取代的C1-9烷基；
(b)Q是C5-7饱和或不饱和链，任选包含1-3个独立地选自O和S(O)m的杂原子；其中m是0、1或2；
(c)W是-NH-SO2-R2；其中R2是C6-10芳基、杂环基或-NRbRc；其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-7烷基)、C1-7环烷基、C1-7环烷基(C1-7烷基)、卤代C1-7烷基、杂环基和杂环基(C1-7烷基)；
(d)X是O；
(e)R′是Het、C6-10芳基或C7-14烷芳基，各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代；或C3-9环烷基或C1-7烷基，各自任选被卤素、氰基、烷氧基和二烷基氨基中相同或不同的1至5个成员取代；
条件是-XR’不同于：
(f)Ra选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基磺酰胺、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基和5-7元单环杂环。
含有碱性部分的本公开的化合物可以通过添加可药用酸来形成盐。由式I的化合物和可药用无机酸(包括但不限于，盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸)或有机酸(如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、丙二酸、富马酸、马来酸、草酸、丁二酸、氨基磺酸或酒石酸)形成酸加成盐。因此，这类可药用盐的实例包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、氨基磺酸盐和酒石酸盐。
胺基团的盐也可以包含季铵盐，其中氨基氮带有合适的有机基团，如烷基、烯基、炔基或芳烷基部分。
被酸性团取代的本公开的化合物可以作为通过碱加成形成的盐存在。这类碱加成盐包括衍生自无机碱的那些，包括例如碱金属盐(例如钠和钾)、碱土金属盐(例如钙和镁)、铝盐和铵盐。此外，合适的碱加成盐包括生理学可接受的有机碱(如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己基胺、N，N’-二苄基乙二胺、2-羟基乙胺、双-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、N-苄基-β-苯乙基胺、脱氢松香胺、N，N’-双氢松香胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、三甲基吡啶、奎宁、喹啉、乙二胺、鸟氨酸、胆碱、N，N’-苄基苯乙基胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷和四甲基氢氧化铵)和碱性氨基酸(如赖氨酸、精氨酸和N-甲基谷氨酰胺)的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
本公开的某些化合物及其盐还可以以其与水(例如水合物)或与有机溶剂(例如甲醇、乙醇或乙腈以分别形成甲醇化物(methanolate)、乙醇化物(ethanolate)或乙腈化物(acetonitrilate))的溶剂合物形式存在。本公开包括各溶剂合物及其混合物。
另外，本公开的化合物或其盐或溶剂合物可表现出多晶型。本公开还涵盖任何这种多晶型形式。
在本公开的化合物中存在不对称中心。例如，该化合物可以包括下式的P1环丙基单元
其中C1和C2各自代表环丙基环的1和2位处的不对称碳原子。无论该化合物的其它链段处的其它可能的不对称中心如何，这两个不对称中心的存在意味着该化合物可以作为非对映体(如在该非对映体中，R2如下所示构造成相对于酰胺为顺式的或相对于羰基为顺式的)的外消旋混合物存在。
(1R，2S) (1S，2R)
R2相对于羰基是顺式的 R2相对于羰基是顺式的
(1R，2R) (1S，2S)
R2相对酰胺是顺式的 R2相对酰胺是顺式的
应该理解的是，本公开包括具有抑制HCV蛋白酶的能力的所有立体化学异构形式或其混合物。
可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过形成可经由结晶、气体-液体或液相色谱法分离的非对映异构盐、一种对映体与对映体特异性试剂的选择性反应来拆分对映体。要认识到，如果通过分离技术将所需对映体转化成另一化学实体，则需要附加步骤形成所需对映体形式。或者，可以通过使用旋光活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成或通过经不对称转化将一种对映体转化成另一种来合成特定对映体。
本公开的某些化合物也可以以可分离的不同的稳定构象形式存在。由围绕不对称单键的限制旋转引起的扭转不对称性，例如由于位阻或环应变，可以实现不同构象异构体的分离。本公开包括这些化合物的各构象异构体及其混合物。
本公开的某些化合物可以以两性离子形式存在且本公开包括这些化合物的各两性离子形式及其混合物。
可用于合成本公开的化合物的原材料是本领域技术人员已知的并且可以容易地制造或可购得。
本公开的化合物可以通过本领域技术人员已知的方法制造。以举例说明为目的提供下述方法，它们不是要限制所要求保护的本公开的范围。例如，可以如图示1中所示合成具有式I的结构的本公开的化合物。要认识到，可能优选或必须制备其中使用传统保护基保护官能团的化合物，然后除去保护基以提供本公开的化合物。关于根据本公开的保护基的应用的细节是本领域技术人员已知的。
如图示1中所示，本公开的中间体，如二肽1可用于制备式1的化合物。在该方法的第一步骤中，在溶剂如醚中使用酸如HCl将1的Boc保护的氮脱保护，以提供相应的游离胺2。胺2可以随后在溶剂如二氯甲烷中使用偶联剂如HATU偶联到氨基酸3上以提供三肽中间体4。应该指出，在一些情况下，中间体，如3可购得，或者，这类化合物可以容易地通过本领域中已知的方法以外消旋或手性方式制备。式1的化合物的构造中的关键转化是大环化过程，其中将通用结构4的中间体转化成通用结构5的中间体。在所列一般实例中，可以通过分子内烯烃复分解反应实现中间体4向5的转化。这类反应是本领域中非常成熟的，并因此已经开发出并可购得许多烯烃复分解催化剂。例如，可以通过在溶剂，如二氯甲烷或二氯乙烷中用足量的Grubb’s第一代烯烃复分解催化剂处理4来实现二烯4向大环5的转化。在用于将4转化成5的一些实例中，可能必须加热反应混合物以实现这种环化法。然后通过两步法将中间体5转化成式1的化合物，如7。在该方法的第一步骤中，将中间体5的酯官能团水解成相应的羧基6。可以通过皂化反应实现这种转化，其中在THF、甲醇和水的混合物中用碱，如氢氧化锂处理5。可以通过与所示磺酰胺衍生物的简单偶联反应将所得酸6转化成式1的化合物。例如，本领域中非常成熟的是，在溶剂如二氯甲烷中用CDI处理羧酸如6，原位产生反应性中间体，其在用磺酰胺处理时提供7，式1的化合物。
图示1
下面阐述可制备式I的化合物的另一方法(图示2)。其中，在P1-P3大环化步骤后引入本文中被指定为连接到脯氨酸C4-部分(XR’)上的官能团的P2*官能。但是，应该指出，可以在该合成的任何合适的阶段实施将P2*引入该分子的方法。在该非限制性图示(图示2)中，使用合适的保护基来保护脯氨酸取代基X。该基团随后如所示的那样在该合成中的几个步骤中均带有，并在环化法后除去以提供中间体，如5，其随后转化成式I的化合物(6)。
图示2
在式I的化合物的构造中，使用上文略述和下文更详细描述的一般方法之一将P1’末端引入该分子中。在一些实例中，P1’单元(其是环烷基磺酰胺或烷基磺酰胺)可购得或可以由相应的烷基-或环烷基-磺酰氯通过用氨处理所述磺酰氯来制备。或者，可以使用图示3中阐述的一般方法合成这些磺酰胺。在此，例如通过用叔丁胺处理，将市售3-氯丙基磺酰氯(1)转化成合适的被护磺酰胺。随后通过在溶剂如THF中在低温下用2当量碱如丁基锂处理，将所得磺酰胺2转化成相应的环烷基磺酰胺3。可以通过用酸处理来将所得环烷基磺酰胺脱保护以提供所需的未保护环烷基磺酰胺4。所述P1’片段4可以并入式I的化合物中。另外，中间体如4的环烷基环可以进一步官能化。例如，用碱如丁基锂处理中间体3然后加入亲电体如烷基卤，这将提供中间体如5，其中环烷基环的C 1位置被官能化。这种类型的反应可以在溶剂如THF中进行。在这种反应中，可能必须向中间体3中加入2或更多当量的碱。此外，可能需要仔细监控这类反应的温度，其中在添加碱之前将3的THF溶液冷却至-78℃，这详细描述在本文中。
图示3
作为上述图示中所用的叔丁基保护基(例如图示3的中间体2)的替代品，可以如下所示使用Boc基团(图示4)。可以通过在碱(如三乙胺)以及催化性DMAP存在下用Boc酐处理中间体如2来并入所述Boc基团。然后通过在溶剂如THF中在低温下用2当量碱如丁基锂处理来将获得的酰基磺酰胺3转化成相应的环烷基酰基磺酰胺4。所得环烷基酰基磺酰胺4可以通过用酸处理来脱保护以提供所需未保护的环烷基磺酰胺。所述P1’片段可以并入式I的化合物中。
图示4
在式1的化合物的制备中，可以通过羟基脯氨酸衍生物1与环丙基氨基酸B如所示的那样偶联来制备下示二肽中间体，如2。这种偶联反应可以使用如HATU或HBTU之类的试剂在溶剂(如二氯甲烷或DMF或THF)中进行。
可以如图示5中所示合成中间体B。
图示5
在碱存在下用1，4-二卤代丁烯2处理市售或容易合成的亚胺1，提供亚胺3。3的酸解随之提供非对映体混合物形式的B。对于化合物3和B，优选的是，乙烯基相对于酯为顺式的。可以使用Boc基团保护B的胺部分以提供完全被护的氨基酸4a/4b。这种中间体是外消旋物，对映体的1∶1混合物，且各对映体显示在上述图示中。外消旋物4a/4b可以通过酶促法拆分，其中使4的酯部分分裂以提供相应的羧酸。不受制于任何特定理论，据信，这种反应是选择性的，因为具有被标作(1S，2R)的绝对立体化学的对映体之一(即4b)在比其镜像4a高得多的速率下发生反应，从而实现外消旋物4a/4b的动力学拆分。因此，在这种酶催化的酯分裂过程中，4b容易转化成相应的酸5，而4a仍是未反应的原材料。一旦反应终止，可以通过常规方法，如水萃取法或色谱法分离羧酸5和回收的原材料4a。如下所示，中间体4a可以容易地通过本文所述的方法转化成式1的化合物。例如，可以通过在溶剂如醚中对4a施以酸如HCl来实现从中间体4a中除去Boc基团，从而提供相应的胺盐酸盐6。然后可以将中间体6偶联到官能化脯氨酸部分1上以提供P1-P2二肽2。可以通过本文所述的方法将中间体如2转化成式1的化合物。
也可以将式1的化合物转化成如本文所述的其它式I的化合物。这类方法的一个实例显示在图示6中，其中将在P4位置带有Boc基团的式I(1)的化合物转化成式I(3)的化合物，其中所述化合物在P4位置带有脲基团。可以在两步法中进行1向3的转化，其中第一步骤是通过在溶剂如二氯甲烷中用酸如TFA处理1来将1转化成胺2。所得胺TFA盐可以在1当量碱存在下用异氰酸酯处理以提供式I(3)的化合物，其中P3部分被脲封端。如上所述，本领域技术人员会认识到，中间体2可用作用于制备式I的化合物的原材料，其中P3基团被酰胺或氨基甲酸酯封端。可以使用由胺形成所述P4官能的标准条件实现所述式I的化合物的构造。
图示6
本领域技术人员会认识到，可以在肽骨架组装中的任何阶段将P2*引入该分子中。这在下面显示(图示7)用于将中间体如1、3或5转化成式1的化合物。
图示7
本公开还提供了包含本公开的化合物或其可药用对映体、非对映体或盐，和可药用载体的组合物。本公开的药物组合物包含治疗有效量的本公开的化合物或其可药用对映体、非对映体或盐和可药用载体，可药用载体是例如赋形剂或载体稀释剂。
这类组合物中的活性成分，即化合物通常构成该组合物的0.1重量％至99.9重量％，并通常构成大约5至95重量％。
因此，在本公开的一个方面中，提供了包含式1的化合物和可药用载体的组合物。优选地，该组合物进一步包含具有抗-HCV活性的化合物。本文所用的术语“抗HCV活性”是指该化合物可有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCVNS5A蛋白质、IMPDH和核苷类似物的靶的功能以治疗HCV感染。通常，其它具有抗-HCV活性的化合物有效抑制HCV生命周期中除HCV NS3蛋白酶蛋白质外的靶的功能。
在一个优选方面中，具有抗-HCV活性的该化合物是干扰素。所述干扰素优选选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A、类淋巴母细胞(lymphoblastiod)干扰素τ。
在本公开的另一方面中，具有抗-HCV活性的该化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助T细胞响应的发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特(Imiqimod)、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸酯脱氢酶抑制剂、金刚胺和金刚乙胺。
在本公开的一个优选方面中，该组合物包含本公开的化合物、干扰素和利巴韦林。
在本公开的另一方面中，具有抗-HCV活性的所述化合物是小分子化合物。本文中使用的术语“小分子化合物”表示分子量小于1,500道尔顿的化合物，优选小于1000道尔顿。优选地，所述小分子化合物可有效抑制靶功能，所述靶选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCV NS5A蛋白质和苷单磷酸盐脱氢酶(“IMPDH”)。
另一方面，本公开提供了包含式I的化合物或其可药用盐和可药用载体的组合物。在这方面的一个实施方案中，该组合物进一步包含至少一种具有抗HCV活性的附加化合物。在另一实施方案中，至少一种该附加化合物是干扰素或利巴韦林。在另一实施方案中，该干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
另一方面，本公开提供了包含式I的化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的附加化合物的组合物，其中至少一种该附加化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助T细胞响应的发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸酯脱氢酶抑制剂、金刚胺和金刚乙胺。
另一方面，本公开提供了包含式I的化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的附加化合物的组合物，其中至少一种该附加化合物有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCV NS5A蛋白质和IMPDH的靶的功能以治疗HCV感染。
另一方面，本公开提供了治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的式I的化合物或其可药用盐。在一个实施方案中，该方法进一步包括在式I的化合物或其可药用盐之前、之后或同时施用至少一种具有抗HCV活性的附加化合物。在另一实施方案中，至少一种该附加化合物是干扰素或利巴韦林。所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
另一方面，本公开提供了治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的式I的化合物或其可药用盐和在式I的化合物或其可药用盐之前、之后或同时的至少一种具有抗HCV活性的附加化合物，其中至少一种该附加化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助T细胞响应的发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸酯脱氢酶抑制剂、金刚胺和金刚乙胺。
另一方面，本公开提供了治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的式I的化合物或其可药用盐和在式I的化合物或其可药用盐之前、之后或同时的至少一种具有抗HCV活性的附加化合物，其中至少一种该附加化合物有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCV NS5A蛋白质和IMPDH的靶的功能以治疗HCV感染。
另一方面，本公开提供了包含式(I)的化合物或其可药用盐、一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的附加化合物和可药用载体的组合物。在此方面的第一实施方案中，该组合物包含三种或四种具有抗HCV活性的附加化合物。在第二实施方案中，该组合物包含一种或两种具有抗HCV活性的附加化合物。
另一方面，本公开提供了治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐和在式(I)的化合物或其可药用盐之前、之后或同时的一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的附加化合物。在此方面的第一实施方案中，该方法包括施用三种或四种具有抗HCV活性的附加化合物。在第二实施方案中，该方法包括施用一种或两种具有抗HCV活性的附加化合物。
本公开的其它方面可以包括本文公开的实施方案的合适的组合。
可以在本文提供的描述中找到其它方面和实施方案。
可以与本公开的化合物一起施用的某些示例性HCV抑制剂化合物包括下列公开文献中公开的那些：2002年1月17日公开的WO02/04425A2、2003年1月30日公开的WO 03/007945A1、2003年2月6日公开的WO 03/010141A2、2003年2月6日公开的WO 03/010142A2、2003年2月6日公开的WO 03/010143A1、2003年1月3日公开的WO 03/000254A1、2001年5月10日公开的WO 01/32153A2、2000年2月10日公开的WO 00/06529、2000年4月6日公开的WO00/18231、2000年3月2日公开的WO 00/10573、2000年3月16日公开的WO 00/13708、2001年11月15日公开的WO 01/85172A1、2003年5月8日公开的WO 03/037893A1、2003年5月8日公开的WO 03/037894A1、2003年5月8日公开的WO 03/037895A1、2002年12月19日公开的WO 02/100851A2、2002年12月19日公开的WO 02/100846A1、2002年11月13日公开的EP 1256628A2、1999年1月14日公开的WO 99/01582、2000年2月24日公开的WO00/09543。
下表1列出可以与本公开的化合物一起施用的化合物的一些示例性实例。本公开的化合物可以与其它抗HCV活性化合物在联合疗法中共同或单独施用，或通过将这些化合物组合成组合物来施用。
表1
| 商标名称 | 生理学分类 | 抑制剂或靶的类型 | 来源公司 |
| NIM811 | Cyclophilin抑制剂 | Novartis | |
| Zadaxin | 免疫调节剂 | Sciclone | |
| Suvus | 亚甲蓝 | Bioenvision | |
| Actilon(CPG10101) | TLR9激动剂 | Coley | |
| Batabulin(T67) | 抗癌 | β-微管蛋白抑制剂 | Tularik Inc.，South SanFrancisco，CA |
| ISIS 14803 | 抗病毒 | 反义 | ISIS PharmaceuticalsInc，Carlsbad，CA/ElanPhamaceuticals Inc.，New York，NY |
| Summetrel | 抗病毒 | 抗病毒 | Endo PharmaceuticalsHoldings Inc.，ChaddsFord，PA |
| GS-9132(ACH-806) | 抗病毒 | HCV抑制剂 | Achillion/Gilead |
| 吡唑并嘧啶化合物和盐，来自WO-2005047288，2005年5月26日 | 抗病毒 | HCV抑制剂 | Arrow TherapeuticsLtd. |
| Levovirin | 抗病毒 | IMPDH抑制剂 | Ribapharm Inc.，CostaMesa，CA |
| Merimepodib(VX-497) | 抗病毒 | IMPDH抑制剂 | Vertex PharmaceuticalsInc.，Cambridge，MA |
| 商标名称 | 生理学分类 | 抑制剂或靶的类型 | 来源公司 |
| XTL-6865(XTL-002) | 抗病毒 | 单克隆抗体 | XTLBiopharmaceuticalsLtd.，Rehovot，Isreal |
| Telaprevir(VX-950，LY-570310) | 抗病毒 | NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Vertex PharmaceuticalsInc.，Cambridge，MA/Eli Lilly和Co.Inc.，Indianapolis，IN |
| HCV-796 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Wyeth/Viropharma |
| NM-283 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Idenix/Novartis |
| GL-59728 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gene Labs/Novartis |
| GL-60667 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gene Labs/Novartis |
| 2’C MeA | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gilead |
| PSI 6130 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Roche |
| R1626 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Roche |
| 2’C甲基腺苷 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Merck |
| JTK-003 | 抗病毒 | RdRp抑制剂 | Japan Tobacco Inc.，Tokyo，Japan |
| Levovirin | 抗病毒 | 利巴韦林 | ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA |
| 利巴韦林 | 抗病毒 | 利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| Viramidine | 抗病毒 | 利巴韦林前药 | Ribapharm Inc.，CostaMesa，CA |
| Heptazyme | 抗病毒 | 核酶 | RibozymePharmaceuticals Inc.，Boulder，CO |
| BILN-2061 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Boehringer IngelheimPharma KG，Ingelheim，Germany |
| SCH 503034 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Schering Plough |
| 商标名称 | 生理学分类 | 抑制剂或靶的类型 | 来源公司 |
| Zadazim | 免疫调节剂 | 免疫调节剂 | SciClonePharmaceuticals Inc.，San Mateo，CA |
| Ceplene | 免疫调节剂 | 免疫调节剂 | Maxim PharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| CellCept | 免疫抑制剂 | HCV IgG免疫抑制剂 | F.Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| Civacir | 免疫抑制剂 | HCV IgG免疫抑制剂 | NabiBiopharmaceuticalsInc.，Boca Raton，FL |
| Albuferon-α | 干扰素 | 白蛋白IFN-α2b | Human GenomeSciences Inc.，Rockville，MD |
| Infergen A | 干扰素 | IFN alfacon-1 | InterMunePharmaceuticals Inc.，Brisbane，CA |
| Omega IFN | 干扰素 | IFN-ω | Intarcia Therapeutics |
| IFN-β和EMZ701 | 干扰素 | IFN-β和EMZ701 | Transition TherapeuticsInc.，Ontario，Canada |
| Rebif | 干扰素 | IFN-β1a | Serono，Geneva，Switzerland |
| Roferon A | 干扰素 | IFN-α2a | F.Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| Intron A | 干扰素 | IFN-α2b | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| 商标名称 | 生理学分类 | 抑制剂或靶的类型 | 来源公司 |
| Intron A和Zadaxin | 干扰素 | IFN-α2b/α1-胸腺素 | RegeneRxBiopharmiceuticalsInc.，Bethesda，MD/SciClonePharmaceuticals Inc，San Mateo，CA |
| Rebetron | 干扰素 | IFN-α2b/利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| Actimmune | 干扰素 | INF-γ | InterMune Inc.，Brisbane，CA |
| 干扰素-β | 干扰素 | 干扰素-β-1a | Serono |
| Multiferon | 干扰素 | 长效IFN | Viragen/Valentis |
| Wellferon | 干扰素 | 类淋巴母细胞IFN-αn1 | GlaxoSmithKline plc，Uxbridge，UK |
| Omniferon | 干扰素 | 天然IFN-α | Viragen Inc.，Plantation，FL |
| Pegasys | 干扰素 | 聚乙二醇化IFN-α2a | F.Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| Pegasys和Ceplene | 干扰素 | 聚乙二醇化IFN-α2a/免疫调节剂 | Maxim PharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| Pegasys和利巴韦林 | 干扰素 | 聚乙二醇化IFN-α2a/利巴韦林 | F.Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| PEG-Intron | 干扰素 | 聚乙二醇化IFN-α2b | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| PEG-Intron/利巴韦林 | 干扰素 | 聚乙二醇化IFN-α2b/利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| 商标名称 | 生理学分类 | 抑制剂或靶的类型 | 来源公司 |
| IP-501 | 保肝 | 抗纤维化 | IndevusPharmaceuticals Inc.，Lexington，MA |
| IDN-6556 | 保肝 | 半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂 | Idun PharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| ITMN-191(R-7227) | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | InterMunePharmaceuticals Inc.，Brisbane，CA |
| GL-59728 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Genelabs |
| ANA-971 | 抗病毒 | TLR-7激动剂 | Anadys |
| TMC-465350 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Medivir/Tibotec |
本公开的药物组合物可以口服、肠道外给药或经由植入型药囊(implanted reservoir)给药。口服或注射给药是优选的。在一些情况下，可以用可药用酸、碱或缓冲液调节制剂的pH值以提高配制的化合物或其输递形式的稳定性。本文所用的术语肠道外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内和病灶内或输注技术。
当口服时，本公开的药物组合物可以以任何可口服剂型给药，包括但不限于，胶囊、片剂、水悬浮液和溶液。在口服用片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。也通常添加润滑剂，如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服，可用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂合并。如果需要，可以加入某些甜味剂和/或增香剂和/或着色剂。用于上述组合物的其它合适的载体可见于标准制药教科书，例如，“Remington′s PharmaceuticalSciences”，第19版，Mack Publishing Company，Easton，Penn.，1995。
该药物组合物可以通过已知程序使用公知易得的成分制备。可以使用本领域公知的程序配制本公开的组合物以提供向患者给药后活性成分的迅速、持久或延迟释放。在制造本公开的组合物时，通常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，或包封在可以为胶囊、小药囊(sachet)、纸或其它容器形式的载体中。当该载体充当稀释剂时，其可以是充当活性成分的媒介物、赋形剂或介质的固体、半固体或液体材料。因此，该组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、微型胶囊、锭剂、小药囊、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射液、无菌包装粉剂和类似形式。关于本公开的药物组合物的合适输递形式的设计和制备的其它细节是本领域技术人员已知的。
大约0.01至大约1000毫克/千克(“mg/kg”)体重/天，优选大约0.5至大约250mg/kg体重/天的本公开的化合物的剂量在用于预防和治疗HCV介导的疾病的单一疗法中是典型的。通常，本公开的药物组合物每天施用大约1至大约5次或以连续输液形式施用。这类施用可用作慢性或急性疗法。可以与载体材料结合制造单剂型的活性成分量随要治疗的宿主和具体给药模式而变。
如技术人员将会认识到的，可能需要比上述那些更低或更高的剂量。对于任何特定患者，具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、感染的严重性和进程、患者对感染的生理倾向性和治疗医师的判断。通常，以明显小于肽最佳剂量的小剂量开始治疗。此后，以小的增量增加剂量直至达到具体情况下的最佳效果。通常，该化合物最好以通常提供有效抗病毒结果而不会造成任何有害或有毒副作用的浓度水平施用。
当本公开的组合物包含本公开的化合物和一种或多种附加治疗或预防剂的组合时，该化合物和附加药剂都通常以在单一治疗方案中通常施用的剂量的大约10至100％，更优选大约10至80％的剂量水平存在。
当这些化合物或它们的可药用对映体、非对映体或其盐与可药用载体一起配制时，所得组合物可以体内施用于哺乳动物，如人，以抑制HCV NS3蛋白酶或治疗或预防HCV病毒感染。
相应地，本公开的另一方面提供了通过施用本公开的化合物或其可药用对映体、非对映体或盐来抑制患者体内的HCV NS3蛋白酶活性的方法。
在本公开的一个方面中，提供了治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的本公开的化合物或其可药用对映体、非对映体、盐或溶剂合物。
施用该化合物的方法优选有效抑制了HCV NS3蛋白酶蛋白质的功能。在一个优选方面中，该方法进一步包括在本公开的化合物之前、之后或同时施用具有抗-HCV活性的另一化合物(如上所述)。
本公开的化合物也可用作实验室试剂。化合物能够有助于提供用于设计病毒复制检验法、验证动物检验系统和结构生物学研究的研究工具以进一步增强对HCV疾病机理的认识。此外，本公开的化合物可用于确定或决定其它抗病毒化合物的结合位点，例如通过竞争性抑制。
本公开的化合物也可用于处理或预防材料的病毒污染和因此降低与这类材料(例如血液、组织、手术仪器和衣物、实验室仪器和衣物、和血液收集或灌输装置和材料)接触的实验室或医务人员或患者的病毒感染危险。
此外，本公开的化合物和组合物可用于制造治疗患者的HCV感染的药物。
实施例
下列具体实施例例证本公开的化合物的合成，并且不能被视为限制下列权利要求书的范围。该方法可以作出变动以制造本公开涵盖但未具体公开的化合物。此外，以略微不同的方式制造相同化合物的方法的变动也是本领域技术人员显而易见的。
常用于识别本文公开的化合物的化学缩写包括Bn：苄基；Boc：叔丁氧基羰基{Me3COC(O)}；BSA：牛血清白蛋白；CDI：羰基二咪唑；DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]-十一-7-烯；CH2Cl2＝DCM：二氯甲烷；TBME：叔丁基甲基醚；DEAD：二乙基偶氮二羧基酯；DIAD：二异丙基偶氮二羧酸酯；DIEA：二异丙基乙胺；DIPEA：二异丙基乙胺；4-DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DCC：1，3-二环己基碳二亚胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物；Et：乙基；EtOH：乙醇；EtOAc：乙酸乙酯；Et2O：二乙醚；Grubb’s催化剂：双(三环己基膦)亚苄基二氯化钌(IV)；Grubb’s 2代催化剂：三环己基膦[1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)-4，5-二氢咪唑-2-亚基][亚苄基]二氯化钌(IV)；HATU：六氟磷酸[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓；HBTU：六氟磷酸[O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓；HOBT，1-羟基苯并三唑；HOAT，1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HPLC：高效液相色谱法；MS：质谱法；Me：甲基；MeOH：甲醇；NMM：N-甲基吗啉；NMP：N-甲基吡咯烷；Pr：丙基；PPA：聚磷酸；TBAF：四-正丁基氟化铵；1，2-DCE或DCE：1，2-二氯乙烷；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃。
除非另行指明，否则溶液百分比表示重量比体积关系，且溶液比率表示体积比体积关系。在Bruker 300、400或500兆赫(MHz)能谱仪上记录核磁共振(NMR)谱；以百万分之份数表示化学位移(δ)。根据Still’s快速色谱技术在硅胶(SiO2)上进行快速色谱法(J.Org.Chem.1978，43，2923)。在Shimadzu LC-10AS液相色谱仪上使用SPD-10AV UV-Vis检测器己录液相色谱(LC)数据，并用用于LC的Micromass Platform以电喷雾模式(ES+)测定质谱(MS)数据。除非另行指明，否则溶液百分比表示重量比体积关系，且溶液比率表示体积比体积关系。在Bruker 300、400或500MHz能谱仪上记录核磁共振(NMR)谱；以百万分之份数表示化学位移(δ)。
根据下列方法制备下列实施例中所述的本公开的实例、化合物和化学中间体。
实施例1：
外消旋(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的
制备(方法A和方法B)
通过下列各方法A和B使所述化合物外消旋。
方法A
甘氨酸乙酯的N-苄基亚胺的制备
将甘氨酸乙酯盐酸盐(303.8克，2.16摩尔)悬浮在叔丁基甲醚(1.6升)中。添加苯甲醛(231克，2.16摩尔)和无水硫酸钠(154.6克，1.09摩尔)并使用冰水浴将该混合物冷却至0℃。经30分钟逐滴添加三乙胺(455毫升，3.26摩尔)，并将该混合物在室温下搅拌48小时。然后通过添加冰冷水(1升)来猝灭反应并分离有机层。用叔丁基甲醚(0.5升)萃取水相，并将合并的有机相用饱和NaHCO3水溶液(1升)和盐水(1升)的混合物洗涤。该溶液经MgSO4干燥，真空浓缩以提供392.4克粘稠的黄色油状的N-苄基亚胺产物，其直接用在下一步骤中。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.32(t，J＝7.1Hz，3H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，4.41(d，J＝1.1Hz，2H)，7.39-7.47(m，3H)，7.78-7.81(m，2H)，8.31(s，1H)。
外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
经60分钟向叔丁醇锂(84.06克，1.05摩尔)在无水甲苯(1.2升)中的悬浮液中逐滴加入甘氨酸乙酯的N-苄基亚胺(100.4克，0.526摩尔)和反式-1，4-二溴-2-丁烯(107.0克，0.500摩尔)在无水甲苯(0.6升)中的混合物。在添加完成后，通过添加水(1升)和叔丁基甲醚(TBME，1升)，将该深红色混合物猝灭。分离水相并用TBME(1升)第二次萃取。合并有机相，加入1N HCl(1升)并将该混合物在室温下搅拌2小时。分离有机相并用水(0.8升)萃取。然后合并水相，用盐(700克)饱和，加入TBME(1升)并将该混合物冷却至0℃。然后通过逐滴添加10N NaOH，将搅拌的混合物碱化至pH 14，分离有机层，并用TBME(2x500毫升)萃取水相。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)并浓缩至1升体积。向该游离胺溶液中加入BOC2O或二碳酸二叔丁酯(131.0克，0.6摩尔)并将该混合物在室温下搅拌4天。向该反应中加入额外的二碳酸二叔丁酯(50克，0.23摩尔)，将混合物回流3小时，然后使其冷却至室温过夜。将反应混合物经MgSO4干燥并真空浓缩以提供80克粗材料。该残留物通过快速色谱法提纯(2.5千克SiO2，用1％至2％MeOH/CH2Cl2洗脱)以提供57克(53％)黄色油状的外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其在置于冷冻机中时凝固：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.46(s，9H)，1.43-1.49(m，1H)，1.76-1.82(br m，1H)，2.14(q，J＝8.6Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，5.12(ddJ＝10.3，1.7Hz，1H)，5.25(br s，1H)，5.29(dd，J＝17.6，1.7Hz，1H)，5.77(ddd，J＝17.6，10.3，8.9Hz，1H)；MS m/z 254.16(M-1)。
外消旋(1R，2S)/(1S，2R)1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
将N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(9.39克，36.8毫摩尔)溶解在4N HCl/二氧杂环己烷(90毫升，360毫摩尔)中并在室温下搅拌2小时。浓缩该反应混合物，从而以定量收率提供(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(7克，100％)。1H NMR(甲醇-d4)δ1.32(t，J＝7.1，3H)，1.72(dd，J＝10.2，6.6Hz，1H)，1.81(dd，J＝8.3，6.6Hz，1H)，2.38(q，J＝8.3Hz，1H)，4.26-4.34(m，2H)，5.24(dd，10.3，1.3Hz，1H)5.40(d，J＝17.2，1H)，5.69-5.81(m，1H)。
方法B
外消旋N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
向-78℃的叔丁醇钾(11.55克，102.9毫摩尔)在THF(450毫升)中的溶液中加入在THF(112毫升)中的市售甘氨酸乙酯的N，N-二苄基亚胺(25.0克，93.53毫摩尔)。将该反应混合物升温至0℃，搅拌40分钟，然后冷却回-78℃。向该溶液中加入反式-1，4-二溴-2-丁烯(20.0克，93.50毫摩尔)，将该混合物在0℃下搅拌1小时，并冷却回-78℃。加入叔丁醇钾(11.55克，102.9毫摩尔)，将该混合物立即升温至0℃，并再搅拌1小时，然后真空浓缩。将粗产物溶于Et2O(530毫升)，加入1N HCl水溶液(106毫升，106毫摩尔)并将所得两相混合物在室温下搅拌3.5小时。分离各层并将水层用Et2O洗涤(2x)并用饱和NaHCO3水溶液碱化。用Et2O(3x)萃取所需胺，并将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并在真空中浓缩以获得游离胺。将该材料用二氧杂环己烷中的4N HCl溶液(100毫升，400毫摩尔)处理并浓缩产生棕色半固体状的(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(5.3克，34％收率)，除了存在少量未识别的芳族杂质(8％)外，其等于获自程序A的材料。
实施例2：
N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的拆分
拆分A
向保持在39℃下并以300rpm搅拌的装在12升夹套反应器中的磷酸钠缓冲液水溶液(0.1M，4.25升(“L”)，pH 8)中加入511克Alcalase 2.4L(大约425毫升)(Novozymes North America Inc.)。当混合物温度达到39℃时，通过添加在水中的50％NaOH，将pH值调节至8.0。然后经40分钟加入外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(85克)在850毫升DMSO中的溶液。然后使反应温度在40℃保持24.5小时，在此期间在1.5小时和19.5小时时间点用水中的50％NaOH将混合物pH值调节至8.0。在24.5小时后，测得酯的对映体过量为97.2％，将该反应冷却至室温(26℃)，并搅拌过夜(16小时)，此后测得酯的对映体过量为100％。然后用50％NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将所得混合物用MTBE(2x2L)萃取。然后将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3x100毫升)、水(3x100毫升)洗涤并在真空中蒸发产生浅黄色固体状的对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(42.55克；纯度：97％@210nm，不含酸；100％对映体过量(“ee”))。
然后将来自萃取过程的水层用50％H2SO4酸化至pH 2并用MTBE萃取(2x2升)。该MTBE萃取物用水(3x100毫升)洗涤并蒸发产生浅黄色固体状的酸(42.74克；纯度：99％@210nm，不含酯)。
拆分B
向在24孔板(容积：10毫升/孔)的孔中的0.5毫升100mMHeps·Na缓冲液(pH 8.5)中加入0.1毫升Savinase 16.0L(来自Bacillusclausii的蛋白酶)(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10毫克)在0.1毫升DMSO中的溶液。密封该板并在40℃下在250rpm下培养。18小时后，如下测得酯的对映体过量为44.3％：取出0.1毫升反应混合物并与1毫升乙醇充分混合；离心后，用手性HPLC分析10微升(“μl”)上清液。向残留反应混合物中加入0.1毫升DMSO，并将该板在40℃下在250rpm下再培养3天，此后向该孔中加入4毫升乙醇。离心后，用手性HPLC分析10微升上清液，并测得酯的对映体过量为100％。
拆分C
向在24孔板(容积：10毫升/孔)的孔中的0.5毫升100mMHeps·Na缓冲液(pH 8.5)中加入0.1毫升Esperase 8.0L(来自Bacillushalodurans的蛋白酶)(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10毫克)在0.1毫升DMSO中的溶液。密封该板并在40℃下在250rpm下培养。18小时后，如下测得酯的对映体过量为39.6％：取出0.1毫升反应混合物并与1毫升乙醇充分混合；离心后，用手性HPLC分析10微升上清液。向残留反应混合物中加入0.1毫升DMSO，并将该板在40℃下在250rpm下再培养3天，此后向该孔中加入4毫升乙醇。离心后，用手性HPLC分析10微升上清液，并测得酯的对映体过量为100％。
以下列方式进行样品分析：
1)样品制备：将大约0.5毫升反应混合物与10体积的EtOH充分混合。离心后，将10微升上清液注射到HPLC柱上。
2)转化率测定：
柱：YMC ODS A，4.6x50mm，S-5μm
溶剂：A，1mM HCl在水中；B，MeCN
梯度：30％B 1分钟；30％至45％B在0.5分钟内；45％B 1.5分钟；45％至30％B在0.5分钟内
流速：2毫升/分钟
UV检测：210nm
停留时间：酸，1.2分钟；酯，2.8分钟
3)酯的对映体过量测定：
柱：CHIRACEL OD-RH，4.6x150mm，S-5μm
流动相：MeCN/50mM HClO4在水中(67/33)
流速：0.75毫升/分钟
UV检测：210nm
停留时间：
(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸5.2分钟；
外消旋物(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯18.5分钟和20.0分钟；
(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯18.5分钟。
拆分D
使5升0.3M磷酸钠缓冲液(pH 8)在以130rpm搅拌的20升夹套反应器中保持在38℃下。向该反应器中加入4升Alcalase 2.4L(Novozymes North America Inc.)和1升去离子水。当混合物的温度接近38℃时，用10N NaOH将pH值调节至7.8。经由加料漏斗经1小时向该反应器中加入外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(500克)在5升DMSO中的溶液。然后将反应温度调节至48℃。在21小时后，酯的对映体过量达到99.3％。在24小时停止加热并将反应缓慢冷却至室温(大约25℃)并搅拌过夜。用10N NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将混合物用MTBE(2x4升)萃取。将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3x400毫升)和水(3x400毫升)洗涤，并蒸发产生浅黄色晶体状的对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(259克；纯度：96.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
拆分E
使10升0.1M磷酸钠缓冲液(pH 8)在以360rpm搅拌的20升夹套反应器中保持在40℃下。向该反应器中加入1.5升Alcalase 2.4L(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度接近38℃时，用10N NaOH将pH值调节至8.0。经由加料漏斗经1小时向该反应器中加入外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)在2升DMSO中的溶液。然后将反应温度调节至40℃。在3小时后，用10N NaOH将pH值调节至8.0。在21小时后，将反应冷却至25℃。用10N NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将混合物用MTBE(2x5升)萃取。将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3x500毫升)和水(3x200毫升)洗涤，并蒸发产生110克黄色油。将该油放置在室温和室内(house)真空下并产生无色长棒晶状的对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(101克；纯度：97.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
通过单晶分析法(X-射线NB#：52795-093，refcode：634592N 1)表征对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的晶体结构。由于缺乏已知手性中心或更重原子，没有确定绝对构型。经由酰胺基团与羰基氧原子之间的分子间氢键合(N...O 3.159
)形成沿结晶a-轴的链结构。
N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：
晶体数据： 实验：
化学式：C13H21N1O4 结晶
晶系：斜方晶系晶体源： MTBE
空间群：P212121晶体描述：无色棒状
a＝5.2902(1)
α＝90°晶体粒度(mm)：0.12X 0.26X 0.30
b＝13.8946(2)
β＝90°数据收集
c＝19.9768(3)
γ＝90°温度(K)：293
V＝1468.40(4)
(°)：65.2(Cu Kα)
Z＝4 dx＝1.155g cm-3测得的反射数：7518
晶格参数的反射数：6817 独立反射数：2390(Rint＝0.0776)
晶格参数的
范围(°)：2.2-65.2观察到的反射数(I≥2σ)：2284
吸收系数(mm-1)：0.700吸收校正(Tmin-Tmax)：0.688-1.000
拆分F
使5升0.2M硼酸钠缓冲液(pH 9)在以400rpm搅拌的20升夹套反应器中保持在45℃下。向该反应器中加入3升去离子水和4升Savinase 16L，EX型(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度接近45℃时，用10N NaOH将pH值调节至8.5。经由加料漏斗经40分钟向该反应器中加入外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)在2升DMSO中的溶液。然后将反应温度调节至48℃。在2小时后，用10N NaOH将pH值调节至pH 9.0。在18小时时，酯的对映体过量达到72％，用10N NaOH将pH值调节至9.0。在24小时时，温度降至35℃。在42小时，将温度升至48℃并用10N NaOH将pH值调节至9.0。在48小时停止加热并将反应缓慢冷却至室温(大约25℃)并搅拌过夜。在66小时，反应混合物的pH值为8.6。将混合物用MTBE(2x4升)萃取。将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(6x300毫升)和水(3x300毫升)洗涤，并蒸发产生浅黄色晶体状的对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(101A克；纯度：95.9％@210nm，不含酸；98.6％ee)。
实施例3：
步骤1：1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(8.5克，33.3毫摩尔)在N2气氛下用200毫升4N HCl/二氧杂环己烷(Aldrich)在室温下搅拌3小时。减压除去溶剂，使温度保持低于40℃。这产生6.57克(～100％)浅褐色(tan)固体状的1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，1.69-1.82(m，2H)，2.38(q，J＝8.8Hz，1H)，4.29(q，J＝7.0Hz，2H)，5.22(d，J＝10.3Hz，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.69-5.81(m，1H)。MS m/z 156(M++1)。
步骤2：1(R)-[1-叔丁氧基羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰氨基
(carboxamido)]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
相继用N-甲基吗啉(9.3毫升，84.7毫摩尔)、HATU(19.5克，51.3毫摩尔)和1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(9.1克，47.5毫摩尔)处理Boc-L-4-羟基脯氨酸(N-Boc(2S，4R)-羟基脯氨酸)(10克，43.3毫摩尔)在400毫升二氯甲烷中的搅拌浆料。将该金色均匀溶液在室温下在N2下搅拌18小时，然后在真空中浓缩产生棕色油。使其在乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液之间分配。有机相用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩产生15克(94％)灰白色固体状的1(R)-[1-叔丁氧基羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰氨基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯：LC-MS(Xterra HPLC柱：3.0x50mm长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：3分钟。停留时间：1分钟。流速：5毫升/分钟。检测器波长：220nm。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)(停留时间：2.09分钟)，MS m/z 369(M++1)。
步骤3：1(R)，[4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰氨基]-2(S)-乙烯基环丙
烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
将1(R)-[1-叔丁氧基羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰氨基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(5.0克，13.6毫摩尔)的搅拌浆料用4N HCl/二氧杂环己烷(20毫升)处理3小时。将反应混合物真空浓缩以产生4.5克(97％)白色固体状的1(R)-[4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰氨基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐：1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.26(t，J＝7.14Hz，3H)，1.46(dd，J＝9.70，5.31Hz，1H)，1.80(dd，J＝8.23，5.31Hz，1H)，2.00-2.15(m，1H)，2.18-2.30(m，1H)，2.45(dd，J＝13.36，7.50Hz，1H)，3.36-3.48(m，1H)，4.11-4.24(m，2H)，4.44(dd，J＝10.25，7.68Hz，1H)，4.58-4.65(m，1H)，4.84-4.94(m，1H)，5.17(d，J＝1.83Hz，1H)，5.27-5.42(m，1H)，5.67-5.89(m，1H)。
实施例4：
环丙基磺酰胺的制备，方法A和B
方法A：
向冷却至0℃的100毫升THF溶液中鼓入气态氨，直至达到饱和。向该溶液中加入5克(28.45毫摩尔)环丙基磺酰氯(购自ArrayBiopharma)在50毫升THF中的溶液，使该溶液升温至室温过夜，并再搅拌1天。将该混合物浓缩直至留下1-2毫升溶剂，施加到30克SiO2柱上(用30％至60％EtOAc/己烷洗脱)以产生3.45克(100％)白色固体状的环丙基磺酰胺。1H NMR(甲醇-d4)δ0.94-1.07(m，4H)，2.52-2.60(m，1H)；13C NMR(甲醇-d4)δ5.92，33.01。
方法B：
步骤1：N-叔丁基-(3-氯)丙基磺酰胺的制备
将叔丁基胺(3.0摩尔，315.3毫升)溶解在THF(2.5L)中。将该溶液冷却至-200℃。缓慢加入3-氯丙烷磺酰氯(1.5摩尔，182.4毫升)。使反应混合物升温至室温并搅拌24小时。过滤混合物，并将滤液真空浓缩。将残留物溶解在CH2Cl2(2.0升)中。将所得溶液用1N HCl(1.0升)、水(1.0升)、盐水(1.0升)洗涤并经Na2SO4干燥。将其过滤并真空浓缩以产生浅黄色固体，使其从己烷中结晶以提供白色固体状产物(316.0克，99％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，2.30-2.27(m，2H)，3.22(t，J＝7.35Hz，2H)，3.68(t，J＝6.2Hz，2H)，4.35(b，1H)。
步骤2：环丙烷磺酸叔丁基酰胺的制备
在-78℃下向N-叔丁基-(3-氯)丙基磺酰胺(2.14克，10.0毫摩尔)在THF(100毫升)中的溶液中加入n-BuLi(2.5M在己烷中，8.0毫升，20.0毫摩尔)。使反应混合物经1小时升温至室温。在真空中除去挥发物。使残留物在EtOAC和水(200毫升，200毫升)之间分配。将分离的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。使残留物从己烷中重结晶以产生白色固体状的所需产物(1.0克，56％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.98-1.00(m，2H)，1.18-1.19(m，2H)，1.39(s，9H)，2.48-2.51(m，1H)，4.19(b，1H)。
步骤3：环丙基磺酰胺的制备
将环丙烷磺酸叔丁基酰胺(110.0克，0.62摩尔)在TFA(500毫升)中的溶液在室温下搅拌16小时。在真空中除去挥发物。使残留物从EtOAC/己烷(60mL/240毫升)中重结晶以产生白色固体状的所需产物(68.5克，91％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.84-0.88(m，2H)，0.95-0.98(m，2H)，2.41-2.58(m，1H)，6.56(b，2H)。
实施例5：
N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的制备
步骤1aN-叔丁基-(3-氯)丙基磺酰胺的制备
如上所示。
步骤1b.N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的制备
将N-叔丁基-(3-氯)丙基磺酰胺(4.3克，20毫摩尔)的溶液溶解在无水THF(100毫升)中并冷却至-78℃。向该溶液中缓慢加入n-BuLi(17.6毫升，44毫摩尔，2.5M在己烷中)。移除干冰浴并使反应混合物经1.5小时升温至室温。然后将该混合物冷却至-78℃，并加入n-BuLi溶液(20毫摩尔，8毫升，2.5M在己烷中)。将反应混合物升温至室温，经2小时再冷却至-78℃，并加入甲基碘的纯溶液(5.68克，40毫摩尔)。将反应混合物升温至室温过夜，在室温下用饱和NH4Cl(100毫升)猝灭。将其用EtOAc(100毫升)萃取。有机相用盐水(100毫升)洗涤，干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生黄色油，使其从己烷中结晶以产生浅黄色固体状的产物(3.1克，81％)：1H NMR(CDCl3)δ0.79(m，2H)，1.36(s，9H)，1.52(m，2H)，1.62(s，3H)，4.10(bs，1H)。
步骤1c：1-甲基环丙基磺酰胺的制备
将N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的溶液(1.91克，10毫摩尔)溶解在TFA(30毫升)中，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。在真空中除去溶剂以产生黄色油，使其从EtOAc/己烷(1∶4，40毫升)中结晶以产生白色固体状的1-甲基环丙基磺酰胺(1.25克，96％)：1HNMR(CDCl3)δ0.84(m，2H)，1.41(m，2H)，1.58(s，3H)，4.65(bs，2H)。C4H9NO2S的分析计算值：C，35.54；H，6.71；N，10.36。实测值：C，35.67；H，6.80；N，10.40。
实施例6：
1-苄基环丙基磺酰胺的制备
步骤1b：N-叔丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺的制备
使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的程序以60％收率获得该化合物，只是使用1.05当量的苄基溴，随后用己烷中的10％EtOAc研制：1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，2H)，1.36(m，2H)，1.43(s，9H)，3.25(s，2H)，4.62(bs，1H)，7.29-7.36(m，5H)。
步骤1c：1-苄基环丙基磺酰胺的制备
使用合成1-甲基环丙基磺酰胺所述的程序由N-叔丁基(1-苄基)环丙基磺酰胺以66％收率获得该化合物1-苄基环丙基磺酰胺，随后从最少量的在己烷中的10％EtOAc中重结晶：1H NMR(CDCl3)δ0.90(m，2H)，1.42(m，2H)，3.25(s，2H)，4.05(s，2H)，7.29(m，3H)，7.34(m，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.1，36.8，41.9，127.4，128.8，129.9，136.5。
实施例7：
1-丙基环丙基磺酰胺的制备
步骤1b：N-叔丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺的制备
使用制备1-甲基环丙基磺酰胺所述的方法制备该化合物，只是在该方法的第二步骤中采用丙基卤代替甲基碘。
实施例8：
N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺的制备
根据N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成中所述的程序以97％收率获得该化合物N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺，只是使用1.25当量的烯丙基溴作为亲电体。该化合物不经提纯直接用于后续反应：1H NMR(CDCl3)δ0.83(m，2H)，1.34(s，9H)，1.37(m，2H)，2.64(d，J＝7.3Hz，2H)，4.25(bs，1H)，5.07-5.10(m，2H)，6.70-6.85(m，1H)。
1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备
根据1-甲基环丙基磺酰胺的合成中所述的程序由N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺以40％收率获得该化合物1-烯丙基环丙基磺酰胺。该化合物通过在SiO2上的柱色谱法使用在CH2Cl2中的2％MeOH作为洗脱剂提纯：1H NMR(CDCl3)δ0.88(m，2H)，1.37(m，2H)，2.66(d，J＝7.0Hz，2H)，4.80(s，2H)，5.16(m，2H)，5.82(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.2，35.6，40.7，119.0，133.6。
实施例9：
N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺的制备
使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的程序以84％收率获得该化合物，只是使用1.30当量的环己酮，然后从最少量的在己烷中的20％EtOAc中重结晶：1H NMR(CDCl3)δ1.05(m，4H)，1.26(m，2H)，1.37(s，9H)，1.57-1.59(m，6H)，1.97(m，2H)，2.87(bs，1H)，4.55(bs，1H)。
实施例10：
1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺的制备
由N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺以85％收率获得该化合物1-(1-环己烯基)-环丙基磺酰胺。1H NMR(DMSO-d6)δ0.82(m，2H)，1.28(m，2H)，1.51(m，2H)，1.55(m，2H)，2.01(s，2H)，2.16(s，2H)，5.89(s，1H)，6.46(s，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ11.6，21.5，22.3，25.0，27.2，46.9，131.6，132.2；LR-MS(ESI)：200(M+-1)。
实施例11：
N-叔丁基-(1-苯甲酰基)环丙基-磺酰胺的制备
使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的程序以66％收率获得该化合物，只是使用1.2当量的苯甲酸甲酯作为亲电体。该化合物通过在SiO2上的柱色谱法使用在己烷中的30％至100％CH2Cl2提纯：1H NMR(CDCl3)δ1.31(s，9H)，1.52(m，2H)，1.81(m，2H)，4.16(bs，1H)，7.46(m，2H)，7.57(m，1H)，8.05(d，J＝8.5Hz，2H)。
1-苯甲酰基环丙基磺酰胺的制备
使用合成1-甲基环丙基磺酰胺所述的程序由N-叔丁基(1-苯甲酰基)环丙基磺酰胺以87％收率获得该化合物1-苯甲酰基环丙基-磺酰胺，然后从最少量的在己烷中的EtOAc中重结晶：1H NMR(DMSO-d6)δ1.39(m，2H)，1.61(m，2H)，7.22(s，2H)，7.53(t，J＝7.6Hz，2H)，7.65(t，J＝7.6Hz，1H)，8.06(d，J＝8.2Hz，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ12.3，48.4，128.1，130.0，133.4，135.3，192.0。
实施例12：
N-叔丁基-(1-苯基氨基羧基)-环丙基磺酰胺的制备
使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的程序，使用1当量苯基异氰酸酯以42％收率获得该化合物，然后从最少量的在己烷中的EtOAc中重结晶。1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，1.67-1.71(m，4H)，4.30(bs，1H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(t，J＝7.5Hz，2H)，7.53(t，J＝7.5Hz，2H)。
实施例13：
制备环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯，C1-取代的环丙基磺酰胺制
备中的关键中间体
步骤1：3-氯丙基磺酰胺的制备
将3-氯丙烷磺酰氯(55克，310.7毫摩尔)的溶液溶解在THF(200毫升)中并经30分钟逐滴添加到冷却至0℃的NH4OH(200毫升)溶液中。将反应混合物升温至室温，搅拌1小时，并用二氯甲烷(4x500毫升)分配水层多次。将合并的二氯甲烷层用1N HCl(150毫升)、水(150毫升)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。使粗固体从最少量的在己烷中的二氯甲烷中重结晶以提供白色固体状的3-氯丙基磺酰胺(45.3克，93％)。1H NMR(CDCl3)δ2.34(m，2H)，3.32(t，J＝7.3Hz，2H)，3.70(t，J＝6.2Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ27.10，42.63，52.57。
步骤2：3-氯丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的制备
向冷却至0℃的3-氯丙基磺酰胺(30.2克，191.5毫摩尔)、三乙胺(30.2毫升，217.0毫摩尔)和4-DMAP(2.40g，19.6毫摩尔)在二氯甲烷(350毫升)中的溶液中经30分钟缓慢地逐滴加入二碳酸二叔丁酯(47.2g，216.9毫摩尔)在二氯甲烷(250毫升)中的溶液。使反应混合物升温至室温，再搅拌3小时并用1N HCl(300毫升)、水(300毫升)、盐水(300毫升)分配，经MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩以提供粗产物。将该材料用70毫升在己烷中的5％二氯甲烷研制以提供灰白色固体状的3-氯丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯(47.2克，96％)：1H NMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，2.33(m，2H)，3.60(t，J＝7.3Hz，2H)，3.68(t，J＝6.21Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)δ26.50，27.95，42.37，50.40，84.76，149.53。
步骤3：环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的制备
将正丁基锂的溶液(74.7毫升，119.5毫摩尔，1.6M在己烷中)溶解在无水THF(105毫升)中并在氩气氛下冷却至-78℃。经20-30分钟向该溶液中逐滴加入3-氯丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯(14克，54.3毫摩尔)在无水THF(105毫升)中的溶液。移除干冰浴并使反应混合物经2小时升温至室温。将反应混合物用冰醋酸(3.4毫升)猝灭，真空浓度并在二氯甲烷(100毫升)和水(100毫升)之间分配。有机相用盐水(100毫升)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，并真空浓缩以提供蜡质灰白色固体状的环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯(12.08克，100％)：1H NMR(CDCl3)δ1.10(m，2H)，1.34(m，2H)，1.50(s，9H)，2.88(m，1H)，7.43(s，1H)。13C NMR(CDCl3)δ6.21，28.00，31.13，84.07，149.82。
实施例14：
1-甲氧基-甲基环丙基-磺酰胺的制备
步骤1：1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的制备
向冷却至-78℃的溶解在THF(30毫升)中的环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯(1.0克，4.5毫摩尔)的溶液中加入正丁基锂(6.4毫升，10.2毫摩尔，1.6M在己烷中)，并将反应混合物搅拌1小时。向该溶液中加入氯甲基甲醚(0.40毫升，5.24毫摩尔)的净溶液，并使该混合物缓慢升温至室温过夜。使用1N HCl水溶液将该溶液pH值调节至3，然后用乙酸乙酯(4x50毫升，分份)萃取。将合并的萃取物干燥(MgSO4)，过滤，并浓缩提供蜡质固体状的1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯(1.20克，100％)，其不经进一步提纯直接进入下一反应：1H NMR(CDCl3)δ1.03(m，2H)，1.52(s，9H)，1.66(m，2H)，3.38(s，3H)，3.68(s，2H)，7.54(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.37，28.29，40.38，58.94，73.43，83.61，149.57。
步骤2：1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的制备
将1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的溶液(1.14克，4.30毫摩尔)溶解在50％TFA/二氯甲烷溶液(30毫升)中并在室温下搅拌16小时。在真空中除去溶剂并将残留物在80克SiO2上色谱分离(用0％至60％乙酸乙酯/己烷洗脱成白色固体状的1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺(0.55克，经2步骤总体为77％)：1H NMR(CDCl3)δ0.95(m，2H)，1.44(m，2H)，3.36(s，3H)，3.65(s，2H)，4.85(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.17，40.87，59.23，74.80；LRMS m/z 183(M++NH4)。
实施例15：
1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备
步骤1：1-环丙基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的制备
根据在1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的合成中所述的程序，只是使用1.10当量的环丙基甲基溴作为亲电体，以92％收率获得1-环丙基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯。该化合物不经提纯直接进入下一反应：1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备
根据合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺所述的程序，由1-环丙基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯以65％收率获得该化合物。该化合物通过在SiO2上的柱色谱法使用在己烷中的0％至60％乙酸乙酯作为洗脱剂提纯：1H NMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
实施例16：
1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
步骤1：1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔丁酯的制备
根据合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯所述的程序，只是使用1.10当量的异氰酸正丙酯作为亲电体，以100％粗制收率获得该化合物。该化合物不经提纯直接进入下一反应：1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
根据合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺所述的程序由1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔丁酯以优化的50％收率获得该化合物，只是不使用色谱法，因为该材料从最少量的二氯甲烷/己烷中重结晶：1HNMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
实施例17
1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
步骤1：1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲
酸叔丁酯的制备
根据合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺氨基甲酸叔丁酯所述的程序，只是使用1.20当量的3，5-二甲基异噁唑-4-异氰酸酯作为亲电体，以100％粗制收率获得该化合物。该化合物不经提纯直接进入下一反应。
步骤2：1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
由1.62克(4.52毫摩尔)的1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔丁酯，使用30毫升(120毫摩尔)的4N HCl/二氧杂环己烷，搅拌过夜，浓缩并在Biotage 40M柱上色谱分离(用0％至5％甲醇/二氯甲烷洗脱)，以50％收率(580毫克)获得该化合物：1H NMR(甲醇-d4)δ1.57(m，2H)，1.61(m 2H)，2.15(s，3H)，2.30(s，3H)，4.84(s，3H)；13C NMR(甲醇-d4)δ9.65，10.94，15.01，46.11，114.82，159.45，165.55，168.15；LRMS m/z 260(M++H)。
实施例18：
由环丁基溴制备环丁基磺酰胺
向冷却至-78℃的5.0克(37.0毫摩尔)环丁基溴在30毫升无水二乙醚(Et2O)中的溶液中加入44毫升(74.8毫摩尔)在戊烷中的1.7M叔丁基锂并将该溶液经1.5小时缓慢升温至-35℃。将该混合物缓慢经套管添加到冷却至-40℃的5.0克(37.0毫摩尔)新鲜馏出的硫酰氯在100毫升己烷中的溶液中，经1小时升温至0℃，并仔细真空浓缩。将该混合物再溶于Et2O，用一些冰冷水洗涤一次，干燥(MgSO4)并仔细浓缩。将该混合物再溶于20毫升THF，逐滴添加到500毫升在THF中的饱和NH3并使其搅拌过夜。将该混合物真空浓缩成粗制黄色固体，并用1-2滴MeOH从最少量的在己烷中的CH2Cl2中重结晶以提供1.90克(38％)白色固体状的环丁基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.95-2.06(m，2H)，2.30-2.54(m，4H)，3.86(p，J＝8Hz，1H)，4.75(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ16.43，23.93，56.29。HRMS m/z(M-H)-C4H8NSO2的计算值：134.0276，实测值134.0282。
实施例19：
环戊基磺酰胺的制备
将18.5毫升(37.0毫摩尔)2M环戊基-氯化镁在醚中的溶液逐滴添加到冷却至-78℃的3.0毫升(37.0毫摩尔)新鲜馏出的硫酰氯(获自Aldrich)在100毫升己烷中的溶液中。将该混合物经1小时升温至0℃，然后仔细真空浓缩。将该混合物再溶于Et2O(200毫升)，用一些冰冷水(200毫升)洗涤一次，干燥(MgSO4)并仔细浓缩。将该混合物再溶于35毫升THF，逐滴添加到500毫升在THF中的饱和NH3中并使其搅拌过夜。将该混合物真空浓缩成粗制黄色固体，使用70％EtOAc-己烷作为洗脱剂，将残留物经50克硅胶过滤，然后浓缩溶液。残留物用1-2滴MeOH从最少量的在己烷中的CH2Cl2中重结晶以提供2.49克(41％)白色固体状的环戊基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.58-1.72(m，2H)，1.74-1.88(m，2H)，1.94-2.14(m，4H)，3.48-3.59(m，1H)，4.80(bs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.90，28.33，63.54；MS m/e 148(M-H)-。
实施例20：
环己基磺酰胺的制备
将18.5毫升(37.0毫摩尔)2M环己基氯化镁(TCI Americas)在醚中的溶液逐滴添加到冷却至-78℃的3.0毫升(37.0毫摩尔)新鲜馏出的硫酰氯在100毫升己烷中的溶液中。将该混合物经1小时升温至0℃，然后仔细地真空浓缩。将该混合物再溶于Et2O(200毫升)，用一些冰冷水(200毫升)洗涤一次，干燥(MgSO4)并仔细浓缩。将该混合物再溶于35毫升THF，逐滴添加到500毫升在THF中的饱和NH3中并使其搅拌过夜。将该混合物真空浓缩成粗制黄色固体，使用70％EtOAc-己烷作为洗脱剂，将残留物经50克硅胶过滤，并浓缩。残留物用1-2滴MeOH从最少量的在己烷中的CH2Cl2中重结晶以提供1.66克(30％)白色固体状的环己基-磺酰胺：1H NMR(CDCl3)δ1.11-1.37(m，3H)，1.43-1.56(m，2H)，1.67-1.76(m，1H)，1.86-1.96(m，2H)，2.18-2.28(m，2H)，2.91(tt，J＝12，3.5Hz，1H)，4.70(bs，2H)；13CNMR(CDCl3)δ25.04，25.04，26.56，62.74；MS m/e 162(M-1)-。
实施例21：
新戊基磺酰胺的制备
根据制备环己基磺酰胺的程序，将49毫升(37毫摩尔)在二乙醚中的0.75M新戊基氯化镁(Alfa)转化成1.52克(27％)白色固体状的新戊基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.17(s，9H)，3.12(s，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ29.46，31.51，67.38；MS m/e 150(M-1)-。
实施例22：
环丁基甲基(carbinyl)磺酰胺的制备
将12.3克(83毫摩尔)环丁基甲基溴(Aldrich)和13.7克(91毫摩尔)碘化钠在150毫升丙酮中的溶液回流过夜，然后冷却至室温。滤出无机固体并分别在环境压力和150torr下在80℃下馏出丙酮和环丙基甲基碘(8.41克，46％)。
将冷却至-78℃的4.0克(21.98毫摩尔)环丁基甲基碘在30毫升无水二乙醚(二乙醚)中的溶液经套管添加到17毫升(21.98毫摩尔)1.3M仲丁基锂在环己烷中的溶液中并将该溶液搅拌5分钟。经套管向该混合物中加入冷却至-78℃的3.0克(21.98毫摩尔)新鲜馏出的硫酰氯在110毫升己烷中的溶液，将该混合物经1小时升温至室温。然后仔细地真空浓缩。将该混合物再溶于二乙醚，用一些冰冷水洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，并仔细浓缩。将该混合物再溶于30毫升THF，逐滴添加到500毫升在THF中的饱和NH3中并使其搅拌过夜。将该混合物真空浓缩成粗制黄色固体并用1-2滴甲醇从最少量的在己烷中的二氯甲烷中重结晶以提供1.39克(42％)白色固体状的环丁基甲基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.81-2.03(m，4H)，2.14-2.28(m，2H)，2.81-2.92(m，1H)，3.22(d，J＝7Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ19.10，28.21，30.64，60.93；MS m/e 148(M-1)-。
实施例23：
环丙基甲基磺酰胺的制备
使用用于制备环丁基甲基磺酰胺所采用的程序，由环丙基甲基溴(Aldrich)制备环丙基甲基磺酰胺(也参见JACS 1981，442-445页)。1H NMR(CDCl3)δ0.39-0.44(m，2H)，0.67-0.76(m，2H)，1.13-1.27(m，1H)，3.03(d，J＝7.3Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.33，5.61，59.93；MS m/e 134(M-1)。
实施例24：
环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺HCl盐的
制备
步骤1：1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸的制备
向1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(3.28克，13.2毫摩尔)在THF(7毫升)和甲醇(7毫升)中的溶液中加入LiOH(1.27克，53.0毫摩尔)在水(14毫升)中的悬浮液。将该混合物在室温下搅拌过夜并用1N NaOH(15毫升)和水(20毫升)猝灭。将所得混合物用乙酸乙酯(20毫升)洗涤，并将有机相用20毫升0.5NNaOH萃取。将合并的水相用1N HCl酸化至pH 4并用乙酸乙酯(3x40mL)萃取。合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩产生白色固体状的标题化合物(2.62克，87％)。1H NMR：(DMSO-d6)δ1.22-1.26(m，1H)，1.37(s，9H)，1.50-1.52(m，1H)，2.05(q，J＝9Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，5.22(d，J＝17Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，7.18，7.53(s，NH(旋转异构体)，12.4(br s，1H))；MS m/z 228(M++H)。
步骤2：环丙烷磺酸(1-(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷
羰基)-酰胺的制备
将步骤1的产物(2.62克，11.5毫摩尔)和CDI(2.43克，15.0毫摩尔)在THF(40毫升)中的溶液在氮气下回流加热50分钟。将该溶液冷却至室温并用套管转移到环丙基磺酰胺(1.82克，15.0毫摩尔)在THF(10毫升)中的溶液中。向所得溶液中加入DBU(2.40毫升，16.1毫摩尔)并继续搅拌20小时。将该混合物用1N HCl猝灭至pH 1并将THF真空浓缩。用乙酸乙酯(2x50毫升)萃取该悬浮液并将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过从己烷-乙酸乙酯(1∶1)中重结晶来提纯，提供白色固体状的标题化合物(2.4克)。通过Biotage 40S柱(洗脱剂：在二氯甲烷中的9％丙酮)提纯母液以产生第二批标题化合物(1.1克)。合并这两批(总收率92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ0.96-1.10(m，4H)，1.22(dd，J＝5.5，9.5Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.70(t，J＝5.5Hz，1H)，2.19-2.24(m，1H)，2.90(m，1H)，5.08(d，J＝10Hz，1H)，5.23(d，J＝17Hz，1H)，5.45(m，1H)，6.85，7.22(s，NH(旋转异构体)；MS m/z 331(M++H)。
步骤3：环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺
HCl盐的制备
将步骤2的产物(3.5克，10.6毫摩尔)在二氯甲烷(35毫升)和TFA(32毫升)中的溶液在室温下搅拌1.5小时。在真空中除去挥发物并将残留物悬浮在二乙醚中的1N HCl(20毫升)中并真空浓缩。该程序重复一次。将所得混合物从戊烷中研制并过滤产生吸湿性的灰白色固体状的标题化合物(2.60克，92％)。1H NMR：(DMSO-d6)δ1.01-1.15(m，4H)，1.69-1.73(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.38(q，J＝9Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，5.20(d，J＝11Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.52-5.59(m，1H)，9.17(br s，3H)；MS m/z 231(M++H)。
实施例25：
(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二
氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-4-羧酸的制备
实施例25
步骤1：1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯
烷-2(S)-羧酸甲酯的制备
将2(S)-叔丁氧基羰基氨基-8-壬烯酸(购自RSP Amino Acids)(3.5克，12.9毫摩尔)在200毫升DCM中的溶液相继用4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯盐酸盐(2.15克，11.8毫摩尔)、N-甲基吗啉(4.25毫升，38.6毫摩尔)和HATU(5.37克，14.1毫摩尔)处理。该反应混合物在N2下在室温下搅拌3天，然后真空浓缩。将残留物在乙酸乙酯和pH 4缓冲液(苯二甲酸氢盐(biphthalate))之间分配。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生粗产物。快速色谱法(50％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)产生4.7克(～100％)无色油状的1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯：1H NMR(500MHz，CD3OD)δ1.33-1.50(m，8H)，1.46(s，9H)，1.57(m，1H)，1.72(m，1H)2.08(m，2H)，2.28(m，1H)，3.72(s，3H，)3.75-3.87(m，2H)，4.36(m，1H)，4.51(bs，1H)，4.57(t，J＝8.2Hz，1H)，4.95(d，J＝10.4Hz，1H)，5.01(m，1H)，5.83(m，1H)；MS m/z 399(M++1)。
步骤2：1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-
吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯的制备
将1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯(4.7克，11.8毫摩尔)溶解在THF(80毫升)、甲醇(20毫升)和水(40毫升)中。加入粉状氢氧化锂(5.6克，233毫摩尔)。将该浅黄色浆料在N2下在室温下搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物在醚与水之间分配。弃置醚相，并用1N HCl处理水相直至pH为4。用EtOAc(3x)萃取该酸性溶液。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)并真空浓缩以产生4.36克(96％)白色固体状的1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-8-壬烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸。随后将该酸溶解在150毫升DMF中并加入(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(2.61克，13.6毫摩尔)、N-甲基吗啉(2.5毫升，22.6毫摩尔)和HATU(5.2克，13.7毫摩尔)。将反应混合物在N2下在室温下搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物在乙酸乙酯和pH 4缓冲液(苯二甲酸氢盐)之间分配。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生粗产物。快速色谱法(60％-80％乙酸乙酯/己烷)产生6.0克(98％)白色固体状的1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯：1H NMR(500MHz，CD3OD)δ1.25(t，J＝7.2Hz，3H)，1.33-1.80(m，10H)，1.46(s，9H)，2.09(m，3H)，2.25(m，2H)，3.76(m，2H)，4.14(m，2H)，4.27(dd，J＝8.5，5.2Hz，1H)，4.50(m，2H)，4.94(d，J＝10.1Hz，1H)，5.01(dd，J＝17.1，1.8Hz，1H)，5.11(dd，J＝10.4，1.8Hz，1H)，5.30(d，J＝15.6Hz，1H)，5.80(m，2H)，8.57(s，1H)；MS m/z 522(M++1)。
步骤3：(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟
基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-4-羧酸乙酯的
制备
将1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基-氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基环丙烷-羧酸乙酯(800毫克，1.53毫摩尔)在2升二氯甲烷中的溶液用N2吹扫0.5小时。然后加入三环己基膦[1，3-双(2，4，6-三甲基-苯基)-4，5-二氢咪唑-2-亚基][亚苄基]-二氯化钌(IV)(Strem)(64毫克，0.075毫摩尔)并将该混合物用N2再吹扫10分钟。将该浅橙色均匀溶液回流2小时以产生深橙色溶液。将反应混合物冷却至室温并真空浓缩产生橙色油。快速色谱法(乙酸乙酯)产生460毫克(61％)灰色固体状的(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.19(t，J＝7.2Hz，3H)，1.42(s，9H)，1.22-1.8(m，8H)，1.87(m，2H)，2.03-2.22(m，4H)，2.63(m，1H)，3.65(m，1H)，4.09(m，3H)，4.45(m，1H)，4.56(s，1H)，4.82(m，1H)，5.23(m，1H)，5.51(s，1H)，7.16(s，1H)；MS m/z 494(M++1)。
步骤4：(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基
-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.0
4，6
]-十九-7-烯-4-羧酸
向(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯(493毫克，1.0毫摩尔)在THF(4毫升)、甲醇(1毫升)和水(2毫升)中的溶液中加入粉状氢氧化锂(480毫克，20毫摩尔)，并将该浅黄色浆料在N2下在室温下搅拌16小时。然后将该混合物真空浓缩并使残留物在醚与水之间分配。弃置醚相，并用1N HCl处理水相直至pH 4。用EtOAc萃取该酸性溶液3次。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)并真空浓缩以产生460毫克(98％)实施例18，灰色固体状的(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸。1H NMR(500MHz，CD3OD)δppm 1.26(t，J＝7.2Hz，3H)，1.35-1.52(m，15H)，1.57-1.68(m，3H)，1.79(m，1H)，2.04(m，1H)，2.16-2.41(m，3H)，3.80(dd，J＝10.7，4.3Hz，1H)，3.88(m，1H)，4.38(dd，J＝8.9，3.1Hz，1H)，4.55(m，2H)，5.39(t，J＝9.8Hz，1H)，5.58(m，1H)；MS m/z 466(M++1)。
实施例26：
(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三
环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁基酯的制备
步骤1：1-{[1-(2-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4-(叔丁基-二甲
基-硅烷氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
向1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(1.5克，2.87毫摩尔)在10毫升DMF中的混合物中加入咪唑(0.25克，3.67毫摩尔)和叔丁基-二甲基甲硅烷基氯(516毫克，3.44毫摩尔)。将该混合物在室温下搅拌2天。然后将反应混合物真空浓缩并将残留物溶解在乙酸乙酯中。将该溶液用水洗涤，经硫酸镁干燥，并真空浓缩以获得粗制固体。通过快速色谱法提纯(用己烷中的20％乙酸乙酯洗脱)产生1.43克(78％)白色固体状的1-{[1-(2-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ0.10(s，6H)，0.89(s，9H)，1.22(m，3H)，1.31-1.48(m，16H)，1.50-1.75(m，3H)，2.06(m，3H)，2.11-2.33(m，2H)，3.70(m，2H)，4.03-4.19(m，2H)，4.21(m，1H)，4.45(t，J＝7.87Hz，1H)，4.59(m，1H)，4.91(d，J＝9.15Hz，1H)，4.98(d，J＝17.20Hz，1H)，5.08(dd，J＝10.25，1.83Hz，1H)，5.27(dd，J＝17.38，1.65Hz，1H)，5.65-5.87(m，2H)；MS m/z 636(M++1)。
步骤2：14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-
二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-4-羧酸，乙酯的制备
向1-{[1-(2-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(1.63克，2.56毫摩尔)在640毫升二氯甲烷中的溶液中加入215毫克(0.26毫摩尔)三环己基膦[1，3-双(2，4，6-三[亚苄基]二氯化钌(IV)。将该混合物回流加热15分钟。将残留物真空浓缩，然后通过用30％乙酸乙酯/己烷洗脱的快速色谱法提纯。为了进一步将样品脱色，将该粗产物二次色谱分离，用己烷中的50％醚洗脱以产生1.5克(96％)白色固体状的14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯。1H NMR(500MHz，CD3Cl)δ0.06(s，3H)，0.07(s，3H)，0.86(s，9H)，1.18-1.24(m，6H)，1.34-1.64(m，14H)，1.86-1.96(m，3H)，2.02-2.09(m，1H)，2.11-2.17(m，1H)，2.19-2.28(m，1H)，2.57-2.63(m，1H)，3.50-3.54(m，1H)，3.71(dd，J＝10.22，6.26Hz，1H)，4.06-4.17(m，2H)，4.52-4.58(m，2H)，4.75(d，J＝8.55Hz，1H)，5.21(t，J＝9.92Hz，1H)，5.35(d，J＝7.63Hz，1H)，5.45-5.50(m，1H)，6.94(s，1H)；MS m/z 608(M++1)。
步骤3：14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-
二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-4-羧酸的制备
向14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯(1.5g，2.47毫摩尔)在THF(4毫升)、甲醇(1毫升)和水(2毫升)的混合溶剂体系中的溶液中加入粉状一水合氢氧化锂(1.0克，50毫摩尔)。将该浅黄色浆料在室温下在N2下搅拌4小时。然后将该混合物真空浓缩并使残留物在醚与水之间分配。弃置醚相，用1N HCl处理水相直至达到pH 4。用EtOAc(3x)萃取该酸性溶液。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生1.2克(84％)灰白色固体状的14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸。1H NMR(300MHz，CD3OD)0.12(s，6H)，0.89(s，9H)，1.23-1.64(m，17H)，1.70-1.87(m，1H)，1.90-2.49(m，6H)，3.70-3.80(m，1H)，3.83-3.90(m，1H)，4.28-4.36(m，1H)，4.47-4.55(m，1H)，4.65(s，1H)，5.30-5.39(m，1H)，5.53-5.62(m，1H)；MS m/z 580(M++1)。
步骤4：[18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基
-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸
叔丁基酯的制备
将14-叔丁氧基羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(500毫克，0.86毫摩尔)溶解在25毫升THF中并用CDI(180毫克，1.12毫摩尔)处理(注意通过使用烘干的玻璃器皿和保持干燥氮气气氛来防潮)。在将反应混合物回流2小时后，将其冷却至室温并相继用环丙基磺酰胺(135毫克，1.12毫摩尔)和DBU(170毫克，1.12毫摩尔)处理。将反应混合物在室温下搅拌4小时，并通过旋转蒸发除去THF。使残留物在乙酸乙酯与pH 4缓冲液之间分配。将有机相干燥(MgSO4)并真空浓缩以产生粗产物。随后将其通过快速色谱法提纯(用己烷中的33％乙酸乙酯洗脱)以产生300毫克(51％)白色固体状的[18-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸叔丁酯。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1H 0.07(s，3H)，0.08(s，3H)，0.85(s，9H)，0.87-1.49(m，21H)，1.73-1.95(m，3H)，2.08-2.16(m，1H)，2.25-2.36(m，2H)，2.42-2.56(m，1H)，2.85-2.93(m，1H)，3.65-3.74(dd，J＝10.61，3.66Hz，1H)，3.89(d，J＝10.25Hz，1H)，4.34(m，J＝9.70，9.70Hz，1H)，4.43(t，J＝7.87Hz，1H)，4.57(s，1H)，4.94-5.01(m，1H)，5.10(d，J＝8.78Hz，1H)，5.66-5.75(m，1H)，6.55(s，1H)，10.13(s，1H)；MS m/z 683(M++1)。
步骤5：(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二
氮杂-三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁酯的制备
向[18-(叔丁基-二甲基硅烷氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸叔丁酯(330毫克，0.48毫摩尔)在25毫升THF中的混合物中加入氟化四丁铵(150毫克，0.54毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌18小时，然后通过旋转蒸发除去THF。使残留物在乙酸乙酯与水之间分配。将有机相干燥(MgSO4)并真空浓缩以产生粗产物。然后将其通过用己烷研制来提纯产生200毫克(73％)白色固体状的(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁酯，实施例19。1H NMR(500MHz，CD3Cl)δ1.87-1.64(m，21H)，1.70-1.98(m，3H)，2.15-2.56(m，5H)，2.85-2.94(m，1H)，3.71(d，J＝13.91Hz，1H)，4.10-4.26(m，2H)，4.51(t，J＝7.87Hz，1H)，4.62(s，1H)，4.98(m，1H)，5.06(d，J＝8.78Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，6.72(s，1H)，10.24(s，1H)；MS m/z 569(M++1)。
使用实施例25和26中所述的程序制备下列大环醇中间体A和B：
可以使用本文中对实施例25和26描述和引用的化学法制备下列大环醇中间体C、D、E、F：
实施例27：
实施例27，2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-戊-4-烯基硫烷基丙酸的制
备
步骤1：在室温下向N-Boc-半胱氨酸甲酯(3.36克，0.014摩尔)在甲醇(166毫升)中的溶液中加入三乙胺(10.8毫升)和1-溴戊-4-烯(3.19克，21毫摩尔，1.5当量)并将所得溶液在室温下搅拌过夜。然后将该混合物真空浓缩并将所得残留混合物使用快速色谱法(己烷，乙酸乙酯梯度)提纯以提供1.76克(41％)所需硫醚。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.43(s，9H)，1.64(m，2H)，2.11(m，2H)，2.51(m，2H)，2.95(m，2H)，3.75(s，3H)，4.51(m，1H)，4.95-5.03(m，2H)，5.34(m，1H)，5.80(1H，m)；MS m/z 304(M++1)。
步骤2：将步骤1(9.51克，31.4毫摩尔)的硫醚产物添加到1MLiOH在水(200mL)和THF(200mL)中的混合物中，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物使用1N盐酸酸化并将所得混合物用乙酸乙酯萃取数次。合并萃取物，经硫酸镁干燥并真空浓缩以提供所需酸，实施例27，其就这样用于下一反应。
实施例28
实施例28，N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸的制备
实施例28
步骤1：N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸，甲酯的制
备
在室温下向7.12克(48毫摩尔，1.0当量)L-青霉胺在100毫升1，4-二氧杂环己烷和25毫升水中的溶液中加入9.60毫升(96毫摩尔，2.0当量)的10N氢氧化钠水溶液，然后经数分钟逐滴加入12.00毫升(101毫摩尔，2.1当量)5-溴-1-戊烯。将所得混合物在室温下搅拌68小时。此时，加入12.50克(57毫摩尔，1.2当量)二碳酸二叔丁酯并将该混合物在室温下再搅拌6小时。将该混合物在真空下浓缩，并将残留物溶解在水中。将含水混合物用二乙醚洗涤，使用1N盐酸调节至pH 3，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩。
将粗产物(12.20克)溶解在120毫升无水二甲基亚砜中。向该溶液中加入10.50克(76毫摩尔)碳酸钾和4.70毫升(76毫摩尔)碘甲烷，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的萃取物用水(2X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。在硅胶上的柱色谱法(洗脱：2-10％乙酸乙酯/己烷)提供8.54克无色油状的N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸，甲酯。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.76(d of dof t，1H，J＝17.2，10.3，6.6Hz)，5.35(br d，1H，J＝9.0Hz)，5.05-4.94(m，2H)，4.27(br d，1H，J＝9.0Hz)，3.73(s，3H)，2.52(m，2H)，2.13(四重，2H，J＝7.3Hz)，1.61(五重，2H，J＝7.3Hz)，1.43(s，9H)，1.35(s，3H)，1.33(s，3H)。
步骤2：实施例28，N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸
的制备
实施例28
在室温下向8.52克(25.7毫摩尔)N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸，甲酯在200毫升四氢呋喃中的溶液中加入1.10克(26.2毫摩尔)一水合氢氧化锂在50毫升水中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌65小时。然后向反应混合物中加入28毫升1.00N盐酸。将该混合物用二乙醚稀释，用水(3X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以提供8.10克无色油状的N-叔丁氧基羰基-3-(4-戊烯基硫代)-L-缬氨酸。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.75(d of d oft，1H，J＝17.2，10.3，6.6Hz)，5.40(br s，1H)，5.05-4.94(m，2H)，4.28(br s，1H)，2.56(m，2H)，2.13(四重，2H，J＝7.3Hz)，1.63(五重，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)，1.39(s，3H)，1.37(s，3H)。
实施例29：
实施例29，5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸的制备
步骤1：吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙酯的制备
使用迪安-斯脱克分水器变体将L-焦谷氨酸(Aldrich，25.0克，195毫摩尔)和一水合对甲苯磺酸(3.71克，19.5毫摩尔)的溶液在氮气下在异丙醇(40毫升)中回流6小时(通过装有4
分子筛的索氏(Soxhlet)抽提器送回冷凝物)。冷却至室温后，将反应用水稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液然后饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发产生无色浆料。其通过静置结晶。在己烷中研制结晶残留物提供31.9克(96％)白色棱晶状的吡咯烷-5-酮-2(S)-羧基异丙酯：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ6.35(br s，1H)，5.04(七重1H，J＝6.2Hz)，4.18(dd，1H，J＝8.4，5.3Hz)，2.51-2.28(m，3H)，2.27-2.12(m，1H)，1.24(d，6H，J＝6.2Hz)。LCMS m/z 172(M+H)+。
步骤2：1-(叔丁氧基羰基)-吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙酯的制备
将吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙酯(步骤26A的产物，31.9克，188毫摩尔)、二碳酸二叔丁酯(48.6克，225毫摩尔)和DMAP(2.30克，8.8毫摩尔)在乙腈(300毫升)中的溶液在室温下在N2下搅拌30分钟。将反应蒸发至大约100毫升，用醚稀释，用1N HCl然后饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发产生浅黄色油状的1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-5-酮-2(S)羧酸异丙酯，50.1克(99％)：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.06(七重1H，J＝6.2Hz)，4.53(dd，1H，J＝9.5，2.9Hz)，2.66-2.40(m，2H)，2.36-2.22(m，1H)，2.03-1.93(m，1H)，1.47(s，9H)，1.26(d，3H，J＝6.2Hz)，1.24(d，3H，J＝6.2Hz)。LCMS m/z272(M+H)+。
步骤3：2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙酯的制备
经1.5小时向1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙酯(步骤26B的产物，49.5克，183毫摩尔)在甲醇(300毫升)中的溶液中分份(每份～1克)加入硼氢化钠(10.0克，263毫摩尔)。将该反应在氮气下再搅拌10分钟。将其用水稀释，用醚萃取，将合并的有机级分用饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发产生浅黄色油。快速色谱法(硅胶，20-30％乙酸乙酯/己烷)产生31.8克(64％)无色浆状的2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙酯：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.16(br d，1H，J＝7.3Hz)，5.03(七重，1H，J＝6.2Hz)，4.28(br d，1H，J＝6.2Hz)，3.67(br dd，J＝10.2，5.5Hz)，1.94-1.79(m，2H)，1.76-1.67(m，1H)，1.66-1.56(m，2H)，1.43(s，9H)，1.25(d，3H，J＝6.2Hz)，1.23(d，3H，J＝6.2Hz)。LCMS m/z 276(M+H)+。
步骤4：异丙基-5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸酯的制
备
将2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙酯(步骤26C的产物，17.6克，63.9毫摩尔)、甲基碳酸烯丙酯(24.0毫升，213毫摩尔)、Pd2(dba)3(1.62克，1.78毫摩尔)和BINAP(4.42克，7.10毫摩尔)在THF(150毫升)中的脱气混合物在氮气下回流3小时。在冷却至室温后，将反应物用醚稀释，经C盐过滤并蒸发产生深褐色浆料。残留物的快速色谱法(硅胶，30％醚/己烷)产生粘稠无色油状的5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸异丙酯，16.3克(81％)：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.88(ddt，1H，17.4，10.4，5.5)，5.28(m，1H)，5.22-5.11(m，1H)，5.02(七重，1H，J＝6.2Hz)，4.21(br t，1H，J＝6.7Hz)，3.94(dt，2H，J＝5.9，1.5Hz)，3.42(t，2H，J＝5.9Hz)，1.90-1.82(m，1H)，1.75-1.57(m，3H)，1.42(s，9H)，1.21(d，3H，J＝6.2Hz)，1.19(d，3H，J＝6.2Hz)。LCMS m/z 316(M+H)+。
步骤5：5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸的制备
将5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸异丙酯(步骤26D的产物，16.1克，51.1毫摩尔)和水合氢氧化锂(4.19克，102毫摩尔)在THF/水(100毫升/20毫升)中的混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。将反应物用水稀释，用醚洗涤，将水性级分的pH值调节至～4，用醚萃取，将合并的有机级分用饱和NaCl洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发产生浅黄色浆状的5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸。1HNMR(300MHz，氯仿-D)δ5.89(ddt，1H，J＝17.4，10.4，5.5)，5.25(dd，1H，J＝17.4，1.6Hz)，5.17(dd，1H，J＝10.4，1.6Hz)，4.30(br d，1H，J＝6.2)，3.96(dt，2H，J＝5.9，1.5Hz)，3.46(t，2H，J＝5.9Hz)，1.96-1.86(m，1H)，1.85-1.77(m，1H)，1.75-1.64(m，2H)，1.43(s，9H)。LCMSm/z 274(M+H)+。
实施例30
制备实施例30的一般程序
实施例30
通过将N-三苯甲基保护的苏氨酸的DMF溶液添加到冷却至-15℃的氢化钠的DMF溶液中，制备实施例23。将反应混合物在-15℃下搅拌30分钟，此后加入5-溴-1-戊烯并将所得混合物升温至-5℃。将反应混合物在-5℃下保持3天，此后通过添加1N HCl水溶液，将反应猝灭，并使用如上所述的标准萃取程序后处理。通过标准色谱程序以纯净形式获得实施例23。
实施例31：
实施例31，N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸的制备
实施例31
步骤1：N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸，甲酯的制备
在室温下向10.26克(50毫摩尔，1.0当量)的N-叔丁氧基羰基-L-丝氨酸在500毫升无水二甲基亚砜中的溶液中加入2.00克(50毫摩尔，1.0当量)在矿物油中的60％氢化钠。将该混合物在室温下搅拌0.5小时直至停止气体释放。向所得溶液中加入6.00毫升(50毫摩尔，1.0当量)5-溴-1-戊烯，然后立即加入另外2.00克(50毫摩尔，1.0当量)在矿物油中的60％氢化钠。然后将反应混合物在室温下搅拌16小时。将该混合物用2000毫升水稀释，通过添加50毫升1.00N盐酸来调节至pH 3-4，并用乙酸乙酯萃取。有机相用水(2X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。为了除去残留矿物油，将所得材料溶解在稀氢氧化钠水溶液中。将该水溶液用己烷洗涤，然后使用盐酸调节至pH 4，并用乙酸乙酯萃取。将该萃取物用水(2X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。
将粗产物(7.70克)溶解在100毫升无水二甲基亚砜中。向该溶液中加入7.80克(56毫摩尔)碳酸钾和3.50毫升(56毫摩尔)碘甲烷，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的萃取物用水(2X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。在硅胶上的柱色谱法(洗脱：2-10％乙酸乙酯/己烷)提供了6.70克无色油状的N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸，甲酯。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.78(t的d的d，1H，J＝17.2，10.2，6.6Hz)，5.34(br d，1H，J＝8.0Hz)，5.03-4.92(m，2H)，4.40(m，1H)，3.81(d的d，1H，J＝9.5，2.9Hz)，3.74(s，3H)，3.61(dof d，1H，J＝9.5，3.5Hz)，3.42(m，2H)，2.06(四重，2H，J＝7.3Hz)，1.61(五重，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)。
步骤2：实施例31，N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸的制
备
实施例31
在室温下向6.65克(23毫摩尔)N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸，甲酯在500毫升四氢呋喃中的溶液中加入1.95克(46毫摩尔)一水合氢氧化锂在100毫升水中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌40小时。然后向反应混合物中加入46毫升1.00N盐酸。将该混合物用乙酸乙酯稀释，用水(3X)和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以提供6.30克无色油状的N-叔丁氧基羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.77(t的d的d，1H，J＝17.2，10.2，6.6Hz)，5.37(br d，1H，J＝8.0Hz)，5.03-4.92(m，2H)，4.42(m，1H)，3.87(d的d，1H，J＝9.5，2.6Hz)，3.63(d的d，1H，J＝9.5，4.0Hz)，3.45(t，2H，J＝6.6Hz)，2.07(四重，2H，J＝7.3Hz)，1.64(五重，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)。
实施例32：
(S)-4-烯丙氧基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸的制备
在0℃下向氢化钠(913毫克，22.8毫摩尔)在DMF中的混合物中加入N-t-Boc-L-高丝氨酸(2克，9.13毫摩尔)。将该反应混合物在0℃下搅拌15分钟，然后加入烯丙基溴(1.38克，11.4毫摩尔)。将该混合物升温至室温，并搅拌2小时。然后将其真空浓缩。将残留物用水稀释，并相继用己烷和醚洗涤。弃置有机层并用1N HCl将水层仔细调节至pH 3。用乙酸乙酯萃取该酸性水溶液。将该有机相干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生2.2克(93％)无色油状的(S)-4-烯丙氧基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.42(s，9H)，1.80-1.90(m，1H)，2.04-2.16(m，1H)，3.50-3.54(m，2H)，3.97(d，J＝4.39Hz，2H)，4.23(dd，J＝8.78，4.39Hz，1H)，5.15(d，J＝10.25Hz，1H)，5.26(dd，J＝17.38，1.65Hz，1H)，5.84-5.97(m，1H)。
实施例33：
化合物1
步骤1：14-叔丁氧基羰基氨基-2，15-二氧代-18-(吡啶-2-基氧基)-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸的制备
向3毫升DMSO中的(14-叔丁氧基羰基氨基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(150mg，0.32mmol；在实施例25，步骤4中制备)中加入叔丁醇钾(91mg，0.81mmol)。在室温搅拌该混合物5分钟，然后加入2-氟-吡啶(39mg，0.40mmoL)并将混合物搅拌过夜。通过加入10毫升水将反应猝灭，并随后使用0.1N HCL将pH调节至4。其然后用乙酸乙酯萃取，干燥，并真空浓缩以获得黄色油。通过硅胶上的快速凝胶色谱法提纯该粗产物，用乙酸乙酯中的10％甲醇洗脱以分离出100mg(56％)的白色固体状的14-叔丁氧基羰基氨基-2，15-二氧代-18-(吡啶-2-基氧基)-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸。1H NMR(500MHz，MeOD)δ1.24-1.53(m，6H)，1.36(s，9H)，1.55-1.68(m，3H)，1.73-1.90(m，1H)，2.02-2.11(m，1H)，2.16(q，J＝8.65Hz，1H)，2.35-2.45(m，1H)，2.51(dd，J＝7.63，2.75Hz，2H)，4.06-4.14(m，1H)，4.27(d，J＝11.29Hz，1H)，4.33(s，1H)，4.58(t，J＝7.93Hz，1H)，5.46-5.57(m，2H)，5.70(s，1H)，6.79(d，J＝8.54Hz，1H)，6.93-7.02(m，1H)，7.68(t，J＝7.63Hz，1H)，8.16(d，J＝4.58Hz，1H).LC-MS(YMC Xterra ODS S7微米柱：3.0x50毫米长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B，梯度时间：4分钟，停留时间：1分钟，流速：4毫升/分钟，检测器波长：220nm，溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA，溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA。)(停留时间：2.90分钟)，MS m/z543(M++1)。
步骤2：化合物1的制备
化合物1c
将14-叔丁氧基羰基氨基-2，15-二氧代-18-(吡啶-2-基氧基)-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(100mg，0.18mmol)溶解在5毫升THF中并用羰基二咪唑(39mg，0.24mmol)。(注意通过使用烘干的玻璃器皿和保持干燥N2气氛来防潮)。在将反应混合物回流1小时后，将其冷却至室温并相继用环丙基磺酰胺(29毫克，0.24毫摩尔)和DBU(36毫克，0.24毫摩尔)处理。在室温下搅拌24小时后，通过旋转蒸发除去THF。将残留物溶解在乙酸乙酯和pH4缓冲液之间分配。有机相干燥(MgSO4)，并真空浓缩以产生粗产物。将所得油溶解在甲醇中并用制备HPLC提纯(YMC ODS-A，S5，30x50mm，梯度：40％B至85％B，8min，停留2min，流速25mL/min)以分离出白色固体状的化合物1(30mg，26％)。NMR(500MHz，CDCl3)δ0.89-0.97(m，1H)，1.04-1.17(m，2H)，1.23-1.36(m，6H)，1.33(s，9H)，1.44-1.51(m，3H)，1.57-1.68(m，1H)，1.83-1.96(m，2H)，2.22-2.32(m，1H)，2.45-2.61(m，3H)，2.85-2.95(m，1H)，3.90-4.00(m，1H)，4.26(d，J＝11.29Hz，1H)，4.32(s，1H)，4.56(s，1H)，4.94-5.01(m，1H)，5.15(d，J＝6.41Hz，1H)，5.63-5.77(m，2H)，6.66(d，J＝8.24Hz，1H)，6.72(s，1H)，6.84-6.94(m，1H)，7.56(t，J＝7.78Hz，1H)，8.13(d，J＝4.27Hz，1H)，10.18(s，1H)。LC-MS(YMC Xterra ODS S7微米柱：3.0x50毫米长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B，梯度时间：4分钟，停留时间：1分钟，流速：4毫升/分钟，检测器波长：220nm，溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA，溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA。)(停留时间：3.05分钟)，MSm/z 646(M++1)。
实施例34：
步骤1：14-叔丁氧基羰基氨基-18-(4-硝基苯氧基)-2，15-二氧代
-3，16-二氮杂三环[14.3.0.0
4，6
]十九-7-烯-4-羧酸的制备
向(14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸，乙酯(192毫克，0.39毫摩尔；在实施例25，步骤3中制备)在3毫升THF中的混合物中加入氢化钠(50毫克，在油中60％，1.25毫摩尔)。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入1-氟-4-硝基苯(60毫克，0.42毫摩尔)并在室温下继续搅拌过夜。通过添加10毫升水，将反应猝灭，然后使用0.1N盐酸使pH达到4。然后用乙酸乙酯萃取该酸性溶液。将有机相经硫酸镁干燥并真空浓缩以获得白色固体状的14-叔丁氧基羰基氨基-18-(4-硝基苯氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(100毫克，44％)。LC-MS(YMC Xterra MS C 18S7柱：3.0x50毫米长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B，梯度时间：4分钟，停留时间：1分钟，流速：4毫升/分钟，检测器波长：220nm，溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA，溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA.)(停留时间：3.17分钟)，MS m/z 587(M++1)。
步骤2：化合物2的制备
将14-叔丁氧基羰基氨基-18-(4-硝基苯氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(100毫克，0.17毫摩尔)溶解在5毫升THF中并用羰基二咪唑(38毫克，0.23毫摩尔)处理(注意通过使用烘干的玻璃器皿和保持干燥N2气氛来防潮)。在将反应混合物回流1小时后，将其冷却至室温并相继用环丙基磺酰胺(29毫克，0.24毫摩尔)和DBU(36毫克，0.24毫摩尔)处理。在室温下搅拌24小时后，通过旋转蒸发除去THF。使残留物在乙酸乙酯与pH4缓冲液之间分配。将有机相干燥(MgSO4)并真空浓缩以产生粗产物。快速色谱法(在己烷中的50％乙酸乙酯)产生30毫克(26％)化合物2。LC-MS(YMC Xterra MS C18 S7柱：3.0x50毫米长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B，梯度时间：4分钟，停留时间：1分钟，流速：4毫升/分钟，检测器波长：220nm，溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA，溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA。)(停留时间：3.21分钟)，MS m/z 690(M++1)。
实施例35：
化合物3
化合物3的制备
向(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基)氨基甲酸叔丁酯(20毫克，0.035毫摩尔；在实施例26，步骤5中制备)在DMF(2毫升)中的混合物中加入t-BuOK(20毫克，0.15毫摩尔)和1-氯-6-氟-5-甲氧基异喹啉(15毫克，0.07毫摩尔)。将该反应在室温下搅拌16小时。然后使反应混合物在醚(10毫升)与水(5毫升)之间分配。使用1N HCl将水相酸化至pH 4。用EtOAc(3x20毫升)萃取所得溶液。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)，过滤，并真空浓缩以产生白色固体。将该粗产物通过制备HPLC(YMC Xterra，S5，19x50mm，60％至100％B，梯度15分钟，停留2分钟，流速25毫升/分钟)提纯以产生10毫克(38％)白色粉末状的化合物3：LC-MS(YMC Xterra S7柱：3.0x50毫米长，梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B，梯度时间：3分钟，停留时间：1分钟，流速：4毫升/分钟，检测器波长：220nm，溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA，溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA。)(停留时间：2.53分钟)，MS m/z 760(M++1)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.89-0.97(m，1H)，1.04-1.16(m，3H)，1.20-1.51(m，7H)，1.30(s，9H)，1.54-1.64(m，1H)，1.73-1.96(m，3H)，2.22-2.31(m，1H)，2.47-2.57(m，1H)，2.60-2.67(m，2H)，2.86-2.94(m，1H)，3.97(s，3H)，3.99-4.10(m，1H)，4.31(t，J＝7.63Hz，1H)，4.45(d，J＝11.29Hz，1H)，4.65(t，J＝7.48Hz，1H)，4.97(t，J＝9.46Hz，1H)，5.16(d，J＝7.93Hz，1H)，5.32(s，1H)，5.71(q，J＝8.95Hz，1H)，6.84(s，1H)，7.10(s，1H)，7.53(d，J＝5.80Hz，1H)，7.55(s，1H)，8.22(d，J＝5.49Hz，1H)，10.18(s，1H)。
实施例36：
化合物4
化合物4的制备
向冷却至-78℃的49毫克(0.105毫摩尔)的(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(在实施例25，步骤4中制备)和26毫克(0.106毫摩尔)LaCl3在1.0毫升DMF中的悬浮液中加入0.53毫升(0.53毫摩尔)在THF中的1M KOtBu，然后加入4-氯-8-氟喹啉(19毫克，0.105毫摩尔)。将该混合物搅拌1小时并升温至室温。分析性反相HPLC(方法G)表明没有原材料，而是与在喹啉环的4-Cl处(MS m/z，[M++1]＝611，停留时间2.78分钟，主要组分)和在8-F处(MS m/z，[M++1]＝627，停留时间3.20分钟，次要组分)的置换相符的两种新产物。将其用半饱和的NH4Cl水溶液猝灭并将有机残留物萃取到EtOAc(10mL X 3)中。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)，真空浓缩并溶解在2毫升MeOH中。通过使用下列条件的制备HPLC分离该溶液：柱Xterra 30X100mm S5，30％至100％溶剂B/A，14分钟梯度，停留时间5分钟；其中溶剂A是含0.1％TFA的10％MeOH/90％H2O，溶剂B是含0.1％TFA的90％MeOH/10％H2O且流速是40毫升/分钟)。不从制备HPLC中回收主要组分，而是收集次要组分(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧基羰基氨基-18-(4-氯喹啉-8-基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸并浓缩成白色泡沫(1.9毫克，3％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.02(s，9H)，1.18-1.47(m，6H)，1.48-1.77(m，3H)，1.93(m，1H)，2.22-2.34(m，2H)，2.44(m，1H)，2.56-2.64(m，1H)，2.70-2.78(m，1H)，4.02(m，1H)，4.14(m，1H)，4.54(m，1H)，5.38(m，1H)，5.52-5.62(m，2H)，7.6(d，J＝9Hz，1H)，7.86(t，J＝8Hz，1H)，7.94-8.03(m，2H)，8.9(d，J＝8Hz，1H)。LC-MS m/z 627[M++1]。
分析LCMS条件：3X50mm YMC Xterra，梯度3分钟，流速4毫升/分钟。
实施例37：
化合物5
步骤1：通过实施例25，步骤1的方式，使用5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸(2.77克，10.1毫摩尔；在实施例29，步骤5中制备)和4(R)-苄氧基吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯盐酸盐(2.50克，9.22毫摩尔)制备1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基-吡咯烷-2(S)-羧酸，甲酯，产生无色油状的1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯，4.53克(100％)，MS 491(ES+，M+H+)。
步骤2：使用1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯(2.78克，5.80毫摩尔)，通过实施例25，步骤2的方式，制备1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯，皂化然后与(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(0.989克，6.38毫摩尔)偶联以产生浅黄色稠油状的1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯，3.21克(90％)，MS 614(M+1)。
步骤3：使用1-{[1-(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-壬-8-烯酰基)-4(R)-苄氧基吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(2.71克，4.42毫摩尔)，通过实施例25，步骤3制备(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸，乙酯以产生褐色泡沫状的(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯，1.44克(56％)，MS 586(ES+，M+H+)。
步骤4：使用(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯(1.30克，2.22毫摩尔)，通过实施例25，步骤4制备(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸，以产生白色粉末状的(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸，0.862克(70％)，MS 558(ES+，M+1)。
步骤5：使用(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-14-叔丁氧基羰基氨基-18-苄氧基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸(860毫克，1.51毫摩尔)和环丙基磺酰胺(365毫克，3.02毫摩尔)，通过实施例26，步骤4制备(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-18-苄氧基-14-叔丁氧基羰基氨基-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-10-氧杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯，以产生白色粉末状的(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-18-苄氧基-14-叔丁氧基羰基氨基-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-10-氧杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯，603毫克(61％)。MS 660(ES+，M+H+)，HRMS计算值661.2907，实测值661.2903，mp 147-149℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.83-0.95(m，3H)，1.01-1.16(m，3H)，1.21-1.27(m，2H)，1.38(s，9H)，1.42-1.52(m，2H)，1.87-1.93(m，1H)，1.97-2.04(m，1H)，2.30-2.36(m，1H)，2.59-2.68(q，J＝9Hz 1H)，2.82-2.91(m，1H)，3.57-3.62(dd，J＝9Hz&3Hz，1H)，3.69-3.74(dd，J＝9Hz & 6Hz，1H)，4.19-4.23(d，J＝12Hz，1H)，4.31-4.39(m，2H)，4.43-4.58(m，2H)，5.18-5.25(t，J＝9Hz，2H)，5.68-5.76(m，1H)，6.73(s，1H)，7.25-7.31(m，5H)，10.00(s，1H)。
实施例38：
化合物6
化合物6的制备
使用实施例37，步骤1-5的程序，由4(R)-叔丁氧基吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯盐酸盐制备(1S，4R，6S，14S，18R，7-顺式)-18-叔丁氧基-14-叔丁氧基羰基氨基-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-10-氧杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯；MS 627(ES+，M+H+)，HRMS计算值627.3064，实测值627.3073，1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ5.77-5.72(m，1H)，5.43-5.39(m，1H)，4.58(br s，1H)，4.54-4.49(m，2H)，4.33(m，1H)，3.94(m，1H)，3.83(m，1H)，3.74(m，1H)，3.57-3.48(m，2H)，2.93(m，1H)，2.63(m，1H)，2.25(m，1H)，2.15(m，1H)，1.99(m，1H)，1.76(m，2H)，1.70-1.67(m，1H)，1.58(m，2H)，1.44(s，9H)，1.29(m，1H)，1.25(s，9H)，1.15-1.09(m，2H)，1.04(m，1H)。
实施例39到实施例86描述了中间体的制备。这些中间体可用于使用本文中描述或引用的教导制造式I的化合物。
实施例39：
中间体39的制备：
中间体39
图示1
步骤1：将3，5-二甲基-4-硝基-异噁唑(1.42克，10.0毫摩尔)、苯乙醛(1.32克，11.0毫摩尔)在哌啶(1毫升)和乙醇(10毫升)中的混合物加热至回流16小时。在冷却至环境温度后，通过过滤收集沉淀出的产物。滤饼用冷乙醇充分洗涤以提供1.20克(53％)白色固体状的所需产物。1H NMR(CDCl3)δ2.87(s，3H)，7.46-7.50(m，3H)，7.56(d，J＝8.5Hz，1H)，7.7-7.80(m，2H)；MS m/z 227(M++H)。
步骤2：将3-甲基-5-苯基-异噁唑[4，5-b]吡啶4-氧化物(1.00克，4.40毫摩尔)和POCl3(2.71克，17.7毫摩尔)在氯仿(10毫升)中的溶液加热至回流1小时。冷却至环境温度后，将最终溶液用氯仿(50毫升)稀释并用NaHCO3(水溶液)(两个50毫升份)和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱法(4∶1己烷-EtOAc)提纯以获得790毫克(73％)白色固体状的所需产物。
1H NMR(CDCl3)δ2.72(s，3H)，7.46-7.54(m，3H)，7.91(s，1H)，8.00-8.03(m，2H)；
MS m/z 245，247(M++H)。
中间体39可如下用于制造式I的化合物：
实施例40：
中间体40的制备
中间体40
图示1
步骤1：将2-氨基-6-甲基吡啶(1.08克，10.0毫摩尔)、苯甲酰基乙酸乙酯(2.30克，12.0毫摩尔)和聚磷酸(6.00克，61.2毫摩尔)的混合物加热至1100C 5小时。冷却至环境温度后，将该混合物倒入冰水(20毫升)中并用10M NaOH中和至pH 7。用CHCl3萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，蒸发。残留物通过快速色谱法(1∶1己烷-EtOAc)提纯以提供510毫克(22％)浅黄色固体状的所需产物。1H NMR(CDCl3)δ3.08(s，3H)，6.64(d，J＝7.0Hz，1H)，6.71(s，1H)，7.42-7.52(m，5H)，8.04-8.06(m，2H)；MS m/z 237(M++H)。
步骤2：将6-甲基-2-苯基-吡啶并[1，2a]嘧啶-4-酮(489毫克，2.07毫摩尔)在熔融二苯基醚(5毫升)中的溶液加热至温和回流5小时。冷却至环境温度后，将形成的悬浮液用二乙醚(10毫升)稀释，过滤。滤饼用二乙醚充分洗涤以提供450毫克(92％)棕色固体状的所需产物。MS m/z 237(M++H)。
步骤3：将7-甲基-2-苯基-1H-[1，8]萘啶-4-酮(450毫克，1.91毫摩尔)在POCl3(10毫升)中的悬浮液加热至温和回流3小时，然后在真空中蒸发。将该残留物倒入冰水(20毫升)中并用10M NaOH中和至pH 10。然后将该混合物用CHCl3萃取并用盐水洗涤有机层，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。残留物通过快速色谱法(2∶1己烷-EtOAc)提纯以提供450毫克(92％)粉色固体状的所需产物。1H NMR(CD3OD)δ2.80(s，3H)，7.54-7.56(m，3H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，8.25-8.30(m，3H)，8.58(d，J＝8.4Hz，1H)；MS m/z 255，257(M++H)。
中间体40可用于如下制造式I：
实施例41：
中间体41的制备
中间体41
图示1
步骤1：在0℃下向4-甲氧基苯乙基醇(1.52克，10.0毫摩尔)在CH2Cl2(50毫升)中的溶液中一次性加入戴斯-马丁试剂(4.45克，10.5毫摩尔)。使形成的混合物升温至环境温度1小时。分别用饱和Na2S2O3(水溶液)和1M NaOH、盐水洗涤。经MgSO4干燥，在真空中蒸发以产生1.50克(100％)粘性油状的所需醛。该产物不经进一步提纯以粗产物形式使用。
步骤2：将3，5-二甲基-4-硝基-异噁唑(142毫克，1.0毫摩尔)、来自实施例3，步骤1的4-甲氧基-苯乙醛(180毫克，1.1毫摩尔)在哌啶(0.1毫升)和乙醇(2毫升)中的溶液加热至回流12小时。冷却至环境温度后，通过过滤收集沉淀出的产物。滤饼用冷乙醇充分洗涤以提供130毫克(51％)浅灰色固体状的所需产物。
1H NMR(CDCl3)δ2.88(s，3H)，3.87(s，3H)，7.02(d，J＝8.5Hz，2H)，7.50(d，J＝9.0Hz，1H)，7.57(d，J＝9.0Hz，1H)，7.81(d，J＝8.5Hz，2H)；MS m/z 257(M++H)。
步骤3：通过与实施例39，步骤2中所述相同的程序制备该产物。1H NMR(CDCl3)δ2.70(s，3H)，3.87(s，3H)，7.00-7.03(m，2H)，7.84(s，1H)，7.96-7.98(m，2H)；MS m/z 275，277(M++H)。
中间体41可如下用于制造式I的化合物：
实施例42：
中间体42的制备
中间体42
图示1
步骤1 & 2：
通过实施例41，步骤1 & 2中所述的相同程序制备该产物，只是代替性地使用4-氟苯乙基醇。MS m/z 245(M++H)。
步骤3：
通过与实施例39的步骤2中所述相同的程序制备该产物。
1H NMR(CDCl3)δ2.71(s，3H)，7.17-7.20(m，2H)，7.86(s，1H)，8.00-8.02(m，2H)；MS m/z 263，265(M++H)。
中间体42可用于如下制造式I的化合物：
实施例43：
中间体43的制备
中间体43
图示1
步骤1 & 2：
通过与实施例41，步骤1 & 2中所述相同的程序制备该产物，只是使用3-甲氧基-苯乙基醇作为原材料。MS m/z 257(M++H)。
步骤3：
通过与实施例39步骤2中所述相同的程序制备该产物。1H NMR(CDCl3)δ2.72(s，3H)，3.90(s，3H)，7.00-7.02(m，1H)，7.41(t，J＝8.0Hz，1H)，7.55(d，J＝7.5Hz，1H)，7.59(d，J＝2.0Hz，1H)，7.89(s，1H)；MS m/z275，277(M++H)。
中间体43可如下用于制造式I的化合物：
实施例44
中间体44的制备
中间体44
图示1
步骤1 & 2：
通过与实施例41，步骤1 & 2中所述相同的程序制备该产物，只是使用2-甲氧基-苯乙基醇作为原材料。MS m/z 257(M++H)。
步骤3：
通过与实施例39，步骤2中所述相同的程序制备该产物。
1H NMR(CDCl3)δ2.721(s，3H)，3.88(s，3H)，7.03(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11(t，J＝7.5Hz，1H)，7.41-7.44(m，1H)，7.79-7.81(m，1H)，8.04(s，1H)；MS m/z 275，277(M++H)。
中间体44可如下用于制造式I的化合物：
实施例45：
中间体45的制备
中间体45
中间体45可购得。
中间体45可如下用于制造式I的化合物：
实施例46：
中间体46的制备
中间体46
如P.Ferrarini等人在J Heterocyclic Chem，1983，第1053页中所述制备中间体46。
中间体46可如下用于制造式I的化合物：
实施例47：
中间体47的制备
中间体47
如R.Nesi等人，Synth Comm.1992，22(16)，2349所述制备中间体47。
中间体47可如下用于制造式I的化合物：
实施例48：
中间体48的制备
中间体48
图示1
步骤1：在中压烧瓶(Chemglass)中向2-溴-5-甲氧基苯甲酸(1.68克，7.27毫摩尔)在DMF(50毫升)中的溶液中加入苄脒(1.25克，8.00毫摩尔)、K2CO3(6.0克，43.6毫摩尔)和铜粉(336毫克，1.45毫摩尔)。将反应混合物加热至180℃1小时。通过真空过滤除去铜和过量K2CO3并用MeOH洗涤。浓缩滤液且所得粗制品通过快速柱色谱法(SiO2，5％MeOH在DCM中)提纯以产生浅绿色固体(1.55克，84％收率)：1H NMR(DMSO-d6)δ3.84(s，3H)，7.26(d，J＝7.8Hz，1H)，7.46(br s，5H)，7.57(s，1H)，8.38(br s，1H)；MS m/z(MH+)253。
步骤2：向Boc-顺式-羟基脯氨酸-OMe(2.0克，8.15毫摩尔)和3(2.26g，8.97毫摩尔)在THF(82毫升)中的0℃浆料中加入Ph3P和偶氮羧酸二异丙酯(1.98克，8.97毫摩尔)。在室温下搅拌17小时后，将反应混合物用EtOAc(100毫升)稀释并用H2O(50毫升)洗涤。分离水层并用EtOAc(2x50毫升)反萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩产生粘性油，将其再溶解在最少量的EtOAc中并加入己烷以实现大部分Ph3PO副产物的沉淀。通过真空过滤除去Ph3PO并浓缩液体滤液。所得粘性油通过快速柱色谱法(SiO2，4∶1hex：EtOAc)提纯以产生白色固体产物(1.76克，45％收率)：1H NMR(60/40旋转异构体(rotomers)，CDCl3)δ1.47(s，9H)，2.49-2.55(m，1H)，2.73-2.83(m，1H)，3.80(s，1.8H)，3.81(s，1.2H)，3.96(s，3H)，4.03-4.09(m，1H)，4.54(t，J＝8.0Hz，0.6H)，4.66(t，J＝7.8Hz)，4.96-5.06(m，1H)，5.97(br s，0.6H)，6.04(br s，0.4H)，7.33(dd，J＝6.1，2.7Hz，1H)，7.46-7.51(m，4H)，7.91(d，J＝9.2Hz，1H)，8.49(t，J＝8.5Hz，2H)；13C NMR(旋转异构体，CDCl3)δ21.7，22.0，28.3，28.4，35.8，36.8，52.3，52.4，52.6，55.8，55.9，57.9，58.3，74.5，74.9，80.6，101.2，101.3，115.7，125.8，126.0，128.1，128.5，129.7，130.2，137.9，147.8，153.8，157.7，158.0，158.0，164.8，173.1，173.3；MS m/z(MH+)480。
中间体48可如下用于制造式I的化合物：
实施例49：
中间体49的制备
中间体49
步骤1：
如对实施例48所述
数据：1H NMR(DMSO-d6)δ0.97-1.01(m，2H)，1.03-1.06(m，2H)，1.90-1.94(m，1H)，3.84(s，3H)，3.87(s，3H)，6.93(s，1H)，7.37(s，3H)，12.28(s，1H)；13C NMR(DMSO-d6)δ9.03，13.17，55.47，55.73，104.81，107.27，113.26，145.16，147.48，154.44，157.21，160.89；MS m/z(MH+)247。
步骤2：
如对实施例48所述
数据：1H NMR(CDCl3)δ1.00-1.04(m，2H)，1.07-1.11(m，2H)，1.43(s，5.4H)，1.46(s，3.6H)，2.17-2.21(m，1H)，2.37-2.43(m，1H)，2.62-2.69(m，1H)，3.75(s，1.8H)，3.78(s，1.2H)，3.92(d，J＝2.8Hz，1H)，4.00(s，3.6H)，4.01(s，2.4H)，4.48(t，J＝8.0Hz，0.6H)，4.59(t，J＝7.6Hz，0.4H)，5.7(br s，0.6H)，5.74(br s，0.4H)，7.18(s，1H)，7.20(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ9.6，9.7，18.1，28.3，28.4，35.8，36.7，52.2，52.4，56.3，57.8，58.2，74.0，74.5，80.5，80.6，101.0，101.1，106.3，108.6，148.8，149.1，153.8，155.4，164.4，165.9，172.9，173.2；LC-MS m/z(MH+)474。
中间体49可如下用于制造式I的化合物：
实施例50：
中间体50的制备
中间体50
步骤1：
如实施例48中所述，其中采用乙脒盐酸盐和2-溴-5-甲氧基苯甲酸作为原材料。
产物：
数据：1H NMR(DMSO)δ2.31(s，3H)，3.85(s，3H)，7.36(d，J＝6.2Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，1H)，12.15(s，1H)；13C NMR(DMSO)δ21.11，55.41，105.57，121.22，123.59，128.12，143.34，151.68，157.00，161.45；LC-MS m/e(MH+)191。
步骤2：如实施例48中所述
中间体50
数据：1H NMR(CDCl3)δ1.43(s，5.4H)，1.45(s，3.6H)，2.38-2.45(m，1H)，2.62-2.71(m，1H)，2.66(s，1.8H)，2.68(s，1.2H)，3.77(1.8H)，3.79(s，1.2H)，3.92(s，3H)，3.93-3.98(m，2H)，4.49(t，J＝80Hz，0.6H)，4.61(t，J＝7.8Hz，0.4H)，5.82(t，J＝2.1Hz，0.6H)，5.89(t，J＝2.3Hz，0.4H)，7.26(dd，J＝4.7，3.2Hz，1H)，7.42(dd，J＝6.3，2.8Hz，1H)，7.75(d，J＝9.15Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ26.1，28.3，28.4，35.8，36.7，52.2，52.2，52.4，52.5，55.755.8，57.9，58.2，74.1，74.7，80.6，101.0，101.2，114.9，125.6，125.9，128.6，147.3，153.8，154.5，157.6，157.6，161.2，164.6，173.0，173.3；LC-MS m/e(MH+)418。
中间体50可如下用于制造式I的化合物：
实施例51：
中间体51的制备
中间体51
步骤1：如实施例48中所述和使用2-溴-4，5-二甲氧基苯甲酸和三氟脒作为原材料进行制备。
数据：1H NMR(DMSO)δ3.92(s，3H)，3.94(s，3H)，7.33(s，1H)，7.50(s，1H)，13.40(br s，1H)；13C NMR(DMSO)δ55.8，56.1，104.9，108.7，150.2，155.0；LC-MS m/e(MH+)275。
步骤2：如实施例48中所述。
产物：
中间体51
数据：1H NMR(CDCl3)δ1.42(s，3.6H)，1.44(s，5.4H)，2.42-2.49(m，1H)，2.67-2.73(m，1H)，3.37(s，1.2H)，3.78(s，1.8H)，3.97(t，J＝6.5Hz，1H)，4.02(s，2.4H)，4.04(s，3.6H)，4.48(t，J＝7.9Hz，0.6H)，4.60(t，J＝7.7Hz，0.4H)，5.86(br s，0.6H)，5.90(br s，0.4H)，7.27-7.29(m，1H)，7.38-7.44(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ8.2，28.3，35.7，36.7，52.1，52.2，52.4，56.5，57.8，58.2，75.5，76.0，80.7，100.8，107.6，111.0，119.7，148.2，150.2，151.4，153.8，154.5，156.4，165.1，172.7，173.0；LC-MS m/e(MH+)502。
中间体51可如下用于制造式I的化合物：
实施例52：
中间体52的制备
中间体52
中间体52可购得并可用于制造式I的化合物。
实施例53：
中间体53的制备
中间体53
中间体53可购得并可用于制造式I的化合物。
实施例54：
中间体54的制备
中间体54
中间体54可购得并可用于制造式I的化合物。
实施例55：
中间体55的制备
中间体55
用于制备中间体55的参考图示。
图示1
步骤1：将3-苯基-丁-2-烯酸(16.2克)、二苯基磷酰基叠氮化物(27.5g)和三乙胺(10.1g)在苯(100毫升)中的溶液搅拌1小时。经由用苯洗涤的硅胶柱过滤和浓缩后，将残留物溶解在二苯基甲烷(80毫升)中并回流3小时。冷却至室温后，经由用苯洗涤的柱塞收集固体，并干燥产生10克(63％)所需固体产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δppm 2.30(s，3H)，7.00(s，1H)，7.54(m，1H)，7.77(m，2H)，8.33(d，J＝7.34Hz，1H)。
步骤2：将4-甲基-2H-异喹啉-1-酮(4.8克)在POCl3(50毫升)中的溶液回流3小时。冷却和浓缩后，将残留物用5N NaOH碱化并用CH2Cl2萃取。有机层用盐水洗涤并经MgSO4干燥。浓缩后，用己烷中的5％乙酸乙酯通过Biotage的快速色谱法提纯产生4.8克(90％)所需固体产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 2.59(s，3H)，7.68(t，J＝7.70Hz，1H)，7.78(m，1H)，7.94(d，J＝8.31Hz，1H)，8.11(s，1H)，8.35(d，J＝8.31Hz，1H)。
中间体55的制备化学
中间体55
步骤1：7-氟-6-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮的制备。如该实施例的步骤1中所示，使用19.6克4-氟-3-甲氧基肉桂酸作为原材料。获得9.5克产物(48％收率)。
数据：1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δppm 4.00(s，1H)，6.49(d，J＝7.34Hz，1H)，7.19(d，J＝7.09Hz，1H)，7.29(d，J＝8.07Hz，1H)，7.86(d，J＝11.74Hz，1H)。
步骤2：1-氯-7-氟-6-甲氧基异喹啉的制备：如该实施例的步骤2中所示，使用7-氟-6-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(9克)作为原材料。获得7克所需产物(70％收率)。
中间体55
数据：1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 4.04(s，3H)，7.17(d，J＝8.07Hz，1H)，7.48(d，J＝5.62Hz，1H)，7.94(d，J＝11.49Hz，1H)，8.20(d，J＝5.62Hz，1H)。
中间体55可用于制造式I的化合物。
实施例56：
中间体56的制备
中间体56
步骤1：如实施例55步骤1中那样，但使用3.82克3-(4-氟-苯基)-3-甲氧基-丙烯酸作为原材料。获得198毫克产物(5％收率)。
产物：
数据：MS：(M+H)+194。
步骤2：如实施例55，步骤1中那样，但使用193毫克7-氟-4-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮作为原材料。获得199毫克产物(94％收率)。
产物：
数据：1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 4.05(s，3H)，7.49(m，1H)，7.78(s，1H)，7.86(dd，J＝9.66，2.57Hz，1H)，8.23(dd，J＝9.29，5.38Hz，1H)；MS：(M+H)+212。
中间体56可用于制造式I的化合物。
实施例57：
中间体57的制备
中间体57
中间体57可用于制造式I的化合物。
实施例58：
中间体58的制备
中间体58
向0℃的Boc-顺式-HYP-OMe(122.6毫克，0.5毫摩尔)在THF(15毫升)中的溶液中加入三苯基膦(196.7毫克，0.75毫摩尔)和苯并[d]异噁唑-3-醇(81毫克，0.6毫摩尔)。然后加入DEAD(0.118毫升，0.75毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌3小时。然后蒸发溶剂并将残留物通过制备HPLC提纯以产生无色稠油(117毫克，54％收率)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.41(m，9H)，2.38(m，1H)，2.75(m，1H)，3.75(m，3H)，3.81(m，1H)，3.90(m，1H)，4.47(m，1H)，5.44(m，1H)，7.31(t，J＝7.46Hz，1H)，7.47(d，J＝8.56Hz，1H)，7.59(t，J＝7.83Hz，1H)，7.66(d，J＝8.07Hz，1H)。
LC-MS(停留时间：2.65分钟.)，MS m/z 363(MH+)。
中间体58可用于制造式I的化合物。
实施例59：
中间体59的制备
向2，4-二氯嘧啶(149毫克，1毫摩尔)在THF(5毫升)中的溶液中加入四(三苯基膦)钯(23毫克，2摩尔％)和苯基溴化锌(2.1毫升，1.05毫摩尔)在THF中的0.5M溶液。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。然后将其添加到饱和氯化铵溶液中并用EtOAc萃取两次。合并有机层，用水洗涤并干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生黄色残留物，其通过制备HPLC提纯产生淡黄色油2-氯-4-苯基-嘧啶。
中间体59可用于制造式I的化合物。
实施例60：
中间体60的制备
向2，4-二氯嘧啶(149毫克，1毫摩尔)在THF(5毫升)中的溶液中加入四(三苯基膦)钯(58毫克，5摩尔％)和2-吡啶基溴化锌(2.4毫升，1.2毫摩尔)在THF中的0.5M溶液。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。然后向其添加饱和氯化铵溶液中并用EtOAc萃取两次。合并有机层，用水洗涤并干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生黄色残留物，其通过制备HPLC提纯产生淡黄色油产物(中间体60，11毫克，3.6％收率)。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.61(m，1H)，8.07(m，1H)，8.36(d，J＝5.19Hz，1H)，8.50(d，J＝7.94Hz，1H)，8.75(d，J＝3.97Hz，1H)，8.82(d，J＝5.19Hz，1H).MS m/z 192(MH+)。
中间体60可用于制造式I的化合物。
实施例61：
中间体61的制备
向2，4-二氯嘧啶(149毫克，1毫摩尔)在DMF(5毫升)中的溶液中，加入二氯双(三苯基膦)钯(II)(35毫克，5摩尔％)和2-(三丁基甲锡烷基)噻吩(0.38毫升，1.2毫摩尔)。将反应混合物在70℃下加热3小时。然后将其添加到甲醇中的饱和KF溶液(20毫升)中并在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，将残留物经滤纸过滤并用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液并将残留物通过制备HPLC提纯以提供灰白色固体产物(110毫克，35％收率)1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.20(dd，J＝5.01，3.79Hz，1H)，7.74(dd，J＝5.01，1.10Hz，1H)，7.77(d，J＝5.38Hz，1H)，7.98(dd，J＝3.79，1.10Hz，1H)，8.55(d，J＝5.38Hz，1H).MS m/z 197(MH+)。
中间体61可用于制造式I的化合物。
实施例62：
中间体62的制备
向2，4-二氯嘧啶(149毫克，1毫摩尔)在DMF(5毫升)中的溶液中加入二氯双(三苯基膦)钯(II)(35毫克，5摩尔％)和2-(三丁基甲锡烷基)呋喃(0.35毫升，1.1毫摩尔)。将反应混合物在70℃下加热3小时。然后向其添加甲醇中的饱和KF溶液(20毫升)中，并在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，将残留物经滤纸过滤并用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液并将残留物通过制备HPLC提纯以提供棕色固体产物(80毫克，27％收率)1H NMR(400MHz，CD3OD)δ6.68(dd，J＝3.67，1.71Hz，1H)，7.42(d，J＝3.67Hz，1H)，7.67(d，J＝5.13Hz，1H)，7.30(d，J＝1.71Hz，1H)，8.62(d，J＝5.14Hz，1H).MSm/z 181(MH+)。
中间体62可用于制造式I的化合物。
实施例63：
中间体63的制备
向2，4-二氯嘧啶(149毫克，1毫摩尔)在DMF(5毫升)中的溶液中，加入二氯双(三苯基膦)钯(II)(35毫克，5摩尔％)和2-(三丁基甲锡烷基)噻唑(412毫克，1.1毫摩尔)。将反应混合物在80℃下加热3小时。然后向其添加甲醇中的饱和KF溶液(20毫升)中，并在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，将残留物经滤纸过滤并用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液并将残留物通过制备HPLC提纯以提供棕色固体产物(9毫克，3％收率)。MS m/z 198(MH+)。
中间体63可用于制造式I的化合物。
实施例64：
中间体64的制备
图示1
步骤1：向Boc-HYP-OH(1.0克，4.324毫摩尔)在DMF(20毫升)中的溶液中，在0℃下加入NaH(0.38克的在矿物油中的60％分散体，9.513毫摩尔)。将反应混合物搅拌1小时。然后加入2，4-二氯嘧啶(0.709克，0.0289毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。然后将其用1N HCl溶液猝灭并用EtOAc萃取。分离有机层，用盐水洗涤并干燥(MgSO4)。溶剂蒸发产生粗产物，其随后通过制备HPLC提纯以提供无色油产物(0.4克，27％收率)。
1H NMR(CD3OD，300MHz)
1.13(m，9H)，2.37(m，1H)，2.62(m，1H)，3.70-3.84(m，2H)，4.38(m，1H)，5.65(m，1H)，6.88(d，J＝5.86Hz，1H)，8.37(d，J＝5.86Hz，1H)。MS m/z 344(MH+)。
步骤2：向(2S，4R)4-(2-氯-嘧啶-4-基氧基)-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯(0.34克，0.99毫摩尔)在CH3CN(20毫升)中的溶液中加入(1R，2S)/(1S，2R)(1-环丙烷磺酰基-氨基羰基-2-乙烯基-环丙基)-氨基甲酸(0.511克，1.48毫摩尔)、DIEA(0.86毫升，4.95毫摩尔)和偶联试剂HOBt(0.226克，1.48毫摩尔)和HBTU(0.561克，1.48毫摩尔)。将该溶液在室温下搅拌过夜。然后将其浓缩，用水洗涤并用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩。其随后通过制备HPLC柱提纯产生黄色固体(A)(0.33克，41％收率)。MS m/z 655(MH+)。
步骤3：向中间体4(50毫克，0.061毫摩尔)在CH2Cl2(2.5毫升)中的溶液中加入1，2，3，4-四氢异喹啉(0.011毫升，0.0915毫摩尔)和Et3N(0.021毫升，0.153毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜和在40℃下搅拌1天。汽提溶剂且残留物通过制备HPLC提纯以产生无色油。随后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4N HCl(1毫升)中并搅拌过夜。溶剂的蒸发产生盐酸盐无色油(20毫克，52％收率)。MS m/z 553(MH+)。
步骤4：向4-[2-(3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-嘧啶-4-基氧基]-吡咯烷-2-羧酸(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基)-酰胺盐酸盐(20毫克，0.032毫摩尔)在CH3CN(5毫升)中的溶液中加入2-甲氧基羰基氨基-3，3-二甲基-丁酸(9.1毫克，0.048毫摩尔)、DIEA(0.028毫升，0.16毫摩尔)和偶联试剂HOBt(7.3毫克，0.048毫摩尔)和HBTU(18.2毫克，0.048毫摩尔)。将该溶液在室温下搅拌过夜。然后将其浓缩，用水洗涤并用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩产生淡黄色油。其通过制备HPLC柱提纯产生无色油状的TFA盐(中间体64)。(16毫克，60％收率)
1H NMR(CD3OD，500MHz)
0.98-1.06(m，13H)，1.13(m，1H)，1.22-1.32(m，1H)，1.35-1.44(m，1H)，1.82(dd，J＝8.24，5.19Hz，0.5H)，1.90(dd，J＝8.24，5.49Hz，0.5H)，2.26(m，1H)，2.32-2.43(m，1H)，2.56(m，1H)，2.96(m，1H)，3.11(m，br，2H)，3.56(s，3H)，4.14(m，1H)，4.21(m，1H)，4.38(m，1H)，4.47(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(m，1H)，5.75(m，1H)，5.94(s，1H)，6.47(d，J＝7.02Hz，1H)，7.29(s，4H)，7.49(m，1H)，7.56(m，1H)，7.74(d，J＝8.24Hz，1H)，7.88(d，J＝8.24Hz，1H)，8.11(d，J＝7.02Hz，1H).MS m/z 724(MH+)。
中间体64可用于制造式I的化合物。
中间体64 式I的化合物
实施例65：
中间体65的制备
向A(50毫克，0.061毫摩尔)在CH2Cl2(2.5毫升)中的溶液中加入异吲哚啉(0.013毫升，0.115毫摩尔)和Et3N(0.026毫升，0.19毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌2天。汽提溶剂且残留物通过制备HPLC提纯产生无色油。随后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4NHCl(1毫升)中并搅拌过夜。溶剂的蒸发产生粗产物，其再通过制备HPLC提纯以提供黄色固体状的TFA盐(8.5毫克，14％收率)。MS m/z539(MH+)。
中间体65可用于制造式I的化合物。
中间体65 式I的化合物
实施例66：
中间体66的制备
实施例64的A 中间体66
向实施例64的A(50毫克，0.061毫摩尔)在CH2Cl2(2.5毫升)中的溶液中加入吗啉(0.008毫升，0.0915毫摩尔)和Et3N(0.021毫升，0.153毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并在40℃下搅拌1天。汽提溶剂且残留物通过制备HPLC提纯以产生无色油。随后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4N HCl(1毫升)中并搅拌过夜。溶剂的蒸发产生无色油状的盐酸盐(12.6毫克，36％收率)；MS m/z507(MH+)。
中间体66可用于制造式I的化合物。
中间体66 式I的化合物
实施例67：
中间体67
中间体67
中间体67的制备
向1，4-对甲苯基硫烷基羰基-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基酯2-甲酯(3.0克，7.91毫摩尔)在乙醇(15毫升)和THF(30毫升)混合物中的溶液中，加入硼氢化钠(0.6克，15.8毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其浓缩，用1N HCl溶液洗涤并用EtOAc萃取三次。合并有机层，用饱和NaHCO3溶液洗涤并干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生淡黄色油，其通过快速柱色谱法(硅胶，3∶1EtOAc∶己烷)提纯以提供无色油状的产物(2)(1.77克，86％收率)。
1H NMR(CD3OD，500MHz)
1.43(m，9H)，2.00-2.13(m，2H)，2.46(m，1H)，3.19(m，1H)，3.47-3.53(m，2H)，3.61(m，1H)，3.73(m，3H)，4.31(m，1H)。MS m/z 282(M+Na+)。
向在0℃下的2(80毫克，0.309毫摩尔)在THF(10毫升)中的溶液中，加入三苯基膦(121.4毫克，0.463毫摩尔)和4-羟基喹啉(67.2毫克，0.463毫摩尔)。然后加入DEAD(80.6毫克，0.463毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌2天。然后蒸发溶剂，且残留物通过制备HPLC提纯以产生无色油。随后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4N HCl(3毫升)中并搅拌2小时。溶剂的蒸发产生粘稠的无色油状的双HCl盐。(110毫克，99％收率)
1H NMR(500MHz，CD3OD)
2.52(m，1H).2.60(m，1H)，3.19(m，1H)，3.45(m，1H)，3.66(s，3H)，3.86(m，1H)，4.61-4.75(m，3H)，7.56(d，J＝6.7Hz，1H)，7.94(t，J＝7.3Hz，1H)，8.10-8.20(m，2H)，8.55(d，J＝8.2Hz，1H)，9.07(d，J＝6.7Hz，1H)。
MS m/z 287(MH+)。
中间体67可用于制造式I的化合物。
中间体67 式I的化合物
实施例68：
中间体68的制备
在0℃下向来自实施例67的2(150毫克，0.578毫摩尔)在THF(15毫升)中的溶液中加入三苯基膦(228毫克，0.868毫摩尔)和3-溴苯酚(150毫克，0.868毫摩尔)。然后加入DEAD(0.14毫升，0.868毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌2天。然后蒸发溶剂，且残留物通过制备HPLC提纯以产生无色油产物(105毫克，44％收率)。MS m/z 436(M+Na+)。
中间体68可用于制造式I的化合物。
中间体68 式I的化合物
实施例69：
中间体69的制备
在0℃下向4-羟基甲基-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基酯2-甲酯(实施例67的2，300毫克，1.157毫摩尔)在THF(15毫升)中的溶液中加入三苯基膦(455毫克，1.735毫摩尔)和5-溴-吡啶-3-酚(根据F.E.Ziegler等人，J.Am.Chem.Soc.，(1973)，95，7458制备)(302毫克，1.735毫摩尔)。然后加入DEAD(0.273毫升，1.735毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌2天。然后蒸发溶剂且残留物通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油。然后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4NHCl溶液(3.0毫升)中并搅拌4小时。溶剂的蒸发产生粗产物，其进一步通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油状的TFA盐(70毫克，11％收率)MS m/z 315(MH+)。
中间体69可用于制造式I的化合物。
中间体69 式I的化合物
实施例70：
中间体70的制备
步骤1：向来自实施例67的2(700毫克，2.7毫摩尔)在THF(90毫升)、甲醇(50毫升)和水(12毫升)混合物中的溶液中加入一水合氢氧化锂(1700毫克，2.0毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其用1N HCl溶液酸化至pH＝3至5。用乙酸乙酯(2x20毫升)萃取并合并有机层和干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生粘稠无色油状产物(0.58，88％收率)。
1H NMR(CD3OD，400MHz)
1.42(m，9H)，2.00-2.09(m，2H)，2.45(m，1H)，3.17(m，1H)，3.49(m，2H)，3.59(m，1H)，4.24(m，1H).MS m/z 268(M+Na+)。
步骤2：向脯氨酸羧酸(270毫克，1.1毫摩尔)在DMSO(10毫升)中的溶液中加入叔丁醇钾(309毫克，2.75毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后加入2-溴-4-氯-吡啶(254毫克，1.32毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其用水猝灭并用乙酸乙酯洗涤。分离水层并用1N HCl溶液酸化至pH＝3。用乙酸乙酯萃取两次，并合并有机层和干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生橙色油。然后将其溶解在甲醇中，在-78℃下鼓入HCl(气体)2分钟。然后将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。溶剂的蒸发产生橙色油，其作为粗产物继续传送。MS m/z 315(MH+)。
中间体70可用于制造式I的化合物。
中间体70 式I的化合物
实施例71：
中间体71的制备
向来自实施例70的中间体3(270毫克，1.1毫摩尔)在DMSO(10毫升)中的溶液中加入叔丁醇钾(309毫克，2.75毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后加入2，6-二溴吡啶(313毫克，1.32毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将其用水猝灭并用乙酸乙酯洗涤。分离水层并用1N HCl溶液酸化至pH＝3。用乙酸乙酯萃取两次，并合并有机层和干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发产生橙色油。然后将其溶解在甲醇中，在-78℃下鼓入HCl(气体)2分钟。然后将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。溶剂的蒸发产生橙色油，其作为粗产物继续传送。MS m/z 315(MH+)。
中间体71可用于制造式I的化合物。
中间体71 式I的化合物
实施例72：
中间体72的制备
在0℃下向4-羟基甲基-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-甲酯(实施例67的2，300毫克，1.157毫摩尔)在THF(15毫升)中的溶液中加入三苯基膦(455毫克，1.735毫摩尔)和5-溴-吡啶-3-酚(根据F.E.Ziegler等人，J.Am.Chem.Soc.，(1973)，95，7458制备)(302毫克，1.735毫摩尔)。然后加入DEAD(0.273毫升，1.735毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌2天。然后蒸发溶剂且残留物通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油。然后将其溶解于在二氧杂环己烷中的4NHCl溶液(3.0毫升)中并搅拌4小时。溶剂的蒸发产生粗产物，其进一步通过制备HPLC提纯以提供淡黄色油状的TFA盐(70毫克，11％收率)。MS m/z 315(MH+)。
中间体72可用于制造式I的化合物。
中间体72 式I的化合物
在实施例68-72中，所述中间体(68-72)和所提出的式I的化合物各自含有卤代吡啶官能性。该官能性可用在偶联反应中，其中卤素基团被环体系或另一官能团替代。这种反应是本领域中公认的且下列反应充当所述偶联法的实例。
实施例73：
偶联反应：实施例A
向A(16毫克，0.0339毫摩尔)在DMF(1毫升)中的溶液中，加入3-噻吩硼酸(5.6毫克，0.044毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.0毫克，0.0017毫摩尔)和2M Na2CO3溶液(0.051毫升，0.1017毫摩尔)。将反应混合物在110℃下加热4小时。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生棕色油产物(6毫克，37％收率)
1H NMR(CD3OD，400MHz)
1.05(s，9H)，2.21-2.30(m，2H)，2.95(m，1H)，3.42(s，3H)，3.93(m，1H)，4.01(m，1H)，4.20-4.30(m，3H)，4.60(dd，J＝8.56，5.87Hz，1H)，7.64(m，2H)，8.12(m，1H)8.37(m，1H)，8.45(m，1H)，8.75(s，1H).MS m/z 476(MH+)。
实施例74：
偶联反应：实施例B
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(1毫升)中的溶液中，加入3-噻吩硼酸(7.0毫克，0.055毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.00212毫摩尔)和2M Na2CO3溶液(0.063毫升，0.127毫摩尔)。将反应混合物在110℃下加热30小时。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生棕色油产物(10.5毫克，42％收率)MS m/z 476(MH+)。
实施例75：
偶联反应：实施例C
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(2毫升)中的溶液中加入2-噻吩硼酸(7.0毫克，0.055毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.00212毫摩尔)和氢氧化钡(40毫克，0.127毫摩尔)。将反应混合物在Smith微波反应器中在150℃下加热110分钟。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油产物(5.0毫克，20％收率)。MS m/z 476(MH+)。
实施例76：
偶联反应：实施例D
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(2毫升)中的溶液中加入3-呋喃硼酸(6.2毫克，0.055毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.00212毫摩尔)和氢氧化钡(40毫克，0.127毫摩尔)。将反应混合物在Smith微波反应器中在150℃下加热30分钟。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油产物(12毫克，49％收率)MS m/z 460(MH+)。
实施例77：
偶联反应：实施例E
向A(25毫克，0.053毫摩尔)在DMF(1毫升)中的溶液中加入3-噻吩硼酸(8.8毫克，0.0688毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(3.1毫克，0.00265毫摩尔)和2M Na2CO3溶液(0.080毫升，0.159毫摩尔)。将反应混合物在110℃下加热过夜。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生棕色油产物(15毫克，48％收率)
1H NMR(CD3OD，500MHz)
1.06(s，9H)，2.20-2.31(m，2H)，2.94(m，1H)，3.55(s，3H)，3.91(m，1H)，3.98(m，1H)，4.34(s，1H)，4.37-4.46(m，2H)，4.61(dd，J＝8.85，5.19Hz，1H)，6.77(d，J＝8.24Hz，1H)，7.39(d，J＝7.32Hz，1H)，7.48(dd，J＝5.19，3.05Hz，1H)，7.68(dd，J＝4.88，1.22Hz，1H)，7.77(t，J＝7.93Hz，1H)，8.04(m，1H)。MS m/z476(MH+)。
实施例78：
偶联反应：实施例F
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(1毫升)中的溶液中加入苯基硼酸(6.7毫克，0.0688毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.00212毫摩尔)和Cs2CO3(41毫克，0.127毫摩尔)。将反应混合物在110℃下加热过夜。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油产物(12毫克，49％收率)。MS m/z470(MH+)。
实施例79：
偶联反应：实施例G
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(1毫升)中的溶液中加入3-呋喃硼酸(6.2毫克，0.055毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.002115毫摩尔)和2M Na2CO3溶液(0.064毫升，0.127毫摩尔)。将反应混合物在110℃下加热2天。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生淡黄色油产物(7.0毫克，29％收率)
实施例80：
偶联反应：实施例H
向A(20毫克，0.0423毫摩尔)在DMF(2毫升)中的溶液中加入2-噻吩硼酸(7.0毫克，0.055毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(2.4毫克，0.00212毫摩尔)和氢氧化钡(40毫克，0.127毫摩尔)。将反应混合物在Smith微波反应器中在150℃下加热30分钟。然后将其过滤和用甲醇洗涤。将滤液浓缩并通过制备HPLC提纯以产生棕色油产物(13.0毫克，52％收率)
1H NMR(CD3OD，400MHz)
1.03(s，9H)，2.18-2.25(m，2H)，2.93(m，1H)，3.55(s，3H)，3.83(m，1H)，3.98(m，1H)，4.34(s，1H)，4.38(m，2H)，4.58(dd，J＝8.05，5.14Hz，1H)，6.63(d，J＝8.07Hz，1H)，7.07(dd，J＝4.89，3.67Hz，1H)，7.33(d，J＝7.34Hz，1H)，7.42(d，J＝5.14Hz，1H)，7.60-7.66(m，2H).MS m/z 476(MH+)。
实施例81：
使用上述偶联实施例(A-H)作为反应条件设计中的参考，可以制备下列中间体。这些提出的中间体(中间体73-80)各自可以随后使用本文描述和引用的教导转化成式1的化合物。
提出的：中间体73，提出的：中间体74，提出的：中间体75，
提出的：中间体76，提出的：中间体77，提出的：中间体78，提出的：中间体79，
提出的：中间体80
实施例82
中间体82的制备
向(2S，4R)Fmoc-4-氨基-1-boc-吡咯烷-2-羧酸(400毫克，0.884毫摩尔)在乙腈(15毫升)中的溶液中，加入5滴吡咯烷。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后将其浓缩和置于高真空上以产生粗制的4-氨基-1-boc-吡咯烷-2-羧酸。在另一圆底烧瓶中，将Pd2dba3(40毫克，5％摩尔)和外消旋的-BINAP(56毫克，10％摩尔)的溶液在脱气的甲苯(8毫升)中在氮气下在室温下搅拌1小时。然后加入1-氯异喹啉(216毫克，1.326毫摩尔)和叔丁醇钠(340毫克，3.536毫摩尔)并将反应混合物搅拌30分钟。然后加入4-氨基-1-boc-吡咯烷-2-羧酸，并将反应混合物在回流下加热1小时。加入水以猝灭反应并分离水层，经滤纸过滤。随后将其浓缩并通过制备HPLC提纯以产生偶联产物TFA盐(165毫克，40％收率)
1H NMR(CD3OD，400MHz)δ1.44(m，9H)，2.51-2.74(m，2H)，3.64(m，1H)，4.01(m，1H)，4.49(m，1H)，4.64(m，1H)，7.30(d，J＝6.85Hz，1H)，7.58(d，J＝6.85Hz，1H)，7.79(m，1H)，7.91-7.99(m，2H)，8.56(d，J＝8.56Hz，1H).MS m/z 358(MH+)。
中间体82可用于制造式I的化合物。
实施例83：
中间体83的制备
步骤1：如文献(Patchett，A.A.；Witkof，B.J.Am.Chem.Soc.1957，185-192)中所述制备Boc脯氨酸中间体(A)的甲苯磺酸盐且不经进一步提纯即使用。
向NaH(76毫克，1.90毫摩尔)在DMF(20毫升)中的浆料中加入1-萘硫酚(0.29毫克，1.80毫摩尔)并将该混合物搅拌30分钟。加入Boc脯氨酸甲苯磺酸盐(0.61克，1.80毫摩尔)的溶液并将该混合物在230℃下搅拌12小时。将该混合物浓缩并使残留物在EtOAc/H2O之间分配。将有机萃取物干燥(MgSO4)并浓缩。残留物通过柱色谱法(用5％EtOAc/己烷至30％EtOAc/己烷洗脱)提纯以产生261毫克(38％)黄色油状的产物。
1H NMR(CDCl3，旋转异构体的3∶2混合物)δ1.41(s，9H)，1.44(s，9H)，2.25-2.29(m，2H)，3.69(s，3H)，3.35-3.42(m，1H)，3.51-3.53(m，1H)，3.80-3.86(m，2H)，4.38-4.39(m，1H)，4.46-4.48(m，1H)，7.41-7.46(m，1H)，7.42-7-54(m，1H)，7.57-7.59(m，1H)，7.58(d，J＝4Hz，1H)，7.82-7.88(m，2H)，8.46(d，J＝5Hz，1H)；MS m/z 388(M++1)。
中间体83可用于制造式I的化合物。
实施例84：
中间体84的制备
向NaH(76毫克，1.90毫摩尔)在DMF(20毫升)中的浆料中加入2-萘硫酚(0.29克，1.80毫摩尔)，并将该混合物搅拌30分钟。加入甲苯磺酸盐(实施例451，步骤1)(0.61克，1.79毫摩尔)在DMF(2毫升)中的溶液并将该混合物在230℃下搅拌12小时。将该混合物浓缩，然后在EtOAc/H2O之间分配。有机层用饱和NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。将残留物用5％EtOAc/己烷然后用30％EtOAc/己烷色谱分离以产生至261毫克(38％)清澈油状的产物。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.32(s，9H)，2.29-2.35(m，2H)，3.33-3.47(m，2H)，3.66(s，3H)，3.71-3.81(m，1H)，4.29-4.32(s，1H)，7.49-7.55(m，3H)，7.70-7.80(m，1H)，7.81-7.97(m，3H)；MS m/z 387(M+1)。
中间体84可用于制造式I的化合物。
实施例85：
中间体85的制备
向氢化钠(0.91克，22.7毫摩尔)在THF(50毫升)中的浆料中加入N-BOC-反式-4(R)-羟基-L-脯氨酸(2.5克，10.8毫摩尔)并将该混合物在230℃下搅拌1小时。加入2-氯甲基萘(1.9克，10.8毫摩尔)并将该混合物在室温下搅拌12小时。除去溶剂并将残留物倒入水中，并用己烷洗涤。将水层酸化(1N HCl)并用EtOAc萃取。分离EtOAc层，干燥(MgSO4)并浓缩产生浅黄色残留物。该油通过快速色谱法用添加了1％乙酸的1∶1EtOAc/己烷提纯以产生1.56克(39％)稠油状的所需产物。
1H NMR(DMSO-d6，旋转异构体的3∶1混合物)
1.35，1.37(s，9H，分别为主要和次要)，1.92-2.02，2.15-2.20(m，2H，分别为主要和次要)，2.35-2.50(m，2H)，3.41-3.49(m，2H)，4.12-4.16，4.20-4.21(m，2H)，4.65-4.68(m，2H)，7.46-7.52(m，3H)，7.74-7.91(m，4H)，(没有观察到酸OH)；MS m/z 394(M++1+Na)。
中间体85可用于制造式I的化合物。
实施例86：
中间体86的制备
图示1
步骤1：向市售N-Boc-(4S)-(顺式)-羟基脯氨酸-OMe(200毫克，0.82毫摩尔)、三苯基膦(320毫克，1.22毫摩尔)和1-萘酚(176毫克，1.22毫摩尔)在2.5毫升四氢呋喃中的溶液中经10分钟逐滴加入二乙基二偶氮二羧酸酯(190微升，1.22毫摩尔)在1.0毫升THF中的溶液。搅拌5.5天后，将该反应真空浓缩。将粗制黄色油在用6-1己烷-乙酸乙酯洗脱的20X40cM制备TLC板(Analtech SiO2)上色谱分离以产生浅黄色油状的所需产物(150毫克，33％)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.44(s，9H)2.33(1H，m)，2.72(1H，m)，3.77和3.38(2s，3H，旋转异构体)，3.88(dd，1H，J＝4.3，12.4Hz)，3.97(bd，1H)，4.53和4.62(2t，1H，J＝7.8Hz，旋转异构体)，5.10(bd，1H)，6.76(t，1H，J＝9.5Hz)，7.37(m，1H)，7.46(m，3H)，7.80(d，1H，J＝7.7Hz)，8.18(m，1H)；MS m/z 394(M+Na)+
步骤2：向Boc-(4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OEt(150毫克，0.40毫摩尔)在1.5毫升THF和0.5毫升水中的搅拌溶液中加入氢氧化锂(10毫克)。将该混合物在室温下搅拌21小时，然后用0.5N NaHCO3稀释。将该碱性溶液用乙酸乙酯萃取，然后将水层用逐滴添加的浓HCl酸化至pH 2。然后将该酸化的层再用乙酸乙酯萃取。该第二乙酸乙酯层用硫酸镁干燥，过滤，然后真空浓缩以产生浅粉色晶体状的Boc-(4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OH(147毫克，100％)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.47和1.48(2s，9H，旋转异构体)，2.40和2.52(2m，1H)，2.68和2.78(2m，1H)，3.78-4.07(m，2H)，4.57和4.69(2t，1H，J＝7.6和8.0Hz，旋转异构体)，5.12(bd，1H)，6.77(dd，1H，J＝7.6，21.2Hz)，7.37(m，1H)，7.46(m，3H)，7.81(t，1H，J＝5.8Hz)，8.19(m，1H)；MS m/z 358(M+H)+
步骤3：向Boc-((4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OH(147毫克，0.41毫摩尔)和外消旋(1R/2S)/(1S/2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(79毫克，0.41毫摩尔)在2.8毫升二氯甲烷中的溶液中加入DIPEA(250微升，1.44毫摩尔)和TBTU(158毫克，0.49毫摩尔)。将所得溶液在氮气下搅拌20小时，然后用40毫升二氯甲烷稀释。将有机层用水、1N NaHCO3、1N HCl、水和盐水洗涤。然后将该溶液用硫酸钠干燥并真空浓缩。通过制备TLC提纯产生两种单独的非对映体，较高Rf的非对映体A(P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1R，2S乙烯基Acca)-OEt，78毫克，38％)和较低Rf的非对映体B(P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1S，2R乙烯基Acca)-OEt，91毫克，45％)，灰白色固体：
非对映体A：P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1R，2S乙烯基Acca)-OEt：1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.24(t，3H)，1.43(s，9H)，1.52(m，1H)，1.84(m，1H)，2.02(m，1H)，2.14(m，1H)，2.81(m，1H)，3.88(m，2H)，4.11(q，1H，J＝7.15)，4.19(m，1H)，4.54(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(dd，1H，J＝17，0.8Hz)，5.77(m，1H)，6.83(m，1H)，7.36(t，1H，J＝7.8Hz)，7.46(m，3H)，7.78(d，1H，J＝7.6Hz)，8.14(d，1H，J＝8.15Hz)；
MS m/z 495(M+H)+
非对映体B，实施例10B：P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1S，2R乙烯基Acca)-OEt：1H NMR(d1-CHCl3，500MHz)δ1.24(t，3H)，1.42(s，9H)，1.85(m，1H)，2.15(q，1H，J＝8.9Hz)，2.40(m，1H)，2.78(m，1H)，3.78(m，1H)，4.12(m，2H)，4.52(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(m，1H)，5.79(m，1H)，6.80(m，1H)，7.35(t，1H，J＝7.6Hz)，7.46(m，3H)，7.78(d，1H，J＝7.6Hz)，8.14(d，1H，J＝8.10Hz)。
MS m/z 495(M+H)+
中间体86可用于制造式I的化合物。
生物学研究
在本公开中采用HCV NS3/4A蛋白酶复合酶检验法和细胞基HCV复制检验法，并如下制备、进行和验证：
重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物的生成
如下所述产生衍生自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物。产生这些提纯的重组蛋白以用在均相检验法(见下文)中以指示本公开的化合物如何有效地抑制HCV NS3蛋白质分解活性。
来自HCV感染患者的血清获自Dr.T.Wright，San FranciscoHospital。由通过血清RNA(核糖核酸)的反转录-PCR(RT-PCR)获得的DNA片段和使用基于其它基因型1a株之间的同源性选择的引物，构造HCV基因组的工程全长cDNA(互补(compliment)脱氧核糖核酸)模板。通过测定整个基因组序列，根据Simmonds等人的分类法，将基因型1a归因于HCV分离物(参见P Simmonds，KA Rose，SGraham，SW Chan，F McOmish，BC Dow，EA Follett，PL Yap和HMarsden，J.Clin.Microbiol.，31(6)，1493-1503(1993))。非结构区域NS2-5B的氨基酸序列据显示＞97％等于HCV基因型1a(H77)和87％等于基因型1b(J4L6S)。感染克隆系H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)获自R.Purcell(NIH)且序列公开在Genbank中(AAB67036，参见Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.和Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，参见Yanagi，M.，StClaire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.和Bukh，J，Virology244(1)，161-172.(1998))。
H77和J4L6S株用于制造重组NS3/4A蛋白酶复合物。如P.Gallinari等人(参见Gallinari P，Paolini C，Brennan D，Nardi C，Steinkuhler C，De Francesco R.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))所述使用为这些株的重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027至1711)编码的DNA。简言之，在NS4A编码区的3’-端加入三个赖氨酸增溶尾(solubilizing tail)。将NS4A-NS4B分裂位点(氨基酸1711)的P 1位置中的半胱氨酸换成甘氨酸以避免酪氨酸标签的蛋白水解。此外，在氨基酸位置1454处通过PCR引入半胱氨酸向丝氨酸突变以防止NS3解旋酶域中的自溶分裂。在pET21b细菌表达载体(Novagen)中克隆变异DNA片段，并根据修改的P.Gallinari等人描述的规程(参见Gallinari P，Brennan D，Nardi C，Brunetti M，Tomei L，Steinkuhler C，De Francesco R.，J Virol.72(8)：6758-69(1998))在大肠杆菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中表达NS3/4A复合物。简言之，在20℃下用0.5毫摩尔(mM)异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)引发NS3/4A蛋白酶复合物表达22小时(h)。典型的发酵(1升(L))产生大约10克(g)湿细胞糊。将所述细胞重悬浮在由25mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)，pH 7.5，20％甘油、500mM氯化钠(NaCl)、0.5％Triton X-100、1微克/毫升(″μg/mL″)溶菌酶、5mM氯化镁(MgCl2)、1μg/ml DnaseI、5mM β-巯基乙醇(βME)、蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸(EDTA)free(Roche)构成的溶胞缓冲液(10毫升/克)中，匀浆并在4℃下培养20分钟(min)。将该匀浆声处理并通过在235000g下在4℃下超离心1小时来澄清化。向上清液中加入咪唑至15mM的最终浓度并将pH值调节至8.0。将该粗制蛋白质提取物加载在用缓冲液B(25mM HEPES，pH 8.0，20％甘油，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，15mM咪唑，5mM βME)预平衡的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上。以1毫升/分钟的流速加载样品。该柱用15倍柱体积的缓冲液C(与缓冲液B相同，但含0.2％TritonX-100)洗涤。用5倍柱体积的缓冲液D(与缓冲液C相同，但含200mM咪唑)洗脱该蛋白质。
汇集含NS3/4A蛋白酶复合物的级分并加载在用缓冲液D(25mMHEPES，pH 7.5，20％甘油，300mM NaCl，0.2％Triton X-100，10mMβME)预平衡的脱盐柱Superdex-S200上。以1毫升/分钟的流速加载样品。汇集含NS3/4A蛋白酶复合物的级分并浓缩成大约0.5毫克/毫升。通过SDS-PAGE和质谱分析判断衍生自BMS、H77和J4L6S柱的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度大于90％。将该酶储存在-80℃下，在冰上解冻并在使用之前在检验用缓冲液中稀释。
FRET肽检验法以监测HCV NS3/4A蛋白水解活性
这种体外检验法的目的是测量本公开的化合物对如上所述衍生自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物的抑制。该检验法指示本公开的化合物如何有效地抑制HCV NS3蛋白质分解活性。
为了监测HCV NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽底物。该底物是Taliani等人在Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996)中描述的RETS1(Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate；AnaSpec，Inc.cat#22991)(FRET肽)。该肽的序列大致基于HCV NS3蛋白酶的NS4A/NS4B自然分裂位点，只是在该分裂位点处存在酯键而非酰胺键。该肽也在肽的一个末端附近含有荧光给体EDANS和在另一末端附近含有受体DABCYL。通过给体与受体之间的分子间共振能量转移(RET)猝灭肽的荧光，但随着NS3蛋白酶使该肽分裂，从RET猝灭中释放出产物且给体的荧光变明显。
用三种重组NS3/4A蛋白酶复合物之一在存在或不存在本公开的化合物的情况下培养肽底物。通过使用Cytofluor Series 4000实时监测荧光反应产物的形成，测定化合物的抑制效果。
试剂如下：HEPES和Glycerol(Ultrapure)获自GIBCO-BRL。二甲亚砜(DMSO)获自Sigma。β-巯基乙醇获自Bio Rad。
检验用缓冲液：50mM HEPES，pH 7.5；0.15M NaCl；0.1％Triton；15％甘油；10mMβME。底物：2μM最终浓度(来自储存在-20℃下的在DMSO中的2mM储液)。HCV NS3/4A蛋白酶1a(1b)型，2-3nM最终浓度(来自在25mM HEPES中的5μM储液，pH 7.5，20％甘油，300mM NaCl，0.2％Triton-X100，10mMβME)。对于效力接近检验限的化合物，通过向检验用缓冲液中添加50微克/毫升胎牛血清白蛋白(Sigma)并将最终蛋白酶浓度降至300pM来使该检验更敏感。
在来自Falcon的96孔聚苯乙烯黑板中进行检验。各孔含有在检验用缓冲液中的25μl NS3/4A蛋白酶复合物、50微升在10％DMSO/检验用缓冲液中的本公开的化合物和25微升在检验用缓冲液中的底物。也在相同检验板上制备对照物(无化合物)。将该酶复合物与化合物或对照溶液混合1分钟，然后通过添加底物来引发酶促反应。立即使用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)读取检验板。将该仪器设定为在25℃下读取340纳米发射和490纳米激发。反应通常进行大约15分钟。
用下列公式计算抑制百分比：
100-[(δFinh/δFcon)x 100]
其中δF是该曲线的线性范围内的荧光变化。对抑制-浓度数据应用非线性曲线拟合，并使用公式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))用ExcelXLfit软件计算50％有效浓度(IC50)。
所有受试化合物都被发现以0.55μM或更低的IC50’s抑制NS3/4A蛋白酶复合物的活性。此外，针对多于一种的NS3/4A复合物测试的本公开化合物据发现具有类似抑制性质，尽管该化合物一律表现出比对1a株高的对1b株的效力。
特异性检验
进行特异性检验以证明与其它丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶相比，本公开的化合物在抑制HCV NS3/4A蛋白酶复合物方面的体外选择性。
对照各种丝氨酸蛋白酶测定本公开的化合物的特异性：人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、猪胰弹性蛋白酶(PPE)和人胰凝乳蛋白酶和一种半胱氨酸蛋白酶：人肝组织蛋白酶B。在所有情况下，如上所述使用经过一些修改的96孔板格式规程(其使用对各酶特异性的比色对硝基苯胺(pNA)底物或荧光氨基-甲基-香豆素(AMC)底物)(PCT专利申请No.WO 00/09543)。所有酶均购自Sigma或EMDbiosciences，而底物来自Bachem。
各pNA检验法包括在室温下的2小时酶-抑制剂预培养，然后添加底物，并水解至在Spectramax Pro微板读数器上测得的～15％转化率。通过将底物添加到在室温下的10分钟酶-抑制剂预培养，引发组织蛋白酶B检验，立即使用Cytofluor Series 4000测量检验板。化合物浓度随其效力从100到0.4μM不等。
各检验的最终条件如下：
50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH 8，0.5M硫酸钠(Na2SO4)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，0.01％Tween-20，含：
133μM succ-AAA-pNA和20nM HNE或8nM PPE；100μMsucc-AAPF-pNA和250pM胰凝乳蛋白酶。
100mM NaHPO4(磷酸氢钠)pH 5.5，3％DMSO，1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，5nM组织蛋白酶B(在使用之前在含20mMTCEP的缓冲液中激活的酶储液)和在H2O中稀释的2μMZ-FR-AMC。
使用下式计算抑制百分比：
[1-((UVinh-UV空白)/(UVctl-UV空白))]x 100
对抑制浓度数据应用非线性曲线拟合，并使用Excel XLfit软件计算50％有效浓度(IC50)。
HCV复制子的生成
如Lohmann V，Korner F，Koch J，Herian U，Theilmann L，Bartenschlager R.，Science 285(5424)：110-3(1999)所述建立HCV复制子全细胞系统。该系统使我们能够评测我们的HCV蛋白酶化合物对HCV RNA复制的影响。简言之，使用Lohmann论文中所述的HCV株1b序列(Assession号：AJ238799)，Operon Technologies，Inc.(Alameda，CA)合成了HCV cDNA，然后在质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中使用标准分子生物技术组装全长复制子。该复制子由下列成分构成：(i)稠合到壳体蛋白的前12个氨基酸上的HCV 5’UTR，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，和(iv)HCV NS3至NS5B基因和HCV 3’UTR。质粒DNA用ScaI线性化并在体外使用T7MegaScript转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)根据制造商的指示合成RNA转录产物。将cDNA的体外转录产物转染到人肝细胞瘤细胞系HUH-7中。在可选择的标记物新霉素(G418)的存在下实现在构成上表达HCV复制子的细胞的选择。随时间针对正链和负链RNA产生和蛋白质产生表征所得细胞系。
HCV复制子FRET检验法
开发HCV复制子FRET检验法以监测本公开中所述的化合物对HCV病毒复制的抑制效果。在含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)的Dulbecco′s Modified Eagle Media(DMEM)(Gibco-BRL)中使在构成上表达HCV复制子的HUH-7细胞生长。在前夜将细胞接种(1.5x104个细胞/孔)在96孔组织培养无菌板中。在稀释板中在含4％FCS、1∶100青霉素/链霉素(Streptomysin)(Gibco-BRL)、1∶100L-谷氨酰胺和5％DMSO的DMEM中制备化合物和无化合物的对照物(在该检验中0.5％DMSO最终浓度)。向细胞中加入化合物/DMSO混合物并在37℃下培养4天。4天后，首先针对CC50读数使用alamar Blue(Trek DiagnotsticSystems)评估细胞的细胞毒性。通过将1/10体积的alamar Blue添加到培养细胞的培养基中，测定化合物的毒性(CC50)。4小时后，在530纳米激发波长和580纳米发射波长下使用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)读取来自各孔的荧光信号。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(150微升3次)充分漂洗各板。用25微升含HCV蛋白酶底物的溶胞检验试剂(5X细胞荧光素酶细胞培养溶胞试剂(Promega#E153A)，用蒸馏水稀释至1X，添加NaCl至150mM最终浓度，FRET肽底物(如上文对酶检验法所述)由在100％DMSO中的2mM储液稀释至10μM最终浓度)溶解细胞。HCV蛋白酶底物。然后将该板放入已设定至340纳米激发/490纳米发射的Cytofluor4000仪器中，自动模式运行21个周期，并以动态模式读取该板。如对IC50测定所述进行EC50测定。
HCV复制子荧光素酶报告基因检验法
作为二次检验法，在复制子荧光素酶报告基因检验法中验证来自复制子FRET检验法的EC50测定结果。Krieger等人(Krieger N，Lohmann V，和Bartenschlager R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))最先描述了复制子荧光素酶报告基因检验法的应用。通过插入编码Renilla荧光素酶基因的人化形式的cDNA和直接稠合到荧光素酶基因的3’-端上的连接子序列，修改对我们的FRET检验法所述的复制子构造。使用位于刚好在新霉素标记基因上游的核中的Asc 1限制位点将这种插入物引入复制子构造中。也介绍了位置1179(丝氨酸至异亮氨酸)处的适应性突变(Blight KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，Science290(5498)：1972-1974)。如上所述产生在构造上表达这种HCV复制子构造的稳定细胞系。如对HCV复制子FRET检验法所述，以下列修改设置荧光素酶报告基因检验法。在37℃/5％CO2培养器中4天后，使用Promega Dual-Glo荧光素酶检验系统分析细胞的Renilla荧光素酶活性。从含细胞的各孔中取出培养基(100微升)。向其余50微升培养基中，加入50微升Dual-Glo荧光素酶试剂，并将板在室温下摇动10分钟至2小时。然后向各孔中加入Dual-Glo Stop & Glo Reagent(50微升)，并将板在室温下再摇动10分钟至2小时。在PackardTopCount NXT上使用荧光程序读取板。
使用下式计算抑制百分比：
使用XLfit绘制和分析数值以获得EC50值。
在HCV酶检测法、HCV复制子细胞检测法和/或在若干概述的特异性检验法中评估代表性的本公开化合物。例如，化合物3据发现在酶检验法中具有对NS3/4A BMS株2.8纳摩尔(nM)的IC50。用公开的H77(0.6nM的IC50)和J4L6S(0.47nM的IC50)株获得类似的效力值。复制子FRET检验法中的EC50值为14.6nM和在复制子荧光素酶检验法中为5.5nM。
在特异性检验法中，发现相同的化合物具有下列活性：HLE＞25μM；PPE＞100μM；胰凝乳蛋白酶＞100μM；组织蛋白酶B＝100μM。这些结果表明，这类化合物对NS3蛋白酶高度特异性且许多这些成员抑制HCV复制子复制。
测试本公开的化合物并发现具有在下列范围内的活性：
IC50活性范围(NS3/4A BMS株)：A是＞1微摩尔(μM)；B是0.1-1μM；C是＜0.1μM
EC50活性范围(对于受试化合物)：A是＞1μM；B是0.1-1μM；C是＜0.1μM
注意，通过使用表1所示的化合物编号，可以在其中发现化合物的结构。
根据本公开的一个实施方案，该化合物具有100μM或更低，在另一实施方案中1μM或更低，最优选0.1μM或更低的生物活性(EC50)。
表1：活性表
| 化合物编号 | IC50活性范围 | EC50活性范围 |
| 化合物1 | C | B |
| 化合物2 | C | A |
| 化合物3 | C | C |
| 化合物5 | C | A |
| 化合物6 | B | A |
表2是可以使用本文描述或引用的教导合成的化合物的列表。
表2
本领域技术人员会认识到，尽管上文已经参照具体方面描述了本公开，但另一些方面也在下列权利要求书的范围内。本文引用的所有文献均像全文阐述的那样经此引用并入本文。
Claims (25)
1.式I的化合物，
或其可药用盐，其中：
(a)R4是氢；C1-6烷基；C3-7环烷基；烷氧基；-C(O)-R5；C(O)-N(R5)2；C(O)-OR5；C7-14烷芳基；或C3-7环烷基，其中所述烷基和环烷基任选被卤素取代；且其中各R5独立地选自C1-9烷基，其中该烷基任选被C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、羟基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基或(C1-6)羧基酯取代；
(b)R6是氢、C1-6烷基或C3-7环烷基；
(c)R3和R’3各自独立地为氢或甲基；
(d)Q是C3-9饱和或不饱和链，其任选包含1-3个独立地选自O和S(O)m的杂原子；其中m是0、1或2；
(e)W是-NH-SO2-R2；其中R2是C6-10芳基、杂环基或-NRbRc；其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-7烷基)、C1-7环烷基、C1-7环烷基(C1-7烷基)、卤代C1-7烷基、杂环基和杂环基(C1-7烷基)；
(f)X是O、S、SO、SO2、OCH2、CH2O或NH；
(g)R′是Het、C6-10芳基或C7-14烷芳基，各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代；或C3-9环烷基或C1-7烷基，其中环烷基和烷基任选被卤素、氰基、烷氧基和二烷基氨基中相同或不同的1至5个成员取代；
条件是-XR’不同于：
(h)Ra是C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、单-或二-卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、烷酰基、NO2、SH、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基磺酰胺、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基或5-7元单环杂环。
2.权利要求1的化合物，其中X是O。
3.权利要求5的化合物，其中R’是Het。
4.权利要求1的化合物，其中R’具有选自下列的结构：
它们各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代。
5.权利要求1的化合物，其中W是-NH-SO2-R2；其中R2是-NRbRc；且Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C1-7环烷基和C1-7环烷基(C1-7烷基)。
6.权利要求18的化合物，其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基和C1-7烷基。
7.权利要求1的化合物，其中Q是任选包含1-3个独立地选自O和S(O)m的杂原子的C5-7饱和或不饱和链；其中m是0、1或2。
8.权利要求1的化合物，其中Q是不饱和的。
9.权利要求1的化合物，其中Q具有结构
其中P是任选包含1个独立地选自O和S(O)m的杂原子的C3饱和链；其中m是0、1或2。
10.权利要求1的化合物，其中R4是-C(O)-R5，其中R5是任选被卤素、烷氧基或氰基取代的C1-6烷基。
11.权利要求10的化合物，其中R5是任选被卤素取代的C1-6烷基。
12.权利要求1的化合物，其中R3和R’3各自是氢。
13.式II的化合物
或其可药用盐，其中：
(a)R4是C(O)-OR5，其中R5是任选被C1-6烷氧基、氰基或卤素取代的C1-9烷基；
(b)Q是C5-7饱和或不饱和链，其任选包含1-3个独立地选自O和S(O)m的杂原子；其中m是0、1或2；
(c)W是-NH-SO2-R2；其中R2是C6-10芳基、杂环基或-NRbRc；其中Rb和Rc各自独立地选自氢、C1-7烷氧基、C1-7烷基、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-7烷基)、C1-7环烷基、C1-7环烷基(C1-7烷基)、卤代C1-7烷基、杂环基和杂环基(C1-7烷基)；
(d)X是O；
(e)R′是Het、C6-10芳基或C7-14烷芳基，各自任选被1至5个相同或不同的Ra基团取代；或C3-9环烷基或C1-7烷基，各自任选被卤素、氰基、烷氧基和二烷基氨基中相同或不同的1至5个成员取代；
条件是-XR’不同于：
(f)Ra选自C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、C3-7环烷氧基、卤代-C1-6烷基、CF3、卤代-C1-6烷氧基、氰基、卤素、硫烷基、羟基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6)烷基氨基、二(C1-6)烷基酰胺、羧基、(C1-6)羧基酯、C1-6烷基砜、C1-6烷基磺酰胺、二(C1-6)烷基(烷氧基)胺、C6-10芳基、C7-14烷芳基和5-7元单环杂环。
14.包含权利要求1的化合物或其可药用盐和可药用载体的组合物。
15.权利要求14的组合物，进一步包含至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。
16.权利要求15的组合物，其中至少一种该其它化合物是干扰素或利巴韦林。
17.权利要求16的组合物，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
18.权利要求15的组合物，其中至少一种该其它化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助T细胞响应的发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸酯脱氢酶抑制剂、金刚胺和金刚乙胺。
19.权利要求15的组合物，其中至少一种该其它化合物有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCV NS5A蛋白质和IMPDH的靶的功能以治疗HCV感染。
20.治疗患者的HCV感染的方法，包括对该患者施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐。
21.权利要求20的方法，进一步包括在权利要求1的化合物或其可药用盐之前、之后或同时施用至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。
22.权利要求21的方法，其中至少一种该其它化合物是干扰素或利巴韦林。
23.权利要求22的方法，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
24.权利要求21的方法，其中至少一种该其它化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、增强1型辅助T细胞响应的发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸酯脱氢酶抑制剂、金刚胺和金刚乙胺。
25.权利要求21的方法，其中至少一种该其它化合物有效抑制选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配体、HCV出去、HCVNS5A蛋白质和IMPDH的靶的功能以治疗HCV感染。
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