CN101569687B

CN101569687B - 用于骨质疏松症及其相关疾病的草药

Info

Publication number: CN101569687B
Application number: CN2008101910935A
Authority: CN
Inventors: 黄三保; 朴丽娅库嗒; 谢晓君
Original assignee: Meidipu Private Co Ltd
Current assignee: Meidipu Private Co Ltd; Medipearl Pte Ltd
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-20
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2028-11-20
Also published as: GB0722758D0; SG153015A1; HK1134447A1; US8153167B2; AU2008246234A1; EP2092940A1; EP2092940B1; CN101569687A; MY151592A; TW200934506A; ES2427591T3; TWI532491B; US20090186102A1

Abstract

来源自6种植物材料的组合物：(i)Herba epimedii淫羊藿(Yin Yang Huo)，(ii)Fructus Psoraleae(Psoralea coryfolia)补骨脂(Bu GU Zhi)，(iii)Radix Rehmanniae preparatae(Rehmannia glutinosa)熟地黄(Shu Di)，(iv)Cortex Eucommiae杜仲(Du Zhong)，(v)Fructus Cnidii蛇床子(She Chuang Zhi)，(vi)Radix Astragali(Astragalus Membranaceus)黄芪(Huang Qi)，用于治疗与成骨细胞和/或破骨细胞活性相关的病况，例如骨质疏松症以及其他和骨量或更年期有关的病况如肥胖症、葡萄糖不耐受症和糖尿病。

Description

用于骨质疏松症及其相关疾病的草药

背景技术

本发明涉及一种能有效治疗骨质疏松及其他疾病的草药。该药物也可被用于治疗或预防肥胖症和糖尿病。该草药来源于多种用于中药的植物材料。更具体地，我们发现六种草药材料的混合物具有所需活性。而且混合物的活性可以通过分离/精制得到增强。最好是个别草药材料在与其他材料混合之前先单独采用合适的方法进行分离/精制。

骨质疏松是一种骨骼疾病，该病中骨矿物质密度降低，骨质变脆易于骨折。当骨矿物质密度降低到稍有压力即可发生骨折的点时诊断为骨质疏松症。骨质疏松引起的骨折最可能发于髋部、腕部和脊骨。更年期后的妇女是骨质疏松的最多发人群，但在超过65岁的男性中此疾病也并不罕见。

骨重建是骨通过吸收而被分解，再通过骨形成的过程重新建立的过程。骨重建是始终发生在骨骼骨的不同部位的自然过程。通常骨吸收和骨形成这两个过程保持平衡，并使骨质量维持在稳定的水平。直到40岁左右的健康成人，由叫作破骨细胞和成骨细胞的细胞完成的骨分解和骨建立的过程，是一个近乎完美的耦联体系，伴有一相刺激另一相。然而，由于人的年龄或者是由于某些疾病的存在，这个体系被破坏，两个过程变得失去平衡。

破骨细胞是通过通常叫作骨吸收的过程使骨量减少的特定骨细胞。破骨细胞的作用通过使骨量增加的成骨细胞的活性而保持平衡。在健康成人的骨骼中，因为破骨细胞和成骨细胞互相平衡并一起工作以维持骨量，所以骨量保持相对稳定。这样使得骨重建持续并在受损伤后痊愈。破骨细胞的功能会被多种药物和关键营养成分影响。

以前，不认为组织影响生物能量学，在最近发表的文章中，Lee和他的同事(2007)惊奇的发现，骨头能够影响肥胖、血糖代谢和胰岛素敏感度。已知患有肥胖症和糖尿病的人常伴有骨代谢异常。虽然很少有迹象显示脂肪堆积和糖尿病会诱发骨质疏松，但是脂肪堆积是儿童骨折的危险因素之一，糖尿病患者也易于骨折(Schwartz等，2001)。

然而，在骨吸收和骨形成过程中生物标记的表达减少反映出糖尿病患者骨转换率降低，这些生物标记包括一种成骨细胞的特异蛋白，骨钙素(Gerdhem等，2005，Osteoporosis Int.，16，(506-1512)。通常认为成骨细胞(建骨的细胞)活性降低是由包括高血糖在内的糖尿病，以及胰岛素、IGF-1的降低水平或作用引起的(Inaba，2004)，Lee等(2007)现在提出数据对这一观点提出质疑，并提出了令人兴奋的观点，成骨细胞功能的减退可能促成肥胖症和葡萄糖耐受不良，根据这一理论，会出现糖尿病代谢后遗症抑制了成骨细胞的功能，导致骨钙素生物活性降低这样的恶性循环，这一恶性循环进一步加重了肥胖症和胰岛素抗性。

发明内容

本发明开发了一种通过双向夹击可减轻或预防(或至少延迟发病)骨质疏松症及相关疾病的药物，其中该药物能够即增加骨建立活性(由成骨细胞引起)又降低骨吸收的活性(由破骨细胞引起)。因而该药物可用于一种或多种下述病症：

1、治疗骨质疏松症

2、降低骨折的发病率

3、增加骨矿物质密度

4、重建骨结构

5、减轻妇女更年期症状，如干燥和潮热

此外，该药物可用于治疗与成骨细胞和/或破骨细胞有关的其他疾病。这些疾病可以包括肥胖症、葡萄糖不耐受症(glucose intolerance)和/或糖尿病。

本发明药物已被证明能够促进成骨细胞增殖。因此它被寄望于通过成骨细胞的激活机制来减轻体重。

进一步，本发明涉及哺乳类(人和非人类)的治疗方法；药物的制备方法(包括成份分级的步骤)；以及草药成分在制备治疗所使用组合物中的应用。

本发明涉及一种组合物，来源于六种植物药：

(i)Herba epimedii淫羊藿(Yin Yang Huo)

(ii)Fructus Psoraleae(Psoralea coryfolia)补骨脂(Bu Gu Zhi)

(iii)Radix Rehmanniae preparatae(Rehmannia glutinosa)熟地黄(ShuDi)

(iv)Cortex Eucommiae杜仲(Du Zhong)

(v)Fructus Cnidii蛇床子(She Chuang Zhi)

(vi)Radix Astragali(Astragalus Membranaceus)黄芪(Huang Qi)

这些植物材料的一些成分在现有技术中已有报道。例如，杜仲所含有的栀子苷酸(Kim等2003)，蛇床子所含有的蛇床子素(Kuo等2005)，补骨脂所含有的补骨脂异黄酮(corylin)和补骨脂黄酮(Wang等，2001)(Xiong等，2003)，淫羊藿(icarrin)所含有的淫羊藿苷(Xie等，2005)以及熟地(Oha等，2003)和黄芪中含有的多糖均已有报道。

本发明优选组分包含下述比例的六种草药材料的提取物(按重量份计)：

(iv)杜仲：2.5-10份，优选4-8份，最优选5份；

(ii)补骨脂：1.5-6份，优选2-4份，最优选3份；

(iii)熟地1.2-5.0份，优选1.5-3份，最优选2.5份；

(v)蛇床子：1-4份，优选1.2-2.8份，最优选2份；

(vi)黄芪：0.3-1.5份，优选0.5-1.0份，最优选0.75份；

(i)淫羊藿：0.15-0.75份，优选0.25-0.5份，最优选0.375份。

提取物优选(i)、(ii)、(iv)和(v)的乙醇提取物以及(iii)和(vi)的水提取物。上述粗提物可部分地进行精制，适宜的工艺步骤说明如下。

本发明组合物可以包含其他组分，例如常规的佐剂和/或赋形剂。可以包含其他活性成份，例如钙源，该钙源例如来源于牡蛎壳或珍珠粉的碳酸钙。适宜的组合物以每日提供0-1400mg钙的单位剂量形式存在。

赋形剂可包括乳糖或淀粉。其他常用赋形剂包括硬酯酸镁、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、滑石和蔗糖。一个作用是对抗草药原料吸潮和结块的趋势。赋形剂的其它可能功能包括矫味(如甜味剂)和着色。赋形剂包括粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)和润滑剂。液体成分可以包括液体载体，例如水。

附图简要说明

图1(i)至(vi)是表示六种草药提取物单独对破骨细胞的活性的一组图。

图2类似图1，表示全部六种草药材料的提取物的混合物对破骨细胞的活性。

图3(i)至(vi)表示六种草药提取物((i)淫羊藿；(ii)补骨脂；(iii)熟地；(iv)杜仲；(v)蛇床子；(vi)黄芪)单独使用对成骨细胞的活性的一组图。

图4a和4b类似图3，表示24小时(图4a)和48小时(图4b)后，全部六种草药材料提取物的混合物对成骨细胞的活性。

图4c是表示混合物对成骨细胞增殖活性的最佳拟合曲线的图。

图5是表示混合物(包含或不包含部分地精制的)对股骨骨量指数的影响的图。

图6和图7表示混合物(包含或不包含部分地精制)对股骨(图6)和腰椎(图7)骨矿物质密度影响的剂量效应曲线。

图8是涉及根据体重改变部分地精制的成分的剂量的图。

具体实施方式

提取步骤

我们用70％含水乙醇和水分别地提取六种草药，并比较其结果。每种草药使用不同来源的3种不同的样品。

(a)原料药(i)(淫羊藿)的提取；

(a)采用70％乙醇：取干燥的淫羊藿叶500g，粉碎，用4L 70％乙醇(ACS级乙醇，购自Megachem)回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(b)采用水：取干燥的淫羊藿叶500g，粉碎，用5L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(b)原料药(ii)(补骨脂)的提取：

(a)采用70％乙醇：取干燥的补骨脂果实500g，粉碎，用4L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(b)采用水：取干燥的补骨脂果实500g，粉碎，用5L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(c)原料药(iii)(熟地)的提取

(a)采用70％乙醇：取干燥的熟地500g，用4L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。提取液过滤，滤液浓缩，真空干燥。

(b)采用水：取干燥的熟地500g，用5L水回流提取2次，每次2小时。提取液过滤，滤液浓缩，真空干燥。

(d)原料药(iv)(杜仲)的提取

(a)采用70％乙醇：取风干的杜仲皮500g，剁碎，用4L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。将合并的提取液过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(b)采用水：取干燥的杜仲皮500g，剁碎，用5L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(e)原料药(v)(蛇床子)的提取

(a)采用70％乙醇：取干燥的蛇床子果实500g，剁碎，用4L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(b)采用水：取干燥的蛇床子果实500g，剁碎，用5L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，滤液浓缩并真空干燥。

(f)原料药(vi)(黄芪)的提取

(a)采用70％乙醇：取干燥的黄芪根500g，用4L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

(b)采用水：取干燥的黄芪根500g，用5L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

粗提物的HPLC分析：

提取物的HPLC分析使用仪器Waters 2695 separation module、结合Waters2487Dual λ Absorbance Detector及预先授权的软件进行。所述HPLC系统装有C18柱(250×4.6mm，5μm)，C18卫柱，3mm。分析在室温下进行。每个样品用60％乙醇作为溶剂制成1mg/ml的浓缩物。样品进样量为20μl。流动相为乙腈和0.1％甲酸的混合物，流速1.0ml/min，使用的方法为fullscan_2b。HPLC色谱图记录的是检测波长为254nm和315nm的数据。HPLC方法的细节见表1。

表1：HFLC法

1％甲酸水溶液	ACN％	时间(分钟)
			96	5	0
50	50	30
			20	80	31
20	80	34
			96	4	35
96	4	40

HPLC级溶剂购自Fisher Scientific，标准样品蛇床子素和淫羊藿苷购自中国的制药和生物厂商，标准品栀子苷酸由Chroma Dex提供。

HPLC分析的结果见表2。

表2；来自中国的三种不同来源的提取率以及活性成分

根据以上结果，得到的结论是对于草药(i)、(ii)、(iv)和(v)使用70％乙醇提取和对于草药(iii)和(vi)使用水提取。

提取物的制备(大规模的)：

提取：

采用70％乙醇的原料药(i)(淫羊藿)的提取：取干燥的淫羊藿叶2kg，粉碎，用16L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：12.98％

采用70％乙醇的原料药(ii)(补骨脂)的提取：取干燥的补骨脂果实(产于河北)750g，粉碎，用6L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：29.3％

采用70％乙醇的原料药(iv)(杜仲)的提取：取风干的杜仲皮1.5kg，剁碎，用12L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：12.14％

采用70％乙醇的原料药(v)(蛇床子)的提取：取干燥的蛇床子果实700g，剁碎，用5.6L 70％乙醇回流提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：22.74％

原料药(iii)(熟地)水提取物：取干燥的熟地300g，用3L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：55.8％

原料药(vi)(黄芪)水提取物：取干燥的黄芪根600g，用6L水回流提取2次，每次2小时。合并提取液，过滤，将滤液浓缩并真空干燥。

收率：29.8％

组合物制备(未精制)

上述获得的原料药的提取物按如下比例混合，补骨脂∶蛇床子∶淫羊藿∶熟地∶杜仲∶黄芪＝1.5∶1∶1.5∶1.25∶1.25∶1.5，得到1kg组合物。

草药名	粗提物量
		补骨脂(ii)	187.5g
蛇床子(v)	125g
		淫羊藿(i)	187.5g
熟地(iii)	156.25g
		杜仲(iv)	156.25g
黄芪(vi)	187.5g

将提取物继续进行部分地精制(或分级)的步骤：

(i)(淫羊藿)粗提物的部分精制：使用乙酸乙酯用硅胶(60-230目)填充柱(55×700mm)。使用在甲醇中的350g硅胶制备35g淫羊藿粗提物(70％乙醇提取)的浆液。使用在乙酸乙酯中的20％甲醇(5L)作为洗脱液，将活性级分洗脱下来。级分浓缩，真空干燥。相同的步骤重复10次。

收率：29.4％

(ii)(补骨脂)粗提物的部分精制：将亲脂性交联葡聚糖基树脂(在本例中选用Sephadex LH-20)置于甲醇中预膨胀整夜，然后填充色谱柱(55×700mm)。取35g补骨脂粗提物(70％乙醇提取)溶于100ml甲醇，经超声处理后上柱。大约4L甲醇作为洗脱液，收集甲醇级分，浓缩，真空脱水干燥。相同的步骤重复4次。

收率：70.1％

(iii)(熟地)粗提物的部分精制：取358g熟地粗提物(水提取)溶入350ml水中，然后缓缓加入100％乙醇进行沉淀。加入的100％乙醇的总量为2.8L。将该混合物在冰箱中放置过夜，完全沉淀，过滤，滤渣真空干燥24小时。

收率：29.32％

(iv)(杜仲)粗提物的部分精制：使用丙酮用硅胶(60-230目)填充柱(55×700mm)。使用在甲醇中的350g硅胶制备35g杜仲粗提物(70％乙醇提取)的浆液。采用丙酮(10L)作为洗脱液，将活性级分洗脱下来。级分浓缩，真空干燥。相同的步骤重复6次。

收率：29.4％

(v)(蛇床子)粗提物的部分精制：取200g蛇床子粗提物(70％乙醇提取)置于5L左右的圆底烧瓶中，再加入丙酮(4L)，搅拌1小时，然后过滤。残渣再加入4L丙酮，搅拌1小时。相同的步骤重复6次。最终所有滤液合并，浓缩，真空干燥。

收率：41.41％

(iv)(黄芪)粗提物的部分精制：取158g黄芪粗提物(水提取)溶入150ml水中，缓缓加入100％乙醇以形成沉淀。100％乙醇加入的总量为1.2L。将得到的混合物在冰箱中放置过夜，完全沉淀，过滤，所得残渣真空干燥24小时。

收率：64.5％

上述原料药粗提物的经部分精制或分离的样品按如下比例混合，补骨脂∶蛇床子∶淫羊藿∶熟地∶杜仲∶黄芪＝1.5∶1∶1.5∶1.25∶1.25∶1.5，得到500g部分精制样品GMA。

草药名	部分精制样品量
		补骨脂	93.75g
蛇床子	62.5g
		淫羊藿	93.75g
熟地	78.125g
		杜仲	78.125g
黄芪	93.75g

草药的粗提物和部分精制的提取物对破骨细胞的作用

通过研究证明本发明草药对体外大鼠破骨细胞的抗增殖的效果。

材料

除了另外说明的，所有的培养基成分购自Sigma-Aldrich(USA)。胎牛血清购自Hyclone，USA。抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒，0.25％胰蛋白酶EDTA溶液，MTT(噻唑蓝溴化四唑)和DMSO均购自Sigma-Aldrich，USA。所有试剂均为最高级，购自Sigma Chemical Co.。96孔板购自NUNC，Denmark。

方法

破骨细胞培养物的制备

将3-4周的幼龄雌性wistar大鼠(100-125g)处死，取股骨。用股骨洗涤介质冲洗4次(每次30ml)。所述洗涤介质为含1mg/ml青霉素G、0.5mg/ml庆大霉素和3mg/ml两性霉素B的α-最低必须培养基(α-MEM)。将大鼠股骨上的骨骺去除。用注射器用含15％(v/v)胎牛血清(Hyclone)，0.1mg/ml青霉素G，0.05mg/ml庆大霉素，300ng/ml两性霉素B，0.28mM L-抗坏血酸2-磷酸酯，10nM地塞米松，10ng/ml M-CSF，10ng/ml RANKL和10ng/ml TNF-α的α-MEM从骨干两端冲洗股骨以得到骨髓细胞。从股骨两端收集介质，在300g条件下离心3分钟。离心之后，除去上层2/3上清液。其余成分作为破骨细胞前体的来源。将细胞混悬液混合均匀，以0.1ml(含1×10⁵个骨髓细胞)接种至96孔板(NUNC)的每个孔。在37℃，5％CO₂，100％湿度条件下培养细胞。24小时后用破骨细胞培养基更换培养基，并且每周重新喂料3次细胞。

TRAP-阳性细胞染色

将破骨细胞混悬于含15％FBS的苯酚α-MEM，在细胞浓度为5×10⁵cells/孔，将其铺板于有10ng/ml RANKL的24孔培养皿中，培养24h。3天后换液。培养5日后固定细胞，使用商业化的TRAP染色试剂盒(Sigma，387-A)，按照厂商说明书，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，TRAP是一种破骨细胞典型的标记酶。TRAP+有3个以上细胞核的细胞，计数为TRAP阳性MNCs。

增殖测定

通过MTT(噻唑蓝溴化四唑)法测定96孔微量滴定板中大鼠破骨细胞存活率，利用此种抗增殖测定，确定6种草药单独和组合使用的粗提物及部分地精制的提取物的剂量响应曲线。将100μl处在指数生长期的10,000存活的癌细胞接种到96孔微量滴定板的每个孔中。这些细胞在37℃、5％二氧化碳气氛条件下过夜进行细胞附着培养。使用过的培养基在第二日清晨弃置并加入200μl新鲜培养基，每孔中以不同浓度添加2μl草药样品，培养板置于37℃、5％二氧化碳气氛条件下培养24小时。

取适量MTT溶解于无血清培养基，得到1mg/ml浓缩的培养基。将50μl MTT溶液转移到每一个孔中。细胞在37℃、5％二氧化碳气氛条件下培养4小时。从孔中吸出培养基，并注入150μl DMSO以溶解蓝色甲沉淀。用微量滴定板读数器在550nm处测定还原的MTT吸光度。细胞存活百分率按如下公式计算：样品OD/对照OD×100％。

结果

图1显示了各种原料药对破骨细胞的抗增殖的活性。所有数值均表示为平均值±标准偏差。

三角标记代表粗提物，方块标记代表部分地精制的材料。

从图1(i)可以看出，淫羊藿粗提物在500μg/ml抑制破骨细胞增殖(37％)，而500μg/ml的含有淫羊藿苷的部分精制的级分对破骨细胞增殖的抑制率为54％。淫羊藿通过抑制破骨细胞增殖对骨诱裂发生进行调节(Xie等2005)。除此之外，淫羊藿疗法可能通过增强成骨细胞的活性和降低骨诱裂发生能够有效地抑制由卵巢切除诱导的骨转换增加(Xie等2005)。

从图1(ii)可以看出，补骨脂粗提物在500μg/ml抑制破骨细胞增殖(33％)。而含有补骨脂黄酮和补骨脂异黄酮的部分地精制的级分在500μg/ml对破骨细胞增殖产生有效抑制(50％)。与补骨脂的粗提物相比较而言，抑制破骨细胞增殖所需的部分精制级分的浓度更小。

从图1(iii)可以看出，熟地粗提物在500μg/ml部分地抑制破骨细胞增殖的(37％)。而含有多糖的熟地的部分精制的提取物在500μg/ml对破骨细胞增殖的抑制率为48％，与粗提物相比为11％还多。杜仲、熟地对破骨细胞增殖的抑制呈现出剂量依赖性。

从图1(iv)显示了杜仲对破骨细胞增殖的抑制呈现出剂量依赖性。杜仲粗提物在500μg/ml抑制破骨细胞增殖(30％)，而含有栀子苷酸(GPA)的杜仲部分地精制的提取物在500μg/ml有效地抑制破骨细胞增殖为47％。

从图1(v)显示了蛇床子粗提物在500μg/ml抑制破骨细胞增殖(32％)。而含有蛇床子素的蛇床子部分地精制的级分在500μg/ml对破骨细胞增殖的抑制率为54％。Qin等于2003年也报道蛇床子抑制破骨细胞形成和分化。蛇床子通过降低和抑制破骨细胞的TRAP活性抑制破骨细胞形成和分化。除此之外，蛇床子还能降低破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝区域和钙离子的释放(Qin等，2003)。

从图1(vi)可以看出黄芪粗提物在500μg/ml抑制破骨细胞增殖(31％)。而含有多糖的黄芪部分地精制的级分在50μg/ml显示对破骨细胞的抗增值促进作用(48％)。抑制破骨细胞所需补骨脂部分精制的提取物的浓度低于补骨脂粗提物。

对于上述6种草药，其部分地精制的级分与其粗提物相比显示出更好的效果。表3总结了其抗破骨细胞增殖效果。

分级的组分的效能也可以ED₅₀(抑制率达到50％时粗提物或部分地分级的成分的浓度)表示，其结果总结于表4。

表3：单独草药提取物在部分地精制前后对破骨细胞的抗增殖活性的总结

原料药名	产地	粗提物在500μg/ml对破骨细胞的活性	活性成分	活性部分在500μg/ml对破骨细胞的活性
					熟地	河北	增殖抑制率37％	多糖类	增殖抑制率48％
黄芪	河北	增殖抑制率31％	多糖类	增殖抑制率48％
					蛇床子	河北	增殖抑制率33％	蛇床子素	增殖抑制率54％
淫羊藿	四川	增殖抑制率37％	淫羊藿苷	增殖抑制率54％
					杜仲	亳州	增殖抑制率30％	栀子苷酸	增殖抑制率47％
补骨脂	河北	增殖抑制率33％	补骨脂黄酮和补骨脂异黄酮	增殖抑制率50％

表4：单独草药提取物在部分地精制前后对破骨细胞的抗增殖活性ED₅₀

将6种粗提物的混合物(2组版本)及6种部分地精制的提取物的混合物进行相似的实验。结果见图2，其中实心圆标记代表第一粗提物的混合物，三角标记代表第二粗提物的混合物，圆环标记代表部分地精制的提取物的混合物。

在相同浓度下，第二组粗提物版本与第一版本组相比显示更佳的对破骨细胞增殖的抑制活性。此外，部分地精制的部分(得自第二粗提物中使用的提取物)在500μg/ml抑制46％的破骨细胞的生长，与其相比粗提物的第二版本组在500μg/ml抑制39％的破骨细胞的生长。

EC₅₀值为：

第一版本组 2.71×10^-3g/ml

第二版本组 2.94×10^-3g/ml

部分地精制的提取物 5.27×10^-4g/ml

粗提物和进一步精制的草药提取物对成骨细胞的作用

通过本发明草药对hFOB人成骨细胞增殖作用的研究来说明其效果。

材料

条件永生人胎成骨细胞系hFOB由美国标准菌库(ATCC)(Manassas，VA，http://www.atcc.org)获得。hFOB由具有温度敏感型突变株SV40大T抗原(ts-SV40LTA)基因的条件永生人胎成骨细胞发育而成。在33.5℃的许可温度下，ts-SV40LTA具有活性，hFOB细胞快速增殖，反之，在39.5℃的非许可温度下，ts-SV40LTA是无活性的，细胞分化并呈现出成熟的成骨细胞的表型。胎牛血清购自Hyclone，USA。G418，Ham′s 12：DMEM(1∶1)，0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，MTT(噻唑蓝溴化四唑)和DMSO均购自Sigma-Aldrich，USA。96孔板购自NUNC，Denmark。

方法

细胞系

hFOB细胞按照ATCC规约在按1∶1的比例将Ham′s F12培养基和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)混合后加入10％胎牛血清、0.3mg/ml G418、成为的完全培养基中培养。在温度34℃，5％CO₂/95％空气的潮湿环境中进行细胞培养。

增殖检测

用MTT法(噻唑蓝溴化四唑)测定96孔微量滴定板中hFOB成骨细胞存活百分率，从而检测成骨细胞增殖活性，分别得到6种草药各自的粗提物、6种部分地精制的提取物及含有来源于6种草药的材料的混合物的计量效应曲线。

将100μl处在指数生长期的10,000存活的癌细胞接种到96孔微量滴定板的每个孔。这些细胞在37℃、5％二氧化碳气氛条件下过夜进行细胞附着培养。使用过的培养基在第二日清晨弃置，每孔中添加200μl新鲜的培养基。每个孔中以不同浓度注入2μl草药样品，将板置于37℃、5％二氧化碳气氛条件下培养24小时。

将MTT溶解于无血清培养基，得到1mg MTT/ml浓度的培养基。将50μlMTT溶液注入每一个孔中。细胞在37℃、5％二氧化碳气氛条件下培养4小时。从孔中吸出培养基，每个孔中注入150μl DMSO以溶解蓝色甲

沉淀。用微量滴定板读数器在550nm处测定还原的MTT的吸光度。细胞存活百分率按如下公式计算：样品OD/对照OD×100％。

结果

结果图见图3。所有数值均表示为平均值±标准偏差。菱形标记代表粗提物，方块标记代表部分地精制的提取物。

从附图3(i)可以看出，200μg/ml淫羊藿粗提物诱导hFOB成骨细胞的增殖(8％)，而100μg/ml含有淫羊藿苷的部分地精制的提取物诱导hFOB成骨细胞的增殖(20％)。部分地精制的提取物与粗提物相比，诱导成骨细胞所需浓度更低而增殖活性更强。淫羊藿通过刺激骨形成和抑制骨吸收的直接作用从而提高了大鼠骨转换率，使其骨小梁结构的缺失得以恢复(Xie等2005)。

从附图3(ii)可以看出，50μg/ml补骨脂粗提物诱导hFOB成骨细胞增殖(20％)，而25μg/ml含有补骨脂黄酮和补骨脂异黄酮的部分地精制的提取物诱导hFOB成骨细胞增殖(20％)。补骨脂部分地精制的提取物与粗提物相比，诱导成骨细胞增殖所需浓度更低(50μg/ml)。

从Psoralea coryfolia(补骨脂)中提取的补骨脂异黄酮显示出对体外培养UMR 106细胞系的成骨细胞增殖刺激作用。通过活性引导的(activity-guided)分离，黄酮类化合物补骨脂黄酮和补骨脂异黄酮已经被分离并被鉴定为活性物质(Wang et al.2001)。这一结果显示，Psoraleacoryfolia果实提取物以及补骨脂黄酮和补骨脂异黄酮有刺激骨形成的作用或具有潜在的抗骨质疏松的活性。Xiong等(2003)还观察了提取物以及Psoraleacorylifolia L.提取物的补骨脂异黄酮级分对成骨细胞的活性。结果显示Psoralea corylifolia L.提取物及补骨脂异黄酮会刺激骨形成(Xiong等2003)。

从附图3(iii)可以看出，50μg/ml熟地粗提物诱导hFOB成骨细胞增殖(7％)。含有多糖的部分地精制的熟地级分无不诱导hFOB成骨细胞增殖。熟地粗提物的部分地精制级分对成骨细胞的浓度和增殖活性没有改善。

从附图3(iv)可以看出，100μg/ml杜仲粗提物略微诱导hFOB成骨细胞增殖(5％)，而含有栀子苷酸(GPA)的粗提物部分地精制的提取物在100μg/ml诱导13％这样的更多的hFOB成骨细胞增殖。

Kim等(2003)报道，来自Cortex Eucommiae(杜仲)的GPA可增加成骨样细胞增殖和骨骼生长，并抑制骨流失。除此之外，Ha(2003)也报道杜仲皮提取物及其所含成分京尼平苷酸、京尼平苷和桃叶珊瑚苷能够增加成骨样细胞增殖从而刺激骨生成。此外，作用于小鼠骨髓细胞和ST-2细胞共同培养的实验表明，这些提取物及其混合物能够抑制破骨细胞的活性(Ha 2003)。

从附图3(v)可以看出，100μg/ml蛇床子粗提物诱导hFOB成骨细胞增殖(7％)。12.5μg/ml含有蛇床子素的部分地精制的提取物诱导hFOB成骨细胞增殖(12％)。蛇床子部分地精制的提取物与粗提物相比，诱导成骨细胞增殖所需浓度更低。Kuo等报道(2005)Fructus Cnidii(蛇床子)中所含的蛇床子素能够显著诱导MG-63和hFOB这两种人成骨样细胞系分化。

如Meng等(2004)报道，Cnidium monnieri(L.)Cuss(伞形科)果实提取物使用体外成骨样细胞UMR106筛选。其中分离出三种香豆素类成分(蛇床子素，佛手柑内酯和欧前胡素)，并研究了它们对成骨细胞增殖的作用。蛇床子素是主要的药理活性成分，能显著提高细胞的活性。佛手柑内酯和欧前胡素的活性低于蛇床子素。这一结果显示，Cnidium monnieri(L.)Cuss提取物具有潜在的抗骨质疏松活性，其部分地精制的级分含有刺激成骨细胞的活性成分(Meng etal.2004)。

如附图3(vi)所示，100μg/ml黄芪粗提物诱导hFOB成骨细胞增殖(17％)。含有多糖的部分地精制的提取物在50μg/ml诱导hFOB成骨细胞增殖(15％)。黄芪部分地精制的提取物与粗提物相比，诱导成骨细胞所需浓度更低。

结果见表5。

表5：草药提取物单独作用于成骨细胞的活性

原料药	粗提物的活性	活性成分	活性成分的活性
				熟地	在50μg/ml诱导的增殖率(10％)	多糖	无明显改善
黄芪	在100μg/ml诱导的增殖率(17％)	多糖	在50μg/ml诱导的增殖率(15％)
				蛇床子	在100μg/ml诱导的增殖率(7％)	蛇床子素	在12.5μg/ml诱导的增殖率(12％)
淫羊藿	在200μg/ml诱导的增殖率(8％)	淫羊藿苷	在100μg/ml诱导的增殖率(20％)
				杜仲	在100μg/ml诱导的增殖率(5％)	栀子苷酸	在100μg/ml诱导的增殖率(13％)
补骨脂	在50μg/ml诱导的增殖率(20％)	补骨脂黄酮、补骨脂异黄酮	在25μg/ml诱导的增殖率(20％)

将含全部6种粗提物的混合物(2种版本)及6种部分地精制的提取物的混合物进行相似的实验，结果见图4a(24小时后的活性)和图4b(48小时后的活性)。菱形标记和方形标记分别代表“粗”提取物混合物版本1组和版本2组，三角标记代表“精制的”组合物。结果表明，版本2组的活性某种程度上高于版本1组，“精制的”组合物的活性更高：24小时后(图4a)“粗”提物版本2组在200μg/ml刺激成骨细胞增殖17％。48小时后(图4b)成骨细胞增殖活性不是所希望的。用50μg/ml浓度的部分地精制的级分处理的48小时的成骨细胞增殖率为6％，相比于用50μg/ml浓度处理的部分地精制的级分24小时的刺激成骨细胞增殖率为18％。与对照细胞相比，用部分地精制的级分和粗提物处理的成骨细胞(hFOB)48小时后细胞死亡。

“粗”提物的第一版本组、第二版本组和”精制的”组合物对成骨细胞(hFOB)增殖活性的最佳曲线拟合见图4c。方形标记和三角形标记分别代表“粗”提物第一版本组和第二版本组，圆环标记代表“精制的”组合物。

动物模型

通过实验检测“粗提物”(第二“粗”版本组)和“精制的”组合物的效果。

本发明物质在卵巢切除大鼠-普遍和通常所接受的骨质疏松症动物模型进行试验。

经过三个月连续口服给药，剂量分别为0.12、0.25、0.5和0.8g/kg/day，一日给药2次，检测并计算骨量指数，股骨的湿重、干重，股骨和腰椎的骨矿物质密度。每周测量大鼠体重。结果见表6和表7。

表6：所有实验组大鼠股骨骨量指数和湿重(mg/cm)

^#：P＜0.05与模拟手术正常对照组相比

^##：P＜0.01与模拟手术正常对照组相比

*：P＜0.05与卵巢切除模型组相比

**：P＜0.01与卵巢切除模型组相比

根据股骨骨量指数数据，剂量效应曲线与ED₅₀值为0.474g/kg/day一日2次的最相适合，见图5。相比于按照文件(GuMiAn Patent File A)中描述所制备的粗提物，部分地精制的活性成分的效力为其约4倍。

图5显示了在卵巢切除的骨质疏松动物模型中部分地精制的活性成分(实心圆标记)和粗提物(圆环标记)对股骨骨量指数的剂量效应曲线。所有数值均表示为平均值±标准偏差。数据符合非线性回归方程，数据处理所使用软件为GraphPad Prism version 3.00 for Windows，GraphPad Software，San DiegoCalifornia USA，www.graphpad.com。

对股骨和腰椎的骨矿物质密度进行测定。数值列表于表7。相对于卵巢切除模型组，全部剂量组的

和部分地精制的活性成分的模型组的全部剂量的股骨矿物质密度值均具有统计学显著意义。然而，与卵巢切除模型组相比较，只有

和GuMiAn粗提物1.4g/kg/day剂量组，以及部分地精制的GuMiAn0.5g/kg/day剂量组的腰椎骨矿物质密度值显示有统计意义上的差别。

GuMiAn粗提物和部分地精制的GuMiAn的剂量效应曲线最符合非线性回归方程(图6表示股骨，图7表示腰椎)。清楚显示出其潜在的体内活性。

表7：每个实验组股骨和腰椎的骨矿物质密度

^#：P＜0.05与模拟手术正常对照组相比

^##：P＜0.01与模拟手术正常对照组相比

*：P＜0.05与卵巢切除模型组相比

**：P＜0.01与卵巢切除模型组相比

图6显示了在卵巢切除的骨质疏松动物模型中部分地精制的GuMiAn(实心圆标记)和GuMiAn粗提物对股骨骨矿物质密度的剂量效应曲线。所有数值均表示为平均值±标准偏差。数据符合非线性回归方程。数据处理所使用软件为GraphPad Prism version 3.00 for Windows，GraphPad Software，San DiegoCalifornia USA，www.graphpad.com。

图7显示了在卵巢切除造成的骨质疏松动物模型中部分地精制的GuMiAn(实心圆标记)和GuMiAn粗提物对腰椎骨矿物质密度的剂量效应曲线。所有数值均表示为平均值±标准偏差。数据符合非线性回归方程。数据处理所使用软件为GraphPad Prism version 3.00 for Windows，GraphPad Software，San DiegoCalifornia USA，www.graphpad.com。

肥胖症

测定精制的混合物对前述组中大鼠体重的影响。

每周测量每个实验动物组的体重，与模拟手术正常对照组相比较，卵巢切除大鼠体重明显增加。部分地精制的组合物处理的卵巢切除大鼠的体重增加显示出显著降低。图8显示ED₅₀为0.27g/kg/day时处理动物的平均体重增长的曲线。

数据符合非线性回归方程。数据处理所使用软件为GraphPad Prism version3.00 for Windows，GraphPad Software，San Diego California USA，www.graphpad.com。

人类试验

这是本发明组合物对绝经后骨质疏松妇女给药的安全性和有效性的初步研究。

本实验中，“粗提物”(“GZS”)制成胶囊。

方法

此项研究中招募具有骨质疏松的妇女，该骨质疏松通过髋骨和/或脊椎的骨矿物质密度值(BMD)＜2.5标准骨峰值来定义。所有受试者均为70岁以下，绝经大于5年。所有受试者均知情并同意。患有肾病、甲状腺疾病、甲状旁腺功能异常、重大疾病、胰岛素依赖型糖尿病，以及使用类固醇、双磷酸盐、激素替代疗法或降钙素的受试者均从本研究中排除。

此项研究采用随机开放标记实验，经过18周治疗，9个月跟踪随访。受试者一天服用两片钙片和维生素D₂(对照肢)或者钙片和维生素D+GZS胶囊(治疗肢)。

对骨形成标记物：骨特异性碱性磷酸酶、以及骨吸收标记物：尿脱氧吡啶诺林(urinary deoxy-pyridiolone)，和尿交联N-端肽进行评价。在研究的最后在基线评价BMD。

结果

22位受试者参加此项研究，随机分组，对照组4人，治疗组18人。18位受试者完成了研究。治疗组3人、对照组1人退出了试验。骨形成和骨吸收标记物均无明显改变。对照组和治疗组BMD的平均值(±SD)变化如下：髋骨分别为-11.26％、-2.51％，脊椎分别为-3.80％、-3.82％。两组均未出现骨折。7名受试者反映GZS胶囊有轻微副作用，如“燥热”、头痛和肿胀。

结论

在9个月的研究期间，本发明组合物能使绝经骨质疏松妇女髋骨中骨流失减少，但是对于脊椎中骨流失无明显作用。该药物只有轻微副作用，服用安全。其改善骨流失的有效性仍需大量长期实验证实。

参考文献

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上面通过例举优选的具体实施例对发明进行了说明，而本领域技术人员在理解的基础上所做出的改变及改进均不脱离本发明精神以及范围。本发明通过权利要求覆盖上述所有改变及改进。

Claims

1.一种药物组合物，其中活性成分由以下6种草药的提取物组成：(i)淫羊藿；(ii)补骨脂；(iii)熟地；(iv)杜仲；(v)蛇床子；和(vi)黄芪，其中所述(i)淫羊藿、(ii)补骨脂、(iv)杜仲和(v)蛇床子的提取物是通过用醇溶剂的溶剂提取的方法制得的，所述(iii)熟地和(vi)黄芪的提取物是通过用水的溶剂提取的方法获得的，

并且以重量份计按如下比例包含所述草药材料的提取物：

(i)淫羊藿：0.15-0.75份；

(vi)黄芪：0.3-1.5份；

(v)蛇床子：1-4份；

(iii)熟地：1.2-5.0份；

(ii)补骨脂：1.5-6份；和

(iv)杜仲：2.5-10份。

2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述醇溶剂为含水乙醇。

3.权利要求2所述的药物组合物，其中所述醇溶剂为70％含水乙醇。

4.权利要求1-3的任一项所述的药物组合物，其中所述组分(i)由淫羊藿提取物经硅胶色谱法分级来制备，所述组分(ii)由补骨脂提取物经亲脂性交联葡聚糖基树脂色谱法分级来制备，所述组分(iii)通过对熟地提取物进行分级来制备，所述熟地提取物的分级是向熟地提取物的水溶液中加入乙醇进行沉淀，所述组分(iv)由杜仲提取物经硅胶色谱法分级来制备，所述组分(v)通过对蛇床子提取物进行分级来制备，所述蛇床子提取物的分级是用丙酮提取干提取物，接着蒸干丙酮提取物，所述组分(vi)通过对黄芪提取物进行分级来制备，所述黄芪提取物的分级是向黄芪提取物的水溶液中加入乙醇进行沉淀。

5.权利要求1所述的药物组合物，其中所述比例为：

(i)淫羊藿：0.25-0.5份；

(vi)黄芪：0.5-1.0份；

(v)蛇床子：1.2-2.8份；

(iii)熟地：1.5-3.0份；

(ii)补骨脂：2-4份；和

(iv)杜仲：4-8份。

6.权利要求5所述的药物组合物，其中所述比例为：

(i)0.375份淫羊藿；(vi)0.75份黄芪；

(v)2份蛇床子；(iii)2.5份熟地；

(ii)3份补骨脂；和(iv)5份杜仲。

7.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于包含一种或多种赋形剂或佐剂。

8.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗与成骨细胞和/或破骨细胞活性有关的骨质疏松症或肥胖症的药物中的用途。

9.权利要求1所述的药物组合物在制备用于哺乳动物的减少骨折发生率、增加骨矿物质密度或重建骨结构的药物的用途。