CN101541332A - 含多官能连接基的靶向聚合物前药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供单链抗体定向的包含多官能连接基的聚合物前药。本发明还公开了制备聚合物递送系统的方法以及用它治疗哺乳动物的方法。

Description

含多官能连接基的靶向聚合物前药
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年9月15日提交的美国临时专利申请60/844943的优先权，该临时专利申请的内容引入本文作为参考。
背景技术
众所周知，很多小分量的抗癌药具有明显毒性。多年来，人们进行了很多尝试，以降低小分量抗癌药的毒性和提高其功效。
降低小分量抗癌药的毒性和提高其功效的尝试之一集中在靶向剂导向的递药系统。例如，单链抗体、RGD肽或者叶酸靶向剂可以导引药物递送并提高其治疗效果。同时，极有效的化疗剂的靶向递送会降低其毒性。FDA的正式批准，确认了例如惠氏的
Figure A20078004258700291
吉妥单抗(gemtuzumab zogamicin)，连接到加里刹霉素(calicheamicin)细胞毒素上的抗CD33的人源化抗体用于急性髓细胞样白血病(AML)的方法。
传统上，免疫缀合物包括三个组分：类似于单克隆抗体的靶向剂，细胞毒素，及连接基。
然而，该方法要求抗体在与药物缀合之后保持其对抗原的高度亲和性。而且，抗体-药物缀合物需在缓冲液或血浆中稳定并且在循环过程中不会过早地释放细胞毒素。一旦抗体在肿瘤细胞表面与其抗原结合，该偶联物还必须陷入(internalized)。其后，药物分子必需以理想的速度完整地释放于靶肿瘤细胞的内部。
单链抗体(SCA)或者单链抗原结合的抗体包括全长抗体与仅四分之一尺寸的结合域。然而，SCA可以高亲和性特异性地结合在抗原上。有关单链抗原结合的蛋白质的理论和制备的描述，参见例如共同受让的美国专利4946778，5260203，5455030和5518889。按上述美国专利中所述方法制备的单链抗原结合的蛋白质具有与相应Fab片段十分类似的结合特异性和亲和性，这些专利的内容引入本文作为参考。最近，共同受让的美国专利6872393披露了聚环氧烷(polyalkylene oxide)修饰的单链多肽。前述各共同受让专利的内容引入本文作为参考。
尽管进行了尝试并取得了进展，但仍然需要提供具有所需治疗活性和更小毒性的靶向剂导向的递药系统。本发明着力解决这种需要以及其它内容。
发明内容
为了解决上述问题并改善聚合药物递药的技术，提供新的和有利的化合物，其采用靶向剂和PEG化技术二者以及其它改进的治疗技术。因此，根据本发明的一个方面，提供式(I)的化合物：
Figure A20078004258700301
式中：
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
A为封端基团或者
Figure A20078004258700302
每个D1独立地选自靶向部分、官能团和离去基团，优选为靶向部分；
每个D2独立地选自生物活性部分、官能团和离去基团，优选为生物活性部分；
每个L1独立地为固定连接基(permanent linker)或可释放连接基(releasable linker)，优选为固定连接基；
L2为多官能连接基；
每个L3独立为固定连接基或可释放连接基，优选为可释放连接基；及
(a)和(b)独立地为0或正整数，优选为0或1。
在本发明的一个方面，聚合物残基为聚环氧乙烷，其经多官能连接基可通过可释放连接基和固定连接基与小的药物分子和单链抗体(SCA)缀合。这样，可以提供化合物，以提供SCA-PEG-连接基-药物递送平台，用于靶向递送小分子的细胞毒化合物。另外，有利的是，每个结合位点的小分子和SCA的加载比传统的SCA-药物缀合物有所增加。因此，可以提供具有成本效率的、低成本的靶向SCA前药。而且，本发明的前药提供调节药物的循环半衰期的方法，例如，在需要时利用适当的连接基增加循环半衰期。
本发明的一个一般方面，非限制性地图示于下面的结构中：
其中PEG通过中央定位的多官能连接基连接在SCA和药物如细胞毒剂上；连接SCA的连接基是固定的，而连接细胞毒剂的连接基是可释放的，并且可以设计成在血液中是稳定的，但在位点特异性酶存在下是容易降解的。
在一个优选的方面，SCA通过固定连接基如含马来酰亚胺基团的连接基连接，且细胞毒剂通过可释放连接基如肽基连接基(Val-Cit)连接，肽基连接基可以被半胱氨酸蛋白酶B特异性地降解。在一优选实施方案中，细胞毒剂为SN38。
本发明的另一方面包括制备含有多官能连接基的活性聚合物的方法，制备含有该活性聚合物的缀合物的方法，以及基于将有效量的含有生物活性部分的偶联物向需要的患者(哺乳动物)给药的治疗方法。
本发明的优点之一在于本文所述的聚合物递送系统是稳定的，因而增强药物的生物利用度。
本发明的另一优点是该聚合物递送系统可以在靶肿瘤细胞内部完整地释放药物。
本发明的另一优点是可以改变药物的释放速度，以达到所需的速度。
本发明的聚合物系统的另一优点是它们很适合于小分子量药物和寡核苷酸如反义的短干扰RNA(siRNA)或LNA化合物。
其它及进一步的优点通过下面的说明可以明白。
对于本发明而言，术语″残基″应当理解为意指所提及的化合物即细胞毒素、SN38、固定连接基、多官能连接基、可释放连接基等经受与另一化合物的取代反应之后残余的部分。
对于本发明而言，术语″聚合物残基″或者″PEG残基″应当各自理解为意指聚合物或者PEG经受与其它化合物、部分等反应之后所残余的部分。
对于本发明而言，取代的烷基包括羧基烷基，氨基烷基，二烷基氨基，羟基烷基和巯基烷基；取代的烯基包括羧基烯基，氨基烯基，二烯基氨基，羟基烯基和巯基烯基；取代的炔基包括羧基炔基，氨基炔基，二炔基氨基，羟基炔基和巯基炔基；取代的环烷基包括诸如4-氯环己基的部分；芳基包括诸如萘基的部分；取代的芳基包括诸如3-溴苯基的部分；芳烷基包括诸如甲苯基的部分；杂烷基包括诸如乙基噻吩的部分；取代的杂烷基包括诸如3-甲氧基-噻吩的部分；烷氧基包括诸如甲氧基的部分；及苯氧基包括诸如3-硝基苯氧基的部分。卤素应当理解为包括氟、氯、碘和溴。
对于本发明而言，″核酸″或者″核苷酸″应当理解为包括单链或双链的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)以及它们的任何化学修饰物(modification)，除非另作说明。
对于本发明而言，术语“生物活性部分”和“生物活性部分的残基”应当理解为意指生物活性化合物在取代反应(其中运输载体部分被连接附着)之后剩余的部分。
为了容易说明而非限制，应当理解，术语“生物活性部分”可与“药物”、“细胞毒剂”、“细胞毒素”互换。
为了容易说明而非限制，应当理解，术语“小分子”可与“药学活性化合物”互换。
除非另外规定，就本发明而言：
术语“烷基”应当理解为包括直链、支链、取代的烷基，例如卤素-C1-12烷基、烷氧基-C1-12烷基和硝基-C1-12烷基、C3-8环烷基或者取代环烷基等；
术语“取代(的)”应当理解为包括增加一个或多个不同的原子或者用一个或多个不同的原子替换官能团或化合物中的一个或多个原子；
术语“取代的烷基”包括羧基烷基，氨基烷基，二烷基氨基，羟基烷基和巯基烷基；
术语“取代的环烷基”包括诸如4-氯环己基的部分；芳基包括诸如萘基的部分；取代芳基包括诸如3-溴苯基的部分；芳烷基包括诸如甲苯基的部分；杂烷基包括诸如乙基噻吩的部分；
术语“取代的杂烷基”包括诸如3-甲氧基-噻吩的部分；烷氧基包括诸如甲氧基的部分；及苯氧基包括诸如3-硝基苯氧基的部分；
术语“卤素”应当理解为包括氟、氯、碘和溴；以及
术语″足量″和“有效量”对于本发明而言意指实现本领域的普通技术人员明白的治疗效果的量。
附图说明
图1图示说明了实施例1-5的合成方法。
图2图示说明了实施例6-7的合成方法。
图3图示说明了实施例8-9的合成方法。
图4图示说明了实施例10-14的合成方法。
图5图示说明了实施例15-17的合成方法。
图6图示说明了实施例18-19的合成方法。
图7图示说明了实施例20-23的合成方法。
图8图示说明了实施例24-25的合成方法。
图9图示说明了实施例26-28的合成方法。
图10图示说明了实施例29-32的合成方法。
图11图示说明了实施例33-35的合成方法。
图12图示说明了实施例36-38的合成方法。
图13图示说明了实施例39-40的合成方法。
具体实施方式
A.概述
在本发明的一个方面，提供式(I)的化合物：
Figure A20078004258700331
式中：
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
A为封端基团或者
Figure A20078004258700332
每个D1独立地选自靶向部分、官能团和离去基团，优选靶向部分；
每个D2独立地选自生物活性部分、官能团和离去基团，优选生物活性部分；
每个L1独立地为固定连接基或可释放连接基，优选为固定连接基；
L2为多官能连接基；
每个L3独立地为固定连接基或可释放连接基，优选可释放连接基；及
(a)和(b)独立地为0或正整数，优选为0或1。
在本发明的一个优选方面，靶向聚合物递送系统包含具有下式的化合物：
Figure A20078004258700341
式中
R2和R′2独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰氧基、芳基羰氧基、C2-6取代烷酰基、取代芳基羰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧基羰基、C2-6取代烷酰氧基、及取代芳羰氧基；
(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c’6)、(c”6)、(c7)和(c8)独立地为0或正整数，优选为0或者约1至约10的整数，更优选为0、1或2；
(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)和(d7)独立地为0或正整数，优选为0或者约1至约10的整数，更优选为0或者约1至约4的整数；及
所有其它变量的定义同前。
另一方面，本文所述的聚合物系统在一端用CH3基团封端即mPEG，而在其它实施方案中提供双活化的(bis-activated)PEG，如那些对应于下式的PEG：
Figure A20078004258700351
其它任选的封端基团包括H，NH2，OH，CO2H，C1-6烷氧基和C1-6烷基。优选的封端基团包括甲氧基和甲基。
在本发明的大多数方面，本文所包括的聚合物一般描述为基本上非抗原性的聚合物。在这类聚合物中，优选聚环氧烷，最优选聚乙二醇(PEG)。为了容易说明而非限制，本发明有时描述成利用PEG作为原型聚合物。然而，应当理解，本发明的范围适用于多种聚合物，该聚合物可以是直链的、基本直链的或者支链的聚合物等。
在本发明的另一方面，生物活性部分包括含-NH2的部分、含-OH的部分和含-SH的部分。
B.多官能连接基(L2)
考虑到本发明的结构，多官能连接基允许连接(可释放的或者固定的)3个或者更多个组分，即靶向剂、聚合物和生物活性的细胞毒化合物如SN38。本领域的技术人员可以理解，也可以使用包含至少3个独立官能团的其它分子。一个优选的多官能连接基可以是天冬氨酸或赖氨酸的残基。
具有至少三个官能位点的L2可以选自：
Figure A20078004258700371
式中
R2和R′2独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰氧基、芳基羰氧基、C2-6取代烷酰基、取代芳基羰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧基羰基、C2-6取代烷酰氧基、及取代芳羰氧基；
(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c’6)、(c”6)、(c7)和(c8)的定义同前；及
(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)和(d7)的定义也同前。
优选的实施方案包括：
Figure A20078004258700372
Figure A20078004258700381
C.基本上非抗原性的水溶性聚合物(R1)
本发明的前药包括聚合物残基R1，优选水溶性且基本上非抗原性的聚合物。这种聚合物的适宜实例包括聚环氧烷(PAO)如聚乙二醇。一些优选的聚合物为聚乙二醇如mPEG。因此，这类聚合物的非限制性举例包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多元醇，其共聚物，及其嵌段共聚物。
本文所述化合物的聚合物部分具有约2000至约100000道尔顿，优选约5000至约60000道尔顿的平均分子量。在一些方面，在连接有蛋白质或寡核苷酸时，聚环氧烷可以为约5000至约25000，优选为约12000至约20000道尔顿；或者作为选择，当本文所述的化合物中采用药学活性化合物(如那些平均分子量小于约1500道尔顿的小分子)时，聚环氧烷为约20000至约45000道尔顿，优选为约30000至约40000道尔顿。
聚乙二醇(PEG)通常表示为如下结构：
-O-(CH2CH2O)n-
其中(n)为约10至约2300的整数，并且在使用多臂聚合物时取决于聚合物臂的数目。应当理解，水溶性聚合物将被官能化以连接到连接基上。
作为选择，本发明的聚乙二醇(PEG)残基部分可由下列结构表示：
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y72)-Y71-，
-Y71-C(＝Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(＝Y72)-Y71-，
-Y71-(CR71R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR71R72)a72-Y71-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y72)-，
-C(＝Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(＝Y72)-，及
-(CR71R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR71R72)a72-，
式中：
Y71和Y73独立地为O，S，SO，SO2，NR73或者化学键；
Y72为O，S或者NR74；
R71-74独立地为与可以用于R2的部分相同的部分；
(a71)，(a72)和(b71)独立地为0或正整数，优选为0～6，且更有选为1；及
(n)为约10至约2300的整数。
例如，PEG可以下列非限定性方式官能化：
-C(＝Y74)-(CH2)m-(CH2CH2O)n-，
-C(＝Y74)-Y-(CH2)m-(CH2CH2O)n-，
-C(＝Y74)-NR11-(CH2)m-(CH2CH2O)n-，
-CR75R76-(CH2)m-(CH2CH2O)n-，
式中
R75和R76独立地选自：H、C1-6烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、杂烷基、取代的杂烷基、及取代的C1-6烷基；
m为0或者为正整数，优选为1；
Y74为O或S；以及
n代表聚合度。
尽管本发明的前药可使用本文所述的任何基本上非抗原性的聚合物形成，但是一些优选的聚环氧烷包括：
CH3O-PEG-O-(CH2)m-CO2H；
PEG-NHS；
CH3O-PEG-O-(CH2)m-NR11R12；及
CH3O-PEG-O-(CH2)2-S-(CH2)m-CO2H；
SC-PEG；或者
本领域认可的任何活化PEG。
具体地，对于聚乙二醇(PEG)，当期望单取代的聚合物时，优选单活化的C1-4烷基末端的PAO如单甲基末端的聚乙二醇(mPEG)；当期望二取代的前药时，优选双活化的聚环氧乙烷。
为了提供所需的连接，使用单酸或二酸活化的聚合物如PEG酸或者PEG二酸。适宜的PAO酸可通过将mPEG-OH转化成乙酯来合成。同样参见Gehrhardt，H.，等人，Polymer Bulletin 18：487(1987)和Veronese，F.M.，等人，J.Controlled Release 10；145(1989)。作为选择，PAO-酸可以通过将mPEG-OH转化成叔丁酯来合成。例如参见共同受让的美国专利5605976和美国专利5965566。前述各文献的公开内容引入本文作为参考。
支链的或者U-PEG衍生物公开于美国专利5643575，5919455，6113906和6566506中，这些专利各自的公开内容引入本文作为参考。这类聚合物的非限制性举例对应于具有下列结构的聚合物体系(i)～(vii)：
Figure A20078004258700401
Figure A20078004258700411
式中：
Y61-62独立地为O，S或者NR61；
Y63为O，NR62，S，SO或者SO2；
(w62)，(w63)和(w64)独立地为0或者正整数，优选为约0至约10，更优选为约1至约6；
(w61)为0或1；
mPEG为甲氧基PEG；
其中PEG如前面所定义，且聚合物部分的总分子量为约2000至约100000道尔顿；及
R61和R62独立地选自：氢，C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-19支链烷基，C3-8环烷基，C1-6取代烷基，C2-6取代烯基，C2-6取代炔基，C3-8取代环烷基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，C1-6杂烷基，取代的C1-6杂烷基，C1-6烷氧基，芳氧基，C1-6杂烷氧基，杂芳氧基，C2-6烷酰基，芳基羰基，C2-6烷氧基羰基，芳氧基羰基，C2-6烷酰氧基，芳基羰氧基，C2-6取代烷酰基，取代芳基羰基，C2-6取代烷酰氧基，取代芳氧基羰基，C2-6取代烷酰氧基，及取代的芳基羰氧基。
在又一方面，聚合物包括多臂的PEG-OH或者“星状-PEG”(star-PEG)产品如在NOF Corp.Drug Delivery System catalog(Ver.8，2006年4月)，中所公开的那些，其公开内容引入本文作为参考。多臂聚合物缀合物(conjugate)包含四个或者更多个聚合物臂，优选包含四个或八个聚合物臂。
为了说明而非限制，多臂聚乙二醇(PEG)残基可以为：
Figure A20078004258700421
式中：
(x)为0和正整数，即约0至约28；及
(n)为聚合度。
在本发明的一个具体实施方案中，多臂PEG具有如下结构：
Figure A20078004258700422
其中n为正整数。在本发明的一个优选实施方案中，聚合物具有约5000Da至约60000Da，优选12000Da至40000Da的总分子量。
在又一具体实施方案中，多臂PEG具有如下结构：
Figure A20078004258700423
其中n为正整数。在本发明的一个优选实施方案中，多臂聚合物的聚合度(n)为约28至约350，以提供总分子量为约5000Da至约60000Da的聚合物，优选为约65至约270(12000-45000道尔顿)，以提供总分子量为12000Da至45000Da的聚合物。这代表聚合物链中重复单元的数目，并且取决于聚合物的分子量。
可以利用美国专利5122614或5808096中所述的活化技术，将聚合物转化成稳定活化的聚合物。具体地，这类PEG可以是下式的PEG：
式中：
(u′)为约4至约455的整数；且残基的至多3个末端部分用甲基或者其它低级烷基封端。
在某些优选实施方案中，所有四个PEG臂均可转化成适宜的活化基团，以促进与芳香基团的连接。转化之前的这类化合物包括：
Figure A20078004258700432
Figure A20078004258700441
本发明所包含的聚合物优选在室温是水溶性的。这类聚合物的非限定性举例包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多元醇，其共聚物，及其嵌段共聚物，条件是嵌段共聚物的水溶性得以保持。
在进一步的实施方案中，且作为PAO-基聚合物的可选方案，可以使用一种或多种实际上非抗原性的材料如葡聚糖，聚乙烯醇，糖类聚合物，羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)，聚环氧烷，和/或其共聚物。同样参照共同受让美国专利6153655，其内容引入本文作为参考。本领域的普通技术人员应当理解，采用与本文中所述的PAO如PEG活化相同类型的活化。本领域的普通技术人员还应了解，前面的列举仅是示例性的，具有本文所述性质的所有聚合物均在考虑范围之内。对于本发明而言，“基本上或者实际上非抗原性的”在本领域中意指无毒的并且不引起哺乳动物可察觉的免疫原应答的所有材料。
在某些方面，可以采用具有末端胺基的聚合物制备本文所述的化合物。制备高纯度的含有末端胺的聚合物的方法参见美国专利申请11/508507和第11/537172，其各自的内容引入本文作为参考。例如，具有叠氮基(azides)的聚合物与膦-基还原剂如三苯基膦或者碱金属硼氢化物还原剂如NaBH4反应。作为选择，包含离去基团的聚合物与保护的胺盐如亚胺二碳酸甲基叔丁基酯(methyl-tert-butyl imidodicarbonate)的钾盐(KNMeBoc)或者亚胺二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl imidodicarbonate)的钾盐(KNBoc2)反应，接着将保护的胺基去保护。通过这些方法形成的含末端胺的聚合物的纯度大于约95％，优选大于99％。
在可供选择的方面，在本文所述的聚合物递送系统中可采用具有末端羧酸基团的聚合物。制备高纯度的具有末端羧酸的聚合物的方法参见美国专利申请11/328662，其内容引入本文作为参考。所述方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，接着将其转化成其羧酸衍生物。该方法中制备PAO羧酸的第一步骤包括形成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁酯。该中间体通过PAO在碱如叔丁醇钾存在下与卤代乙酸叔丁酯反应而形成。一旦形成叔丁酯中间体，可以很容易地以超过92％，优选超过97％，更优选超过99％，最优选超过99.5％的纯度得到聚环氧烷的羧酸衍生物。
D.靶向剂S(D1)
靶向剂可以连接在本文所述的聚合物上以引导缀合物至活体内的靶向区域。靶向剂允许生物活性部分如药学活性化合物和寡核苷酸在靶向区域即肿瘤部位发挥疗效。体内靶向递送增强细胞对这些分子的吸收，以具有更好的疗效。在某些方面，一些细胞穿膜肽可以被多种靶向递送至肿瘤部位的靶向肽所代替。
在本发明的一个方面，靶向部分如单链抗体(SCA)或单链抗原结合的抗体，单克隆抗体，细胞粘附肽(cell adhesion peptide)如RGD肽和选择蛋白(Selectin)，细胞穿膜肽(cell penetrating peptide)(CPP)如TAT，穿膜肽(penetratin)和(Arg)9，受体配体，靶向糖分子或凝集素(lectin)，寡核苷酸，寡核苷酸衍生物如锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)和适配体(aptamer)，等等，允许胞毒药物特异性地导入靶区。参见Curr Opin Pharmacol.2006年10月；6(5)：509-14，Cell-penetrating peptide as vectors for peptide，protein andoligonucleotide delivery；还参见J Pharm Sci.2006年9月；95(9)：1856-72，Celladhesion molecules for targeted drug delivery，其各自的内容引入本文作为参考。
靶向部分可以是标记的，如生物素标记的化合物、荧光化合物、放射性标记的化合物。合适的标记可通过将任何适宜的部分如氨基酸残基连接到下列部分而制得：任何本领域的标准放射性同位素，不透辐射的标记物，磁共振标记或适于磁共振影像学的其它非放射性同位素标记物，荧光型标记物，具有可见颜色和/或能够在紫外线、红外线或电化学刺激下发出荧光以容许在外科手术中使肿瘤组织成像的标记物，等等。任选地，可以将诊断标记合并到和/或连接到缀合的治疗剂部分，以监测治疗生物活性材料在动物或者人患者体内的分布。
在本发明的更进一步的方面，本发明的标记的缀合物容易通过本领域已知的方法用任何适宜的标记物(包括例如放射性同位素标记物)制备。举例来说，这些标记物包括131碘，125碘，99m锝和/或111铟，以在体内产生选择性吸收到肿瘤细胞中的放射性免疫显像剂(radioimmunoscintigraphic agent)。例如，存在大量本领域已知的将肽连接到Tc-99m上的方法，包括例如美国专利5328679、5888474、5997844和5997845中所述的方法，这些专利引入本文作为参考。
优选的靶向部分为单链抗体(SCA)或者抗体的单链可变区片段(sFv)。SCA包含可以结合或者识别靶向肿瘤细胞的特异性分子的抗体区域。除了保留抗原结合位点之外，经连接基PEG化的SCA可以降低抗原性并增加SCA在血流中的半衰期。
术语″单链抗体(SCA)″、″单链抗原结合的分子或抗体″或者″单链Fv″(sFv)可以交换地使用。单链抗体对抗原具有结合亲和性。单链抗体(SCA)或者单链Fv可以并且以若干方式构建。单链抗原结合的蛋白质的理论和制备的说明参见共同受让的美国专利申请10/915069和美国专利6824782，它们各自的内容引入本文作为参考。
通常，SCA或者Fv区域可在单克隆抗体中选取，所述单克隆抗体在文献中的简称为26-10，MOPC 315，741F8，520C9，McPC 603，D1.3，鼠phOx，人phOx，RFL3.8 sTCR，1A6，Se155-4，18-2-3，4-4-20，7A4-1，B6.2，CC49，3C2，2c，MA-15C5/K12GO，Ox等(参见Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；Huston，J.S.等人，SIM News 38(4)(Supp)：11(1988)；McCartney，J.等人，ICSU Short Reports 10：114(1990)；McCartney，J.E.等人，unpublished results(1990)；Nedelman，M.A.等人，J.Nuclear Med.32(Supp.)：1005(1991)；Huston，J.S.等人，In：Molecular Design and Modeling：Concepts and Applications，Part B，edited by J.J.Langone，Methods inEnzymology 203：46-88(1991)；Huston，J.S.等人，In：Advances in theApplications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology，Epenetos，A.A.(Ed.)，London，Chapman & Hall(1993)；Bird，R.E.等人，Science 242：423-426(1988)；Bedzyk，W.D.等人，J.Biol.Chem.265：18615-18620(1990)；Colcher，D.等人，J.Nat.Cancer Inst.82：1191-1197(1990)；Gibbs，R.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4001-4004(1991)；Milenic，D.E.等人，CancerResearch 51：6363-6371(1991)；Pantoliano，M.W.等人，Biochemistry30：10117-10125(1991)；Chaudhary，V.K.等人，Nature 339：394-397(1989)；Chaudhary，V.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066-1070(1990)；Batra，J.K.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.171：1-6(1990)；Batra，J.K.等人，J.Biol.Chem.265：15198-15202(1990)；Chaudhary，V.K.等人，Proc.Natl.AcadSci.USA 87：9491-9494(1990)；Batra，J.K.等人，Mol.Cell.Biol.11：2200-2205(1991)；Brinkmann，U.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8616-8620(1991)；Seetharam，S.等人，J.Biol.Chem.266：17376-17381(1991)；Brinkmann，U.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3075-3079(1992)；Glockshuber，R.等人，Biochemistry 29：1362-1367(1990)；Skerra，A.等人，Bio/Technol.9：273-278(1991)；Pack，P.等人，Biochemistry 31：1579-1534(1992)；Clackson，T.等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Iverson，B.L.等人，Science 249：659-662(1990)；Roberts，V.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6654-6658(1990)；Condra，J.H.等人，J.Biol.Chem.265：2292-2295(1990)；Laroche，Y.等人，J.Biol.Chem.266：16343-16349(1991)；Holvoet，P.等人，J.Biol.Chem.266：19717-19724(1991)；Anand，N.N.等人，J.Biol.Chem.266：21874-21879(1991)；Fuchs，P.等人，Biol Technol.9：1369-1372(1991)；Breitling，F.等人，Gene 104：104-153(1991)；Seehaus，T.等人，Gene 114：235-237(1992)；Takkinen，K.等人，Protein Engng.4：837-841(1991)；Dreher，M.L.等人，J.Immunol.Methods139：197-205(1991)；Mottez，E.等人，Eur.J.Immunol.21：467-471(1991)；Traunecker，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8646-8650(1991)；Traunecker，A.等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)；Hoo，W.F.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4759-4763(1993))。前述出版物各自引入本文作为参考。
作为选择，靶向部分可以是寡核苷酸或者寡核苷酸衍生物。寡核苷酸(类似物)不限于单一种类的寡核苷酸，而是设计成以多种此类部分而工作的。应当理解，连接基可以连接在一个或多个3′-末端或者5′-末端上，通常是核苷酸的PO4或者SO4基团上。寡核苷酸包括反义或者互补的寡核苷酸，短干扰RNA(siRNA)，锁核酸(LNA)，微RNA(miRNA)，肽核酸(PNA)，磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)和适配体等。
例如，靶向基团的非限定性举例包括血管内皮细胞生长因子，FGF2，生长抑素和生长抑素类似物，转铁蛋白，促黑激素，ApoE和ApoE肽，冯维勒布兰德氏因子(Willebrand’s Factor)和冯维勒布兰德氏因子肽，腺病毒纤维蛋白和腺病毒纤维蛋白肽，PD1和PD1肽，EGF和EGF肽，RGD肽，叶酸，等等。在本文所述化合物中还可以采用本领域的技术人员理解的其它任选靶向剂。
优选地，靶向剂包括单链抗体(SCA)，RGD肽，选择蛋白，TAT，穿膜肽，Oligo(Arg)优选(Arg)9，叶酸，等等。对于本发明而言，术语″TAT″可理解为意指转录活化蛋白的反式激活因子部分，包括例如肽序列YGRKKRRQRRR。本说明书和实施例中所使用的肽的序列表和结构包括：
C-TAT：(SEQ ID NO：1)CYGRKKRRQRRR；
C-(Arg)9：(SEQ ID NO：2)CRRRRRRRRR；
RGD可以是链状或环状的：
叶酸
(Arg)9可包括用于缀合的半胱氨酸，如CRRRRRRRRR，且TAT可以在肽末端添加另外的半胱氨酸，如CYGRKKRRQRRRC。
E.生物活性部分(D2)
很多种生物活性部分可以连接到本文所述的活化聚合物上。该生物活性部分包括药学活性化合物、酶、蛋白质、寡核苷酸、抗体、单克隆抗体、单链抗体和肽。
能够连接到聚合物上的任何细胞毒剂或化疗剂即叶酸等，包括但不限于共同受让的美国专利5965566中所述的那些生物活性部分，该专利的内容引入本文作为参考。
在本发明的一个方面，生物活性化合物适合于治疗动物如哺乳动物(包括人)的医疗或者诊断用途，以用于治疗需要这种治疗的症状。
另一方面，含有胺-、羟基-或巯基-的生物活性部分也在本发明的范围之内。对适于本发明的生物活性部分的类型的限制，仅在于存在至少一个可以反应并与载体部分相连的羟基-或者巯基-，并且在缀合到本文所述聚合物递送系统的形式下基本不存在生物活性损失。
作为选择，适于包含在本发明的聚合物转运缀合化合物中的母体化合物，可以在从偶联化合物水解释放之后是活性的，也可以在水解释放之后是非活性的但在经历进一步的化学过程/反应之后是活性的。例如，通过聚合物转运系统递送至血流的抗癌药，可以在进入癌或肿瘤细胞之前一直保持为非活性的，并且在进入时通过癌或肿瘤细胞化学活化，例如通过只有该细胞才有的酶反应活化。
在一个优选实施方案中，本文所述聚合物运输系统包含药学活性化合物。
对于本发明而言，应当理解，药学活性化合物包括小分子量分子。通常，药学活性化合物具有小于约1500道尔顿的分子量。这种化合物的非限定性举例包括DNA拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱及类似物，紫杉烷和紫杉醇衍生物，包括AZT和无环鸟苷的核苷，包括柔红霉素和多柔比星的蒽环类化合物，包括Ara-C(阿糖胞苷)和吉西他滨的相关抗代谢化合物，等等。
1.紫杉烷和紫杉烷衍生物
本发明的前药组合物中所包含的一类化合物是紫杉烷。对于本发明而言，术语″紫杉烷″包括紫衫烷族的萜内的所有化合物。因而，在本发明的范围内包括例如得自密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical的(紫杉醇)，3′-取代的叔丁氧基羰基胺衍生物等，以及可得到的其它类似物。
已经发现这些化合物是有效的抗癌剂。大量研究表明，该抗癌剂对若干恶性肿瘤具有活性。到目前为止，其应用尤其受限于它们的供应短缺以及不良的水溶性和超敏反应。应当理解，其它紫杉烷，包括共同受让的美国专利5622986和5547981中所公开的7-芳基-氨基甲酸酯和7-肼基甲酸酯在内，同样包括在本发明的前药中。前述美国专利的内容引入本文作为参考。
尽管实施例中为了说明而格外地描述了紫杉醇，但是应当理解，本文所述方法适用于所有的紫杉烷及相关的分子。
2.喜树碱及相关的拓扑异构酶I抑制剂
喜树碱是水不溶性细胞毒生物碱，其产于中国的旱莲树(camptotecaaccuminata)和印度的臭味假柴龙树(nothapodytes foetida)。同样知道喜树碱和相关化合物以及类似物是潜在的抗癌剂或抗肿瘤剂，并且已经表明具有体内和体外活性。喜树碱和相关的化合物同样是转化成本发明的前药的候选物。参见，例如，美国专利5004758和Hawkins，Oncology，1992年12月，第17-23页。喜树碱及有关类似物为例如托泊替康(Topotecan)、依立替康(Itinotecan)(CPT-11)或SN38。
其它的喜树碱类似物包括文献中报导的那些，包括10-羟基喜树碱，11-羟基喜树碱和/或10，11-二羟基喜树碱，7-和/或9-烷基、取代烷基、环烷基、烷氧基、烯基、氨基烷基等喜树碱，A-环取代的喜树碱如10，11-亚烷二氧基喜树碱，例如美国专利5646159中公开的那些，该专利的内容引入本文作为参考。
在本发明的一个优选实施方案中，细胞毒剂为SN38。
3.寡核苷酸
为了更完全理解本发明的范围，定义下列术语。本领域的技术人员会理解，术语″核酸″或″核苷酸″适用于脱氧核糖核酸(“DNA”)，核糖核酸(“RNA”)，及其任何化学修饰，无论其为单链或是双链的，除非另有说明。“寡核苷酸”通常为较短的多核苷酸，例如长度大小约2至约200个核苷酸，或更优选长度大小约10至约30个核苷酸。根据本发明的寡核苷酸通常为合成的核酸，并且为单链的，除非另有说明。术语“多核苷酸”和“多核酸”在本文中也可以同义使用。
本发明的寡核苷酸的修饰包括，例如，选定核苷酸被允许寡核苷酸共价连接至所需聚合物上的官能团或部分的加成或者取代，和/或向寡核苷酸中引入另外的电荷、极化度、氢键、静电相互作用和官能团的官能部分的加成或者取代。这种修饰包括但不限于2′-位糖修饰，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，环外胺的修饰，4-硫代尿苷的取代，5-溴或5-碘尿嘧啶的取代，主链修饰，甲基化，碱基配对组合如异碱基(isobase)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)，及类似组合。寡核苷酸修饰还可包括3′和5′修饰如加帽。核苷类似物的非限定性举例包括：
Figure A20078004258700521
核苷类似物的更多实例参见Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，其各自的内容引入本文作为参考。
术语“反义”，如本文中所使用的，是指与编码基因产物或者编码控制序列的特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”用于指与“有义链”互补的核酸链。在细胞代谢的正常运转中，DNA分子的有义链是编码多肽和/或其它基因产物的链。有义链充当合成信使RNA(“mRNA”)转录物(反义链)的模板，后者又指导合成任何编码的基因产物。反义核酸分子可通过本领域任何已知的方法制备，包括按病毒启动子的反向连接感兴趣的基因而进行的合成，这允许合成互补链。一旦引入到细胞中，该转录的链即与细胞产生的天然序列结合形成双链体。这些双链体随后阻断进一步的转录或翻译。按这种方式，可以产生突变的表型。在本领域还公知的是，标识“负”或者(-)是指反义链，而“正”或者(+)是指有义链。
在一优选实施方案中，缀合的选择是寡核苷酸(或者“多核苷酸”)，且缀合之后，靶指的是寡核苷酸的残基。寡核苷酸可选自具有磷酸二酯骨架或者硫代磷酸酯骨架的任何已知寡核苷酸和寡脱氧核苷酸。
寡核苷酸或者寡核苷酸衍生物可包括长度为约10至约1000个核酸，优选相对短的多核苷酸，例如长度为约2至约200个核苷酸，或更优选长度为约10至约30个核苷酸。
此外，可用于本发明的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸包括但不限于下列内容：
具有天然磷酸二酯骨架、硫代磷酸酯骨架或者任何其它修饰骨架类似物的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸；
LNA(锁核酸)；
PNA(具有肽骨架的核酸)；
短干扰RNA(siRNA)；
微RNA(miRNA)；
具有肽骨架的核酸(PNA)；
磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)；
三环-DNA；
诱捕ODN(decoy ODN)(双链寡核苷酸)；
催化的RNA序列(RNAi)；
核酶；
适配体；
镜相异构物(spiegelmer)(L-构象寡核苷酸)；
CpG寡聚物等，如下列文献中所公开的那些：
Tides 2002，Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences，2002年5月6-8日，Las Vegas，NV；及
Oligonucleotide & Peptide Technologies，18th & 19th 2003年11月，Hamburg，Germany，其内容引入本文作为参考。
根据本发明的寡核苷酸还可以任选包括本领域中已知的任何适宜的核苷酸类似物和衍生物，包括下面表1中所列出的那些：
Figure A20078004258700541
优选地，寡核苷酸包含于靶肿瘤细胞中或者涉及向下调节肿瘤细胞抵抗抗癌治疗中所涉及的蛋白。例如，本发明可以使用本领域已知的任何细胞蛋白质，如通过反义寡核苷酸向下调节的BCL-2，以用于癌症治疗。参见2004年4月9日提交的美国专利申请10/822205，其内容引入本文作为参考。优选的治疗用寡核苷酸的非限制性举例包括反义HIF-1α寡核苷酸和反义存活蛋白(Survivin)寡核苷酸。
在一个优选实施方案中，寡核苷酸可以是例如具有与Genasense(a/k/a奥利默森钠(oblimersen sodium)，Genta Inc.，Berkeley Heights，NJ制备)相同或基本上类似的核苷酸序列的寡核苷酸。Genasense为18-聚体硫代磷酸反义寡核苷酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQ ID NO：6)，其与人bcl-2mRNA(人bcl-2mRNA是本领域已知的，并且例如在美国专利6414134中描述为SEQID NO：19，该专利引入本文作为参考)的起始序列的最初六个密码子互补。美国食品和药物管理局(FDA)在2000年8月授予Genasense罕见病用药(Orphan Drug)认证。优选实施方案包括：
(i)反义存活蛋白LNA(SEQ ID NO：3)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c；
其中大写字母代表LNA，“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(ii)反义Bcl2siRNA：
有义5′-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3′(SEQ ID NO：4)
反义3′-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5′(SEQ ID NO：5)
其中dT代表DNA；
(iii)Genasense(硫代磷酸酯反义寡核苷酸)：(SEQ ID NO：6)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
其中小写字母代表DNA，且“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(iv)反义HIF1αLNA(SEQ ID：7)
5′sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′(SEQ ID NO：7)
其中大写字母代表LNA，且“s”代表硫代磷酸酯骨架。
LNA包括2′-O，4′-C亚甲基二环核苷酸，如下面所示：
Figure A20078004258700551
有关存活蛋白LNA的详细说明参见美国专利申请11/272124(题为“LNAOligonucleotides and the Treatmemt of Cancer”)和10/776934(题为“OligomericCompounds for the Modulation Survivin Expression”)，其各自的内容引入本文作为参考。还可参见美国专利申请10/407807(题为“Oligomeric Compounds forthe Modulation HIF-1 Alpha Expression”)和11/271686(题为“Potent LNAOligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression”)，其各自的内容同样引入本文作为参考。
用于本文所述化合物中的寡核苷酸可以用(CH2)w氨基连接基于寡核苷酸的5′或者3′末端进行修饰，其中w在该方面是优选为约1至约10的正整数，更优选为6。本文所述化合物中预期的修饰寡核苷酸可以是NH-(CH2)w-寡核苷酸。
在一优选实施方案中，对siRNA的有义链的5′末端进行修饰。例如，将聚合缀合物中所采用的siRNA用5′-C6-NH2修饰。本发明的一个具体实施方案中采用具有如下序列的Bcl2-siRNA：
有义5′-(NH2-C6)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3′；
反义3′-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5′。
在另一优选实施方案中，本文所述化合物可包括用含有位阻酯的(CH2)w氨基连接基修饰的寡核苷酸。参见美国临时申请60/844942(题为“Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers”)，其内容引入本文作为参考。聚合化合物可以释放没有氨基尾的寡核苷酸。例如，该寡核苷酸可具有如下结构：
Figure A20078004258700561
其中w为约1至约10的正整数，优选为约6。
在又一优选实施方案中，寡核苷酸可用(CH2)w巯基连接基修饰(硫代寡核苷酸)。硫代寡核苷酸可用于直接或者通过马来酰亚胺基缀合到正电荷肽的半胱氨酸上。硫代寡核苷酸可具有SH-(CH2)w-寡核苷酸结构。硫代寡核苷酸还可以包括具有如下结构的位阻酯：
Figure A20078004258700562
修饰的寡核苷酸的实例包括：
(i)用C6-NH2尾修饰的Genasense：
5′-NH2-C6-stscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3′
Figure A20078004258700563
(ii)用C6-NH2尾修饰的反义HIF1αLNA：
5′-NH2-C6-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′；
(iii)用C6-NH2尾修饰的反义存活蛋白LNA：
5′-NH2-C6-s mCsTs mCsAsastscscsastsgsgs mCsAsGsc-3′；
(iv)用C6-SH尾修饰的反义存活蛋白LNA：
5′-HS-C6-s mCsTs mCsAsastscscsastsgsgs mCsAsGsc-3′；
(v)用位阻酯尾修饰的Genasense：
Figure A20078004258700571
4.其它生物活性部分
除了前述分子之外，本发明的化合物可利用很多其它化合物制备。例如，可包含生物活性化合物，如含OH基团的顺铂衍生物、氟尿苷、鬼臼毒素及相关的化合物。
其它可以使用的母体化合物包括例如某些低分子量生物活性蛋白、酶和肽(包括肽聚糖)，以及其它抗肿瘤剂，心血管药如福斯高林(forskolin)，抗新生瘤药如考布他丁、长春碱、长春新碱、多柔比星、AraC、美登素(maytansine)等，抗感染药如万古霉素等，抗真菌药如制霉菌素或两性霉素B，抗炎药，甾体药，等等。
前述是适于本发明的前药的生物活性部分的说明。
F.固定连接基和可释放连接基(L1和L3)
L1和L3连接基包括双官能连接基。该双官能连接基可以是固定连接基或者可释放连接基。双官能连接基包括氨基酸或氨基酸衍生物。氨基酸可以是天然存在和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及各种已知的非天然存在的氨基酸(D或L)，疏水或亲水的，同样包括在本发明的范围内。非天然存在的氨基酸的适宜的非限定性举例包括2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，2-氨基丁酸，4-氨基丁酸，哌啶酸(piperidinic acid)，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2-氨基异丁酸，3-氨基异丁酸，2-氨基庚二酸，2，4-氨基丁酸，锁链素，2，2-二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸，异锁链素，别-异亮氨酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，N-甲基-异亮氨酸，6-N-甲基-赖氨酸，N-甲基缬氨酸，正缬氨酸，正亮氨酸，及鸟氨酸。某些优选的氨基酸残基选自甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和肌氨酸，更优选甘氨酸。
作为选择，L1和L3可以选自：
-[C(＝O)]v(CR22R23)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-O[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-NR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′O[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t′NR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′O[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R29O)t′NR26[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t′O[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t′[C(＝O)]v′-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t′NR26[C(＝O)]v′-，
Figure A20078004258700591
式中：
R21-29独立地选自：氢，C1-6烷基，C3-12支链烷基，C3-8环烷基，C1-6取代烷基，C3-8取代环烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，C1-6杂烷基，取代的C1-6杂烷基，C1-6烷氧基，苯氧基，及C1-6杂烷氧基；
(t)和(t′)独立地为0或正整数，优选为0或者约1至约12的整数，更优选为约1至约8的整数，且最优选为1或2；及
(v)和(v′)独立地为0或1。
优选地，所述双官能连接基选自：
-[C(＝O)]rNH(CH2)2CH＝N-NHC(＝O)-(CH2)2-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s′[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s′[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s′[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s′[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNHCH2CH2NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)2O[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)3[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)O[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3NH[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3O[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rCH2NHCH2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rCH2OCH2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rCH2SCH2[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]rS(CH2)3[C(＝O)]r′-，
-[C(＝O)]r(CH2)3[C(＝O)]r-，
Figure A20078004258700601
其中(r)和(r′)独立地为0或1，条件是(r)和(r′)二者不同时为0。
1.可释放连接基
在本发明的一个优选实施方案中，本文所述化合物包含连接到可释放连接基的生物活性部分。本发明的一个优点是生物活性部分可以受控方式释放。
可释放连接基可以是基于苄基消除的连接基(benzyl elimination-basedlinker)，基于三烷基锁定(trialkyl lock-based)(或者基于三烷基锁定内酯化(trialkyl lock lactonization based))的连接基，基于N-二(羟乙基)甘氨酸的连接基(bicine-based linker)，酸不稳定连接基，溶酶体可裂解的肽(lysosomallycleavable peptide)，及半胱氨酸蛋白酶B可裂解的肽(capthepsin B cleavablepeptide)。酸不稳定连接基可以是含二硫键、腙的连接基和含硫代丙酸(thiopropionate)的连接基。
作为选择，可释放连接基是细胞内不稳定连接基，细胞外连接基，及酸不稳定连接基。酸不稳定连接基如腙连接基可以在酸性溶酶体环境中水解。一些合适的可释放连接基为寡肽，包括例如Val-Cit、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly及Phe-Lys。一种优选的可释放连接基为肽基连接基(Val-Cit)，其可以被半胱氨酸蛋白酶B特异性地降解。优选L3包括可释放连接基。
优选的可释放连接基包括：
Figure A20078004258700612
-Val-Cit-，
-Gly-Phe-Leu-Gly-，
-Ala-Leu-Ala-Leu-，
-Phe-Lys-，
Figure A20078004258700622
Figure A20078004258700631
-Val-Cit-C(＝O)-CH2OCH2-C(＝O)-，
-Val-Cit-C(＝O)-CH2SCH2-C(＝O)-，及
-NHCH(CH3)-C(＝O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(＝O)-，
其中
Y11-19独立地为O，S或NR48；
R31-48，R50-51和A51独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基、及C1-6杂烷氧基；
Ar为芳基或杂芳基部分；
L11-15是独立选取的双官能间隔基；
J和J′独立地选自：主动运输至靶细胞中的部分，疏水部分，双官能连接部分，及其组合；
(c11)、(h11)、(k11)、(111)、(m11)和(n11)是独立选取的正整数，优选1；
(a11)、(e11)、(g11)、(j11)、(o11)和(q11)独立地为0或者为正整数，优选为1；及
(b11)，(x11)，(x′11)，(f11)，(i11)和(p11)独立地为0或者为1。
很多可释放连接基，基于苄基消除或基于三烷基锁定的连接基，参见例如共同受让的美国专利6180095，6720306，5965119，6624142和6303569，其各自的内容引入本文作为参考。基于N-二(羟乙基)甘氨酸的连接基还记载在共同受让的美国专利7122189和7087229以及美国专利申请10/557522、11/502108和11/011818中，其各自的内容引入本文作为参考。
优选地，包括寡核苷酸的生物活性化合物通过酸不稳定连接基连接到本文所述化合物的聚合物部分。抛开任何理论限制，酸不稳定连接基促进寡核苷酸在细胞中特别是溶酶体、内含体或大胞饮体中自母体聚合物的释放。
2.固定连接基
在本发明的优选方面，靶向部分如SCA通过固定连接基连接到多官能连接基上。固定连接基能够缀合靶向部分和多官能连接基。一个优选的固定连接基可以是能够提供硫醚键的类似于含马来酰亚胺基的分子。
含马来酰亚胺基的固定连接基可选自：
Figure A20078004258700641
在可供选择的实施方案中，固定连接基包括与上面所示那些相对应的结构，但是不具有马来酰亚胺基而是具有下述基团，如乙烯基，砜的残基，氨基，羧基，巯基，酰肼，氨基甲酸基(carbamate)等以代替马来酰亚胺基。
G.离去基团和官能团
在一些方面，适宜的离去基团包括但不限于卤素(Br、Cl)，活化的碳酸酯(activated carbonate)，羰基咪唑，环状酰亚胺硫酮，异氰酸酯，N-羟基琥珀酰亚胺基，对硝基苯氧基，N-羟基邻苯二甲酰亚胺，N-羟基苯并三唑基，咪唑，甲苯磺酸基(tosylate)，甲磺酸基(mesylate)，三氟乙基磺酸基(tresylate)，硝基苯磺酸基(nosylate)，C1-C6烷氧基，C1-C6烷酰氧基，芳基羰氧基，邻硝基苯氧基，N-羟基苯并三唑基，咪唑，五氟苯氧基，1，3，5-三氯苯氧基，及1，3，5-三氟苯氧基，或者本领域的普通技术人员显而易见的其它适宜离去基团。
对于本发明而言，离去基团应当理解为那些能够与期望的靶(即生物活性部分和靶向部分)上的亲核物(nucleophile)反应的基团。
在某些优选实施方案中，将聚合物运输系统连接到生物活性部分上的官能团包括马来酰亚胺基，乙烯基，砜的残基，氨基，羧基，巯基，酰肼，肼基甲酸基等，它们可以进一步地偶联到生物活性基团或靶向基团上。
对于本发明而言，当D1或D2为官能团时，L1和L3基团不为官能部分。
在一个优选实施方案中，官能团可以是马来酰亚胺基，且离去基团可选自OH、甲氧基、叔丁氧基、对硝基苯氧基和N-羟基琥珀酰亚胺基。
H.对应于式(I)的优选实施方案
一些通过本文所述方法制备的具体实施方案包括：
Figure A20078004258700671
Figure A20078004258700681
式中
mPEG具有式CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；
(n)为约10至约2300的正整数；
R51和R52独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、苯氧基、及C1-6杂烷氧基；
D1为靶向部分，官能团或者离去基团；及
D2为生物活性部分，官能团或者离去基团。
根据本发明的优选的聚合化合物包括：
Figure A20078004258700691
Figure A20078004258700701
Figure A20078004258700711
Figure A20078004258700731
Figure A20078004258700741
Figure A20078004258700761
Figure A20078004258700771
Figure A20078004258700781
Figure A20078004258700791
Figure A20078004258700801
Figure A20078004258700811
Figure A20078004258700821
式中
S-SCA为单链抗体；
RGD为
Figure A20078004258700831
LNA为锁核酸；
叶酸为下式的残基：
Figure A20078004258700832
SN38为7-乙基-10-羟基喜树碱；
mPEG具有式CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；及
(n)为约10至约2300的正整数。
I.制备缀合物的方法
一般地，缀合物可通过依次将聚合物、细胞毒剂和靶向部分连接至多官能连接基上而制得。添加的准确顺序并不限于该顺序，且这是本领域的普通技术人员容易明白的，在一些方面，PEG先添加到多官能连接基上，接着添加可释放连接的细胞毒药物，再接着添加靶向剂如单克隆抗体。涉及该实施方案的某些优选方面的具体内容提供于下面的实施例中。
在本发明的一个方面，具有多官能连接基的聚合化合物可如此制备，即令具有OH或离去基团末端的聚合化合物与亲核试剂缀合，该亲核试剂含有通过任选连接基连接的细胞毒剂。技术人员可以使用数量比聚合物上的离去基团数目少的亲核试剂，形成含有细胞毒剂和离去基团二者的聚合物中间体。该中间体进一步与靶向部分反应，形成被细胞毒剂和靶向剂多取代的聚合缀合物。
作为选择，聚合物可用不同的基团活化以对不同的亲核部分提供不同的化学反应性。例如，不同的保护基，如羧酸末端的tert-Bu酯和甲基酯，可以选择性地和分步地去保护，以提供不同活性程度的基团，进而与不同的生物活性剂如细胞毒剂和靶向剂缀合。如图1中所示，马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基酯可分别选择性地与含SH或NH2的部分反应。
本文所述的所有反应均为标准的化学反应，本领域的技术人员知道其必要的步骤和条件。因此，本文所述的合成反应无需过度的实验。
制备包含多官能连接基的聚合缀合物的方法包括：
使式(IIIa)的化合物：
Figure A20078004258700841
与式(IIIb)的含有生物活性部分的化合物：
M3-(L3)b-D22
在足以形成式(IIIc)的化合物的条件下反应：
Figure A20078004258700842
式中
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
A21为封端基团或者
A22为封端基团或者
Figure A20078004258700844
M1为官能团；
D22为生物活性部分；
M2为OH或者离去基团；
M3为OH，NH2，或者SH；
L1为固定连接基或者可释放连接基；
L2为多官能连接基；
L3为固定连接基或者可释放连接基；及
(a)和(b)独立地为0或正整数。
该方法还包括：
使式(IIIc)的化合物：
Figure A20078004258700851
与具有式(IIId)的含有亲核部分的部分：
D21-M4(IIId)
在足以形成式(IIIe)的化合物的条件下反应：
Figure A20078004258700852
式中：
A23为封端基团或者
Figure A20078004258700853
M1为官能团；
D21为靶向部分；及
M4为OH，NH2，或者SH。
亲核化合物如式(IIIb)与PEG或其它聚合物的连接，可利用本领域的普通技术人员公知的标准化学合成方法进行。活化的聚合物部分如SC-PEG、PEG-胺、PEG酸等可从商业来源得到，也可以由技术人员在无需过度实验的情况下合成。
亲核化合物如式(IIIb)与聚合物部分的连接优选在偶合剂存在下进行。适宜偶合剂的非限定性举例包括：1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)，任何适宜的二烷基碳二亚胺，2-卤素-1-烷基-吡啶鎓卤化物(Mukaiyama试剂)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，丙烷膦酸环酐(PPACA)，及二氯磷酸苯酯等，它们可从商业来源如Sigma-Aldrich Chemical得到，也可以利用已知的方法合成。
优选地，反应在惰性溶剂如二氯甲烷、氯仿、DMF或其混合物中进行。反应可优选在碱如二甲氨基吡啶(DMAP)、二异丙基乙基胺、吡啶、三乙基胺等存在的条件下进行，以中和所生成的酸。反应可以在约0℃到高至约22℃(室温)的温度下进行。一些通过本文所述方法制备的具体实施方案包括：
H.治疗的方法
在本发明可供选择的方面，还提供治疗哺乳动物的方法，包括将有效量的含有本发明的式(I)化合物的药物组合物向需要它的患者给药。
在本发明的一个优选方面，还提供治疗患有恶性肿瘤或癌症的患者的方法，包括将有效量的含有本发明的式(I)化合物的药物组合物向需要它的患者给药。在一些方面，欲治疗的癌症可以是下列中的一种或多种：实体瘤，淋巴瘤，小细胞肺癌，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，胰腺癌，恶性胶质瘤，卵巢癌，胃癌等。该组合物可用于治疗哺乳动物的肿瘤性疾病，减轻肿瘤负担，预防赘生物转移，及预防肿瘤复发/赘生物生长。
本发明的另一方面提供治疗哺乳动物多种医疗症状的方法。简而言之，能够连接到PEG聚合物上的任何生物活性部分，均可向需要这种治疗的哺乳动物给药。在非缀合状态具有治疗效果的任何寡核苷酸等，均可以其缀合物形式使用，并按本文所述制备。
组合物的给药量取决于其中所包含的母体分子。一般地，前药在所述治疗方法中的用量是有效实现所需哺乳动物治疗结果的量。自然地，各种前药化合物的剂量会随母体化合物、体内水解速度、聚合物的分子量等而变化。本领域的技术人员可以根据临床经验和治疗表现，确定所选择的聚合物递送偶联物的最佳剂量。实际剂量对于技术人员而言是显而易见的，无需过度的实验。
本发明的化合物可包含于一种或多种适于向哺乳动物给药的药物组合物中。药物组合物可以呈溶液、混悬液、片剂、胶囊等形式，并可根据本领域公知的方法制备。还期望的是，这些组合物的给药可通过口服和/或胃肠外途径进行，这取决于技术人员的需要。可以通过例如静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射等已知的方法，利用组合物的溶液和/或混悬液作为例如注射或渗透组合物的载体。这种给药还可以是灌注到体间隙或体腔中，以及吸入和/或鼻内途径。然而，在本发明的优选方面，聚合缀合物通过胃肠外向需要它的哺乳动物给药。
在本发明的又一方面，提供将多核苷酸(寡核苷酸)，优选反义寡核苷酸向哺乳动物细胞给药的方法。该方法包括：依据多核苷酸对这类症状的功效，将有效量的按本文所述制备的缀合物递送至欲治疗的症状。例如，如果非缀合的寡核苷酸(如反义BCL2寡核苷酸，反义存活蛋白寡核苷酸)具有对抗某些癌症或赘生细胞的功效，则该方法包括将含寡核苷酸的聚合缀合物递送至对本身寡核苷酸敏感的细胞。该递送可以作为适宜药物组合物的一部分在体内进行，或者在体外环境中直接递送至细胞。在一个具体的治疗中，可以使用包含寡核苷酸(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和3，及SEQ ID NO：4)的聚合缀合物。
实施例
下面的实施例用来进一步来理解本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例中的黑体数字与图1中所示的相对应。整个实施例中使用缩写词，如DCC(二环己基碳二亚胺)，DCM(二氯甲烷)，DCU(二环己基脲)，DIEA(二异丙基乙基胺)，DIPC(二异丙基碳二亚胺)，DMAP(4-二甲基氨基吡啶)，DMF(N，N′-二甲基甲酰胺)，DSC(二琥珀酰亚胺基碳酸酯)，EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉)，IPA(异丙醇)，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，NMM(N-甲基吗啉)，PEG(聚乙二醇)，SCA-SH(单链抗体)，SN38(7-乙基-10-羟基喜树碱)，TBDPS(叔丁基二丙基甲硅烷基)，及TEA(三乙胺)。
一般方法。所有反应均在干燥的氮气或氩气气氛下进行。使用商业试剂，不进一步纯化。所有PEG化合物在使用前均真空干燥或者用甲苯共沸蒸馏。1H NMR光谱在300MHz下得到，13C NMR光谱在75.46MHz下得到，采用Varian Mercury 300NMR光谱仪，并采用氘化氯仿作为溶剂，除非另有说明。化学位移(δ)以距四甲基硅烷(TMS)低场的百万分之几(ppm)来表示。
HPLC方法。反应混合物以及中间体和最终产物的纯化通过BeckmanCoulter System
Figure A20078004258700871
HPLC仪器监测。其采用装有168二极管阵列UV检测器的
Figure A20078004258700872
300SB C8反相色谱柱(150×4.6mm)或者Phenomenex
Figure A20078004258700873
300A C18逆相色谱柱(150×4.6mm)，采用10～90％乙腈于0.05％三氟乙酸(TFA)中的梯度，流速为1mL/分钟)。
实施例1：N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(化合物1)。
在0℃，将氯甲酸甲酯(4.4mL，56.7mmol，1当量)加到马来酰亚胺(5.5g，56.7mmol，1当量)和NMM(6.2mL，56.7mmol，1当量)于200mL EtOAc中的溶液中。将该混悬液在0℃搅拌30分钟，过滤并用EtOAc洗涤。将滤液和洗涤液合并，用冷水洗涤，并用无水Na2SO4干燥。过滤和真空蒸发之后，得到粉红色固体。通过硅胶柱色谱(己烷-EtOAc，1∶1，v/v)进行纯化，得到产物(4.8g，55％)。
实施例2：Nε-马来酰基-α-(Boc)-L-赖氨酸(化合物2)。
在0℃，将N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(315mg，2.03mmol，1当量)加到Boc-L-赖氨酸(500mg，2.03mmol，1当量)于10mL饱和的NaHCO3水溶液中的溶液中。将该混合物在0℃剧烈搅拌40分钟，并于室温再搅拌1小时。待冷却至0℃之后，用浓H2SO4将该溶液酸化至pH 3.0，然后用乙酸乙酯萃取。合并有机层并用无水MgSO4干燥。待在真空中除去溶剂之后，剩余物通过硅胶柱色谱进行纯化，采用CHCl3-MeOH混合物(5∶1，v/v)，得到产物(458mg，69％)：1H NMRδ1.39-1.87(6H，m，(CH2)3)，1.44(9H，s，Boc)，3.52(2H，t，J＝7.2Hz，NCH2)，4.25-4.30(1H，m，CH)，5.15(1H，d，NH)，6.70(2H，s，马来酰亚胺)。
实施例3：Nε-马来酰基-α-L-赖氨酸(化合物3)。
在室温，将Nε-马来酰基-α-(Boc)-L-赖氨酸(172mg，0.53mmol)于5mL无水DCM中的溶液用10mL 2N HCl的乙醚溶液处理1小时，然后加入10mL无水乙醚。将所得固体过滤，得到82mg(59％)的Nε-马来酰基-α-L-赖氨酸HCl盐：1H NMR(CD3OD)δ1.36-1.54(2H，m，CH2)，1.65(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，1.83-2.02(2H，m，CH2)，1.44(9H，s，Boc)，3.53(2H，t，J＝6.9Hz，NCH2)，3.95(1H，t，6.2Hz，CH)，6.82(2H，s，马来酰亚胺)；13CNMR(CD3OD)δ23.17，29.03，31.01，37.96，135.26，172.34，175.20。
实施例4：5KmPEG-酰胺-Lys(Nε-马来酰基)-COOH(化合物4)。
向5KmPEGCOONHS(805mg，0.16mmol，1当量)于8mL无水DCM中的溶液中加入于2mL DMF中的Nε-马来酰基-α-L-赖氨酸(3,82mg，0.31mmol，2当量)，接着加入DIEA(109μL，0.62mmol，4当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，过滤并真空蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶。13C NMR(CDCl3)：δ22.53，28.02，31.69，37.32，51.18，58.86，70.11-71.73(PEG)，133.84，169.51，170.38，172.41。
实施例5：5KmPEG-酰胺-Lys(Nε-马来酰基)-NHS(化合物5)。
在0℃，将于DCM中的5KmPEG-Lys(Nε-马来酰基)-COOH(4)和NHS用DCC处理。该混合物在室温搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂，剩余物用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶。
实施例6：5KmPEG-氨基甲酸酯-Lys(Nε-马来酰基)-COOH(化合物6)。
向5KmPEGCOONHS(5g，0.98mmol，1当量)于45mL无水DCM中的溶液中加入于5mL DMF中的Nε-马来酰基-α-L-赖氨酸(3,514mg，1.95mmol，2当量)，然后加入DIEA(0.7mL，3.92mmol，4当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，过滤并真空蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到化合物6：13C NMRδ22.30，28.01，31.89，37.29，53.26，58.89，64.06，69.31-71.77(PEG)，133.87，155.60，170.42，172.82。
实施例7：5KmPEG-氨基甲酸酯-Lys(Nε-马来酰基)-NHS(化合物7)。
在0℃，向5KmPEG-氨基甲酸酯-Lys(Nε-马来酰基)-COOH(6,1g，0.19mmol，1当量)和NHS(88mg，0.76mmol，4当量)于10mL DCM中的溶液中加入DIPC(118μL，0.76mmol，4当量)。该混合物在室温搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂，剩余物用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到化合物7：13C NMRδ22.31，25.90，28.25，32.39，37.44，52.42，59.30，64.92，69.64-72.18(PEG)，134.25，155.59，167.75，168.55，170.91。
实施例8：化合物8。
向5′extGS(5mg，0.85μmol)于PBS缓冲液(2.5mL，pH 7.8)中的溶液中加入化合物7(92mg，17μmol，20当量)，并将该混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物用水稀释至10mL，过滤并加载到Poros HQ强阴离子交换柱(10mm×1.5mm，柱床体积～16mL)上，该交换柱用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0，缓冲液A)预平衡。将该交换柱用3～4倍柱体积的缓冲液A洗涤，以除去过量的PEG连接基。然后将产物用0～100％的1M NaCl于20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.0，缓冲液B)中的梯度液洗脱10分钟，接着用100％缓冲液B洗脱10分钟，流速为10mL/分钟。洗脱的产物用HiPrep脱盐柱(50mL)脱盐并冻干，得到化合物8(相当于1mg寡核苷酸，40％收率)。
实施例9：化合物9。
向化合物8(相当于1mg寡核苷酸)于PBS缓冲液(1mL，pH 7.0)中的溶液中加入肽cRGDfC(1mg，1.7μmol)，并将该混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物用水稀释至20mL并加载在Poros HQ强阴离子交换柱(10mm×1.5mm，柱床体积～16mL)上，该交换柱用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0，缓冲液A)预平衡。将该柱用3～4倍柱体积的缓冲液A洗涤，以除去过量的PEG连接基。然后将产物以0～100％的1M NaCl于20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0，缓冲液B)中的梯度洗脱10分钟，接着用100％缓冲液B洗脱10分钟，流速为10mL/分钟。洗脱的产物用HiPrep脱盐柱(50mL)脱盐并冻干，得到化合物9(相当于0.78mg寡核苷酸，78％收率)。
实施例10：化合物10。
向对氨基-苄醇(1g，8.12mmol，1当量)于80mL无水THF中的溶液中加入DIEA(1.4mL，8.12mmol，1当量)和Boc2O(1.9mL，8.12mmol，1当量)。将该混合物加热回流过夜，然后冷却并在真空下蒸发。将剩余物溶解于EtOAc。有机层用0.1N HCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。粗产物通过硅胶柱色谱(Hex-EtOAc，1∶1，v/v)进行纯化，得到1.85g产物(定量收率)：1H NMRδ0.1.49(9H，s)，2.17(1H，s)，4.53(2H，s)，6.83(1H，s)，7.19(2H，d，J＝8.5Hz)，7.28(2H，d，J＝8.2Hz)；13C NMRδ28.28，64.54，80.37，118.49，127.59，135.31，137.46，152.72。
实施例11：化合物11。
向化合物10(220mg，0.98mmol，1当量)和DIEA(188μL，1.08mmol，1.1当量)于8mL无水DCM中的-20℃溶液中滴加MsCl(84μL，1.08mmol，1.1当量)于2mL无水DCM中的溶液。使该混合物升温至室温，然后搅拌1小时。将反应混合物用饱和NaHCO3溶液、饱和NH4Cl溶液和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。粗化合物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
实施例12：化合物12。
向溶解于15mL无水DMF中的化合物11(0.98mmol，2当量)中加入SN38(192mg，0.49mmol，1当量)和K2CO3(68mg，0.49mmol，1当量)。利用预热的油浴将反应混合物升温至60℃。2小时之后，HPLC表明SN38完全消失和主产物形成。将反应混合物真空蒸发，剩余物溶解于EtOAc，并用水、饱和NH4Cl和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。粗产物通过硅胶柱色谱(CH2Cl2-EtOAc，1∶1，v/v)进行纯化，得到140mg产物(48％收率)：1H NMR(DMSO-d6)δ0.88(3H，t，J＝7.0Hz)，1.27(3H，t，J＝7.3Hz)，1.47(9H，s)，1.85-1.88(2H，m)，3.15-3.17(2H，m)，5.25(2H，s)，5.26(2H，s)，5.42(2H，s)，6.49(1H，s)，7.26(1H，s)，7.41-7.56(6H，m)，8.05(1H，d，J＝9.1Hz)，9.39(1H，s)；13C NMR(DMSO-d6)δ7.65，13.31，22.09，27.96，30.11，49.31，65.05，69.47，72.17，78.84，95.74，103.39，117.71，117.92，122.35，127.44，127.99，128.43，129.59，131.07，139.07，143.46，144.06，145.92，149.21，149.69，152.37，156.46，156.82，172.11。
实施例13：化合物13。
将15％(v/v)的TFA/DCM溶液加到化合物12(535mg)中，并将该混合物在室温搅拌1小时或者直至HPLC表明原料完全消失为止。加入乙醚(200mL)并将所得固体过滤，再用乙醚洗涤(307mg，58％收率)。
实施例14：化合物14。
将化合物13(48mg，0.1mmol，1当量)和15(36mg，0.1mmol，1当量)用EEDQ(48mg，0.2mmol，2当量)处理。在暗处和室温下将该混合物搅拌过夜。在真空下除去溶剂，所得固体剩余物用10mL乙醚研磨。将固体过滤并用硅胶柱色谱(CHCl3∶MeOH，15∶1～9.1)纯化，得到所需产物(8mg，9％收率)：13C NMR(DMSO-d6)δ7.8，13.49，18.11，18.17，18.58，19.13，19.25，22.25，26.51，26.72，28.19，29.59，30.26，30.41，30.50，49.49，51.67，51.80，52.90，55.98，59.26，59.67，63.03，65.21，69.54，72.33，77.91，78.01，95.92，103.63，118.10，118.95，122.52，127.63，128.21，128.58，131.17，131.27，138.53，143.69，144.25，146.10，149.43，149.86，155.15，155.26，156.63，156.97，158.48，158.66，170.39，171.15，171.33，172.15，172.29。
实施例15：Boc-Val-Cit-OH(化合物15)。
将于80mL DME中的Boc-Val-NHS(10g，31.81mmol，1当量)加到L-瓜氨酸(5.85g，33.40mmol，1.05当量)于20mL THF中的溶液和NaHCO3(2.8g，33.40mmol，1.05当量)于80mL水中的溶液中。将该混合物在室温搅拌过夜。加入柠檬酸水溶液(200mL，15％水溶液)，并将该混合物用10％IPA/EtOAc(2×200mL)萃取。将该混悬液用水(2×200mL)洗涤并在真空下蒸发溶剂。所得固体用200mL乙醚研磨并过滤，得到产物(6.08g，51％收率)：1H NMR(CD3OD)δ0.92(3H，d，J＝6.7Hz)，0.97(3H，d，J＝6.7Hz)，1.44(9H，s)，1.51-2.06(5H，m)，3.12(2H，t，J＝6.7Hz)，3.90(1H，d，J＝7.0Hz)，4.37-4.41(1H，m)。13C NMR(CD3OD)：δ18.58，19.83，27.58，28.75，30.03，32.09，40.48，53.33，61.38，80.49，157.75，162.05，174.30，174.69。
实施例16：化合物16(Boc-Val-Cit-PAB)。
将于2∶1的DCM/MeOH(26mL/13mL)中的Boc-Val-Cit(1g，2.67mmol，1当量)和对氨基苄醇(362mg，2.94mmol，1.1当量)用EEDQ(1.32g，5.34mmol，2当量)处理。将该混合物在暗处和室温下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，所得固体剩余物用10mL乙醚研磨。过滤收集固体并用乙醚洗涤，得到产物(900mg，70％)：1HNMR(CD3OD)δ0.93(3H，d，J＝7.0Hz)，0.97(3H，d，J＝7.0Hz)，1.44(9H，s)，1.49-2.06(5H，m)，3.07-3.29(2H，m)，3.91(1H，d，J＝6.7Hz)，4.50-4.55(3H，m)，7.29(2H，d，J＝8.5Hz)，7.54(2H，d，J＝8.5Hz)，8.22(1H，d，J＝7.3Hz)；13C NMR(CD3OD)δ18.64，19.85，27.84，28.75，30.61，31.92，40.28，54.90，54.99，61.73，64.78，80.62，121.09，128.44，138.47，138.55，158.01，162.11，172.00，174.42，174.52。
实施例17：化合物14(Boc-Val-Cit-PABE-SN38)。
向Boc-Val-Cit-PAB(214mg，0.45mmol，1当量)于3mL CH3CN中的混悬液中加入DIEA(0.23mL，1.35mmol，3当量)，接着滴加MsCl(0.1mL，1.35mmol，3当量)于1mL CH3CN中的溶液。1小时之后，TLC表明没有剩余的起始原料(CHCl3-MeOH，5∶1，v/v)。将反应混合物在真空下蒸发，并将所得剩余物溶解于EtOAc。有机相用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。向溶解于5mL的DMF中的粗剩余物中加入SN38(88mg，0.22mmol，0.5当量)和K2CO3(31mg，0.22当量，0.5当量)，并将该混合物在60℃加热3小时。通过HPLC监测产物生成，且其与实施例14中制备的产物一致。
实施例18：化合物17。
将化合物14在DCM中用2N HCl/乙醚处理。待反应完成之后，加入额外的乙醚，过滤所得固体并用乙醚洗涤，得到Val-Cit-PABE-SN38。向化合物5于无水DCM中的溶液中加入于无水DMF中的HCl·Val-Cit-PABE-SN38，接着加入DIEA。将该混合物在室温搅拌过夜。在真空下除去溶剂，所得固体用DCM/乙醚沉淀并用CH3CN/IPA重结晶，得到产物。
实施例19：化合物18。
向化合物17(1当量)于DCM/DMF混合物中的溶液中加入RGDC(2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空下蒸发溶剂。剩余物用DCM/乙醚沉淀并用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例20：化合物19。
向20k4臂PEGSC(7g，0.35mmol，1当量)于60mL无水DCM中的溶液中加入于15mL DMF中的Lys(Boc)-OH(690mg，2.8mmol，2当量)，接着加入DIEA(1mL，5.6mmol，4当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，过滤并真空蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到化合物19：13C NMRδ21.88，27.97，29.04，31.57，39.60，44.98，53.00，63.44，68.86-70.37(PEG)，78.04，155.26，172.89。
实施例21：化合物20。
向4臂-PEG-Lys(Boc)-OH于25mL无水DCM中的溶液中加入4N HCl/二噁烷溶液(25mL)。将反应在室温搅拌4小时，然后在真空下蒸发。剩余物通过加入乙醚而沉淀。将固体过滤并用乙醚洗涤，得到4臂-PEG-Lys-OH(1.77g)：13C NMRδ21.97，26.54，31.22，39.63，45.11，53.16，63.66，69.88-70.51(PEG)，78.04，155.59，172.78。
实施例22：化合物21。
将BocCys(NPys)-OH(300mg，0.80mmol，1当量)和NHS(97mg，0.84mmol，1.05当量)于10mL无水DCM中的溶液在0℃用DCC(173mg，0.84mmol，1.05当量)处理。使该混合物升温至室温并搅拌过夜。滤除固体的DCU副产物。向滤液中加入化合物20(1.7g，0.082mmol，1当量)，接着加入DIEA(114μL，0.66mmol，8当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜并在真空下蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到化合物21(1.5g)：13C NMRδ22.32，25.52，28.27，28.83，31.90，39.03，42.45，45.38，53.41，53.58，63.91，64.37，69.30-72.38(PEG)，80.11，120.98，133.94，142.54，153.34，155.51，155.71，157.28，169.98，173.32。
实施例23：化合物22。
在0℃，向化合物21(1.5g，0.07mmol，1当量)和NHS(125mg，1.09mmol，16当量)于15mL DCM中的溶液中加入DIPC(168μL，1.09mmol，16当量)。将该混合物在室温搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂，剩余物用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物(1.3g)：13C NMRδ22.05，25.76，25.93，28.68，28.92，32.01，38.89，42.49，45.79，52.40，53.97，64.78，69.57-71.77(PEG)，80.47，121.32，134.29，142.93，153.75，155.71，157.60，168.18，169.14，169.71，170.56。
实施例24：化合物23。
(BocPheLys(Fmoc)-OH)。向BocPheOSu(1.5g，4.14mmol，1当量)于DCM(10.3mL)和DMF(10.3mL)中的溶液中加入H-Lys(Fmoc)-OH(1.84g，4.55mmol，1.1当量)，接着加入DIEA(2.9mL，16.56mmol，4当量)。将所得反应混合物搅拌过夜，并用乙酸乙酯稀释。将该溶液用水(30mL×2)和盐水(30mL×2)洗涤。合并有机层，用MgSO4干燥并真空浓缩，得到黄色剩余物。然后将粗剩余物经过采用CHCl3-MeOH(3∶1，v/v)的硅胶色谱，得到产物。MS：[M+1]+616。
实施例25：化合物24。
将化合物13(111mg，0.22mmol，1当量)和16(208mg，0.34mmol，1.5当量)用EEDQ(167mg，0.67mmol，3当量)处理。将该混合物在暗处和室温下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，所得固体剩余物用10mL乙醚研磨。将固体过滤并用硅胶柱色谱(CH2Cl2-EtOAc，1∶1～1∶2，v/v)纯化，得到所需产物(20mg，8％收率)。MS：[M+1]+1095。
实施例26：化合物25。
将化合物24(8当量)用4N HCl/二噁烷处理。将反应在室温搅拌4小时。加入乙醚并过滤固体。将该固体溶解于DMF中并加到化合物22(1当量)于DCM中的溶液中。向该混合物中加入DIEA(16当量)，并将反应在室温搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并将所得固体用DCM/乙醚沉淀且用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例27：化合物26。
向化合物25于DCM中的溶液中加入哌啶。将反应混合物搅拌4小时。在真空下除去溶剂，所得固体用DCM/乙醚沉淀并用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例28：化合物27。
向化合物26(1当量)于DCM/DMF混合物中的溶液中加入RGDC(2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空下蒸发溶剂。剩余物用DCM/乙醚沉淀并用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例29：FmocVal-Cit-OH(化合物28)。
将于15mL DME中的Fmoc-Val-NHS(2.5g，5.73mmol，1当量)加到L-瓜氨酸(1.05g，6.01mmol，1.05当量)于8mL THF中的溶液和NaHCO3(505mg，6.01mmol，1.05当量)于15mL水中的溶液中。将该混合物在室温搅拌过夜。加入柠檬酸水溶液(75mL，15％水溶液)，并将该混合物用10％IPA/EtOAc(2×100mL)萃取。有机层用水(3×100mL)洗涤并真空蒸发溶剂。所得固体用100mL乙醚研磨并过滤，得到产物(1.98g，70％收率)：1H NMR(DMSO-d6)δ0.86(3H，d，J＝6.7Hz)，0.90(3H，d，J＝7.0Hz)，1.40-1.48(2H，m)，1.51-1.75(2H，m)，1.98(1H，sext，J＝6.8Hz)，2.95(2H，q，J＝6.2Hz)，3.93(1H，dd，J＝7.3，8.8Hz)，4.14-4.29(4H，m)，5.40(2H，brs)，5.96(1H，t，J＝5.6Hz)，7.32(2H，t，J＝7.5Hz)，7.39-7.44(3H，m)，7.75(2H，t，J＝6.3Hz)，7.89(2H，d，J＝7.3Hz)，8.19(1H，d，J＝7.3Hz)；13C NMR(DMSO-d6)δ18.31，19.25，26.75，28.40，30.59，46.68，51.91，59.81，64.92，65.65，119.98，125.30，126.94，127.52，140.55，143.61，143.76，155.88，158.58，171.12，173.25。
实施例30：FmocVal-Cit-PAB(化合物29)。
将化合物28(1g，2.01mmol，1当量)和对氨基苄醇(273mg，2.21mmol，1.1当量)于DCM/MeOH混合物(20mL/10mL)中的溶液用EEDQ(996mg，4.03mmol，2当量)处理。将该混合物在暗处和室温下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，所得固体剩余物用10mL乙醚研磨。过滤收集固体并用乙醚洗涤，得到产物(925mg，76％收率)：1H NMR(DMSO-d6)δ0.87(6H，d，t＝7.5Hz)，1.36-1.47(2H，m)，1.51-1.75(2H，m)，1.99(1H，sext，J＝6.7Hz)，2.90-3.04(3H，m)，3.93(1H，dd，J＝7.3，8.8Hz)，4.23-4.38(4H，m)，4.43(2H，d，J＝5.3Hz)，5.13(1H，t，J＝5.6Hz)，5.43(2H，brs)，5.99(1H，t，J＝5.6Hz)，7.23(2H，d，J＝8.5Hz)，7.32(2H，t，J＝7.3Hz)，7.39-7.48(3H，m)，7.54(2H，d，J＝8.5Hz)，7.74(2H，t，J＝6.7Hz)，7.89(2H，d，J＝7.6Hz)，8.12(1H，d，J＝7.3Hz)；13C NMR(DMSO-d6)δ18.34，19.28，26.84，29.56，30.47，46.67，53.05，60.05，62.55，65.65，118.71，119.98，125.23，126.79，126.94，127.51，137.27，137.36，140.55，143.60，143.73，155.93，158.69，170.17，171.06，
实施例31：Val-Cit-PAB(化合物30)。
向化合物29(622mg，1.03mmol)于10mL无水DMF中的溶液中加入哌啶(2mL)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后在真空下蒸发溶剂。剩余物用DCM研磨，过滤所得固体并用DCM洗涤，得到产物(283mg，72％收率)：1H NMR(DMSO-d6)δ0.79(3H，d，J＝6.7Hz)，0.89(3H，d，J＝6.7Hz)，1.38-1.42(2H，m)，1.52-1.68(2H，m)，1.94(1H，sext，J＝6.3Hz)，2.89-3.01(2H，m)，3.05(1H，d，J＝4.7Hz)，4.46(2H，s)，5.09(1H，brs)，5.40(2H，s)，5.98(1H，t，J＝5.3Hz)，7.23(2H，d，J＝8.2Hz)，7.54(2H，d，J＝8.5Hz)，8.14(1H，brs)，10.03(1H，s)；13C NMR(DMSO-d6)δ16.80，19.33，26.53，29.95，31.10，52.31，59.33，62.35，118.61，126.59，137.06，137.14，158.44，170.06，173.69。
实施例32：化合物31。
向化合物22(1.3g，0.06mmol，1当量)于15mL无水DCM和3mL无水DMF中的溶液中加入化合物30(175mg，0.46mmol，8当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后真空蒸发溶剂。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物(1.1g)：13C NMR(CDCl3/CD3OD)δ18.48，19.46，22.85，26.74，28.54，28.94，29.50，30.47，31.81，39.21，42.04，45.79，53.51，54.06，55.32，59.67，64.32，65.04，69.54-70.99(PEG)，80.70，120.23，121.44，127.64，134.31，137.16，142.94，153.86，155.86，156.85，160.44，170.45，171.02，171.87，173.19。
实施例33：化合物32。
向化合物31(1当量)于DCM/DMF混合物(4/1，v/v)中的溶液中加入DSC(16当量)，并将该混合物冷却至0℃。然后加入吡啶(16当量)，并将该混合物逐渐升温至室温且搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂，剩余物用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物。
实施例34：化合物33。
向化合物32中加入多柔比星。将反应混合物在室温搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂，剩余物用DCM/乙醚沉淀，然后用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例35：化合物34。
向化合物33(1当量)于DCM/DMF混合物中的溶液中加入RGDC(2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空下蒸发溶剂。剩余物用DCM/乙醚沉淀并用DMF/IPA重结晶，得到产物。
实施例36：化合物35。
在0℃，向化合物19(6.14g，0.307mmol，1当量)和NHS(283mg，2.456mmol，8当量)于31mL无水DCM中的溶液中加入DCC(507mg，2.456mmol，2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，用硅藻土垫过滤并在真空下蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物(5.69g，86％)：13C NMRδ21.59，25.21，28.11，29.03，31.42，39.36，45.13，51.80，64.07，68.90-70.53(PEG)，155.15，155.58，168.17，168.54。
实施例37：化合物36
向化合物35(5.0g，0.232mmol，1当量)于各自23mL的无水DCM和无水DMF中的溶液中加入HCl.NH2Cys(NPys)-OH(0.77g，2.78mmol，12当量)，接着加入DIEA(0.65mL，3.71mmol，16当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜，并在经过硅藻土垫过滤之后于真空下蒸发。剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物(4.88g，95％收率)：13C NMRδ22.17，28.22，29.27，31.85，39.92，45.22，51.85，54.49，63.98，69.06-70.62(PEG)，78.56，120.87，132.88，142.27，153.44，155.67，156.47，162.14，170.74，171.20。
实施例38：化合物37。
向化合物36(4.38g，0.197mmol，1当量)于DCM(44mL)中的溶液中加入8.8mL的TFA，并将反应混合物在室温搅拌过夜。20小时之后，将反应混合物在真空下蒸发，剩余物先用DCM/乙醚沉淀，然后用CH3CN/IPA重结晶，得到产物(2.1g，49％)：13C NMRδ21.47，26.41，31.64，39.47，45.25，52.32，54.11，63.75，69.12-70.65(PEG)，120.85，133.46，142.25，153.67，155.64，156.39，171.53，171.79。
实施例39：化合物38。
在室温，向叶酸(124mg，0.28mmol，1当量)于3.1mL DMSO中的溶液中加入NHS(71mg，0.616mmol，2.2当量)，接着加入DCC(64mg，0.308mmol，1.1当量)和63μL的三乙胺。将反应混合物在暗处搅拌过夜，并用
Figure A20078004258700981
垫过滤，得到FA-NHS的透明黄色溶液，该溶液用于与连接基偶联的下一偶联步骤。向H2N-Lys(4臂-PEG)CysNPys(37,381mg，0.0175mmol，1当量)于各自4mL的无水DCM和无水DMF中的溶液中加入FA-NHS的DMSO溶 液(如上制备的)，接着加入DIEA(49μL，0.28mmol，16当量)。将反应混合物在室温和暗处搅拌过夜。然后将其用蒸馏水渗析4天。然后将该黄色溶液冻干，得到197mg的最终产物。
实施例40：化合物39。
向C6-硫代-LNA-存活蛋白(寡核苷酸SH(OligoSH))于pH 6.5的磷酸盐缓冲液中的溶液中加入化合物38，并将该溶液在室温搅拌1小时。通过阴离子交换HPLC检查反应进程。将反应混合物用0.2微米过滤器过滤并加载在Poros阴离子交换柱上。梯度洗脱产物，该梯度采用pH 7.0的缓冲体系20mMTris.HCl 2M NaCl。将产物脱盐并冻干。
序列表
<110>安佐制药股份有限公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)
<120>含多官能连接基的靶向聚合物前药
<130>213.1263-PCT
<140>
<141>
<150>60/884,943
<151>2006-09-15
<160>7
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>1
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
  1               5                  10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>2
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
  1               5                  10
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)  (16)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>甲基化胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)
<223>LNA
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)
<223>甲基化胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)
<223>LNA
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(13)
<223>甲基化胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)
<223>LNA
<400>3
ctcaatccat ggcagc                            16
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)  (19)
<223>RNA
<400>4
gcaugcggcc ucuguuugat t                      21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)  (19)
<223>RNA
<400>5
ucaaacagag gccgcaugct t                            21
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<400>6
tctcccagcg tgcgccat                               18
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)  (16)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)  (3)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)  (15)
<223>LNA
<400>7
tggcaagcat cctgta                                 16

Claims (30)

1.式(I)的化合物
Figure A2007800425870002C1
式中：
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
A为封端基团或者
Figure A2007800425870002C2
每个D1独立地选自：靶向部分、官能团和离去基团；
每个D2独立地选自：生物活性部分、官能团和离去基团；
每个L1为独立选取的固定连接基或可释放连接基；
L2为多官能连接基；
每个L3为独立选取的固定连接基或可释放连接基；以及
(a)和(b)独立地为0或正整数。
2.权利要求1的化合物，其中L2选自：
Figure A2007800425870002C3
式中
R2和R′2独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰氧基、芳基羰氧基、C2-6取代烷酰基、取代芳基羰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧基羰基、C2-6取代烷酰氧基和取代芳羰氧基；
(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c’6)、(c”6)、(c7)和(c8)独立地为0或正整数；以及
(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)和(d7)独立地为0或正整数。
3.权利要求2的化合物，其中L2选自：
Figure A2007800425870003C1
4.权利要求2的化合物，该化合物选自：
Figure A2007800425870003C2
Figure A2007800425870004C1
5.权利要求4的化合物，该化合物选自：
Figure A2007800425870004C2
Figure A2007800425870005C1
6.权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自：含-NH2的部分、含-OH的部分、及含-SH的部分。
7.权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自：药学活性化合物、酶、蛋白质、寡核苷酸、抗体、单克隆抗体、单链抗体和肽。
8.权利要求7的化合物，其中该药学活性化合物选自：DNA拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药、DNA损伤剂、抗代谢药、核苷类似物和抗癌药。
9.权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分为寡核苷酸。
10.权利要求9的化合物，其中所述寡核苷酸选自：反义寡核苷酸、锁核酸(LNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适配体、肽核酸(PNA)及磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
11.权利要求9的化合物，其中所述寡核苷酸选自：反义bcl-2寡核苷酸、反义HIF-1α寡核苷酸及反义存活蛋白寡核苷酸。
12.权利要求1的化合物，其中该靶向剂选自：单克隆抗体、单链抗体、细胞粘附肽、细胞穿膜肽、受体配体、靶向糖分子或凝集素、及寡核苷酸。
13.权利要求1的化合物，其中所述靶向剂选自：RGD肽、选择蛋白、TAT、穿膜肽、(Arg)9及叶酸。
14.权利要求1的化合物，其中所述可释放连接基选自：基于苄基消除的连接基、基于三烷基锁定的连接基、N-二(羟乙基)甘氨酸-基连接基、酸不稳定连接基、溶酶体可裂解的肽、及半胱氨酸蛋白酶B可裂解的肽。
15.权利要求1的化合物，其中所述可释放连接基独立地选自：
Figure A2007800425870006C1
-Val-Cit-，
-Gly-Phe-Leu-Gly-，
-Ala-Leu-Ala-Leu-，
-Phe-Lys-，
Figure A2007800425870007C1
-Val-Cit-C(＝O)-CH2OCH2-C(＝O)-，
-Val-Cit-C(＝O)-CH2SCH2-C(＝O)-，及
-NHCH(CH3)-C(＝O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(＝O)-，
式中
Y11-19独立地为O、S或NR48；
R31-48，R50，R100和A51独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、苯氧基及C1-6杂烷氧基；
Ar为芳基或杂芳基部分；
L11-15为独立选取的双官能间隔基；
Z和Z′独立地选自：主动运输至靶细胞中的部分、疏水部分、双官能连接部分，及其组合；
(c11)，(h11)，(k11)，(l11)，(m11)和(n11)是独立选取的正整数；
(a11)，(e11)，(g11)，(j11)，(o11)和(q11)独立地为0或者为正整数；及
(b11)，(x11)，(x′12)，(f11)，(i11)和(p11)独立地为0或者为1。
16.权利要求1的化合物，其中所述固定连接基独立地选自：
17.权利要求1的化合物，其中L1和L3独立地选自：氨基酸、氨基酸衍生物及肽。
18.权利要求1的化合物，其中R1包括直链、末端支化或者多臂的聚环氧烷。
19.权利要求18的化合物，其中所述聚环氧烷选自：聚乙二醇和聚丙二醇。
20.权利要求18的化合物，其中所述聚环氧烷选自：
-Y21-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y21-，
-Y21-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y22)-Y21-，
-Y21-C(＝Y22)-(CH2)a2-Y23-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y23-(CH2)a2-C(＝Y22)-Y21-，及
-Y21-(CR51R52)a2-Y23-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y23-(CR51R52)a2-Y21-，
式中：
Y21和Y23独立地为O、S、SO、SO2、NR53或者化学键；
Y22为O、S或者NR53；
R51-53独立地选自R2的基团；
(a2)和(b2)独立地为0或正整数；及
(n)为约10至约2300的整数。
21.权利要求18的化合物，其中所述聚环氧烷为式-O-(CH2CH2O)n-的聚乙二醇，式中(n)为约10至约2300的整数。
22.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约2000至约100000道尔顿。
23.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约5000至约60000道尔顿。
24.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约5000至约25000道尔顿，或者为约20000至约45000道尔顿。
25.权利要求1的化合物，该化合物选自：
Figure A2007800425870009C1
Figure A2007800425870010C1
Figure A2007800425870012C1
式中
mPEG具有式CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；
(n)为约10至约2300的正整数；
R51和R52独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、苯氧基及C1-6杂烷氧基；
D1为靶向部分、官能团或者离去基团；以及
D2为生物活性部分、官能团或离去基团。
25.权利要求1的化合物，该化合物选自：
Figure A2007800425870013C1
Figure A2007800425870015C1
Figure A2007800425870016C1
Figure A2007800425870018C1
Figure A2007800425870019C1
Figure A2007800425870020C1
Figure A2007800425870022C1
Figure A2007800425870023C1
Figure A2007800425870024C1
Figure A2007800425870025C1
Figure A2007800425870026C1
其中
S-SCA为单链抗体；
RGD为
Figure A2007800425870027C1
LNA为锁核酸；
叶酸为下列残基：
Figure A2007800425870027C2
mPEG具有式CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；以及
(n)为约10至约2300的正整数。
26.一种制备含有多官能连接基的聚合缀合物的方法，包括：
使式(IIIa)的化合物：
Figure A2007800425870027C3
与式(IIIb)的含生物活性部分的化合物：
M3-(L3)b-D22
在足以形成式(IIIc)的化合物的条件下反应：
Figure A2007800425870027C4
其中
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
A21为封端基团或者
Figure A2007800425870027C5
A22为封端基团或者
Figure A2007800425870028C1
M1为官能团；
D22为生物活性部分；
M2为OH或者离去基团；
M3为OH、NH2或SH；
L1为固定连接基或者可释放连接基；
L2为多官能连接基；
L3为固定连接基或者可释放连接基；及
(a)和(b)独立地为0或正整数。
27.权利要求26的方法，还包括：
使式(IIIc)的化合物：
Figure A2007800425870028C2
与具有式(IIId)的含亲核部分的部分：
D21-M4(IIId)
在足以形成式(IIIe)的化合物的条件下反应：
Figure A2007800425870028C3
其中：
A23为封端基团或者
M1为官能团；
D21为靶向部分；
M4为OH、NH2或者SH；以及
所有其它变量与权利要求27中的定义相同。
28.一种治疗哺乳动物的方法，包括向需要治疗的患者给药有效量的式(I)的化合物。
29.一种将多核苷酸向哺乳动物细胞给药的方法，包括将有效量的式(I)的化合物递送至需要这种治疗的细胞。
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