CN101528815A - 药物复合物用嵌段共聚物及医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域和侧链上具有酰肼基及疏水基的聚氨基酸区域构成的药物复合物用嵌段共聚物。

Description

药物复合物用嵌段共聚物及医药组合物
技术领域
本发明提供一种具有优良的血中滞留性的药物复合物用嵌段共聚物。
背景技术
已确认，药物通过口服或静脉内注射等向个体进行全身给药时，会在靶位病灶部位以外的正常组织中产生副作用，时常迫使人们改变或中断治疗方法。另外，由于难以维持获得疗效所需的药物浓度，药物时常在到达靶位之前即被代谢。
为解决这些问题，目前正在广泛地研究通过动态控制或选择性输送在体内的药物，可在靶位中获得理想的药物浓度-时间模式，实现治疗效果最优化的导入了先进的制剂学技法和理念的技术。这些技术和理念被称作为药物输送系统(DDS)。近年，将抗癌剂、DNA、多肽等更安全高效地输送至肿瘤部位或炎症部位等病灶部位的这一课题受到特别的重视。
作为DDS的具体方法，已经开发出将脂质体、乳状液或纳米微粒等作为药物载体利用的方法、将药物包含在高分子胶束等高分子载体中的方法或者将药物共价结合于合成高分子或天然多糖类中的方法等。然而，在这些系统的实用化过程中，出现了种种必须克服的问题点，其中较大的课题有对生物体侧的异物识别机制的回避、DDS药物载体中的药物高含量化及药物游离速度的控制。
关于对生物体侧的异物识别机制的回避，通过在脂质体等药物载体的表面包覆聚乙二醇等亲水性高分子，可防止血浆蛋白质和调理素蛋白质等的吸附，提高血中稳定性，避免被肝脏、脾脏等的网状内皮系统(RES)捕捉。其结果，脂质体或高分子胶束等在静脉内给药后获得了较高的血中滞留性，可被动地积聚于肿瘤组织或炎症部位等血管通透性迅速增加的组织中，获得高效率的治疗。
另一方面，关于DDS药物载体中的药物含量，药物含量越高，输送必要药物所需的载体量越少，其结果对治疗效果和制剂设计皆有利[J.Med.Chem.45，4336-4343(2002)]。尽管如此，对于脂质体或高分子胶束，从物理稳定性方面考虑，应对药物含量有所限制，另外对于高分子复合物类型，增加药物含量时，会影响水溶性高分子的性质，降低其水溶性。其结果不能抑制阻隔血浆成分的相互作用，不能保持血中滞留性，因此药物含量大多数为数个％点[CRIPS 5(2)，2-8(2004)]。因此，现状是难以同时实现药物的高含量化和优良血中滞留性。
例如，在日本特开2003-34653号专利公报中记载了通过试图实现DDS最优化的具体方法所获得的最优化的实质扩大了治疗领域的DDS化合物，通过选择连接药物和载体的多肽接头的序列及载体的结构，可制备利用各抗癌剂的特征的DDS化合物。但是，抗肿瘤剂的含量是DDS化合物全部重量的1～10％左右。
另外，关于药物游离，从减轻副作用和增强治疗效果的观点看，较为理想的是药物在血中和载体稳定内包或结合、在到达病灶组织之后迅速释放出药物的系统。
例如，日本第3270592号专利、特开平7-69900号公报以及WO97/12895公开了高分子嵌段共聚物-蒽环类抗癌剂医药制剂。药物通过物理化学性结合或通过药物中的氨基和嵌段共聚物中的羧基反应形成酰胺键而被封入。因此可认为，虽然药物与载体结合变得稳定，但药物到达病灶组织后难以迅速释放出来。
为了高度实现药物游离的控制，人们对各种环境应答性载体，即对由疾病引起的环境变化、或对正常组织和病灶部位之间的环境差异进行应答从而改变性质的药物载体进行了研究。
例如，已有报告，通过GFLG间隔基将阿霉素结合于分子量约3万Da的HPMA聚合物而得到HPMA共聚物-阿霉素(PK1)。在相比于正常组织更多发现于肿瘤部位的组织蛋白酶B的作用下，PK1中的药物游离出来，但是其药物含量为8.5％，不能达到药物的高含量化。
另一方面，人们利用肿瘤和炎症等病灶部位的局部的pH值低于正常组织的pH值这一点进行尝试研究，目的是通过对这样的病变部位中的pH变化的环境进行应答，从而将药物释放出来[Adv.Drug Delivery Rev.56，1023-1050(2004)；Biochim.Biophys.Acta，1329(2)，291-301(1997)]。
另外，已有报告，通过内吞作用途径进入肿瘤局部位置中的各个癌细胞中后，确实地对内涵体内的低pH环境进行应答，从而将盐酸阿霉素释放出的细胞内低pH环境应答型高分子复合物[J.Controlled Release 87，33-47(2003)]和高分子胶束[Bioconjugate Chem.16，122-130(2005)]。特别是，该高分子胶束实现了药物游离的pH依赖性及较高的药物含量。
但是，本申请的发明人发现，增加该高分子胶束的药物量时，其血中滞留性显著低降低。本申请的发明人通过锐意的研究，结果成功实现了高的药物含量和高的血中滞留性。
发明内容
本发明的课题是提供可解决上述问题点的药物复合物用的嵌段共聚物。该嵌段共聚物和药物的复合物与未复合物化的原药物相比，具有优良的血中滞留性，可扩大治疗领域。
本发明包含以下的形式。
[1]一种由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域和侧链上具有酰肼基及疏水基的聚氨基酸区域构成的药物复合物用嵌段共聚物。
[2]具有以下结构的[1]所述的药物复合物用嵌段共聚物：
Figure A20078003862700121
或
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可以被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
但是，在p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的20％以上～不满90％，n存在的情况下，n、p及q是任意存在的，在n不存在的情况下，p及q是任意存在的，
y表示1或2的整数)。
[3]p占嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的25％以上～75％以下的[2]的药物复合物用嵌段共聚物。
[4]R5是从由苄基、苯基、C4-苯基及C6～C16的烷基构成的群组中选出来的疏水基的[3]的药物复合物用嵌段共聚物，。
[5]一种药物复合化嵌段共聚物，其由具有酮结构的药物结合于[1]～[4]中任意一个药物复合物用嵌段共聚物的酰肼基而成。
[6][5]的药物复合化嵌段共聚物，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
[7][6]的药物复合化嵌段共聚物，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～50％以下的单元相结合。
[8][7]的药物复合化嵌段共聚物，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～40％以下的单元相结合。
[9][8]的药物复合化嵌段共聚物，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星(Nemorubicin)及PNU-159682构成的群组中选出的。
[10]一种高分子胶束医药组合物，其是由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域作为外壳，由聚氨基酸及/或其衍生物构成的全体疏水性区域作为内核的高分子胶束医药组合物，上述全体疏水性区域具有结合于酰肼基的药物和疏水基，此处，结合于该酰肼的药物和疏水基可存在于相同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中，或可存在于不同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中。
[11][10]的医药组合物，其是由药物结合于下式的嵌段共聚物中的酰肼基而得到的一种医药组合物：
Figure A20078003862700141
或
Figure A20078003862700142
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；
R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
但是，p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的20％以上～不满90％、n存在的情况下，n、p及q是任意存在的，n不存在的情况下，p及q是任意存在的，
y表示1或2的整数)。
[12][11]的医药组合物，p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的25％以上～75％以下。
[13][11]的医药组合物，R5是从由苄基、苯基、C4-苯基及C6～C16的烷基构成的群组中选出的疏水基。
[14][11]的医药组合物，具有酮结构的药物结合于上述嵌段共聚物的酰肼基上。
[15][14]的医药组合物，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
[16][15]的医药组合物，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～50％以下的单元相结合。
[17][16]的医药组合物，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％～40％以下的单元相结合。
[18][17]的医药组合物，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682构成的群组中选出的。
[19][10]的医药组合物，其是由
(1)药物结合于下式的酰肼基的嵌段共聚物：
或
Figure A20078003862700162
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可以被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
y表示1或2的整数)。
以及
(2)下述嵌段共聚物：
Figure A20078003862700171
或
Figure A20078003862700172
(式中
R1、R2、R3、R4、L1、L2、m、n、p及y具有与式(I)(II)相同的定义，但是，n+p内的p占到50％～100％、n存在的情况下，n和p是任意存在或存在于嵌段中。)
构成的医药组合物。
[20][19]的医药组合物，药物是具有酮结构的药物。
[21][20]的医药组合物，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
[22][21]的医药组合物，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682构成的群组中选出的。
惊奇地发现，通过由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域和侧链上具有酰肼基及疏水基的聚氨基酸区域构成的药物复合物用嵌段共聚物，能够显著提高药物的血中滞留性。
附图说明
图1表示将DOX的聚合物复合物(实施例5及8)以DOX量1mg/kg对雄性大鼠进行尾静脉给药后的血浆中的总DOX浓度的经时变化(n＝3，平均值±SD)。
图2表示将DOX的聚合物复合物(比较例5及6)以DOX量1mg/kg的给药量对雄性Wistar大鼠进行尾静脉给药后的血浆中的总DOX浓度的经时变化(n＝3，平均值±SD)。
图3表示DOX制剂在静脉内给药后的大鼠血浆中的总DOX浓度的经时变化(n＝3，平均值±SD)。
图4表示13DOX聚合物复合物(实施例5)的药物游离率。
图5表示各DOX制剂给药后的PC-3移植裸鼠的肿瘤体积的经时变化(n＝8，平均值±SE)。箭头记号表示给药时间。
图6表示各DOX制剂给药后的PC-3移植裸鼠的体重的经时变化(n＝8，平均值±SE)。箭头记号表示给药时间。
图7表示DOX的聚合物复合物(实施例14)及EPI的聚合物复合物(实施例15)以药物量1mg/kg向雄性大鼠进行尾静脉投药后的血浆中总药物浓度的经时变化。
具体实施方式
本发明的药物复合物用嵌段共聚物可通过向由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域和聚氨基酸区域构成的嵌段共聚物中导入酰肼基及疏水基而制得。
并非特别限制，聚氨基酸区域是聚(天冬氨酸)及/或其衍生物、聚(谷氨酸)及/或其衍生物，可列举出，例如聚(天冬氨酸-β-烷酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸-β-烯丙酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸-β-芳烷酯-共-天冬氨酸)、聚(谷氨酸-γ-烷酯-共-谷氨酸)、聚(谷氨酸-γ-芳烷酯-共-谷氨酸)、聚(天冬酰胺-β-烷酯-共-天冬氨酸)、聚(谷酰胺-γ-芳烷酯-共-谷氨酸)、聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)及聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)等聚(氨基酸衍生物)。
特别是，容易制造的，可便于在本发明中使用的嵌段共聚物可列举出下式(I)(II)所示的嵌段共聚物。
Figure A20078003862700191
或
Figure A20078003862700192
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，最好是40～600的整数，
n表示0～1000的整数，最好是0～100的整数
p表示1～1000的整数，最好是1～100的整数
q表示1～1000的整数，最好是1～100的整数
但是，在p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的20％以上～不满90％、优选25％以上～50％以下、n存在的情况下，n、p及q是任意存在的，在n不存在的情况下，p及q是任意存在的，
y表示1或2的整数)。
由于可以根据嵌段共聚物的制造方法变换连接基，因此并非限定，但是L1可列举-Z-NH-、-CO-Z-NH-及-CO-NH-Z-NH-(此处，Z是独立的C1～C8烷基)，L2可列举-CO-Z-、-Z-CO-、-CO-Z-CO-、Z-CO-Z-及-Z-CO-O-Z-(此处，Z是独立的C1～C8烷基)。
上述嵌段共聚物可以通过例如公知的MeO-PEG聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)与肼或水合肼进行反应，将其苄酯部分变换成肼基而合成得到。通常该反应在脱水溶剂中进行。溶剂可使用脂肪族或芳香族的有机溶剂，嵌段共聚物及肼、或水合肼中的任意一个最好为溶解物。例如，溶剂最好使用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲、氯仿或这些溶剂的混合溶剂。另外，使用的溶剂最好尽量不含水。关于合成时的肼的添加量，由于反应是大致定量进行的，通常只要添加相对于嵌段共聚物的苄酯部分欲导入的量即可。例如，使用肼时，相对于苄酯部分导入50％的情况下，添加0.5倍当量的肼，导入75％的情况下，就添加0.75倍当量的肼。反应在0℃～100℃的温度范围内进行，优选在20℃～80℃，最好在25℃～50℃的范围内进行。压力最好为常压。反应时间只要使得反应能充分进行就没有特别限制，但是通常为2小时～2天。
能够复合于本发明的药物复合物用嵌段共聚物的药物，只要其可与肼基反应形成共价结合，就没有特别限制。作为这种的药物的优选例子，可列举具有酮结构的药物，例如蒽环类抗癌剂。作为蒽环类抗癌剂的具体例，已知有盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682等。另外，与该嵌段共聚物复合的药物的量，只要能够维持血中滞留性就没有特别限定，可选择相对于嵌段共聚物中的聚氨基酸的全单元数的10％以上～50％以下的数，优选10％以上～40％以下的数，若考虑药效和稳定性则最好选择15％以上～35％以下的数。此外，上述蒽环类类抗癌剂中存在多个酮，但是与肼基共价结合的酮为13位。
上述药物与本发明的药物复合物用共聚物的结合，最好是通过在极度无水条件下仅仅使药物与嵌段共聚物的肼基进行反应而实现。最好溶解于对本发明的嵌段共聚物进行脱水的溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲、氯仿或这些溶剂的混合溶剂中，添加所需量的药物，例如相对于肼基的0.1～10当量、优选0.1～3当量，使之反应。反应在0℃～50℃的温度范围中进行，优选在20℃～40℃、最好在25℃～37℃的范围进行。压力最好选择常压。反应时间只要能使反应充分进行就没有特别限制，通常为2小时～5天左右。将反应后的溶液注入适当的亲水性有机溶剂中，例如2-丙醇等醇类，使之沉淀，洗净，回收。回收过程可进行离心分离操作。必要时，可采用凝胶过滤色谱法、超滤法对药物复合共聚物进行精制，去除未结合的药物。
本发明的另一个方面是以由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域作为外壳、以由聚氨基酸及其衍生物构成的全体疏水性区域作为内核的高分子医药组合物，提供一种上述全体疏水性区域具有结合于肼基的药物和疏水基的高分子胶束医药组合物，此处，结合于该肼基的药物和疏水基可以存在于相同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中，也可以存在于不同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中。本发明的“全体疏水性区域”是指，通过结合于嵌段共聚物中聚氨基酸及/或其衍生物的疏水基而具有疏水性，嵌段共聚物在水性溶剂中能够形成的以聚乙二醇为外壳的聚合物胶束的疏水性区域。
这样的医药组合物的高分子胶束可以只由在肼基上复合了药物的本发明的药物复合嵌段共聚物所构成(即，结合于肼基的药物和疏水基存在于相同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中)；或者由(1)由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域以及侧链上具有肼基、具有疏水基的聚氨基酸所构成的、药物结合于该肼基的嵌段共聚物，以及(2)由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域以及具有疏水基的聚氨基酸及/或其衍生物区域所构成的、未结合药物的嵌段共聚物所构成。
未结合药物的形态的上述(1)的嵌段共聚物可利用例如下式所表示的聚合物。
或
Figure A20078003862700222
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可以被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，根据嵌段共聚物的制造方法可以变化，因此并非限定，但是L1可列举-Z-NH-、-CO-Z-NH-及-CO-NH-Z-NH-(此处，Z是独立的C1～C8烷基)，L2可为-Z-CO-、-CO-Z-、-CO-Z-CO-、Z-CO-Z-及-Z-CO-O-Z-(此处，Z是独立的C1～C8烷基)。
m表示5～1000的整数，最好是40～600的整数，
n表示0～1000的整数，最好是0～100的整数
p表示1～1000的整数，最好是1～100的整数
q表示1～1000的整数，最好是1～100的整数
y表示1或2的整数)。
上述嵌段共聚物中肼基的导入和药物的结合，可以按照本发明的药物复合物用嵌段共聚物的制法进行。
另外，上述(2)的嵌段共聚物可以利用例如下式表示的聚合物：
Figure A20078003862700231
或
(式中
R1、R2、R3、R4、L1、L2、m、n、p及y与式(I)(II)相同定义，但是，在n+p内的p占到50％～100％，n存在的情况下，n和p是任意存在或存在于嵌段中)。上述(1)的嵌段共聚物中，复合了药物的嵌段共聚物和上述(2)的嵌段共聚物的混合比，没有特别限定，但是能够以1∶1～9∶1的范围进行混合。该情况下，相对于混合的全嵌段共聚物中的全聚氨基酸的数的疏水基的比例为35％以上～不满95％，最好为50％以上～不满95％。此时，上述(1)、上述(2)中任意一个共聚物中可存在疏水基。复合物化的药物的比例是相对于混合的全嵌段共聚物中的全聚氨基酸的数的5％以上～65％以下，优选5％以上～50％以下，最好是5％以上～20％以下的数。
形成高分子胶束的方法并没有特别限制，本发明的医药复合化嵌段共聚物，可以通过在水性溶剂中溶解或分散后进行搅拌，制备高分子胶束。此时，可以施加超声波、压力、剪切力或其组合的物理能。另外，嵌段共聚物溶解于挥发性有机溶剂后，使有机溶剂挥发而使其干固，向其中加入水性溶剂进行搅拌，施加超声波、压力、剪切力或其组合的物理能，向嵌段共聚物中添加水性溶剂，如上述通过施加物理能可制备。此处，挥发性溶剂可列举出甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙腈、四氢呋喃、二氯甲，可根据所结合的药物进行适当选择。此处的水性溶剂可列举水、生理食盐水、缓冲液等，只要不影响高分子胶束的形成，亦可含有少量的有机溶剂。另外，考虑药物的结合部位，缓冲液的pH优选6～8，最好为中性。
将药物复合化嵌段共聚物和非复合化嵌段共聚物混合以制备高分子胶束时，其方法没有特别限定，例如两种嵌段共聚物溶解于挥发性的有机溶剂后，使有机溶剂挥发使其干固，向其中加入上述水性溶剂而搅拌，施加超声波、压力、剪切力或其组合的物理能，向两嵌段共聚物中添加水性溶剂，如上述通过施加物理能即可制备。此处挥发性溶剂可列举出甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙腈、四氢呋喃、二氯甲，可根据所结合的药物进行适当选择。
这样，关于所形成的高分子胶束，只要其粒子径具有能够向生物体给药的尺寸，就没有特别限制，优选10μm以下，最好是5μm以下。特别在静脉内给药中使用的情况下，优选200nm以下，最好是100nm以下。必要时使用具有所需孔径的亲水性滤膜对含有高分子胶束医药组合物的水性溶剂进行过滤。另外，可根据需要，向含有含有高分子胶束的医药组合物中添加缓冲剂、等渗透剂、稳定化剂等。
在本发明的药物复合嵌段共聚物或高分子胶束医药组合物用于向生物体给药的情况下，不问其投药路径，但是可列举出静脉内给药、皮下给药、肌内给药、关节内给药、腹腔内给药、眼内给药等。另外，给药量根据疾病的种类、年龄、体重、性别进行适当选择。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但是这些实施例并不起限定本发明的范围的作用。
实施例1
MeO-PEG-PBLA的合成
氩气环境下，向61.64g(5.14mmol)具有片末端甲氧基、片末端氨丙基的聚乙二醇(MeO-PEG-NH2，平均分子量12,000)中添加400mL脱水二甲基亚砜(DMSO)、200mL脱水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，使之溶解，加入67.21g(269.68mmol)L-天冬氨酸-β-苄基N-羧酸酐(BLA-NCA，Mw＝249.22)，在氩气环境下37℃反应一昼夜。将反应后的溶液滴入6L己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液，使聚合物沉淀。使用桐山滤纸(Φ90mm，5B)进行过滤。进一步，向聚合物添加干净的6L己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)溶液中，重复进行2次同样的操作，在洗净操作之后，进行减压干燥，得到粉末状的甲氧基聚乙二醇-聚(L-天冬氨酸-β-苄基)嵌段共聚物(MeO-PEG-PBLA)。为确认所得到的化合物是否目的物质，可在以下记载的测定条件下通过凝胶渗透色谱法(GPC)及1H-NMR法进行进一步确认。根据GPC的结果，聚合物的分子量为Mp＝20,778Da，聚合物的分子量分布Mw/Mn＝1.06。聚合物的聚(L-天冬氨酸-β-苄基)(PBLA)的聚合度根据PEG链的分子量及1H-NMR光谱计算出来的，为40。PEG的分子量12,000、PBLA的聚合度40，略记为[12-40]。
此外，在实施例中为方便起见，以MeO-PEG-PBLA的分子量为20,000Da而用以计算。所得到的MeO-PEG-PBLA是一般式1中所示的平均值为m＝272、n+p+q＝40、其中P占100％状态的嵌段共聚物。
下面，只要没有特别的说明，采用下述条件进行同样的分析。
[测定装置和条件等]
(1)分子量测定(GPC)
系统：Waters 600 GPC System
色谱柱：Waters Styragel HR3(7.8Φ×300mm)(40℃)
移动相：含有10mM氯化锂的DMF
流速：0.8mL/min
检测：折光率检测器(RI)
(2)核磁共振光谱(1H-NMR)
日本电子制JEOL AL300(300MHz)，溶剂：DMSO-d6，测定温度：室温
实施例2
MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)的合成
氩气环境下，向实施例1中得到的5g(0.25mmol)MeO-PEG-PBLA(12-40)中添加50mL脱水DMF，使之溶解，加入相对于苄酯的0.5倍当量(相对于嵌段共聚物的20当量)的159μL无水肼(5mmol，Mw＝32.05)，在室温下反应一昼夜。反应后的溶液滴入冷却至-20℃的700mL的2-丙醇中，使聚合物沉淀。进行离心分离操作(8,000G，15min，4℃)，回收聚合物。在干净的冷却至-20℃的2-丙醇中，采用同样的离心操作重复进行2次洗净。进一步，在700mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)溶液中，采用同样的离心操作重复进行2次洗净。使用桐山滤纸(Φ45mm，5B)进行过滤后，进行减压干燥，得到粉末状的MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)聚合物。为确认所得到的化合物是否目的物质，可使用无水醋酸进行酰肼基的乙酰化反应，在以上记载的测定条件下通过1H-NMR而确认。1H-NMR的结果表明，1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基(q)为19个，苄酯基(p)为13个，COOH(n)为8个。
实施例3
MeO-PEG-pAsp(Hyd，C8)的合成
氩气环境下，向实施例1中得到的1.5g(0.075mmol)MeO-PEG-PBLA(12-40)中添加15mL脱水DMF，使之溶解，加入相对于苄酯的0.5倍当量(相对于嵌段共聚物的20当量)的249μL n-辛胺(1.5mmol，Mw＝129.25)，在室温下反应一昼夜。接着，加入相对于苄酯的0.5倍当量(相对于嵌段共聚物的20当量)的47.6μL无水肼(1.5mmol)，在室温下反应一昼夜。反应后，采用与实施例2同样的操作进行精制，得到粉末状的MeO-PEG-pAsp(Hyd，C8)聚合物。为确认所得到的化合物是否目的物质，进行与实施例2相同的乙酰化反应，通过1H-NMR而确认。1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基(q)为20个，辛基(p)为11个，COOH(n)为9个。
实施例4
MeO-PEG-pAsp(Hyd，C4-Phenyl)的合成
氩气环境下，向实施例1中得到的1.5g(0.075mmol)MeO-PEG-PBLA(12-40)中添加15mL脱水DMF，使之溶解，加入相对于苄酯的0.5倍当量(相对于嵌段共聚物的20当量)的249μL辛胺(1.5mmol，Mw＝129.25)，在室温下反应一昼夜。接着，加入相对于苄酯的1.5倍当量(相对于嵌段共聚物的60当量)的711Ml 4-苯基-丁胺(4.5mmol，Mw＝149.23)，在室温下反应一昼夜。反应后，采用与实施例2相同的操作进行精制，得到粉末状的MeO-PEG-pAsp(Hyd，C4-Phenyl)聚合物。为确认所得到的化合物是否目的物质，进行与实施例2相同的乙酰化反应，通过1H-NMR而确认。1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基(q)为20个，苯基丁基(p)为13个，COOH(n)为7个。
实施例5
a.MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)的合成(以下，盐酸阿霉素有时略记为DOX)
将实施例2中得到的250mg MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)添加于0.5mL脱水DMF，使之溶解，加入相对与酰肼基1.5倍当量(相对于嵌段共聚物的30当量)的盐酸阿霉素(DOX，Mw＝580)，在室温、遮光下进行3天反应。将反应后的溶液注入冷却至-20℃的80mL的2-丙醇中，使聚合物沉淀。进行离心分离操作(2,380G，10min，4℃)，回收聚合物。在干净的冷却至-20℃的90mL的2-丙醇中，采用同样的离心操作重复进行4次洗净。接着，将聚合物溶解于50mL的甲醇(MeOH)中，使用充填了由甲醇膨润后的葡聚糖凝胶LH-20(GE医疗集团生命科学部门制)的凝胶柱(Φ42mm×55cm)进行凝胶过滤精制，去除未结合的DOX。向回收的聚合物溶液中加入8mLDMF，通过蒸发，浓缩至约30mL，再次进行凝胶过滤精制。向回收的聚合物溶液中加入8mL的DMF，通过蒸发，溜去甲醇。接着，将聚合物溶液滴入80mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中，使聚合物沉淀。进行离心分离操作(2,380G，10min，10℃)，回收聚合物。在干净的90mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中，采用同样的离心操作重复进行2次洗净。使用桐山滤纸(Φ21mm，5B)进行过滤后，进行减压干燥，得到粉末状的的盐酸阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)。以下的HPLC的测定结果表明，得到的1分子的聚合物复合物中的盐酸阿霉素的结合量为13个，占聚氨基酸的全单元数的32.5％。
b.另外，按照上述a的方法，制备1分子聚合物中结合8个盐酸阿霉素的盐酸阿霉素的聚合物复合物。
但是，由于1分子聚合物复合物中的盐酸阿霉素结合量是通过酸加水分解后的聚合物中天冬氨酸浓度和盐酸阿霉素浓度的HPLC而得到的测定值，被计算的1分子聚合物包含着40分子天冬氨酸。天冬氨酸浓度是根据Waters AccQ·TagTM氨基酸分析法的操作手册(日本Waters)进行测定的。另一方面，DOX浓度的测定方法如下，将DOX的聚合物复合物的分散在20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)并使其浓度为1mg/mL，之后，向其一部加入同量的0.2N HCl，最终在0.1N HCl的浓度下，在室温中静置1小时后，通过HPLC进行测定。此外，HPLC的测定条件如下。另外，在没有特别说明的情况下，DOX相关的HPLC测定都采用相同条件进行。
系统：Waters Alliance System
色谱柱：Tosoh TSK-gel ODS-80TM(4.6Φ×150mm)(40℃)
移动相：25mM甲酸胺(pH3.0)/乙腈＝7/3
流速：1mL/min
检测：荧光(Ex：448nm，Em：560nm)
注入体积：10μL
实施例6
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C8)的合成
使用实施例3得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd，C8)，进行和实施例5同样的操作，得到盐酸阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C8)。HPLC测定的结果表明，得到的1分子聚合物中的盐酸阿霉素的结合量为12个。
实施例7
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C4-Phenyl)的合成
使用实施例4得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd，C4-Phenyl)，进行和实施例5同样的操作，得到盐酸阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C4-Phenyl)。HPLC测定的结果表明，得到的1分子聚合物中的盐酸阿霉素的结合量为6个。
实施例8
使用MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)的大鼠PK试验
1)胶束的制备
使用实施例5a中得到复合物(13DOX)及按实施例5a制备的具有不同DOX结合量的MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)(8DOX)(实施例5b)这2种复合物。以10～20mg之间的量精细称量各聚合物放在玻璃样品瓶中，添加1mL二氯甲，使聚合物完全溶解。其后，在氮气气流下，将溶剂溜去，将聚合物制成膜状。在减压下，在室温中进一步干燥1小时后，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/5％(w/v)葡萄糖使得聚合物浓度为10mg/mL，在4℃下将聚合物膜水合。在4℃下搅拌一昼夜后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷温度下进行10分钟超声波处理。其后，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)过滤，滤液为胶束，用于以下试验。
2)动物实验
在下述条件下，对乙醚麻醉状态下的雄性Wistar大鼠(日本CharlesRiver(株)，6～7周龄)分别进行上述2种胶束的尾静脉内给药(n＝3)。对由肝素包覆的注射器采取到的血液，在4℃下进行离心分离后，回收血浆，在测定之前保存于-30℃下。
给药量：DOX 1mg/kg
采血时间：给药后5分钟，1、3、6、9、24、48小时
采血量：0.2-0.25mL/次(从颈静脉)
3)血浆中的DOX浓度的测定
a)总DOX浓度的测定
相对于回收的50μL大鼠血浆，按顺序添加100μL乙腈、50μL0.4NHCl，使得总体积为200μL，搅拌后，在室温中静置1小时。接着在室温下进行离心分离(Funakoshi，Chibitan，10,000rpm，10分钟)，回收100μL上清。向其中，按顺序加入30μL的0.2N NaOH、20μL的1％Triton X-100、50μL的2μg/mL的道诺霉素盐酸盐(Wako)(内部标准)/25mM甲酸胺缓冲液(pH3.0)，使得总体积为200μL，搅拌。将这种处理样品液充填在HPLC玻璃样品瓶中，通过HPLC测定，确定血浆中的DOX浓度。
b)游离DOX浓度的测定
相对于回收的50μL大鼠血浆，添加100μL乙腈，在室温下进行离心分离(Funakoshi，Chibitan，10,000rpm，10分钟)，回收50μL上清。向其中，加入100μL的2μg/mL的道诺霉素盐酸盐(Wako)(内部标准)/20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)。将这种处理样品液充填在HPLC玻璃样品瓶中，通过HPLC分析，确定血浆中的DOX浓度。
c)聚合物结合型DOX浓度的计算方法
使用上述(a)、(b)的值，从下式求得聚合物结合型DOX浓度。
(聚合物结合型DOX浓度)＝(总DOX浓度)-(游离型DOX浓度)
4)血浆中浓度的经时变化的测定结果
图1所示为静脉内给药后的血液中的总DOX浓度的经时变化。8DOX、13DOX中任意一个的聚合物复合物都显示出持续的血浆中浓度变化，由此可知具有优良的血中滞留性。但是，游离型DOX浓度为总DOX浓度的1/100左右，血中的DOX的聚合物复合物是稳定的。作为总DOX浓度的AUC，8DOX、13DOX依次为149、238μg/mL·h。AUC的结果如表1所示。
实施例9
使用MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C8)及MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C4-Phenyl)的大鼠PK试验
使用实施例7中得到的盐酸阿霉素的聚合物复合物、MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C4-Phenyl)以及实施例6中得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C8)，与实施例8同样地制备胶束，进行大鼠PK试验。
该结果表明，将含有1mg/kg的DOX量的MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C4-Phenyl)进行尾静脉内给药时的AUC为156μg/mL·h，这种复合物具有与实施例8相匹敌的优良的血中滞留性。
另外，可知MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，C8)的AUC为90.7μg/mL·h，具有比后述的比较例7更优良的血中滞留性。
比较例1
MeO-PEG-pAsp(Hyd)的合成
氩气环境下，向实施例1中得到的6g(0.3mmol)MeO-PEG-PBLA(12-40)中添加60mL脱水DMF，使之溶解，加入相对于苄酯的3倍当量(相对于嵌段共聚物的120当量)的1.14mL无水肼(36mmol，Mw＝32.05)，在室温下反应一昼夜。采用与实施例2相同的操作进行精制，得到粉末状的MeO-PEG-pAsp(Hyd)聚合物。为确认所得到的化合物是否目的物质，进行与实施例2相同的乙酰化反应，通过1H-NMR而确认。1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基(q)为37个，COOH(n)为3个。
比较例2
MeO-PEG-pAsp(Hyd，NH4)的合成
向与实施例2相同地得到的2g(0.11mmol)MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)(12-40)中添加30mL 0.1N NaOH，在室温下进行4小时加水分解。其后，使用3L 0.25％氨水进行2天透析(区划分子量(MWCO＝3,500)、5次交换0.25％氨水)，接着使用3L蒸馏水进行2天透析(区划分子量(MWCO＝3500)、4次交换蒸馏水)后，进行冻干。所得到的聚合物粉体溶解于20mL的DMSO中，滴入500mL乙醚中，使聚合物沉淀，使用桐山滤纸(Φ45mm，5B)进行过滤。在干净的400mL乙醚中重复进行2次同样的洗净后，进行减压干燥，得到粉末状的MeO-PEG-pAsp(Hyd，NH4)。为确认所得到的化合物是否目的物质，在MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)的阶段，进行与实施例2相同的乙酰化反应，通过1H-NMR而确认。1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基为18个，铵盐为22个。
比较例3
MeO-PEG-pAsp(COOH)的合成
向2g(0.1mmol)的实施例1中得到的MeO-PEG-PBLA(12-40)中添加16mL的0.5N NaOH(8mmol)，在室温下进行2小时加水分解。使用柠檬酸一水合物将pH调整为3后，进行超滤(Millipore社实验室规模TFF系统(UF膜：Pellicon(注册商标)XL Biomax5附属))，过滤器过滤(Millipore社Sterivex(注册商标)GS，0.22μm)后，进行冻干。接着，溶解于20mL的DMF中，滴入500mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中，使聚合物沉淀。使用桐山滤纸(Φ45mm，5B)进行过滤。进一步，向聚合物中加入500mL干净的己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)溶液，重复进行2次同样的操作，进行减压干燥，得到粉末状的加水分解物MeO-PEG-pAsp(COOH)。
比较例4
MeO-PEG-pAsp(amide-DOX)的合成
在氩气条件下，向1g(0.059mmol)的比较例3中得到的MeO-PEG-pAsp(COOH)中添加100mL脱水DMF，使之溶解，加入相对于羧酸的1倍当量的(相对于嵌段共聚物的40当量)的1.365g(2.35mmol)盐酸阿霉素、1.5倍当量的(相对于嵌段共聚物的60当量)的728mg(3.53mmol)二环己基碳二亚胺(DCC，Mw＝206.33)、1.5倍当量(相对于嵌段共聚物的60当量)的492μL(3.53mmol)三乙胺(Mw＝101.19)，在室温下反应一昼夜。反应后的溶液对3L水进行1天透析(区划分子量(MWCO＝3,500，交换5次蒸馏水))后，进行冻干。接着，将聚合物溶解于20mL DMF中，，使用充填了由DMF膨润了的葡聚糖凝胶LH-20(GE医疗集团生命科学部门制)的凝胶柱(Φ42mm×55cm)进行凝胶过滤精制。回收的聚合物溶液对3L水进行2天透析(区划分子量(MWCO＝3500)、5次交换蒸馏水)后，进行冻干。再次溶解于DMF中，重复进行凝胶过滤精制及冻干，得到DOX的氨基与聚合物的羧基形成酰胺键的粉末状的聚合物(MeO-PEG-pAsp(amide-DOX))。HPLC测定结果可知，所得到的1分子聚合物中的阿霉素结合量为13个。
比较例5
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX)的合成
使用比较例1中得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd)，进行与实施例5相同的操作，得到盐酸阿霉素的聚合物复合物(MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX))。通过HPLC测定结果，所得到的1分子聚合物中的盐酸阿霉素结合量为8个。
比较例6
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX)的合成
使用比较例1中得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd)，按照比较例5进行操作，得到了盐酸阿霉素的结合量为不同的盐酸阿霉素的聚合物复合物(MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX))。HPLC测定结果可知，所得到的1分子聚合物中的盐酸阿霉素结合量各为15、20、39个。但是可认为，关于结合了39个DOX的聚合物混合物，混有游离的DOX。
比较例7
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，NH4)的合成
使用比较例2中得到的MeO-PEG-pAsp(Hyd，NH4)，进行与实施例5相同的操作，得到盐酸阿霉素的聚合物复合物(MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，NH4))。HPLC测定结果可知，所得到的1分子聚合物中的盐酸阿霉素结合量为12个。
比较例8
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX)的PK试验
1)使用比较例5及6中得到的DOX复合物的高分子胶束的制备
在玻璃样品瓶中以10～20mg之间的量分别对4种聚合物(8、15、20及 39 DOX)进行精细称量，添加1mL二氯甲，使聚合物完全溶解。其后，在氮气气流下，将溶剂溜去，将聚合物制成膜状。在减压下，在室温中进一步干燥1小时后，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/5％(w/v)葡萄糖使得聚合物浓度为10mg/mL，在4℃下将聚合物膜水合。在4℃下搅拌一昼夜后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷温度下进行10分钟的超声波处理。其后，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)过滤，滤液为高分子胶束，用于以下试验。
2)大鼠PK实验
在与实施例8相同的条件下，对雄性Wistar大鼠(日本Charles River(株)，6～7周龄)进行上述胶束(DOX量为1mg/kg，n＝3)的尾静脉内给药。在4℃下对所采取到的血液进行离心分离后，回收血浆，测定血浆中的DOX浓度。
3)血浆中浓度的经时变化的测定结果
图2所示为静脉内给药后的血浆中的总DOX浓度的经时变化，以此测定结果为基础计算得到的AUC值的整理结果参见表1。虽然39及20DOX的聚合物复合物迅速消失，但是15及8 DOX的聚合物复合物表现出比较持续的血浆滞留性。39、20、15及8 DOX的聚合物复合物的AUC分别为1.2、3.1、7.6及19.1μg/mL·h。但是相比于实施例1中得到的AUC，小于其1/10。
比较例9
MeO-PEG-pAsp(amido-DOX)胶束的制备
在玻璃样品瓶中用10～20mg之间的量对从比较例4中得到的聚合物、MeO-PEG-pAsp(amide-DOX)进行精细称量，添加1mL二氯甲，使聚合物完全溶解。其后，在氮气气流下，将溶剂溜去，将聚合物制成膜状。在减压下，在室温中进一步干燥1小时后，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)使得聚合物浓度为10mg/mL，在4℃下聚合物膜进行水合。在4℃下搅拌一昼夜后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷下进行10分钟超声波处理。其后，通过凝胶过滤(PD-10凝胶柱，GE医疗集团生命科学部门，洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/5％(w/v)葡萄糖)去除样品中的游离DOX，回收的高分子馏分为高分子胶束。
比较例10
内包DOX的脂质体的制备
使用H-精制的大豆卵磷脂(HPC)[味之素Healthy Supply(株)]、胆固醇(Chol)(Wako)、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺氨基甲酸酯复合物(PEG-DSPE)(日本油脂(株)SUNBRIGHT(注册商标)DSPE-020CN，PEG链分子量：2,000)，按摩尔比为HPC∶Chol∶DSPE-PEG＝2∶1∶0.1的组成，制备成脂质体。即，从脂质的氯仿·储备溶液，在氮气流下制成上述组成比的膜，经过一夜的减压干固后，添加250mM的(NH4)2SO4水溶液，在60℃下水合。在60℃下进行超声波照射(5分钟)后，在60℃下通过微型挤出机(Avanti Polar Lipids)进行11次的0.1μm的过滤器的处理。接着通过超离心(65,000rpm、1小时、20℃、贝克曼库尔特社、MLA-130转子)回收脂质体，在5％葡萄糖水溶液中悬浮。向回收的空脂质体中添加DOX溶液(5％(w/v)葡萄糖)(lipid∶DOX＝1∶0.2w/w)，在65℃下进行2小时培养。其后，为了去除没有被内包入脂质体中的DOX，进行同样的超离心操作(65,000rpm、1小时、20℃、贝克曼社、MLA-130转子)，得到沉淀物脂质体。进一步，进行凝胶过滤(PD-10，GE医疗集团生命科学部门)，进行精制(洗脱液：5％(w/v)葡萄糖)，将回收的脂质体馏分作为大鼠给药样品。
比较例11
内包DOX的物理吸附高分子胶束的制备
MeO-PEG-PBLA(12-40 Bn60％)的合成
在氩气环境下，将比较例3中得到的1g(0.059mmol)MeO-PEG-pAsp(COOH)溶解于20mL脱水DMF中。加入相对于羧酸的1倍当量的(相对于嵌段共聚物的40当量)的244μL苄醇(2.36mmol)、1倍当量的(相对于嵌段共聚物的40当量)的288mg(2.36mmol)的4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Mw：122.17)、1.5倍当量(相对于嵌段共聚物的60当量)的548μL(3.54mmol)二异丙基碳二亚胺(DIPCI，Mw＝126.2 d：0.815)。将反应后的溶液滴入200mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中，使聚合物沉淀。使用桐山滤纸(Φ45mm，5B)进行过滤。进一步，在200mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)溶液中对聚合物进行2次洗净操作，得到聚合物粉末。
将所得到的聚合物粉末分散于100mL水中，进行超滤[Millipore实验室规模TFF系统(UF膜：Pellicon(注册商标)XL Biomax 100附属)]，过滤器过滤(Millipore社Sterivex(注册商标)GS，0.22μm)后，进行冻干。接着，溶解于20mL的DMF中，滴入200mL己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中，使聚合物沉淀。使用桐山滤纸(Φ45mm，5B)进行过滤。进一步，在200mL干净的己酸乙酯/乙酸乙酯(1/1)混合溶液中对聚合物进行2次洗净后，进行减压干燥，得到MeO-PEG-PBLA(12-40 Bn60％)。
在与实施例1相同的条件下对所得到的聚合物进行确认，从GPC的结果可知聚合物的分子量为Mp＝19500Da，分子量分布Mw/Mn＝1.08。另外，通过1H-NMR光谱计算出苄基的导入量为25分子，从实施例1中得到的MeO-PEG-PBLA(12-40)计算出导入率为63％。
精细称量约10mg的盐酸阿霉素(wako)，添加DMSO(Wako)溶液使盐酸阿霉素浓度为10mg/mL。此处，添加相对于盐酸阿霉素的2倍摩尔数(约5μL)的三乙胺(西格玛-奥德里奇)，室温下放置一晚。另一方面，聚合物使用PEG-PBLA(60％Bn)(12-40)。精细称取约20mg该聚合物，添加DMSO(Wako)进行溶解使其浓度为10mg/mL。此处，添加0.4mL事先制备的盐酸阿霉素DMSO溶液(聚合物：DOX＝1∶0.2w/w)，将此混合液放入截止分子量为3,500的透析膜管(Spectra/Por(注册商标))中，4℃下在300mL的20mM硼酸缓冲液(pH8.0)中透析一夜。回收透析膜管的内液，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷温度下进行5分钟超声波处理。接着，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)过滤后，通过凝胶过滤(PD-10柱、GE医疗集团生命科学部门、洗脱液：5％(w/v)葡萄糖)去除样品中的游离DOX，回收的高分子馏分为内包DOX的物理吸附高分子胶束，用于以下动物试验。
比较例12
DOX溶液的制备
精细称量约10mg的盐酸阿霉素(wako)，添加5％(w/v)葡萄糖水溶液使盐酸阿霉素浓度为2mg/mL，药物完全溶解，用于动物试验。
比较例13
比较例的PK试验
1)大鼠给药试验
对乙醚麻醉下的雄性Wistar大鼠(日本Charles River(株)，6～7周龄)进行上述比较例7及9～12的DOX制剂的尾静脉内给药(n＝3)，使得DOX量为1mg/kg(但是比较例12为5mg/kg)。将采取到的血液进行离心分离后，回收血浆，在测定之前保存于-30℃下。
给药量：DOX量为1mg/kg(但是比较例12为5mg/kg)
采血时间：给药后5、30分钟，1、3、6、9、24、48小时
采血量：0.2-0.25mL/次(从颈静脉)
将采取到的血液进行离心分离后，回收血浆，在测定之前保存于-30℃下。
2)DOX浓度的测定
比较例7和实施例8同样，而其它比较例如下述进行血浆中的DOX浓度的测定。
(1)脂质体的情况下
相对于回收的40μL大鼠血浆，添加40μL乙腈，搅拌后，加入40μL的1％Triton-X-100水溶液。在室温下离心后(Funakoshi、Chibitan、10,000rpm、10分钟)，回收80μL上清，加入20μL作为内部标准的10μg/mL的道诺霉素盐酸盐(Wako)/25mM甲酸胺缓冲液(pH3.0)，使用WatersAlliance System，按照实施例8中记载的条件进行测定。
(2)MeO-PEG-pAsp(amido-DOX)的情况下
相对于回收的50μL大鼠血浆，添加50μL的1N HCl，使总体积为100μL，搅拌后，在85℃下加热20分钟。但是，在预备试验中确认，通过这种处理可将阿霉素100％地变换成相关化合物。样品在室温下冷却后，按顺序添加100μL乙腈、50μL的作为内部标准的5μg/mL的盐酸阿霉素/IM硼酸缓冲液(pH8.0)、50μL的1N NaOH，进行搅拌。接着，在室温下进行离心分离(Funakoshi、Chibitan、10,000rpm、10分钟)，回收10μL的上清，使用22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)进行过滤，通过HPLC分析滤液。使用对DOX水溶液进行同样处理而制得的检量线，确定血浆中的总DOX浓度。
(3)DOX溶液的情况下
根据实施例8中记载的游离DOX浓度的测定方法进行测定。
3)血浆中浓度的经时变化的测定结果
各DOX制剂的血浆中的浓度变化结果见图3，基于该测定结果计算出的AUC整理在表1中。与溶液给药相比较，由物理吸附高分子胶束化得到的AUC增加了7倍。另一方面，虽然具有铵盐的DOX复合物(比较例7)及利用酰胺键的DOX的聚合物复合物(比较例9)的AUC增加了约500倍，它们只是实施例5的1/4左右。脂质体(比较例10)的AUC增加了约2000倍，可与实施例5的AUC相匹敌。
表1各DOX制剂的大鼠静脉内给药后的AUC(1mg/kg)(n＝3的平均值)
关于比较例12，通过将由5mg/kg得到的AUC除以5，对给药量修正。
实施例10
具有疏水基的聚合物的添加的影响
1)混合胶束的制备
使用1个聚合物中含有39分子DOX的MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX)(比较例6)。以各10～20mg之间的量在玻璃样品瓶中精细称取该复合物与由比较例11制备的具有疏水基的PEG-PBLA(60％Bn)(12-40)，使得重量比为1∶1，添加1mL二氯甲，使聚合物完全溶解。其后，在氮气气流下，将溶剂溜去，将聚合物制成膜状。在减压下，在室温中进一步干燥1小时后，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/5％(w/v)葡萄糖使得聚合物浓度为10mg/mL，在4℃下将聚合物膜水合。在4℃下搅拌一昼夜后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷下进行10分钟超声波处理。其后，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)过滤，滤液为高分子胶束，用于以下试验。
2)大鼠PK试验及其结果
采用与实施例8相同的方法，将上述胶束进行静脉内给药使得DOX量的给药量为1mg/kg。测定血浆中的浓度变化，计算AUC为12.4μg/mL·h，与仅仅制备DOX的聚合物复合物的情况(比较例13中记载)相比较，确认获得了约10倍的AUC的改善。该结果表明，通过加入具有疏水基的嵌段共聚物，能提高DOX的聚合物复合物胶束的血中稳定性。
实施例11
药物游离的pH依赖性试验
在玻璃样品瓶中精细称取约10mg的聚合物，添加1mL二氯甲，使聚合物完全溶解。其后，在氮气气流下，溜去溶剂，将聚合物制成膜状。在减压下，在室温中进一步干燥1小时后，加入20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)使得聚合物浓度为10mg/mL，在4℃下将聚合物膜水合。在4℃下搅拌一昼夜后，使用Biodisruptor(日本精机制作所High Power Unit)，在冰冷下进行10分钟超声波处理。其后，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Millex(注册商标)GP PES)过滤，滤液为胶束，用于以下试验。
向950μL的37℃预先加热的20mM的甲酸铵缓冲液(pH3)、醋酸钠缓冲液(pH5)或者磷酸钠缓冲液(pH7.4)中，添加50μL的由上述方法制备的聚合物胶束，由此开始药物游离试验。在预定的时间之后，回收50μL样品，替代地补充相同的缓冲液的液量。仿照上述的方法，通过HPLC方法测定回收样品中的游离DOX浓度。
结果如图4所示，虽然在pH3的条件下DOX发生迅速游离，但是在pH5、7.4和液体的pH为中性时，其游离速度降低，确认为pH依赖性。
实施例12
药效试验
使用皮下移植于雄性裸鼠的人前列腺癌PC-3细胞作为药效评价模型。
雄性裸鼠(Balb nu/nu、5周龄)购自日本Charles River(株)，人前列腺癌PC-3细胞购自(财)生命科学振兴财团研究资源库。将在CO2培养箱中继代培养的PC-3细胞悬浮于注射用生理食盐水(大冢制药)中，注射于裸鼠的背部皮下使得每只裸鼠的PC-3细胞数为2×106/50μL。其后，饲养裸鼠约2周后，肿瘤体积平均生长到约50mm3时开始给药。将DOX的聚合物复合物(2处方：实施例5及比较例6)进行尾静脉给药(每4天给药一次总计给药3次)，依据肿瘤体积来评价抗肿瘤效果，依据体重变化评价副作用(一组8只)。作为对比，使用DOX溶液(比较例12)及内包DOX的脂质体(比较例10)。使用健康大鼠时，各制剂的给药量为各自预先决定的MTD(比较例6、10、12)或其2/3(实施例5)。
肿瘤体积及体重的经时变化分别如图5和图6所示。在使用DOX溶液(比较例12)的情况下，MTD为5m/kg时体重最大减少17％，肿瘤增殖抑制效果最大为T/C＝0.4[T/C：给药组(T)与对照组(C)的肿瘤体积的比]。脂质体(比较例10)的情况下，MTD为5mg/kg时20％以上的体重减少一直持续到试验结束，肿瘤增殖抑制达到T/C＝0.43。在DOX的聚合物复合物(比较例6)的情况下，15mg/kg时体重最大减少13％，肿瘤抑制达到T/C＝0.42。实施例5中，在MTD×2/3的11mg/kg时，体重虽然最大减少15％，但是自给药开始16天转为增加，显示出达到T/C＝0.32的肿瘤抑制效果。以上结果表明，与DOX溶液及内包DOX的脂质体相比较，DOX的聚合物复合物(实施例5)具有优良的抗肿瘤效果。
实施例13
MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)的合成
在改变无水肼的当量比之外，可以按照实施例2的合成方法进行聚合物的合成。具体而言，加入相对于5g(0.25mmol)MeO-PEG-pAsp(12-40)中的苄酯的0.25倍当量(相对于嵌段共聚物的10当量)的79.3μL无水肼(2.5mmol、Mw＝32.05)，得到粉末状的聚合物MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)。为确认所得到的化合物是否目的物质，可进行与实施例2相同的酰肼基的乙酰化反应，通过1H-NMR而确认。1分子聚合物中的聚天冬氨酸侧链上的酰肼基(q)为10个，苄酯基(p)为26个，COOH(n)为4个。
实施例14
MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)的合成
将实施例13中得到的500mg MeO-PEG-pAsp(Hyd，Bn)溶解于5mL的脱水DMSO中，加入相对于酰肼基的2倍当量(相对于嵌段共聚物的20当量)的盐酸阿霉素(DOX、MW＝580)，在37℃、遮光下进行3天反应。反应后，进行与实施例5相同的操作而精制，得到盐酸阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)。根据HPLC测定结果可知，1分子所得到的聚合物中盐酸阿霉素结合量为9个。
实施例15
MeO-PEG-pAsp(Hyd-EPI，Bn)的合成
除了将盐酸阿霉素变更为盐酸表阿霉素之外，进行与实施例14相同的操作，加入相对酰肼基的2倍等量(相对于嵌段共聚物的20当量)盐酸表阿霉素(以下有时略记为EPI、Mw＝580)，反应3天，得到盐酸表阿霉素的聚合物复合物(MeO-PEG-pAsp(Hyd-EPI，Bn))。根据HPLC测定结果可知，1分子所得到的聚合物中盐酸表阿霉素结合量为9个。
实施例16
使用MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)及MeO-PEG-pAsp(Hyd-EPI，Bn)的大鼠PK试验
使用实施例14中得到的盐酸阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)及实施例15中得到的盐酸表阿霉素的聚合物复合物MeO-PEG-pAsp(Hyd-EPI，Bn)，与实施例8相同地进行胶束的制备，进行大鼠PK试验。血浆中的EPI浓度的测定按照实施例8中记载的DOX浓度的测定方法进行。
从其结果可知，使用MeO-PEG-pAsp(Hyd-DOX，Bn)以DOX量为1mg/kg地进行尾静脉内给药时的AUC为142μg/mL·h，具有与实施例8相匹敌的优良的血中滞留性。另外，使用MeO-PEG-pAsp(Hyd-EPI，Bn)以EPI量为1mg/kg地进行尾静脉内给药时的AUC为132μg/mL·h，同样具有优良的血中滞留性。
另一方面，精细称取约10mg盐酸表阿霉素(山东新时代药业有限公司)，添加5％(w/v)葡萄糖水溶液使得其浓度为2mg/mL，完全溶解后，1mg/kg的尾静脉给药时的AUC为0.04μg/mL·h。
这些静脉内给药后的血浆中药物浓度的经时变化如图7所示。与盐酸表阿霉素溶液相比较，DOX及EPI中任意一个的聚合物复合物都表现出明显的持续的血浆中浓度变化，相比于比较例具有明显的优良血中滞留性。
至此为止，本发明的说明是以实例和说明为目的的例示。应当理解在不离开本发明的主旨及范围的条件下可进行种种改变。因此，可以理解本发明的权利要求书实际上包含了所有这样的改变。

Claims (22)

1.一种由由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域和侧链上具有酰肼基及疏水基的聚氨基酸区域构成的药物复合物用嵌段共聚物。
2.根据权利要求1所述的药物复合物用嵌段共聚物，其特征在于，具有以下结构：
Figure A2007800386270002C1
或
Figure A2007800386270002C2
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
但是，在p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的20％以上～不满90％、n存在的情况下，n、p及q是任意存在的，在n不存在的情况下，p及q是任意存在的，
y表示1或2的整数)。
3.根据权利要求2所述的药物复合物用嵌段共聚物，其特征在于，p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的25％以上～75％以下。
4.根据权利要求3所述的药物复合物用嵌段共聚物，其特征在于，R5是从由苄基、苯基、C4-苯基及C6～C16的烷基构成的群组中选出来的疏水基。
5.一种药物复合化嵌段共聚物，其特征在于，由具有酮结构的药物结合于权利要求1～4中任意一个所述的药物复合物用嵌段共聚物的酰肼基而成。
6.根据权利要求5所述的药物复合化嵌段共聚物，其特征在于，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
7.根据权利要求6所述的药物复合化嵌段共聚物，其特征在于，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～50％以下的单元相结合。
8.根据权利要求7所述的药物复合化嵌段共聚物，其特征在于，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～40％以下的单元相结合。
9.根据权利要求8所述的药物复合化嵌段共聚物，其特征在于，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682构成的群组中选出的。
10.一种高分子胶束医药组合物，其是由聚乙二醇构成的水溶性高分子区域作为外壳，由聚氨基酸及/或其衍生物构成的全体疏水性区域作为内核的高分子胶束医药组合物，其特征在于，上述全体疏水性区域具有结合于酰肼基的药物和疏水基，此处，结合于该酰肼的药物和疏水基可存在于相同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中，或可存在于不同的嵌段共聚物中的上述全体疏水性区域中。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其特征在于，其是由药物结合于下式的嵌段共聚物中的酰肼基而得到的医药组合物：
Figure A2007800386270004C1
或
Figure A2007800386270004C2
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可以被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；
R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
但是，在p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的20％以上～不满90％、n存在的情况下，n、p及q是任意存在的，在n不存在的情况下，p及q是任意存在的，
y表示1或2的整数)。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其特征在于，p占到嵌段共聚物中的聚氨基酸的全部单元数的25％以上～75％以下。
13.根据权利要求11所述的医药组合物，其特征在于，R5是从由苄基、苯基、C4-苯基及C6～C16的烷基构成的群组中选出的疏水基。
14.根据权利要求11所述的医药组合物，其特征在于，具有酮结构的药物结合于上述嵌段共聚物的酰肼基上。
15.根据权利要求14所述的医药组合物，其特征在于，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
16.根据权利要求15所述的医药组合物，其特征在于，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～50％以下的单元相结合。
17.根据权利要求16所述的医药组合物，其特征在于，蒽环类抗癌剂与聚氨基酸的全部单元数的10％以上～40％以下的单元相结合。
18.根据权利要求17所述的医药组合物，其特征在于，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682构成的群组中选出的。
19.根据权利要求10所述的医药组合物，其特征在于，其是由
(1)药物结合于下式的酰肼基的嵌段共聚物：
Figure A2007800386270006C1
或
Figure A2007800386270006C2
(式中
R1，相同或不同，表示氢原子、甲醇基、甲基、被置换的直链或分枝链或环状的C1～C12烷基，该置换基是从由可被保护的马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、羟基及活性酯基构成的群组中选出的官能基；
R2表示氢原子、饱和或不饱和C1～C30脂肪族羰基或芳基羰基；
R3表示-O-R5或-NH-R5；R5，相同或不同，表示疏水基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基；
L1及L2表示各自独立的连接基，
m表示5～1000的整数，
n表示0～1000的整数，
p表示1～1000的整数，
q表示1～1000的整数，
y表示1或2的整数)。
以及
(2)下述嵌段共聚物：
Figure A2007800386270007C1
或
Figure A2007800386270007C2
(式中
R1、R2、R3、R4、L1、L2、m、n、p及y具有与式(I)(II)相同的定义，但是，在n+p内的p占到50％～100％、n存在的情况下，n和p是任意存在或存在于嵌段中。)
构成的医药组合物。
20.根据权利要求19所述的医药组合物，其特征在于，药物是具有酮结构的药物。
21.根据权利要求20所述的医药组合物，其特征在于，具有酮结构的药物是蒽环类抗癌剂。
22.根据权利要求21所述的医药组合物，其特征在于，蒽环类抗癌剂是从由盐酸阿霉素、盐酸道诺霉素、盐酸表阿霉素、吡柔比星、盐酸伊达比星、盐酸氨柔比星、奈莫柔比星及PNU-159682构成的群组中选出的。
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