JP4781435B2 - 薬剤複合体用ブロック共重合体及び医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、優れた血中滞留性を供することができる薬物複合体用のブロック共重合体を提供する。

薬剤を経口や静脈内注射等により個体全身に投与すると、標的とすべき病巣部位以外の正常組織において副作用が認められ、治療方法の変更や中断を余儀なくされる場合がある。また、薬剤によっては、効果が得られる薬物濃度の維持が困難であったり、標的部位に送達される前に代謝されてしまう場合もある。
これらの問題を解決するため、体内における薬物の動態の制御あるいは選択的な送達により、目的とする作用部位において望ましい薬物濃度−時間パターンを与えて治療効果の最適化を図る、高度な製剤学的手法とコンセプトを導入した技術が、現在、盛んに研究されている。これらの技術とコンセプトは、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれ、近年、抗癌剤、ＤＮＡ、ペプチドなどを腫瘍部位や炎症部位などの病巣部に、より安全に効率よく送達するという点で特に重要視されている。
ＤＤＳの具体的な手段として、リポソーム、エマルジョン、またはナノパーティクルなどを薬物キャリアとして利用する方法、高分子ミセルなどの高分子キャリアに薬物を包含させる方法、あるいは合成高分子や天然多糖類に薬物を共有結合させる方法等が開発されている。しかしながら、これらシステムの実用化に際しては、克服すべき様々な問題点があり、中でも、生体側の異物認識機構からの回避、ＤＤＳ薬物キャリア中の薬物高含量化及び薬物遊離速度の制御が大きな課題となっている。
生体側の異物認識機構からの回避に関しては、リポソームをはじめとする薬物キャリアの表面をポリエチレングリコール等の親水性高分子で被覆することにより、血漿タンパク質やオプソニンタンパク質などの吸着を防止して血中安定性を高め、肝臓、脾臓等の細網内皮系（ＲＥＳ）での捕捉を回避することが可能となってきた。この結果、リポソームや高分子ミセルなどは、静脈内投与後、高い血中滞留性が得られ、腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進した組織に受動的に集積可能となり、効率よく治療できるようになってきた。
一方、ＤＤＳ薬物キャリア中の薬物含量に関しては、薬物含量が高い方が、必要な薬物をデリバリーするために要するキャリア量が少なくなり、その結果、治療効果と製剤設計の両面から好都合である［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，４３３６−４３４３（２００２）］。それにもかかわらず、リポソームや高分子ミセルに関しては、物理的安定性の面から、薬物含量に制限があり、また高分子複合体タイプのものに関しては、薬物含量を増加させると、水溶性高分子の性質にも影響を与え、その水溶性が低下してしまう。その結果、血漿成分との相互作用を抑制仕切れなくなり、血中滞留性を保つことが不可能になるので、薬物含量が数％のものがほとんどである［ＣＲＩＰＳ ５（２），２−８（２００４）］。したがって、現状では、薬物の高含量化と優れた血中滞留性の両面を達成するのは困難である。
例えば、特開２００３−３４６５３号公報には、ＤＤＳの最適化を図る具体的手段により、最適化され治療域が実質的に拡大されたＤＤＳ化合物を開示しており、薬物とキャリアを結合させるためのペプチドリンカーの配列、及びキャリアの構造を選択することにより、各抗癌剤の特徴を生かしたＤＤＳ化合物を作製することができる、と記述されている。しかし、抗腫瘍剤の含量はＤＤＳ化合物全重量に対して１−１０％程度である。
また、薬物遊離に関しては、血中において薬剤はキャリアと安定に内包、あるいは結合しており、病巣組織に到達した後に速やかに薬剤を放出するシステムが、副作用の軽減と治療効果の増強の観点から理想的である。
たとえば、特許第３２７０５９２号、特開平７−６９９００号公報、及びＷＯ９７／１２８９５は、高分子ブロック共重合体−アンスラサイクリン系抗癌剤医薬製剤を開示している。薬物を物理化学的結合、または薬物中のアミノ基とブロック共重合体中のカルボキシル基を利用したアミド結合にて封入している。したがって、薬剤はキャリアと結合し安定化されているが、病巣組織に到達した後に速やかに薬剤を放出するとは考えづらい。
薬物遊離の制御を高度に実現するため、各種の環境応答性キャリア、すなわち疾病に起因する環境変化、または、正常組織と病巣部位の環境の相違に応答して性質が変化する薬物キャリアが検討されている。
例えば、分子量約３万ＤａのＨＰＭＡポリマーにＧＦＬＧスペーサーを介してドキソルビンシンを結合させたＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＰＫ１）が報告されている。ＰＫ１は、正常組織よりも腫瘍部位により多く発現しているカテプシンＢによって薬物が遊離されるが、その薬物含量は８．５％であり、薬物の高含量化を達成しているわけではない。
一方、腫瘍や炎症などの病巣部位では局所のｐＨが正常な組織よりも低下することを利用し、このような病変部位でのｐＨ変化による環境に応答して薬物を放出することを目的とした検討が試みられている［Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５６，１０２３−１０５０（２００４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３２９（２），２９１−３０１（１９９７）］。
また、腫瘍局所において個々の癌細胞にエンドサイトーシス経路で取り込まれた後に、エンドソーム内の低ｐＨ環境に的確に応答して、塩酸ドキソルビシンを放出する、細胞内低ｐＨ環境応答型高分子複合体［Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ８７，３３−４７（２００３）］や高分子ミセルが報告されている［Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１６，１２２−１３０（２００５）］。特に、この高分子ミセルに関しては、薬物遊離のｐＨ依存性及び比較的高い薬物含量が達成されている。
しかしながら、当該高分子ミセルの薬物量を増加させると、著しく血中滞留性が低下することを本願発明者らは見出し、鋭意研究を重ねた結果、高薬物含量を達成し、且つ血中滞留性を高めることに成功した。

本発明の課題は、上記の問題点を解決可能な薬物複合体用のブロック共重合体の提供にある。当該ブロック共重合体と薬物の複合体は、複合体化されていない親薬物に比べて優れた血中滞留性を有し、治療域を拡大させることが可能となる。
本願発明は以下の態様を含む。
［１］ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、側鎖にヒドラジド基及び疎水性基を有するポリアミノ酸領域からなる薬剤複合体用ブロック共重合体。
［２］以下の構造からなる［１］の薬剤複合体用ブロック共重合体：

又は

（式中
Ｒ_１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ_２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ_３は、−Ｏ−Ｒ_５又は−ＮＨ−Ｒ_５を表し、Ｒ_５は同一または異なって疎水性基を表し、Ｒ_４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ_１及びＬ_２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００の整数を表し、
但し、ｐはブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２０％以上〜９０％未満を占め、ｎが存在する場合は、ｎ、ｐ及びｑはランダムに存在し、ｎが存在しない場合は、ｐ及びｑはランダムに存在し、
ｙは１又は２の整数を表す）。
［３］ｐがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２５％以上〜７５％以下を占める、［２］の薬剤複合体用ブロック共重合体。
［４］Ｒ_５が、ベンジル基、フェニル基、Ｃ_４−フェニル基及びＣ_６〜Ｃ_１６のアルキル基からなる群より選択される疎水性基である、［３］の薬剤複合体用ブロック共重合体。
［５］［１］〜［４］の何れかの薬剤複合体用ブロック共重合体のヒドラジド基にケトン構造を有する薬剤が結合した、薬剤複合化ブロック共重合体。
［６］ケトン構造を有する薬剤が、アンスラサイクリン系抗がん剤である［５］の薬剤複合化ブロック共重合体。
［７］アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、［６］の薬剤複合体化ブロック共重合体。
［８］アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜４０％以下の数結合している、［７］の薬剤複合体化ブロック共重合体。
［９］アンスラサイクリン系抗がん剤が、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸エピルビシン、ピラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、ネモルビシン及びＰＮＵ−１５９６８２からなる群より選択される［８］の薬剤複合化ブロック共重合体。
［１０］ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域を外殻とし、ポリアミノ酸及び／又はその誘導体からなる全体として疎水性の領域を内核とした高分子ミセル医薬組成物であって、前記全体として疎水性の領域は、ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基を有し、ここで当該ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基は同一のブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していても、異なるブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していてもよい、高分子ミセル医薬組成物。
［１１］医薬組成物が、下記式のブロック共重合体におけるヒドラジド基に薬物が結合してなる、［１０］の医薬組成物：

又は

（式中
Ｒ_１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ_２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、
Ｒ_３は、−Ｏ−Ｒ_５又は−ＮＨ−Ｒ_５を表し、Ｒ_５は同一または異なって疎水性基を表し、
Ｒ_４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ_１及びＬ_２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００の整数を表し、
但し、ｐはブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２０％以上〜９０％未満を占め、ｎが存在する場合は、ｎ、ｐ及びｑはランダムに存在し、ｎが存在しない場合は、ｐ及びｑはランダムに存在し、
ｙは１又は２の整数を表す）。
［１２］ｐがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２５％以上〜７５％以下を占める、［１１］の医薬組成物。
［１３］Ｒ_５がベンジル基、フェニル基、Ｃ_４−フェニル基およびＣ_６〜Ｃ_１６のアルキル基からなる群より選択される疎水性基である、［１１］の医薬組成物。
［１４］前記ブロック共重合体のヒドラジド基にケトン構造を有する薬剤が結合した、［１１］の医薬組成物。
［１５］ケトン構造を有する薬剤が、アンスラサイクリン系抗がん剤である、［１４］の医薬組成物。
［１６］アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、［１５］の医薬組成物。
［１７］アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％〜４０％以下の数結合している、［１６］の医薬組成物。
［１８］アンスラサイクリン系抗がん剤が、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸エピルビシン、ピラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、ネモルビシン及びＰＮＵ−１５９６８２からなる群より選択される、［１７］の医薬組成物。
［１９］医薬組成物が、
（１）下記式のヒドラジド基に薬物が結合しているブロック共重合体：

又は

（式中
Ｒ_１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ_２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ_３は、−Ｏ−Ｒ_５又は−ＮＨ−Ｒ_５を表し、Ｒ_５は同一または異なって疎水性基を表し、Ｒ_４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ_１及びＬ_２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００の整数を表し、
ｙは１又は２の整数を表す）
及び
（２）下記ブロック共重合体：

又は

（式中、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｌ_１、Ｌ_２、ｍ、ｎ、ｐ及びｙは式（Ｉ）（ＩＩ）と同義であり、但し、ｎ＋ｐの内ｐは５０％から１００％を占め、ｎが存在する場合は、ｎとｐはランダム又は、ブロックで存在する）
とからなる［１０］の医薬組成物。
［２０］薬剤が、ケトン構造を有する薬剤である［１９］の医薬組成物。
［２１］ケトン構造を有する薬剤が、アンスラサイクリン系抗がん剤である［２０］の医薬組成物。
［２２］アンスラサイクリン系抗がん剤が、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸エピルビシン、ピラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、ネモルビシン及びＰＮＵ−１５９６８２からなる群より選択される［２１］の医薬組成物。
驚くべきことに、薬剤複合体用ブロック共重合体を、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、側鎖にヒドラジド基及び疎水性基を有するポリアミノ酸領域とからなる構成にすることで、薬物の血中滞留性を顕著に向上させることができることを見出した。

図１は、ＤＯＸポリマーコンジュゲート（実施例５及び８）を雄性ラットにＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した後の、血漿中の総ＤＯＸ濃度の時間推移を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
図２は、ＤＯＸポリマーコンジュゲート（比較例５及び６）を雄性ＷｉｓｔａｒラットにＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇの投与量で尾静脈内投与した後の、血漿中の総ＤＯＸ濃度の時間推移を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
図３は、ＤＯＸ製剤静脈内投与後のラット血漿中の総ＤＯＸ濃度の時間推移を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
図４は、１３ＤＯＸポリマーコンジュゲート（実施例５）からの薬物遊離率を示す。
図５は、各ＤＯＸ製剤投与後のＰＣ−３移植ヌードマウスの腫瘍体積の経時変化を示す（ｎ＝８，平均値±ＳＥ）。矢印は投与のタイミングを示す。
図６は、各ＤＯＸ製剤投与後のＰＣ−３移植ヌードマウスの体重の経時変化を示す（ｎ＝８，平均値±ＳＥ）。矢印は投与のタイミングを示す。
図７は、ＤＯＸポリマーコンジュゲート（実施例１４）及びＥＰＩポリマーコンジュゲート（実施例１５）を雄性ラットに薬物量として１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した後の、血漿中総薬物濃度の時間推移を示す。

本発明に係る薬剤複合体用ブロック共重合体は、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、ポリアミノ酸領域とからなるブロック共重合体にヒドラジド基及び疎水性基を導入することで調製することができる。
ポリアミノ酸領域は、特に制限されるものではないが、ポリ（アスパラギン酸）及び／又はその誘導体、ポリ（グルタミン酸）及び／又はその誘導体、例えばポリ（β−アルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アリルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アラルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（γ−アルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（β−アルキルアスパルタミド−コ−アスパラギン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタミド−コ−グルタミン酸）、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）及びポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）などのポリ（アミノ酸誘導体）を挙げることができる。
特に、製造容易であり、本発明で都合よく使用できるブロック共重合体としては、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示すことのできるものを挙げることができる。

又は

（式中
Ｒ_１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ_２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ_３は、−Ｏ−Ｒ_５又は−ＮＨ−Ｒ_５を表し、Ｒ_５は同一または異なって疎水性基を表し、Ｒ_４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ_１及びＬ_２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００、好ましくは４０〜６００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００、好ましくは０〜１００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
但し、ｐはブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２０％以上〜９０％未満、好ましくは２５％以上〜５０％以下を占め、ｎが存在する場合は、ｎ、ｐ及びｑはランダムに存在し、ｎが存在しない場合は、ｐ及びｑはランダムに存在し、
ｙは１又は２の整数を表す）。
リンカーはブロック共重合体の製造方法により変化しうるので限定されるものではないが、Ｌ_１は、−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｚ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＨ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ_１〜Ｃ_８のアルキル基である）を挙げることができ、Ｌ_２は、−ＣＯ−Ｚ−、−Ｚ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、−Ｚ−ＣＯ−Ｚ−および−Ｚ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ−（ここで、Ｚは独立してＣ_１〜Ｃ_８のアルキル基である）を挙げることができる。
上記ブロック共重合体は、例えば公知のＭｅＯ−ＰＥＧポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）にヒドラジン、あるいはヒドラジン水和物を反応させることにより、そのベンジルエステル部分をヒドラジド基に変換することで合成することができる。通常その反応は脱水溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族又は芳香族の有機溶媒が用いられ、ブロック共重合体及びヒドラジン、あるいはヒドラジン水和物のいずれもが溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、又はそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。また、使用する溶媒は極力水を含まないことが好ましい。合成時におけるヒドラジンの添加量は、反応がほぼ定量的に進行することから、通常ブロック共重合体のベンジルエステル部分に対して導入したいだけの量を添加すればよい。例えば、ヒドラジンを用いる場合、ベンジルエステル部分に対して５０％導入する場合、０．５倍当量のヒドラジンを添加し、７５％導入する場合は、０．７５当量のヒドラジンを添加する。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が十分に進行する時間であればとくに制限はされないが、通常は２時間〜２日間である。
本発明に係る薬剤複合体用ブロック共重合体に複合せしめることのできる薬剤は、ヒドラジド基と反応して共有結合を形成できる薬剤であれば特に制限されない。このような薬剤の好ましい例としてケトン構造を有する薬剤、例えばアンスラサイクリン系抗がん剤が挙げられる。アンスラサイクリン系抗がん剤の具体例としては、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸エピルビシン、ピラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、ネモルビシン及びＰＮＵ−１５９６８２などが知られる。また、当該ブロック共重合体に複合せしめる薬剤の量は、血中滞留性を維持可能であれば特に限定されないが、ブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数に対して１０％以上〜５０％以下、好ましくは１０％以上〜４０％以下、薬効と安定性を考慮すれば１５％以上〜３５％以下の数である事が特に好ましい。尚、上記アンスラサイクリン系抗がん剤には複数のケトンが存在するが、ヒドラシド基と共有結合するケトンは１３位である。
上記薬剤の本発明に係る薬剤複合体用共重合体への結合は、好ましくは極力無水な条件下で薬剤をブロック共重合体のヒドラジド基に反応させるだけで達成される。好ましくは、本発明に係るブロック共重合を脱水した溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、又はそれらの混合溶媒に溶解し、薬剤を所望量において、例えばヒドラジド基に対し０．１〜１０当量、好ましくは０．１〜３当量で添加し、反応させる。反応は、０℃〜５０℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃の範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が十分に進行する時間であれば特に制限はされないが、通常は２時間〜５日間程度であろう。反応後の溶液を、適当な親水性有機溶媒、例えば２−プロパノールといったアルコール類に注ぎ入れ、沈殿させて洗浄し、回収する。回収は遠心分離操作で行ってよい。必要であれば、薬剤複合共重合体をゲル濾過クロマトグラフィーによる精製、限外濾過による精製などを行い、未結合の薬剤を除去してよい。
別の観点において、本発明は、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域を外殻とし、ポリアミノ酸及び／又はその誘導体からなる全体として疎水性の領域を内核とした高分子医薬組成物であって、前記全体として疎水性の領域は、ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基を有し、ここで当該ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基は同一のブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していても、異なるブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していてもよい、高分子ミセル医薬組成物、を提供する。本発明において「全体として疎水性の領域」とは、ブロック共重合体中のポリアミノ酸及び／又はその誘導体に結合した疎水性基によって疎水性となり、水性媒体中でブロック共重合体が、ポリエチレングリコールを外殻としたポリマーミセルを形成しうる疎水性の領域をいう。
かかる医薬組成物における高分子ミセルは、ヒドラジド基に薬剤の複合した本発明に係る薬剤複合ブロック共重合体のみから構成されるか（即ち、ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基は同一のブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在する）、あるいは（１）ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、側鎖にヒドラジド基を有し、疎水性基を有してもよいポリアミノ酸領域からなり、薬剤がそのヒドラジド基に結合したブロック共重合体と、（２）ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、疎水性基を有するポリアミノ酸及び／又はその誘導体領域からなり、薬剤の結合していないブロック共重合体、とから構成されてもよい。
薬剤の結合していない形態における上記（１）のブロック共重合体としては、例えば以下の式で表されるものが利用される。

又は

（式中
Ｒ_１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ_２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ_３は、−Ｏ−Ｒ_５又は−ＮＨ−Ｒ_５を表し、Ｒ_５は同一または異なって疎水性基を表し、Ｒ_４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ_１及びＬ_２は各々独立してリンカーを表し、ブロック共重合体の製造方法により変化しうるので限定されるものではないが、例えばＬ_１は、−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｚ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＨ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ_１〜Ｃ_８のアルキル基である）を挙げることができ、Ｌ_２は、−Ｚ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｚ−、−ＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、−Ｚ−ＣＯ−Ｚ−および−Ｚ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ−（ここで、Ｚは独立してＣ_１〜Ｃ_８のアルキル基である）であってよく、
ｍは、５〜１０００、好ましくは４０〜６００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００、好ましくは０〜１００の整数を表し、
ｐは、０〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｙは１又は２の整数を表す）。
上記ブロック共重合体におけるヒドラジド基の導入や薬剤の結合は、本発明に係る薬剤複合体用ブロック共重合体の製法に準じて行うことができる。
また、上記（２）のブロック共重合体としては、例えば以下の式で表されるものが利用される：

又は

（式中、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｌ_１、Ｌ_２、ｍ、ｎ、ｐ及びｙは式（Ｉ）（ＩＩ）と同義であり、但し、ｎ＋ｐの内ｐは５０％から１００％を占め、ｎが存在する場合ｎとｐはランダム又は、ブロックで存在する）。上記（１）のブロック共重合体に薬物を複合化したブロック共重合体と上記（２）のブロック共重合体の混合比は、特に限定されないが、１：１〜９：１の範囲で混合することができる。その場合、混合した全ブロック共重合体中の全ポリアミノ酸の数に対する疎水性基の割合は、３５％以上〜９５％未満であり、好ましくは５０％以上〜９５％未満である。この際、上記（１）、上記（２）何れの共重合体にも疎水性基は存在することができる。複合体化する薬物の割合は、混合した全ブロック共重合体中の全ポリアミノ酸の数に対して５％以上〜６５％以下、好ましくは５％以上〜５０％以下、より好ましくは５％以上〜２０％以下の数である。
高分子ミセルを形成する限り方法は特に限定されないが、本発明の医薬複合化ブロック共重合体は、水性媒体中に溶解または分散後撹拌することによって高分子ミセルを調製することができる。その際、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組合せた物理的エネルギーを与えてもよい。また、ブロック共重合体を揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を揮発させて乾固し、そこに水性媒体を加えて撹拌し、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組合せた物理的エネルギーを与えるか、ブロック共重合体に水性媒体を添加し、上記のごとき物理的エネルギーを与えることによって調製することができる。ここで揮発性の有機溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等を挙げることができ、結合する薬物に応じて適宜選択することができる。ここで水性媒体とは、水、生理食塩水、緩衝液等を挙げることができ、高分子ミセルの形成に影響を及ぼさない限り、少量の有機溶媒を含有してもよい。また、緩衝液のｐＨは、薬剤の結合部位を考慮すると６〜８が好ましく、より好ましくは中性である。
薬物複合化ブロック共重合体と非複合体化ブロック共重合体を混合して高分子ミセルを調製する場合は、特にその方法は限定されないが、例えば、両ブロック共重合体を揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を揮発させて乾固し、そこに上記水性媒体を加えて撹拌し、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組合せた物理的エネルギーを与えるか、両ブロック共重合体に水性媒体を添加し、上記のごとき物理的エネルギーを与えることによって調製することができる。ここで揮発性の有機溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等を挙げることができ、結合する薬物に応じて適宜選択することができる。
こうして、形成した高分子ミセルについて、その粒子径は生体に投与できるサイズであれば特に限定されないが、１０μｍ以下が好ましく、５μｍ以下であることがより好ましい。特に、静脈内投与で用いる場合は、２００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以下であることがより好ましい。必要であれば、高分子ミセル医薬組成物を含有する水性溶液を所望の孔径の親水性フィルターで濾過する。また、必要に応じて高分子ミセル含有医薬組成物には、緩衝剤、等張剤、安定化剤などを添加することができる。
本発明に係る薬剤複合ブロック共重合体又は高分子ミセル医薬組成物を生体内に投与する場合は、その投与ルートは問わないが、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。また、投与量は疾患の種類、年齢、体重、性別などにより適宜選択される。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡの合成
アルゴン下、片末端メトキシ、片末端アミノプロピルのポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ_２、平均分子量１２，０００）６１．６４ｇ（５．１４ｍｍｏｌ）に脱水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４００ｍｌ、脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍＬを加えて溶解し、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ，Ｍｗ＝２４９．２２）６７．２１ｇ（２６９．６８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下３７℃で一昼夜反応させた。反応後の溶液をヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液６Ｌに滴下し、ポリマーを沈殿させた。桐山ろ紙（φ９０ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行った。さらに、ポリマーを清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）溶液６Ｌを加えて、同様の操作を２回繰り返して洗浄操作をした後、減圧乾燥を行って粉末のメトキシポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。得た化合物が目的物であることは、下記に記載した測定条件にてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び^１Ｈ−ＮＭＲより確認した。ＧＰＣの結果から、ポリマーの分子量はＭｐ＝２０，７７８Ｄａ、ポリマーの分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０６である。ポリマーのポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）の重合度はＰＥＧ鎖の分子量及び^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより算出し、４０である。ＰＥＧの分子量１２，０００、ＰＢＬＡの重合度４０であるものを「１２−４０」と略記する）。
尚、実施例では便宜上、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡの分子量は２０，０００Ｄａとして計算に用いた。得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡは一般式Ｉにおいて平均値としてｍ＝２７２、ｎ＋ｐ＋ｑ＝４０であり、その内ｐが１００％を占める状態のブロック共重合体である。
以下、特に記載のない限り、下記の条件にて同様に分析を行った。
［測定装置と条件等］
（１）分子量測定（ＧＰＣ）
システム：Ｗａｔｅｒｓ ６００ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｔｙｒａｇｅｌ ＨＲ３（７．８φ×３００ｍｍ）（４０℃）
移動相：１０ｍＭ塩化リチウム含有ＤＭＦ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：屈折計（ＲＩ）
（２）核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ）
日本電子製 ＪＥＯＬ ＡＬ３００（３００ＭＨｚ）、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６、測定温度：室温
実施例２
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）の合成
アルゴン下、実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ５０ｍＬを加え、溶解させた。ベンジルエステルに対し０．５倍当量（ブロック共重合体に対して２０当量）の無水ヒドラジン１５９μＬ（５ｍｍｏｌ、Ｍｗ＝３２．０５）を加え、室温にて一昼夜反応させた。反応後、−２０℃に冷却した２−プロパノール７００ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させた。遠心分離操作（８，０００Ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を行い、ポリマーを回収した。清浄な−２０℃に冷却した２−プロパノールにて、同様の遠心操作による洗浄を２回繰り返した。さらにヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液７００ｍＬにて同様の遠心操作による洗浄を２回繰り返した。桐山ろ紙（φ４５ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行った後、減圧乾燥を行って粉末のポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ））を得た。得られた化合物が目的物であることは、無水酢酸を用いてヒドラジド基のアセチル化を行い、上記に記載した測定条件にて^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。^１Ｈ−ＮＭＲの結果から、ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基（ｑ）が１９個、ベンジルエステル基（ｐ）が１３個、ＣＯＯＨ（ｎ）が８個であった。
実施例３
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ８）の合成
アルゴン下、実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）１．５ｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ １５ｍＬを加え、溶解させた。ベンジルエステルに対し０．５倍当量（ブロック共重合体に対して２０当量）のｎ−オクチルアミン２４９μＬ（１．５ｍｍｏｌ、Ｍｗ＝１２９．２５）を加え、室温にて一昼夜反応させた。次いで、ベンジルエステルに対し０．５倍当量（ブロック共重合体に対して２０当量）の無水ヒドラジン４７．６μＬ（１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一昼夜反応させた。反応後、実施例２と同様の操作にて精製し、粉末のポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ８））を得た。得られた化合物が目的物であることは、実施例２と同様にアセチル化を行い、^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基（ｑ）が２０個、オクチル基（ｐ）が１１個、ＣＯＯＨ（ｎ）が９個であった。
実施例４
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）の合成
アルゴン下、実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）１．５ｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ１５ｍＬを加え、溶解させた。ベンジルエステルに対し０．５倍当量（ブロック共重合体に対して２０当量）の無水ヒドラジン４７．６μＬ（１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一昼夜反応させた。次いで、ベンジルエステルに対し１．５倍当量（ブロック共重合体に対して６０当量）の４−フェニルブチルアミン７１１μＬ（４．５ｍｍｏｌ、Ｍｗ＝１４９．２３）を加え、室温にて一昼夜反応させた。反応後、実施例２と同様の操作にて精製し、粉末のポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ））を得た。得られた化合物が目的物であることは、実施例２と同様にアセチル化を行い、^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基（ｑ）が２０個、フェニルブチル基（ｐ）が１３個、ＣＯＯＨ（ｎ）が７個であった。
実施例５
ａ．ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）の合成（以下、塩酸ドキソルビシンをＤＯＸと略記する事がある）
実施例２で得られた、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）２５０ｍｇを、脱水ＤＭＳＯ ５ｍＬに溶解し、ヒドラジド基に対して１．５倍当量（ブロック共重合体に対して３０当量）の塩酸ドキソルビシン（ＤＯＸ，Ｍｗ＝５８０）を加えて、室温、遮光下で３日間反応させた。反応後の溶液を−２０℃に冷却した２−プロパノール８０ｍＬに注ぎ、ポリマーを沈殿させた。遠心分離操作（２，３８０Ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）を行い、ポリマーを回収した。清浄な−２０℃に冷却した２−プロパノール９０ｍＬにて、同様の遠心操作による洗浄を４回繰り返した。次いで、ポリマーをメタノール（ＭｅＯＨ）５０ｍＬに溶解し、ＭｅＯＨで膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を充填したカラム（φ４２ｍｍ×５５ｃｍ）によりゲルろ過精製し、非結合のＤＯＸを除去した。回収したポリマー溶液にＤＭＦ８ｍＬを加えてエバポレーションにより、約３０ｍＬに濃縮し、再度ゲルろ過精製を行った。回収したポリマー溶液にＤＭＦ８ｍＬを加えて、エバポレーションによりＭｅＯＨを留去した。次いで、ポリマー溶液をヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液８０ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させた。遠心分離操作（２，３８０Ｇ，１０ｍｉｎ，１０℃）を行い、ポリマーを回収した。清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液９０ｍＬにて、同様の遠心操作による洗浄を２回繰り返した。桐山ろ紙（φ２１ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行った後、減圧乾燥を行って粉末の塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ））を得た。以下のＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマーコンジュゲート１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は１３個であり、ポリアミノ酸の全ユニット数の３２．５％であった。
ｂ．また、上記ａに準じた方法によってポリマー１分子中に８個の塩酸ドキソルビシンが結合した塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲートを調製した。
但し、ポリマーコンジュゲート１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は、酸加水分解後のポリマー中アスパラギン酸濃度と塩酸ドキソルビシン濃度のＨＰＬＣによる測定値から、ポリマー１分子がアスパラギン酸４０分子を含むとして計算した。アスパラギン酸濃度は、Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ・Ｔａｇ^ＴＭアミノ酸分析法のマニュアル（日本ウォーターズ）に従い、測定した。一方、ＤＯＸ濃度は、ＤＯＸポリマーコンジュゲートの濃度が１ｍｇ／ｍＬになるよう２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に分散後、その一部に同量の０．２Ｎ ＨＣｌを加え、最終０．１Ｎ ＨＣｌの濃度の下で、１時間室温で静置したのち、ＨＰＬＣで測定した。尚ＨＰＬＣによる条件は以下の通りである。また、特に記載がない場合、ＤＯＸに関するＨＰＬＣによる測定は、すべて同条件で行った。
システム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．６φ×１５０ｍｍ）（４０℃）
移動相：２５ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）／アセトニトリル＝７／３
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：蛍光（Ｅｘ：４８８ｎｍ，Ｅｍ：５６０ｎｍ）
インジェクション体積：１０μＬ
実施例６
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ８）の合成
実施例３で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ８）を用いて、実施例５と同様の操作にて、塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ８））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は１２個であった。
実施例７
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）の合成
実施例４で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）を用いて、実施例５と同様の操作にて、塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は６個であった。
実施例８
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）を用いたラットＰＫ試験
１）ミセルの調製
実施例５ａで得たコンジュゲート（１３ ＤＯＸ）、及び実施例５ａに準じて調製した異なるＤＯＸ結合量を有するＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）（８ ＤＯＸ）（実施例５ｂ）の２種を用いた。各ポリマーを１０〜２０ｍｇの間でサンプルバイアル中に精秤し、ジクロロメタンを１ｍＬ添加して、ポリマーを完全に溶解させた。その後、窒素気流下において、溶媒を留去し、ポリマーをフィルム状に製した。減圧下、室温で１時間さらに乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度になるよう、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％（ｗ／ｖ）グルコースを加え、ポリマーフィルムを４℃で水和した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間、超音波処理した。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液をミセルとし、以下の実験に用いた。
２）動物実験
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー（株）、６〜７週齢）に上記２種類のミセルをそれぞれ以下の条件でエーテル麻酔下、尾静脈内投与した（ｎ＝３）。ヘパリンコートしたシリンジを用いて採取した血液を４℃で遠心分離後、血漿を回収し測定まで−３０℃で保存した。
投与量： ＤＯＸとして１ｍｇ／ｋｇ
採血時間：投与後５分，１，３，６，９，２４，４８時間
採血量： ０．２−０．２５ｍＬ／回（頸静脈から）
３）血漿中のＤＯＸ濃度の測定
ａ）総ＤＯＸ濃度の測定
回収したラット血漿５０μＬに対し、アセトニトリル１００μＬ、０．４Ｎ ＨＣｌ ５０μＬをこの順序で加え、計２００μＬにして撹拌後、室温で１時間静置した。続いて遠心分離（フナコシ、チビタン、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）を室温で行い、上清を１００μＬ回収した。そこへ、０．２Ｎ ＮａＯＨ ３０μＬ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２０μＬ、２μｇ／ｍＬダウノルビシン塩酸塩（Ｗａｋｏ）（内部標準）／２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）５０μＬをこの順序で加え、計２００μＬとし撹拌した。この処理サンプル液をＨＰＬＣサンプルバイアルに充填し、ＨＰＬＣによる測定により、血漿中のＤＯＸ濃度を決定した。
ｂ）遊離ＤＯＸ濃度の測定
回収したラット血漿５０μＬに対し、アセトニトリル１００μＬを加え、遠心分離（フナコシ、チビタン、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）を室温で行い、上清を５０μＬ回収した。そこへ、２μｇ／ｍＬダウノルビシン塩酸塩（Ｗａｋｏ）（内部標準）／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００μＬを加えた。この処理サンプル液をＨＰＬＣサンプルバイアルに充填し、ＨＰＬＣ分析により、血漿中のＤＯＸ濃度を決定した。
ｃ）ポリマー結合型ＤＯＸ濃度の求め方
上記（ａ）、（ｂ）の値を用い、下式からポリマー結合型ＤＯＸ濃度を求めた。
（ポリマー結合型ＤＯＸ濃度）＝（総ＤＯＸ濃度）−（遊離型ＤＯＸ濃度）
４）血漿中濃度時間推移の測定結果
静脈内投与後の血漿中の総ＤＯＸ濃度の時間推移を図１に示した。８ ＤＯＸ、１３ ＤＯＸいずれのポリマーコンジュゲートにおいても、持続した血漿中濃度推移を示し、優れた血中滞留性を有することが分かった。但し、遊離型ＤＯＸ濃度は総ＤＯＸ濃度の１／１００程度であり、血中でＤＯＸポリマーコンジュゲートは安定であった。総ＤＯＸ濃度としてのＡＵＣは、８ ＤＯＸ、１３ ＤＯＸで順に１４９、２３８μｇ／ｍＬ・ｈとなった。ＡＵＣの結果を表１に示す。
実施例９
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ８）およびＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）を用いたラットＰＫ試験
実施例７で得られた塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）及び実施例６で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ８）を用い、実施例８と同様にミセルを調製し、ラットＰＫ試験を行った。
その結果ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ４−Ｐｈｅｎｙｌ）ではＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した時のＡＵＣは１５６μｇ／ｍＬ・ｈとなり、このコンジュゲートは実施例８に匹敵する優れた血中滞留性を有することが分かった。
また、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｃ８）のＡＵＣは９０．７μｇ／ｍＬ・ｈとなり、後述の比較例７よりも優れた血中滞留性を有する事が分かった。
比較例１
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ）の合成
アルゴン下、実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）６ｇ（０．３ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ ６０ｍＬを加え、溶解させた。ベンジルエステルに対し３倍当量（ブロック共重合体に対して１２０当量）の無水ヒドラジン１．１４ｍＬ（３６ｍｍｏｌ、Ｍｗ ３２．０５）を加え、室温にて一昼夜反応させた。実施例２と同様の操作にて精製し、粉末のＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ）を得た。得られた化合物が目的物であることは、実施例２と同様にアセチル化を行い、^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基（ｑ）が３７個、ＣＯＯＨ（ｎ）が３個であった。
比較例２
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，ＮＨ_４）の合成
実施例２と同様にして得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）２ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）に０．１Ｎ ＮａＯＨ ３０ｍＬを加えて、室温にて４時間加水分解を行った。その後、０．２５％アンモニア水３Ｌに対して２日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ＝３，５００）、０．２５％アンモニア水を５回交換］、次いで蒸留水３Ｌに対して２日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ＝３，５００）、蒸留水を４回交換］後、凍結乾燥を行った。得られたポリマー粉体をＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解し、ジエチルエーテル５００ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させ、桐山ろ紙（φ４５ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行った。清浄なジエチルエーテル４００ｍＬにて、同様の洗浄を２回繰り返した後、減圧乾燥を行って粉末のＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，ＮＨ_４）を得た。得た化合物が目的物であることは、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）の段階で、実施例２と同様にアセチル化を行い、^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基が１８個、アンモニウム塩が２２個であった。
比較例３
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＣＯＯＨ）の合成
実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）に０．５Ｎ ＮａＯＨ １６ｍＬ（８ｍｍｏｌ）を加えて、室温にて２時間加水分解を行った。クエン酸・１水和物でｐＨを３に調整後、限外ろ過（ミリポア社 ラボスケールＴＦＦシステム（ＵＦ膜：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ５付属））を行い、フィルターろ過（ミリポア社Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（登録商標）ＧＳ，０．２２μｍ）後、凍結乾燥した。次いで、ＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、ヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液５００ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させた。桐山ろ紙（φ４５ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行った。さらに、ポリマーを清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）溶液５００ｍＬを加えて、同様の操作を２回繰り返した後、減圧乾燥を行って粉末の加水分解物を（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＣＯＯＨ））を得た。
比較例４
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ａｍｉｄｅ−ＤＯＸ）の合成
アルゴン下、比較例３で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＣＯＯＨ）１ｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ １００ｍＬを加えて溶解し、カルボン酸に対し１倍当量（ブロック共重合体に対して４０当量）の塩酸ドキソルビシン１．３６５ｇ（２．３５ｍｍｏｌ）、１．５倍当量（ブロック共重合体に対して６０当量）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，Ｍｗ＝２０６．３３）７２８ｍｇ（３．５３ｍｍｏｌ）、１．５倍当量（ブロック共重合体に対して６０当量）のトリエチルアミン（Ｍｗ＝１０１．１９）４９２μＬ（３．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜反応させた。反応後の溶液を水３Ｌに対して１日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ＝３，５００、蒸留水を５回交換］後、凍結乾燥を行った。次いで、ポリマーをＤＭＦ ２０ｍＬに溶解し、ＤＭＦで膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を充填したカラム（φ４２ｍｍ×５５ｃｍ）によりゲルろ過精製した。回収したポリマー溶液を水３Ｌに対して２日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ＝３，５００、蒸留水を５回交換］後、凍結乾燥を行った。再度ＤＭＦに溶解し、ゲルろ過精製及び凍結乾燥を繰り返して、ＤＯＸのアミノ基がポリマーのカルボン酸にアミド結合で結合した粉末のポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ａｍｉｄｅ−ＤＯＸ））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中のドキソルビシン結合量は１３個であった。
比較例５
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ）の合成
比較例１で得られた、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ）を用いて、実施例５と同様の操作にて、塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は８個であった。
比較例６
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ）の合成
比較例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ）を用いて、比較例５に準じて塩酸ドキソルビシンの結合量が異なる塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は各々１５，２０，３９個であった。但し、３９個のＤＯＸが結合したポリマーコンジュゲートに関しては、フリーのＤＯＸが混在していると考えられた。
比較例７
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，ＮＨ_４）の合成
比較例２で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，ＮＨ_４）を用いて、実施例５と同様の操作にて、塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，ＮＨ_４））を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は１２個であった。
比較例８
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ）のＰＫ試験
１）比較例５、及び６で得られたＤＯＸコンジュゲートを用いた高分子ミセルの調製
４種のポリマー（８，１５，２０及び３９ ＤＯＸ）それぞれを１０〜２０ｍｇの間でサンプルバイアル中に精秤し、ジクロロメタンを１ｍＬ添加して、ポリマーを完全に溶解させた。その後、窒素気流下において、溶媒を留去し、ポリマーをフィルム状に製した。減圧下、室温で１時間さらに乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度になるよう、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％（ｗ／ｖ）グルコースを加え、ポリマーフィルムを４℃で水和した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間、超音波処理した。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液を高分子ミセルとし、以下の実験に用いた。
２）ラットＰＫ試験
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー（株）、６〜７週齢）に上記のミセルを実施例８と同様の条件で尾静脈内投与した（ＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）。採取した血液を４℃で遠心分離後、実施例８と同様の方法で、血漿中のＤＯＸ濃度を測定した。
３）血漿中濃度時間推移の測定結果
静脈内投与後の血漿中の総ＤＯＸ濃度の時間推移を図２に示し、この測定結果を基に計算したＡＵＣを表１にまとめた。３９及び２０ ＤＯＸポリマーコンジュゲートは速やかに消失するものの、１５及び８ ＤＯＸポリマーコンジュゲートに関しては、比較的持続した血漿滞留性を示した。３９、２０、１５及び８ ＤＯＸポリマーコンジュゲートのＡＵＣはそれぞれ、１．２、３．１、７．６及び１９．１μｇ／ｍＬ・ｈとなった。但し、実施例１で得られたＡＵＣと比較すると、１／１０以下であった。
比較例９
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ａｍｉｄｅ−ＤＯＸ）ミセルの調製
比較例４で得られたポリマー、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ａｍｉｄｅ−ＤＯＸ）を１０〜２０ｍｇの間でサンプルバイアル中に精秤し、ジクロロメタンを１ｍＬ添加して、ポリマーを完全に溶解させた。その後、窒素気流下において、溶媒を留去し、ポリマーをフィルム状に製した。減圧下、室温で１時間さらに乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度になるよう、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、ポリマーフィルムを４℃で水和した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間、超音波処理した。その後、ゲルろ過（ＰＤ−１０カラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％（ｗ／ｖ）グルコース）でサンプル中の遊離ＤＯＸを除き、回収した高分子画分を高分子ミセルとした。
比較例１０
ＤＯＸ内包リポソームの調製
Ｈ−Ｒｅｆｉｎｅｄ Ｓｏｙａ Ｌｅｃｉｔｈｉｎ（ＨＰＣ）［味の素ヘルシーサプライ（株）］、コレステロール（Ｃｈｏｌ）（Ｗａｋｏ）、Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ Ｃａｒｂａｍａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（日本油脂（株）ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ，ＰＥＧ鎖分子量：２，０００）を用い、モル比でＨＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ＝２：１：０．１の組成のもと、リポソームを調製した。すなわち、脂質のクロロホルム・ストック溶液から、窒素気流下で上記組成比のフィルムを作製し、一晩減圧乾固した後、２５０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４水溶液を添加し、６０℃で水和した。超音波照射（５分間）を６０℃で行った後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）で０．１μｍフィルター処理を６０℃で１１回行った。続いて、超遠心（６５，０００ｒｐｍ、１時間、２０℃、ベックマンコールター社、ＭＬＡ−１３０ローター）でリポソームを回収し、５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ水溶液で懸濁した。回収した空リポソームにＤＯＸ溶液（５％（ｗ／ｖ）グルコース）を添加し（ｌｉｐｉｄ：ＤＯＸ＝１：０．２ｗ／ｗ）、６５℃で２時間インキュベーションした。その後、リポソームに内包されなかったＤＯＸを除くため、同様の超遠心操作（６５，０００ｒｐｍ、１時間、２０℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）を行い、沈殿としてリポソームを得た。更に、ゲルろ過（ＰＤ−１０，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて、精製し（溶離液：５％（ｗ／ｖ）グルコース）、回収したリポソーム画分をラット投与サンプルとした。
比較例１１
ＤＯＸ内包物理吸着高分子ミセルの調製
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０ Ｂｎ６０％）の合成
比較例３で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＣＯＯＨ）１ｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を、アルゴン下脱水ＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、カルボン酸に対し１倍当量（ブロック共重合体に対して４０当量）のベンジルアルコール２４４μＬ（２．３６ｍｍｏｌ）、１倍当量（ブロック共重合体に対して４０当量）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，Ｍｗ：１２２．１７）２８８ｍｇ（２．３６ｍｍｏｌ）、１．５倍当量（ブロック共重合体に対して６０当量）のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ，Ｍｗ＝１２６．２ ｄ：０．８１５）５４８μＬ（３．５４ｍｍｏｌ）を加え室温で一昼夜反応させた。反応後の溶液をヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液２００ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させ、桐山ろ紙（φ４５ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行なった。さらに、ポリマーを清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液２００ｍＬにて洗浄を２回行いポリマー粉末を得た。
得られたポリマー粉末を水１００ｍＬに分散し、限外ろ過［ミリポア社 ラボスケールＴＦＦシステム（ＵＦ膜：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ １００付属）］を行い、フィルターろ過（ミリポア社 Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（登録商標）ＧＳ，０．２２μｍ）後凍結乾燥した。次いで、ＤＭＦ２０ｍＬに溶解しヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液２００ｍＬに滴下し、ポリマーを沈殿させ、桐山ろ紙（φ４５ｍｍ，５Ｂ）にてろ過を行なった。さらに、ポリマーを清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液２００ｍＬにて洗浄を２回行った後、減圧乾燥を行いＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０ Ｂｎ６０％）を得た。
得られたポリマーは実施例１と同様の条件で確認し、ＧＰＣの結果からポリマーの分子量はＭｐ＝１９５００Ｄａ、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０８であった。また、ベンジル基の導入は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより算出し２５分子であり、実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）から導入率を算出すると６３％であった。
塩酸ドキソルビシン（Ｗａｋｏ）を約１０ｍｇ精秤し、１０ｍｇ／ｍＬとなるようＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）を添加し溶解した。ここに、トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を塩酸ドキソルビシンに対して２倍のモル数（約５μＬ）添加し、室温で一晩放置した。一方、ポリマーとしては、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（６０％Ｂｎ）（１２−４０）を用いた。このポリマーを約２０ｍｇ精秤し、１０ｍｇ／ｍＬとなるようＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）を添加し溶解した。ここに、先ほど調製した塩酸ドキソルビシンＤＭＳＯ溶液０．４ｍＬを添加し（ｐｏｌｙｍｅｒ：ＤＯＸ＝１：０．２ｗ／ｗ）、この混合液を分子量カットオフが３，５００の透析膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標））の中に入れ、２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００ｍＬ中にて透析を４℃で一晩行った。透析膜チューブ内液を回収し、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下にて５分間超音波照射した。続いて、０．２２μｍフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過した後、ゲルろ過（ＰＤ−１０カラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、溶離液：５％（ｗ／ｖ）グルコース）でサンプル中の遊離ＤＯＸを除き、回収した高分子画分をＤＯＸ内包物理吸着高分子ミセルとし、以下の動物実験に用いた。
比較例１２
ＤＯＸ溶液の調製
塩酸ドキソルビシン（Ｗａｋｏ）を約１０ｍｇ精秤し、２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液を添加し、薬物を完全に溶解し、動物実験に使用した。
比較例１３
比較例のＰＫ試験
１）ラット投与実験
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー（株）、６〜７週齢）に上記比較例７、及び９〜１２のＤＯＸ製剤をＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇ（但し、比較例１２は５ｍｇ／ｋｇ）になるよう、エーテル麻酔下、尾静脈内投与した（ｎ＝３）。採取した血液を４℃で遠心分離後、血漿を回収し、測定まで−３０℃で保存した。
投与量： ＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇ（但し、比較例１２は５ｍｇ／ｋｇ）
採血時間：投与後５，３０分，１，３，６，９，２４，４８時間
採血量： ０．２〜０．２５ｍＬ／回（頸静脈から）
採取した血液を４℃で遠心分離して血漿を回収し、測定まで−３０℃で保存した。
２）ＤＯＸ濃度測定
比較例７に関しては、実施例８と同様に、他の比較例に関しては以下のようにして、血漿中のＤＯＸ濃度を測定した。
（１）リポソームの場合
回収したラット血漿４０μＬに対し、アセトニトリル４０μＬを添加し撹拌した後、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液を４０μＬ加えた。室温で遠心後（フナコシ、チビタン、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清８０μＬを回収し、内部標準となる１０μｇ／ｍＬダウノルビシン塩酸塩（Ｗａｋｏ）／２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）を２０μＬ加え、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用い、実施例８に記載の条件で測定した。
（２）ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ａｍｉｄｅ−ＤＯＸ）の場合
回収したラット血漿５０μＬに対し、１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを加え、計１００μＬにして撹拌後、８５℃で２０分間加温した。ただし、予備実験で、この処理によりドキソルビシンが関連化合物に１００％変換することを確認した。サンプルを室温に冷却後、アセトニトリル１００μＬ、内部標準として５μｇ／ｍＬ塩酸ドキソルビシン／１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０μＬ、１Ｎ ＮａＯＨ ５０μＬを順に加え撹拌した。続いて、遠心分離（フナコシ、チビタン、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）を室温で行い、上清を１００μＬ回収し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液をＨＰＬＣにより分析した。ＤＯＸ水溶液を同様に処理して作製した検量線を用い、血漿中の総ＤＯＸ濃度を決定した。
（３）ＤＯＸ溶液の場合
実施例８に記載した遊離ＤＯＸ濃度の測定方法に従い、測定した。
３）血漿中濃度時間推移の測定結果
各ＤＯＸ製剤の血漿中濃度推移の結果を図３に、この測定結果を基にして計算したＡＵＣを表１にまとめた。溶液投与時と比較して、物理吸着高分子ミセル化によるＡＵＣ増加は７倍であった。一方、アンモニウム塩を有するＤＯＸ複合体（比較例７）、及びアミド結合を利用したＤＯＸポリマーコンジュゲート（比較例９）ではＡＵＣが約５００倍増加したものの、実施例５の１／４程度であった。リポソーム（比較例１０）では、約２０００倍増加し、実施例５に匹敵するＡＵＣが得られた。

比較例１２に関しては５ｍｇ／ｋｇで得られたＡＵＣを５で除することにより投与量補正済み
実施例１０
疎水性基を有するポリマーの添加の影響
１）混合ミセルの調製
３９分子のＤＯＸを１ポリマー中に含有するＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ）（比較例６）を用いた。このコンジュゲートと比較例１１で調製した疎水性基を有する、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（６０％ Ｂｎ）（１２−４０）とを、各１０〜２０ｍｇの間で、重量比が１：１になるようサンプルバイアル中に精秤し、ジクロロメタンを１ｍＬ添加して、ポリマーを完全に溶解させた。その後、窒素気流下において、溶媒を留去し、ポリマーをフィルム状に製した。減圧下、室温で１時間さらに乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度になるよう、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％グルコースを加え、ポリマーフィルムを４℃で水和した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間、超音波処理した。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液を高分子ミセルとし、以下の実験に用いた。
２）ラットＰＫ試験とその結果
実施例８と同様の方法で、ＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように上記ミセルを静脈内投与した。血漿中の濃度推移を測定し、ＡＵＣを計算したところ１２．４μｇ／ｍＬ・ｈとなり、ＤＯＸポリマーコンジュゲートだけで調製した場合（比較例１３に記載）と比較して、約１０倍のＡＵＣの改善が認められた。この結果は、疎水性基を持つブロック共重合体を加えることで、ＤＯＸポリマーコンジュゲートミセルの血中安定性を向上できることを示している。
実施例１１
薬物遊離のｐＨ依存性試験
実施例５で得たポリマー約１０ｍｇをサンプルバイアル中に精秤し、ジクロロメタンを１ｍＬ添加して、ポリマーを完全に溶解させた。その後、窒素気流下において、溶媒を留去し、ポリマーをフィルム状に製した。減圧下、室温で１時間さらに乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度になるよう、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、ポリマーフィルムを４℃で水和した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所 Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間、超音波処理した。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液をミセルとし、以下の実験に用いた。
３７℃に予め加温した２０ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、またはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）９５０μＬに対し、上記の方法で調製したポリマーミセル５０μＬを添加することで、薬物遊離実験を開始した。予め決めた時間の後に、サンプルを５０μＬ回収し、代わりに同緩衝液で液量を補充した。回収サンプル中の遊離ＤＯＸ濃度は前述の方法に倣い、ＨＰＬＣで測定した。
結果を図４に示した。ｐＨ３においては速やかにＤＯＸが遊離するものの、ｐＨ５、７．４と液のｐＨが中性になるにつれて、その遊離速度が低下し、ｐＨ依存性が確認された。
実施例１２
薬効試験
雄性ヌードマウスに皮下移植したヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を薬効評価モデルとして用いた。
雄性ヌードマウス（Ｂａｌｂ ｎｕ／ｎｕ、５週齢）は日本チャールス・リバー（株）から、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞は（財）ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから、それぞれ購入した。ＣＯ_２インキュベーター内で継代培養したＰＣ−３細胞を注射用生理食塩水（大塚製薬）に懸濁し、一匹あたり細胞数として２×１０^６／５０μＬとなるようにヌードマウスの背部皮下に注射した。その後約２週間ヌードマウスを飼育した後、腫瘍体積の平均値が約５０ｍｍ^３に生育したところで薬剤の投与を開始した。ＤＯＸポリマーコンジュゲート（２処方：実施例５及び比較例６）を尾静脈内投与し（４日毎に計３回）、腫瘍体積から抗腫瘍効果、体重変化から副作用を評価した（１群８匹）。比較としてＤＯＸ溶液（比較例１２）及びＤＯＸ内包リポソーム（比較例１０）を用いた。各製剤の投与量は、健常マウスを用いて各々予め決定したＭＴＤ（比較例６，１０，１２）またはその２／３（実施例５）とした。
腫瘍体積と体重の経時変化を図５と図６にそれぞれ示した。ＤＯＸ溶液（比較例１２）の場合、ＭＴＤの５ｍｇ／ｋｇで体重が最大１７％減少し、腫瘍増殖抑制効果は最大でＴ／Ｃ＝０．４であった［Ｔ／Ｃ：薬物投与群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）の腫瘍体積の比］。リポソーム（比較例１０）の場合、ＭＴＤの５ｍｇ／ｋｇで２０％以上の体重減少が実験終了まで持続し、Ｔ／Ｃ＝０．４３まで腫瘍増殖を抑制した。ＤＯＸポリマーコンジュゲート（比較例６）の場合、１５ｍｇ／ｋｇで体重は最大１３％減少し、腫瘍はＴ／Ｃ＝０．４２まで抑制した。実施例５では、ＭＴＤ×２／３の１１ｍｇ／ｋｇで体重は最大１５％減少するものの、投与開始１６日以降には増加に転じ、Ｔ／Ｃ＝０．３２まで腫瘍増殖抑制効果を示した。以上の結果は、ＤＯＸ溶液やＤＯＸ内包リポソームと比較して、ＤＯＸポリマーコンジュゲート（実施例５）は優れた抗腫瘍効果を有することを示している。
実施例１３
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）の合成
無水ヒドラジンの当量比を変えた以外は、実施例２の合成方法に準じて、ポリマーの合成を行った。具体的には、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）中のベンジルエステルに対し０．２５倍当量（ブロック共重合体に対して１０当量）の無水ヒドラジン７９．３μＬ（２．５ｍｍｏｌ、Ｍｗ＝３２．０５）を加え、粉末のポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）を得た。得られた化合物が目的物であることは、実施例２と同様にヒドラジド基のアセチル化を行い、^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。ポリマー１分子中のポリアスパラギン酸側鎖はヒドラジド基（ｑ）が１０個、ベンジルエステル基（ｐ）が２６個、ＣＯＯＨ（ｎ）が４個であった。
実施例１４
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）の合成
実施例１３で得られた５００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ，Ｂｎ）を、５ｍＬの脱水ＤＭＳＯに溶解し、ヒドラジド基に対して２倍当量（ブロック共重合体に対して２０当量）の塩酸ドキソルビシン（ＤＯＸ、ＭＷ＝５８０）を加えて、３７℃、遮光下、３日間反応させた。反応後、実施例５と同様の操作にて精製し、塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸ドキソルビシン結合量は９個であった。
実施例１５
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＥＰＩ，Ｂｎ）の合成
塩酸ドキソルビシンを塩酸エピルビシンに変更した以外は実施例１４と同様の操作を行い、ヒドラジド基に対して２倍等量（ブロック共重合体に対して２０当量）の塩酸エピルビシン（以下ＥＰＩと略記することがある、Ｍｗ＝５８０）を加えて３日間反応させ、塩酸エピルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＥＰＩ，Ｂｎ）を得た。ＨＰＬＣによる測定の結果、得られたポリマー１分子中の塩酸エピルビシン結合量は９個であった。
実施例１６
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）、及びＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＥＰＩ，Ｂｎ）を用いたラットＰＫ試験
実施例１４で得られた塩酸ドキソルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ））、及び実施例１５で得られた塩酸エピルビシンポリマーコンジュゲート（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＥＰＩ，Ｂｎ））を用い、実施例８と同様にミセルを調製し、ラットＰＫ試験を行った。血漿中のＥＰＩ濃度の測定は、実施例８に記載のＤＯＸ濃度の測定方法に準じて行った。
その結果ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＤＯＸ，Ｂｎ）ではＤＯＸ量として１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した時のＡＵＣは１４２μｇ／ｍＬ・ｈとなり、実施例８に匹敵する優れた血中滞留性を有することが分かった。また、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（Ｈｙｄ−ＥＰＩ，Ｂｎ）でもＥＰＩ量として１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した時のＡＵＣは１３２μｇ／ｍＬ・ｈとなり、同様に優れた血中滞留性を有することが分かった。
一方、塩酸エピルビシン（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｎｅｗｔｉｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を約１０ｍｇ精秤し、２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液を添加し、完全に溶解した後、１ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した時のＡＵＣは０．０４μｇ／ｍＬ・ｈであった。
これらの静脈内投与後の血漿中薬物濃度の時間推移を図７に示した。塩酸エピルビシン溶液と比較して、ＤＯＸ及びＥＰＩいずれのポリマーコンジュゲートも、持続した血漿中濃度推移を示し、比較例に比べて優れた血中滞留性を有することが明らかとなった。
これまでの本発明の説明は実例と説明のための例示的なものである。本発明の概念及び範囲を逸脱することなく種々の改変を行い得ることが理解されるべきである。従って、請求の範囲はそのような改変の全てを包含するものと解されることを意図するものである。

Claims (9)

1. 所定の薬剤複合体用ブロック共重合体のヒドラジド基にケトン構造を有する薬剤が結合した、薬剤複合化ブロック共重合体であって、当該薬物結合の帰結として、側鎖にヒドラジド基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の０％を超えて３５％以下を占めた状態にある、薬剤複合化ブロック共重合体であり、
   前記所定の薬物複合体用ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、側鎖にヒドラジド基及び疎水性基を有するポリアミノ酸領域からなる薬剤複合体用ブロック共重合体であって、当該ブロック共重合体は以下の構造からなる、薬剤複合化ブロック共重合体：
   

   

   又は
   

   

   （式中
   Ｒ₁は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ₁〜Ｃ₁₂アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
   Ｒ₂は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ₁〜Ｃ₃₀脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
   Ｒ₃は、−Ｏ−Ｒ₅又は−ＮＨ−Ｒ₅を表し、Ｒ₅は同一または異なって疎水性基を表し、Ｒ₄は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ₁〜Ｃ₃₀脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
   Ｌ₁及びＬ₂は各々独立してリンカーを表し、
   ｍは、5〜1000の整数を表し、
   ｎは、0〜1000の整数を表し、
   ｐは、1〜1000の整数を表し、
   ｑは、1〜1000の整数を表し、
   但し、側鎖に疎水基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２５％以上〜７５％以下を占め、側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在する場合は、側鎖にカルボン酸基を有するユニット、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、そして側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在しない場合は、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、
   ｙは１又は２の整数を表す）。
2. Ｒ₅が、ベンジル基、フェニル基、Ｃ₄-フェニル基及びＣ₆〜Ｃ₁₆のアルキル基からなる群より選択される疎水性基である、請求項１に記載の薬剤複合化ブロック共重合体。
3. ヒドラジド基にケトン構造を有する薬剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、請求項１又は２に記載の薬剤複合化ブロック共重合体。
4. ヒドラジド基にケトン構造を有する薬剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜４０％以下の数結合している、請求項３に記載の薬剤複合体化ブロック共重合体。
5. ケトン構造を有する薬剤が、アンスラサイクリン系抗がん剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤複合化ブロック共重合体。
6. アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、請求項５に記載の薬剤複合体化ブロック共重合体。
7. アンスラサイクリン系抗がん剤が、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜４０％以下の数結合している、請求項６に記載の薬剤複合体化ブロック共重合体。
8. アンスラサイクリン系抗がん剤が、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸エピルビシン、ピラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、ネモルビシン及びPNU-159682からなる群より選択される請求項５〜７のいずれか１項に記載の薬剤複合化ブロック共重合体。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬物複合化ブロック共重合体によって形成された高分子ミセル医薬組成物であって、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域を外殻とし、ポリアミノ酸及び／又はその誘導体からなる全体として疎水性の領域を内核とし、前記全体として疎水性の領域は、ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基を有し、ここで当該ヒドラジド基に結合した薬剤と疎水性基は同一のブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していても、異なるブロック共重合体における前記全体として疎水性の領域に存在していてもよい、高分子ミセル医薬組成物。

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