JP7046321B2 - 修飾されたスチレン-無水マレイン酸共重合体及びその使用 - Google Patents
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Description
のようにして従来の抗酸化剤の欠点を克服したRNPはROSが関与する種々疾病に対し著しい治療効果を示すことを確認してきた。しかし、これまでのブロック共重合体による抗酸化ナノ粒子は合成に高真空条件を必要とし、合成にコストがかかる難点があった。また、リガンドの導入も難しく、粒子調製時に凝集しやすいなどの難点があった。これまでの低分子薬やタンパク薬と異なり、長いバイオアベイラビリティーと副作用を削減するためにはデザインが容易で非特異核酸を抑制し、安定に分散する材料を提供する材料が求められている。
前田らのスマンクスにおいて問題のあった分散安定性を向上させることが可能であること、さらに抗癌剤等の薬物を高分子骨格に共有結合やイオン結合させることなく前記の特定の薬剤を共有結合せしめた薬剤修飾共重合体から形成されるミセル(ナノ粒子)に封入又は内包できることが確認できたことにより解決された。
態様1:次式(I)に表される各反復単位を含んでなる共重合体:
x+yは5~1400の整数であり、nは5~1400の整数であり、x+y:nは1:1~5の比率にあり、x:yは1~20:1の比率にあり、x:yは1~60:1の比率にある。
(1)下付き記号yの付された反復単位において、L-PEG-A中、
Lは、O又はNHであり、PEGは次式で表され、
Aは、 A1:非置換若しくは置換C1-C12アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式RaRbCH-(ここで、Ra及びRbは独立して、C1-C4アルコキシまたはR1とR2は一緒になって-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-もしくは-O(CH2)4O-を表す。)の基、又は
A2:次式
(2)下付き記号xの付された反復単位において、
(a)R1又はR2のいずれか一方は、
a1 :次式
TEMPOは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル-3-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリン-1-オキシル-3-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-オキサゾリジン-3-オキシル-2-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-チアゾリジン-3-オキシル-2-イル及び2,4,4-トリメチル-イミダゾリンジン-3-オキシル-2-イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基;
a2:次式
a3:次式
a4:次式
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はOHであり、又は
(b)R1及びR2は、一緒になって-O-を表し、環式無水物残基を形成し、又は
(c)R1及びR2は、各OHを表す。
かつ、前記xの付された反復単位において、
(i)(a)を含む単位中のa1~a4のいずれか1つの残基のみを含むか、
(ii)(a)を含む単位中のa1~a4のいずれか1つの残基を含む単位と(b)及び(c)を含む単位のいずれか1つが相互に独立してランダムに存在し、(a)を含む単位中のa1~a4のいずれか1つを含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、
(iii)(a)を含む単位中のa1~a4のいずれか1つの残基を含む単位と(b)を含む単位と(c)を含む単位が共に独立してランダムに存在し、(a)を含む単位中のa1~a4のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、
(iv)(a)を含む単位の中の、a4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位と(b)及び(c)のいずれか1つを含む単位が共に独立してランダムに存在し、(a)を含む単位中のa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、
(v)(a)を含む単位の中の、a4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位と(b)を含む単位と(c)を含む単位が共に独立してランダムに存在し、(a)を含む単位中のa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占める。態様2:態様1に記載された共重合体であって、前記(a)を含む単位が、a1の残基を含む単位である、共重合体。
態様3:態様1に記載された共重合体であって、前記(a)を含む単位が、a2の残基を含む単位である、共重合体。
態様4:態様1に記載された共重合体であって、前記(a)を含む単位が、a3の残基を含む単位である、共重合体。
態様5:態様1に記載された共重合体であって、前記(a)を含む単位が、a4の残基を含む単位である、共重合体。
態様6:態様1に記載された共重合体であって、前記(a)を含む単位が、a1の残基を含む単位とa4の残基を含む単位である、共重合体。
態様7:態様1~6のいずれかに記載された共重合体であって、下付き記号yの付された反復単位において、L-PEG-A中のAが、A2の式
態様8:態様1~7のいずれかに記載された共重合体であって、TEMPOが、次式
で表されるいずれかの残基である、共重合体。
態様9:態様1~8のいずれかに記載された共重合体であって、水性媒体中で動的光散乱を測定すると、平均粒径がナノサイズにあるナノ粒子として存在する、共重合体。
態様10:態様1~8のいずれかに記載された共重合体と塩化ベンザルコニウムを含んでなる複合体。
態様11:態様1~8のいずれかに記載された共重合体と抗癌剤含んでなる医療用組成物。
態様12:抗癌剤がパクリタキセル又はソラフェニブである請求項11に記載の医療用組成物。
態様13:次式(II)で表される共重合体。を
R1-1又はR2-1のいずれか一方は、
a1 :次式
TEMPOは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル-3-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリン-1-オキシル-3-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-オキサゾリジン-3-オキシル-2-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-チアゾリジン-3-オキシル-2-イル及び2,4,4-トリメチル-イミダゾリンジン-3-オキシル-2-イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基;
a2:次式
a3:次式
a4:次式
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はOHであり、式(II)における環式無水物残基部分はm1の10%まで加水分解され開環していてもよく、
そして
m1+m2は、5~1400の整数であり、nは5~1400の整数であり、m1+m2:nは1:1~5の比率にある。
態様14:下付き記号m2の付された反復単位において,R1-1又はR2-1のいずれか一方が、
a1 :次式
、X線造影剤として機能すること以外、同等の特性を発揮する。また、このような残基は、例えば、当該共重合体が生体内で滞留又は蓄積する部位の追跡にも役立つ。
A中のPEGは、式
A2に定義される式
るPEG鎖の数、シリカの含有量等により、ミセル水溶液について動的光散乱(DLS)の測定を行った場合の平均粒径が約10nm~約600nm、好ましくは約15nm~約150nmのミセル粒子として得ることができる。
で表される共重合体にL-PEG-Aで表されるグラフト鎖に対応する化合物又はPEG誘導体を求核的に反応せしめることにより式(I)の共重合体を提供することもできる。かような観点から、式(II)で表される共重合体は、式(I)の共重合体の前駆体であり、また、それ自体、環式無水物残基の単位を利用して医療用デバイス等の表面のコーティング用材料して使用することもできる。
ルで結合したもの)
テルで結合したもの)
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)7.6gを無水THF50mLに溶解させた。市販の片末端メトキシ、他末端ヒドロキシ ポリ(エチレングリコール)(MW=5,000,MeO-PEG-OHと略記)25gを100mLナス型フラスコに計り取り、80℃で1日間減圧乾燥させた後、乾燥THF200mLに溶解させ、市販ブチルリチウム(ヘキサン溶液、1.6M)3.3mL加え、PEG末端をアルコラートにした。この溶液を先のPSMAのTHF溶液に加え、室温で1日反応させた。反応溶液を1Lのイソプロピルアルコールに投入し、遠心(9,000rpm、2分間)により沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をヘキサンに分散し、遠心で沈殿物を精製した(2回)。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した(30g)。得られたポリマーの構造は、製造例1のものを参照。
にエステルで結合したもの)
PSMA(分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)3.8g用いた以外、製造例2と同様の方法を実施した(収量30g)。得られたポリマーの構造は、製造例1のものを参照。
PSMA、分子量230KDa、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=1:1)7gを無水THF50mLに溶解させたこと以外、製造例4と同様の方法を実施して目的物を合成した(11g)。電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり464個であった。得られたポリマーの1H-NMRスペクトルを図4に示す。
無水THFの代わりに無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)を使ったこと以外、製造例5と同様の方法を実施して目的物を得た(7g)。電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり468個であった。得られたポリマーの1H-NMRスペクトルを図5に示す。
-TEMPOを導入したもの)
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量1,600、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=1.3:1)15gを無水THF100mLに溶解させたこと以外、製造例7と同様の方法を実施して目的物を合成した(19.5g)。電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり2.2個であった(残存無水マレイン酸4.8個)。得られたポリマーの1H-NMRスペクトルを図7に示す。
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にNH2-TEMPOを導入したもの)
ステルで結合し残りの無水マレイン酸環にNH2-TEMPOを導入したも
の)(一段合成)
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)38gを無水THF100mLに溶解させた。市販の片末端メトキシ、他末端ヒドロキシポリエチレングリコール(MW=5,000,MeO-PEG-OHと略記)50gを200mLナス型フラスコに計り取り、80℃で1日間減圧乾燥させた後、乾燥THF200mLに溶解させ、市販ブチルリチウム(ヘキサン溶液、1.6M)6.5mL加え、PEG末端をアルコラートにした。この溶液を先のPSMAのTHF溶液に加え、室温で2時間反応させた。NH2-TEMPO20gを60mLの無水THFに溶解し、上記溶液に加え室温で2時間攪拌する。反応溶液を1Lのエーテルに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った。(収量104g)ESRより1本あたりのTEMPO導入量は16.5であった。得られたポリマーの1H NMRスペクトルを図10に示す。
エステルで結合し残りの無水マレイン酸環の一部にNH2-TEMPOを導
入したもの)
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にボロン化合物を導入したもの)
テルで結合し残りの無水マレイン酸環にヨウ素化合物を導入したもの)
にベンジルアセタール基を導入したSMAPoの合成)
製造例14で調製した溶液A 43gと溶液B27gを混合し、室温で5時間攪拌した。反応溶液を1Lの2-プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行ない、目的のポリマーを得た(収量7g)。
Da)
窒素下100mLナスフラスコ中、4-(ジメトキシメチル)ベンジルアルコール0.54gを30mLの無水THFに溶解させ、カリウムナフタレンのTHF溶液(1.05M)3.3mLを加えた。その後冷却エチレンオキシ度(EO)を7g加え、水冷下、1日攪拌した。市販のPSMA(分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)2.3gを無水THF10gに溶解し上の溶液に混合し、5時間反応させた。反応溶液を1Lの2-プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行い目的のポリマーを得た(収量8.2g)。得られたポリマーのTOF-MSスペクトルを図17に、1H-NMRスペクトルを図18に、SEC測定結果を図19に示す。
製造例9で合成したSMAPoTN(N564)の50mgを10mLのDMFに溶解し、分画分子量3.6KDaの透析膜を用いて2Lの水に対して透析を行った。12時間ごとに透析水を2度交換したのち、遠心エバポレータで濃縮して10mg/mLとした。その溶液の動的光散乱及びゼータ電位を測定した。動的光散乱の測定結果を図20に、ゼータ(ζ)電位の測定結果を図21に示す。
塩化ベンザルコニウム(BKCl)(10%水溶液)を0.28gとミリQ水3.7mLとを混合させた(溶液A)。SMAPoTN(N564)70mgをミリQ水2mLと0.1M NaOH一滴加え混合した(溶液B)。溶液A、Bを下記の表1に示すように混合し、複合体を調製した。
イオン強度安定性
製造例18で調製したSMAPoTN(N564)と塩化ベンザルコニウ無(BKCl)との複合体(50:50)溶液にNaClを加えてイオン強度を60から500mMとして動的光散乱および散乱強度等を測定した。当該複合体のイオン強度依存性の粒径分布を図25に、散乱強度を図26に示す。
調製及び特性の決定
SMAPoB(N559)を用いたこと以外、製造例18と同様の方法で溶液を調製し、複合体を調製し、試験例1に記載のごとく粒度分布、イオン強度依存性の粒度分布及び散乱強度の測定を行った。測定結果をそれぞれ、図27、図28及び図29に示す。
調製及び特性の決定
製造例13で得られるSMAPoI(N561)を用いたこと以外、製造例19と同様の方法で溶液を調製し、複合体を調製し、試験例1に記載のごとく粒度分布、イオン強度依存性の粒度分布及び散乱強度の測定を行った。測定結果をそれぞれ、図30、図31及び図32に示す。
製造例13で合成したN561の20mgを4mLのメタノールに溶解し、4mLのミリQ水を加え、エバポレートした。半量になったところで4mLの水を加え、再度エバポレートした。これを二度繰り返した後全量を4mLとして動的光散乱により粒径を測定した。測定結果を図33に示す。図から平均粒径は体積分布で11nmであることが解かる。
製造例4、9及び15でそれぞれ、合成したサンプルN547(PEGなしSMATN)、N564(SMAPoTN,n=2)及びN606I(SMAace-PhPoTN;n=2)1.5gをそれぞれ15mLのDMFに溶解し、2Lの透析水に対して2日間透析した。最終濃度はそれぞれ30mg/mL、23mg/mL及び26mg/mLであった。これらの各溶液0.5mLをICRマウスに経口投与し、30分後及び4時間後に臓器を採取して電子スピン共鳴装置により分布を計測した。投与30分後及び4時間後の各ナノ粒子の臓器分布測定結果を図34及び35に示す。これらの結果から上記の3つのナ
ノ粒子は経口投与で血中には全く移行することが無かった。また、PEGのないN547は小腸には殆ど集積が見られないが、N564は小腸に良く集積した。ベンズアセタール末端を有するナノ粒子は胃への残存が長い傾向が認められる。
スチレン(100mg/ml)のトルエン溶液にSMATN(N547)(100mg/ml)、pSMAPoTN(N563)(100mg/ml)又はSMAPoTN(N564)(100mg/ml)のトルエン溶液を1:1の割合で混合し100μLずつ96wellの白色プレートに加え真空乾燥させトルエンを除去し、プレート表面にキャストした。比較対象としてスチレンのみでのキャストも同様におこなった。ヒポキサンチン及びキサンチンオキシダーゼを加え発生したスーパーオキシドをMPEC(アトー)により検出した。結果を図36に示す。N563及びN564をスチレンに練りこんでキャストしたものは発光量がスチレンのみの場合と比較して減少しており、スーパーオキシドを消去していることが確認できた。
(1)製造例11で得られるpSMAPoTN(n=2,N563)の22mgをガラスバイアル中で1mLのDMFに完全に溶解し、3-アミノプロピルトリメトキシシラン(d=0.946)の21μLと混合した。次いで、溶液に2.2mgのソラフェニブ(Sorafenib)、21μLのテトラエチルオルソシリケート(TEOS)及び30 μLのアンモニア水(NH3,28%)を連続的に加えた。混合2時間後、前記溶液に500μLのミリQ水を加えてさらに5分間混合した。その後、分画分子量3.6KDaの透析膜を用いて2Lの水に対して透析を行った。水を12時間後に交換し、さらに24時間後に回収した。溶液をPBS緩衝液(pH7.2(20mM PO4 3-))に1:1の比率で混合することにより動的光散乱分析に供し、粒子径分布を求めた。得られた結果を図37に示す。
(2)薬物の内包量を次のとおり試験した。サンプルをアセトにトリスと混合(50:50)し、2時間超音波浴中に放置した後、0.2μm孔のフィルターを用いて濾過した。薬物量は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用い254nmにおける吸収波長を試験することにより決定した。結果を表2に示す。
N561を125mg/mlの濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させ担癌マウス(Balb/c 5週齢)に100μLを癌に局所投与し、ALOKA LaTheta LCT-100にて撮影を行った。比較対象として、イオメロン(エーザイ)をヨウ素含有量にして等量局所投与した。測定結果を示す図に代わる写真を図38に示す。N561の場合に30分後においても腫瘍部分で検出できていることが確認された(同図矢印)。
入
N564(40mg)に対してPTXをポリマー重量の10%(4mg)と20%(8mg)をそれぞれ入れ、1mLのDMFガラスバイアル中で3時間混合した。その後2Lの超純水に対して分画分子量3.6kDaの透析膜を用いて透析を行い12時間後に水を交換し、さらに12時間後に回収した。未封入のドラッグを0.2μm孔のフィルターで除いた後、動的散乱光解析により粒子径分布を測定した。結果を図39に示す。その後、以下の通りに薬物封入量を調べた。サンプルを凍結乾燥しアセトニトリルに溶解後(1mg/mL)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて227nmの波長吸収を調べることでPTX薬物量を定量した。結果を以下の表3に示す。
pSMAPoTN(N563)、SMAPoTN(N564)のメタノール溶液(50mg/mL)でコラーゲンコートされた市販プラビーズカラム(http://dev.medicalonline.jp/index/product/eid/45155)をコーティングした。コーティング条件は下記のとおりである。
<コーティング条件>
(マル1):プラビーズそのまま
(マル2):N563コーティング
(マル3):N564 コーティング
I群:試料コーティング後風乾
II群:試料コーティング後風乾し、再度コーティング風乾を繰り返す
III群:試料コーティング後1週間密閉し放置
(1)上記のように準備したカラム(マル2)、(マル3)をリン酸緩衝液で3回洗浄した。洗浄液のESR強度を測定した結果を図40に示す。図(マル3)40から、N564((マル3)シリーズ、無水マレイン酸(MA)の残存が無いか又は少ないサンプル)では洗浄ごとにコーティングポリマーが剥離しているのに対し、N563(MAが明らかに残存している)では殆ど溶出しないことがわかり、安定なコーティングが達成された。図40参照。
(2)作製したカラムにヘパリン等の抗凝固剤無添加のマウス全血500μLを注入し2
0分間静置した。その後1μLのリン酸緩衝溶液で洗浄した。コーティングによる血栓の形成について測定した結果を図41に示し、洗浄後のカラムの状態を表す図に代わる写真を図42に示す。コラーゲンコーティングカラムでは極めて大量の血栓ができており、ほぼ洗浄ができない状況にあった。N564コーティングでもかなりの血栓が残っているのに対し、N563ではほぼ完全に血栓形成が押さえられており、極めて高性能な表面コーティング材となる。
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を150mmのシャーレで培養後コンフルエントに達した時、培地で細胞を107cells/mLに分散し、1mLずつバイアルに分注した。DMSO1%とSMAPoTN(N564)の所定量を加えピペッティング後、-80℃の冷凍庫で急速冷凍した。2日後バイアルを37℃の温湯の中に入れ、素早く融解させ、37℃のDMEM培地4mLと細胞懸濁液1mLを15mLファルコンに入れた。希釈した細胞懸濁液50μLと市販0.4w/v%トリパンブルー染色液50μLを1.5mLチューブに取り、混合し、血球計算盤により生細胞数を計測した。結果を図43に示す。図から、N564の添加で著しい細胞生存率の向上が見られる。一般に培養細胞は5~10%程度のジメチルスルホキシド(DMSO)を培養液に加え、105~106cells/mL程度の細胞を-80℃で凍結保存し、再度利用するときに解凍さる。再生医療や臓器保存を考えたときDMSOの量を極力減らし、大量に凍結できることが望ましい。
製造例1で合成したSMAPo(N557)の2.5gを無水THF25mLに溶解した。NH2-CH2Ph-I(4-ヨードベンジルアミン)1.0gの25mLのDMF溶液を、上記溶液に加え室温で2時間攪拌した。反応溶液を400mLの2-
プロパノールに投入し、減圧ろ過にて沈殿を回収し、減圧乾燥を行った。ICP解析より得られたポリマー中のNH-CH2Ph-I導入量は18であった。1H-NMRスペクトルを図44に示す。(収量2.5g)。
製造例1で合成したSMAPo(N557)2.5gを無水THF25mLに溶解した。NH2-CH2Ph-B(ピナコール):
スチレン溶液(100mg/mL トルエン)及びスチレン・N563混合溶液(前記スチレン溶液とN563溶液(10mg/mLトルエン溶液を遠心して得た上澄み液)を1:1で混和した溶液)を300μLずつ48ウェルプレートに加えた後乾燥させて薄膜を形成させた。マウスより得た全血を100μLずつ加え5分間静置させた後、生理食塩水で5回洗浄した。吸着したタンパク質成分をRIPAバッファーにより溶解させ、吸着量をBCA法により測定した。結果を図46に示す。図からN563を加えた薄膜の方がタンパク質の吸着量が少ない事が確認できた。
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)200mgを無水DMF5mLに溶解させた。市販の4-アミノ―2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル NH2-TEMPO)171mgをDMF0.85mLに溶解させ、上のPSMA/DMF溶液に加え、室温で1日攪拌した。反応溶液を透析膜(分画分子量3500)に入れ、蒸留水に対し24時間透析させDMFと残存NH2-TEMPOを除いた。その後透析後の溶液を液体窒素で凍結させ減圧下で凍結乾燥を行うことでポリマーを回収した(503mg)。得られたポリマーの電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり21個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー(SEC)の測定結果を図47に示す。
SMAにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にTEMPOを導入したも
の)の合成
SMAにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にTEMPOを導入したも
の)の合成
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)200mgとNH2-PEGをPSMAに対してモル比で1:3(399mg)の割合で無水DMF5mLに溶解させたこと以外、製造例9と同様の方法を実施してSMAPn3 TNを合成した(536mg)。得られたポリマーの電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり16個であった。得られたポリマーの1H-NMRスペクトルの測定結果を図49に示す。
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)300mgを無水THF10mLに溶解させた。市販の4-アミノ―2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル NH2-TEMPO)200mgをTHF1.2mLに溶解させ、上のPSMA/THF溶液に加え、室温で3日攪拌した。反応溶液を1Lのエーテルに投入し、沈殿物を得た。上澄みを捨て、沈殿物をエーテルに分散し、ろ過にて精製した(2回)。その後減圧乾燥によりポリマーを回収した(397mg)。得られたポリマーの電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり17個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー(SEC)の測定結果を図50に示す。
EGをPSMAにアミノ結合させ、残りの無水マレイン酸にTEMPOを導
入したもの)の合成
市販のポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)共重合体(PSMA、分子量7,500、スチレン:無水マレイン酸ユニット比=2:1)(PSMAと略記)300mgとNH2-PEGをPSMAに対してモル比で1:1.5(300mg)の割合で無水THF10mLに溶解させたこと以外、製造例25と同様の方法を実施してSMAPn1.5 TNを合成した(720mg)。得られたポリマーの電子スピン共鳴(ESR)スペクトル測定によりTEMPO導入率は1ポリマーあたり21.5個であった。得られたポリマーのサイズ分画クロマトグラフィー(SEC)の測定結果を図51に示す。
製造例24、25、26でそれぞれ合成した3つのサンプルSMATN、SMAPnTN(n=1、3)の20mgを2mLのメタノールに溶解し、分画分子量3.5KDaの透析膜を用いて2Lの水に対して透析を行った。数時間おきに透析水を交換し、最終濃度が5mg/mL前後となるように調製し、その溶液の動的光散乱を測定した。動的光散乱の測定結果を、それぞれ図52、図53及び図54に示す。
製造例27、28でそれぞれ合成した2つのサンプルSMATN、SMAPnTN(n=1.5)の20mgを2mLのメタノールに溶解し、分画分子量3.5KDaの透析膜を用いて2Lの水に対して透析を行った。数時間おきに透析水を交換し、最終濃度が5mg/mL前後となるように調製し、その溶液の動的光散乱を測定した。動的光散乱の測定結果を図55及び56に示す。
のpH応答性の評価
TEMPO導入率がほぼ等しいSMATN(反応溶媒DMF)とSMAPn1.5 TN(反応溶媒THF)に対し、上記のミセル調製法に基づき、最終ミセル濃度が約10mg/mLとなるようにミセルを調製し、pHに対する応答性を評価した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーに対して0.1Mおよび0.01M HClと0.1M NaOHを加えてさまざまなpHとなるようにバッファーを調製したあと、調製したミセル300μLに対してバッファー300μLを加え数秒攪拌し、動的散乱強度を測定した。SMATN及びSMAPn1.5 TNに関する測定結果をそれぞれ図57及び58に示す。体積別散乱強度で見た結果、PEGを導入していないSMATNはpH=2前後で顕著に凝集する傾向を示したのに対し、PEG鎖を1.5本導入したSMAPn1.5 TNはpH=3まで30nm前後の粒径を保つことが分かった。
応溶媒THF)の安定性評価
SMATN(反応溶媒DMF)とSMAPn1.5 TN(反応溶媒THF)に対し、上記のミセル調製法に基づき最終ミセル濃度が約10mg/mLとなるようにミセルを調製し、PBS滴下後のミセルの安定性を評価した。調製したミセル500μLに対し、pH=7.7のPBS500μLを加えて攪拌したあと、動的散乱強度及びESR測定を行った。なお、恒温水槽を用いて生体温度である37.4℃に保存して時間経過を測定した。SMATNにつていの結果をそれぞれ図59及び60に、SMAPn1.5 TNについての結果をそれぞれ図61及び62に示す。PEGを導入していないSMATNは時間経過につれ粒径や散乱強度に大きな変化は見られなかったが、PBS滴下後からTEMPOのシグナルがはっきりとみられた。PEG鎖を1.5本導入したSMAPn1.5 TNは時間経過につれ粒径および散乱強度が増加し、TEMPOシグナルも徐々にはっきりとしていったことから、イオンを含むPBS溶媒と親和していることが示唆された。
Claims (14)
- 次式(I)に表される各反復単位を含んでなる共重合体:
x+yは5~1400の整数であり、nは5~1400の整数であり、x+y:nは1:1~5の比率にあり、x:yは1~60:1の比率にある。
(1)下付き記号yの付された反復単位において、L-PEG-A中、
Lは、O又はNHであり、PEGは次式で表され、
Aは、
A1:非置換若しくは置換C1-C12アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式RaRbCH-(ここで、Ra及びRbは独立して、C1-C4アルコキシまたはR1とR2は一緒になって-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-もしくは-O(CH2)4O-を表す。)の基、又は
A2:次式
(2)下付き記号xの付された反復単位において、
(a)R1又はR2のいずれか一方は、
a1 :次式
TEMPOは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル-3-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリン-1-オキシル-3-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-オキサゾリジン-3-オキシル-2-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-チアゾリジン-3-オキシル-2-イル及び2,4,4-トリメチル-イミダゾリンジン-3-オキシル-2-イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基;
a2:次式
a3:次式
a4:次式
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はOHであり、又は
(b)R1及びR2は、一緒になって-O-を表し、環式無水物残基を形成し、又は
(c)R1及びR2は、各OHを表す、
ただし、前記xの付された反復単位は、
(i)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1~a4のいずれか1つの残基のみを含み、又は、
(ii)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1~a4のいずれか1つの残基を含む単位と(b)で定義される基若しくは(c)で定義される基を含む単位のいずれか1つを独立してランダムに含み、(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1~a4のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、又は、
(iii)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1とa2~a4のいずれか1つの残基を含む単位と(b)で定義される基若しくは(c)で定義される基を含む単位を独立してランダムに含み、(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1とa2~a4のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、又は、
(iv)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位と(b)で定義される基若しくは(c)で定義される基のいずれか1つを含む単位を共に独立してランダムに含み、(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、又は、
(v)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位と(b)で定義される基を含む単位と(c)で定義される基を含む単位をそれぞれ独立してランダムに含み、(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位とa1~a3のいずれか1つの残基を含む単位はxの付された反復単位の総数の15%~60%を占めるか、又は、
(vi)(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位とa1の残基を含む単位を共に独立してランダムに含む。 - 請求項1に記載された共重合体であって、前記(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1の残基である、共重合体。
- 請求項1に記載された共重合体であって、前記(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa2の残基である、共重合体。
- 請求項1に記載された共重合体であって、前記(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa3の残基である、共重合体。
- 請求項1に記載された共重合体であって、前記(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa4の残基を含む単位である、共重合体。
- 請求項1に記載された共重合体であって、前記(a)で定義されるR 1 又はR 2 のいずれか一方がa1の残基を含む単位とa4の残基である、共重合体。
- 次式(I)に表される各反復単位を含んでなる共重合体:
x+yは5~1400の整数であり、nは5~1400の整数であり、x+y:nは1:1~5の比率にあり、x:yは1~60:1の比率にある。
(1)下付き記号yの付された反復単位において、L-PEG-A中、
Lは、O又はNHであり、PEGは次式で表され、
Aは、
A1:非置換若しくは置換C 1 -C 12 アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式R a R b CH-(ここで、R a 及びR b は独立して、C 1 -C 4 アルコキシまたはR 1 とR 2 は一緒になって-OCH 2 CH 2 O-、-O(CH 2 ) 3 O-もしくは-O(CH 2 ) 4 O-を表す。)の基、又は
A2:次式
(2)下付き記号xの付された反復単位において、
(a)R 1 又はR 2 のいずれか一方は、
a1 :次式
TEMPOは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル-3-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリン-1-オキシル-3-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-オキサゾリジン-3-オキシル-2-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-チアゾリジン-3-オキシル-2-イル及び2,4,4-トリメチル-イミダゾリンジン-3-オキシル-2-イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基;
a2:次式
a3:次式
a4:次式
からなる群より選ばれる残基であり、
他方はOHであり、又は
(b)R 1 及びR 2 は、一緒になって-O-を表し、環式無水物残基を形成し、又は
(c)R 1 及びR 2 は、各OHを表す、
ただし、下付き記号yの付された反復単位において、L-PEG-A中のAが、A2の式
- 請求項1~8のいずれかに記載された共重合体であって、水性媒体中で動的光散乱を測定すると、平均粒径がナノサイズにあるナノ粒子として存在する、共重合体。
- 請求項1~8のいずれかに記載された共重合体と塩化ベンザルコニウムを含んでなる複合体。
- 請求項1~8のいずれかに記載された共重合体と抗癌剤含んでなる医療用組成物。
- 抗癌剤がパクリタキセル又はソラフェニブである請求項11に記載の医療用組成物。
- 次式(II)で表される共重合体。
R1-1又はR2-1のいずれか一方は、
a1 :次式
TEMPOは、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル-3-イル、2,2,5,5-テトラメチルピロリン-1-オキシル-3-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-オキサゾリジン-3-オキシル-2-イル、2,4,4-トリメチル-1,3-チアゾリジン-3-オキシル-2-イル及び2,4,4-トリメチル-イミダゾリンジン-3-オキシル-2-イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基;
a2:次式
a3:次式
a4:次式
からなる群より選ばれる1以上の残基であり、
他方はOHであり、式(II)における環式無水物残基部分はm1の10%まで加水分解され開環していてもよく、
そして
m1+m2は、5~1400の整数であり、nは5~1400の整数であり、m1+m2:nは1:1~5の比率にある。
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