CN101524374A - 黄背木耳发酵物、含该发酵物的口服制剂及制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用中药材与黄背木耳发酵制备而得的发酵产物及其制备方法，并涉及该发酵物的衍生产品及在医药保健食品领域的应用，本发明所解决的技术问题是提供一种具有活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢作用的全新的发酵产物，它是以黄背木耳Auricularia Polytricha(Mont)Sacl为起始菌体，在其培养基质中加入丹参，采用固体发酵的方式所得到的包含菌丝体及培养基质成分在内的菌质混合物。通过相关药理实验证明，该固体发酵物在活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢作用方面与丹参相比，具有相当于丹参或高于丹参药效的效果。

Description

黄背木耳发酵物、含该发酵物的口服制剂及制法和应用

技术领域

本发明涉及采用中药材与黄背木耳发酵制备而得的发酵产物及其制备方法，并涉及该发酵物的衍生产品及在医药保健食品领域的应用。

背景技术

目前对于多种药用、食用真菌代谢产物的研究，尤其涉及多糖类的抗肿瘤研究已有许多报道。长期以来其生产研究主要集中在液体深层发酵技术方面，又以借鉴抗生素生产工艺为主要方式；液体深层发酵技术生产效率较高，产品质量较稳定，但存在成本较高、耗能大、且易受污染、不易操作等技术问题。

由于我国具有丰富的中药资源，现研究领域新兴的双向型发酵技术即是将中药添加到真菌发酵底物中用于混合发酵的发酵技术，利用中药在发酵过程中抑制或促进真菌生长，或是影响代谢的作用，同时真菌又能通过微生物转化的作用将中药中的某些成分进行合成或修饰对中药起到减毒增效的作用。若将适当的中药材作为真菌发酵培养基或培养基的一部分成分，使其既提供真菌生长所需营养，同时又因真菌的分解和合成作用产生新的成分，从而使其性质发生变化；同时因不同种类真菌的生理代谢过程不同，基质中采用的中药材品种不同，因而使得发酵产生的物质可能具有的性质变得不可预测，但是要在数以千计的中药资源中与目前常用的药用、食用真菌配对培养发酵，以求获得兼具真菌和中药材的功效、或产生新功效的药性菌质、或兼有原有营养基质和中药材基质的全性菌质发酵终产物的随机性和不可预测性则大大增加。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种具有活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢作用的全新的发酵产物。

该发酵产物是以黄背木耳Auricularia Polytricha(Mont)Sacl为起始菌种，在其培养基质中加入丹参，采用固体发酵的方式所得到的包含菌丝体及培养基质成分在内的菌质混合物。

具体地，在培养基中包括提供碳源和氮源的成分，以重量百分比计为玉米芯3％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，剩余部分为丹参。

通过相关药理实验证明，该固体发酵物具有活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢的作用。

本发明所解决的第二个技术问题则是在该固体发酵物的基础上制备衍生产品，即是以黄背木耳固体发酵物为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而得的口服制剂，如常规的胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液，甚至于缓释制剂、控释制剂等后续产品；或加入食品上可接受的添加剂制备而得的食品或保健食品。制备上述产品是为了方便公众对该发酵产物的利用，根据实际需要生产成便利的产品。

本发明所解决的第三个技术问题是提供该固体发酵物的一种制备方法，具体地即采用固体发酵技术。其培养基质中的碳源和氮源成分以重量百分比计为玉米芯3％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，剩余部分为丹参；其中所述丹参为粉末；取黄背木耳菌丝体置于培养基质中发酵，在15～25℃的温度条件下发酵30～50天得到包含菌丝体及培养基质成分在内的菌质混合物。该制备方法简单易行，原料成本低廉易得，还避免了采用液体发酵方式存在的成本较高、耗能大、且易受污染、不易操作等技术问题。

本发明所解决的第四个技术问题是提供该固体发酵物的用途，即是应用于制备具有活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢功效的药品、保健食品，该固体发酵物作用广泛，无副作用。

具体实施方式

本发明黄背木耳固体发酵物，其培养基质包括碳源和氮源成分，在培养基质中加入丹参，通过丹参对黄背木耳菌丝体生长代谢过程的影响和黄背木耳真菌酶系对丹参改造在内的双向性固体发酵后，得到的兼具丹参药材和黄背木耳真菌功效的菌质发酵产物，在本申请文件中又称菌质混合物。

培养基质中加入重量百分比为10～85％的丹参，便于混合，需将丹参粉碎为粉末。其余物质为碳源和氮源成分，可以采用黄背木耳常用的碳源及氮源成分。根据培养基筛选实验显示，当丹参在培养基质中所占重量配比为10～70％时，黄背木耳菌丝体均能正常生长，无生长抑制现象，生长速度也无差别。

发明人所采用的固体培养基质中的碳源和氮源成分以重量百分比计为玉米芯3％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，其余成分为丹参(含量约为10～85％)。

而通过实验结果显示，培养基质中加入重量百分比为70％的丹参时，即采用玉米芯2％、麦麸24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，丹参70％作为培养基质可以获得较好和满意的结果，并且随培养基质中丹参药材添加比例的增高，多糖和蛋白含量也呈现逐渐增高的趋势。

采用添加了丹参的培养基质采用固体发酵的方式制备黄背木耳固体发酵物，其温度条件为15～25℃，发酵时间为30～50天，较优的发酵时间为35～40天，得到的包含菌丝体及培养基质成分在内的菌质混合物即为黄背木耳固体发酵物，此时子实体还基本未长出。在培养基质中所添加的丹参既可以是药材丹参，也可以是丹参边角料，即全株除入药以外的部分，以及药材加工过程中产生的边角料次等品、废弃物，使用该部分即可实现所生产的固体发酵物具有药用功效，利用这些边角料成本也将大大降低，提高对丹参药材的利用率。

为了便于公众实际应用，可以将所得的黄背木耳固体发酵物作为活性成分，加入药学上可接受的辅料，采用常规的制剂方法制备口服制剂；也可以按照保健食品或食品常用的制备方法，加入常用添加剂制备，或者与食品主料成分(如米、面、杂粮等主食性淀粉成分，或糖果、糕点、饮料等其它食品的主要原料成分)混合食用。

以下提供几种常用口服制剂的制备方法，但并不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

若将本发明黄背木耳固体发酵物与常规辅料(蜂蜜、单糖浆、山梨酸、苯甲酸等)混合均匀后，分装灭菌，即得口服液。

若将本发明黄背木耳固体发酵物与常规辅料(水溶性赋形剂、乙醇等)通过制粒、干燥、整粒、包装等过程，即得颗粒剂。

若将本发明黄背木耳固体发酵物与淀粉、乳糖混匀，成规方法制粒后，加入硬酯酸镁整粒，压片，即得。具体地，称取本发明黄背木耳固体发酵物100g、淀粉60g、乳糖30g、硬酯酸镁10g，共制成1000片，得到每片含黄背木耳固体发酵物100mg的片剂。

以下通过对培养基质及发酵条件的筛选说明采用本发明方法制备而得的黄背木耳固体发酵物所具有的优点。并通过相关药理实验证明该发酵产物所在保健医疗方面所具有的意想不到的功效。

(一)培养基质的选择

以如表1所示的不同组成形式的培养基质对黄背木耳在含有丹参的培养基质中的生长适应性进行了试验，表1中的“其他成分”是重量比为2∶1∶1的玉米粉、蔗糖和食用级石膏粉，然后按黄背木耳的常规发酵方式操作。

黄背木耳的常规发酵方式：母菌种由PDA斜面培养基保存。按培养基质配方，加水拌匀，含水量为60％，装袋后压实，每袋装料500g，中间打一个圆洞，用牛皮封口并扎紧，115MPa高压灭菌，保持3小时，或常压灭菌，煮沸后保持24小时。冷却后，无菌操作接入黄背木耳母菌种，把接好种的瓶子放在培养室培养，培养室内温度应保持在22-25℃。

表1固体发酵培养基

发酵结果显示，所有组合的培养基质均适于黄背木耳菌丝体生长，无生长抑制现象，就生长速度而言组间无明显差别。

从接种开始记录黄背木耳菌丝体在固体发酵培养基上的平均生长速度，生长速度见表2，由表2绘制的黄背木耳菌丝体生长曲线显示：菌丝体生长可分为四个阶段：(1)萌芽期(0-6d)：菌丝生长较慢，菌丝较纤弱；(2)旺盛期(6-8d)：菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；(3)下降期(8-13d)：菌丝生长速度急剧下降；(4)回升期(13-15d)：菌丝生长速度有所回升；(5)衰退期(15-35d)：菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色素。该实验结果表明，菌丝生长至接种13天后，生长速度趋于平稳且不断下降，至30天后，生长速度趋于平缓不变。

以苯酚-硫酸比色法观察上述黄背木耳/丹参全性菌质固体发酵体系总多糖含量的动态变化：

(1)取样方法：从接种日起，每隔10d分别取各组合的固体发酵样品3袋(3个平行)，各袋分别烘干打粉(40目)作为受测样品。

(2)供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉5g(约相当于多糖0.22g)，置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min后收集上清液，少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。②提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热(避免焦化)浓缩到约15ml，放冷至室温，加乙醇100ml，搅匀，放置使其沉淀15分钟。转移此溶液连同沉淀于离心管中，继续用少量80％乙醇以玻棒充分刮洗蒸发皿，洗液和沉淀同样转移至离心管中，以3000～4000rpm速度离心15min，弃去上清液，在离心管中加入少量80％乙醇，轻轻洗涤，同样离心弃去上清液(保留沉淀物)。然后将离心管(连同沉淀物)于50℃烘箱挥干乙醇，然后加热水溶解沉淀，转移至250ml量瓶中，继续用热水以玻棒充分刮洗离心管，洗液同样转移至250ml量瓶中，放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀即得供试品溶液。

(3)标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配制成0.85mg/ml的贮备液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml分别置于50ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。再分别精密量取上述各稀释液2ml置具塞试管中，同时精密量取水2.0ml置另一具塞试管中，各管分别加5％苯酚溶液(新制)1ml，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0ml，立即摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做参比，于490nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度(μg/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取供试品溶液2.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算出样品中总多糖的含量(以葡萄糖计)。实验结果见表3所示。

由表3绘制的图表显示，随着发酵时间的增长，各组合粗多糖含量基本呈逐渐下降趋势，从接种后10天到30天，变化较为剧烈；接种后30天到50天，变化趋势变缓，至50天取样时粗多糖含量与40天时相比已基本不变。

以考马斯亮蓝法观察该全性菌质固体发酵体系粗蛋白含量动态变化：

(1)取样方法：从接种日起，每隔10d取各组的固体发酵样品2-4袋，按组分别混合后烘干打粉(40目)作为样品。

(2)供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉5g(约相当于多糖0.22g)，置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min，收集上清液，用少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热(避免焦化)浓缩到约20ml，放冷至室温。

(3)标准曲线的制作：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000μg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。精密吸取牛血清白蛋白标准溶液0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于具塞试管中加水定容至1ml，摇匀得牛血清白蛋白稀释液，各管分别加考马斯亮蓝工作液(新制)5ml，摇匀，以1.0ml水所制得的空白溶液做参比，于590nm波长处测定各溶液吸收度，以牛血清白蛋白稀释液的浓度(μg/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取供试品溶液1.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加考马斯亮蓝工作液，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取蛋白质浓度，再计算出样品中蛋白质的含量。实验结果见表4。

由表4绘制的图表显示，随着发酵时间的增长，各组合的粗蛋白含量基本呈逐渐下降趋势，从接种后10天到30天，变化较为剧烈；接种后30天到50天，变化趋势变缓，至50天取样时粗蛋白含量与40天时相比已基本不变。

上述试验结果显示，以营养性成分的重量比例为玉米芯2％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，其余为药用原料丹参为培养基质，特别是以玉米芯2％、麦麸24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，丹参70％可以获得较好和满意的结果，并且随培养基质中丹参药材添加比例的增高，多糖和蛋白含量也呈现逐渐增高的趋势。黄背木耳在上述的培养基质中按常规方式进行的固体发酵时，常温下(约15～25℃)，发酵30～50天，更好的是在固体发酵35～40天，收集包含菌丝体及培养基质成分在内的菌质混合物，可以获得理想的效果。

表2黄背木耳菌丝体在固体发酵培养基上的平均生长速度(cm/d)

表3黄背木耳菌丝体在固体发酵过程中的粗多糖含量(mg/g)

时间(d)	10	20	30	40	50
						组合1	939.6732	282.4306	109.7952	31.67659	29.85314
组合2	1076.522	364.8612	148.4322	78.397	73.26989
						组合3	1280.512	1041.332	523.4254	90.2305	84.3621
组合4	1364.92	726.4055	306.8151	129.0231	126.7934
						组合5	1404.093	1326.587	875.0189	109.0644	105.6245
组合6	1636.9	1289.738	830.2405	126.8169	124.6214
						组合7	1550.841	1212.334	708.1624	117.8612	110.255
组合8	1689.841	1597.926	405.4935	141.3008	134.8219
						组合9	1582.663	1278.673	702.3321	115.3826	108.2646
组合10	1840.839	1299.476	815.1074	142.3	135.2314
						组合11	1775.848	880.9534	469.0074	163.095	154.6982
组合12	1958.46	1009.821	788.5977	280.827	259.1324

表4黄背木耳菌丝体在固体发酵过程中的粗蛋白含量(μg/g)

(二)药理实验

通过下述显示，本发明黄背木耳-丹参固体发酵物(简称黄丹菌质)可以具有明显优于单一的黄背木耳或丹参药材，以及按常规方式相互组合的黄背木耳、丹参混合药物的生物学功能。

样品制备：

(1)黄丹菌质组：在下述药理实验中均采用的是编号为12的培养基质发酵所得的黄丹菌质，发酵条件为常温下(约15～25℃)，发酵35～40天。收获黄丹菌质，烘干后用10倍体积蒸馏水100℃提取30分钟，提取3次，浓缩后为黄丹菌质样品。

(2)黄背木耳菌质组：用无丹参的培养基，常温下(约15～25℃)，发酵35～40天。收获菌质，烘干后用10倍体积蒸馏水100℃提取30分钟，提取3次，浓缩后为黄背木耳菌质样品。

(3)黄背木耳/丹参混合药物组：用无丹参的培养基础，常温下(约15～25℃)，发酵35～40天，烘干后添加与编号为12的培养基质中相同比例的中药丹参，后用10倍体积蒸馏水100℃提取30分钟，提取3次，浓缩后为黄背木耳/丹参混合药物样品。

(4)丹参药材组：用10倍体积蒸馏水100℃提取丹参中药30分钟，提取3次，浓缩至与黄丹菌质中丹参浓度相同，为丹参药材样品

一、黄丹菌质对小鼠凝血时间(CT)的影响

实验动物：KM种小鼠50只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组(0.15g/10g，即每10g体重小鼠灌胃黄丹菌质中丹参含量为0.15g，折算成黄丹菌质为0.15÷丹参在黄丹菌质中的比例，以下同)、正常组(蒸馏水0.2ml/10g)、黄背木耳/丹参混合药物组(用无丹参单独发酵的黄背木耳菌质代替除与黄丹菌质等比例的丹参药材外的其余部分，以下同)、黄背木耳空白对照组(无丹参单独发酵的黄背木耳菌质，灌胃剂量同黄丹菌质组即0.15÷丹参在黄丹菌质中的比例，组合12为0.15÷0.7≈0.2ml/10g，以下同)和丹参药材组(与黄丹菌质同批次药材，0.15g丹参生药/10g，即每10g体重小鼠灌胃0.15g丹参水提取液，以下同)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后1h用内径1mm玻璃毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血，自血液流人管中开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌上，每隔30s折断两端毛细管，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现时停止计时，所得时间即为CT。结果以X±S表示，组间行t检验。

实验结果：经单因素方差分析表明，黄背木耳/丹参混合药物组、黄丹菌质组、丹参药材组的凝血时间与正常组相比有显著延长(P＜0.05)，黄丹菌质组略好于黄背木耳/丹参混合药物组和丹参药材组，提示其具备抑制小鼠的凝血功能。结果如表5所示。

表5黄丹菌质对小鼠凝血时间(CT)的影响

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

二、黄丹菌质对小鼠尾出血时间的影响

实验动物：KM种小鼠50只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、正常组、黄背木耳/丹参混合药物组、黄背木耳、空白对照组和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后1h取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖1.5mm处剪断，用滤纸吸血直至吸不出血为止，记录断尾尖至吸不出血的时间即为尾出血时间。

实验结果：黄丹菌质组、丹参药材组的尾出血时间明显长于正常组(P＜0.05)，说明黄丹菌质组具有能够抑制小鼠血凝系统的功能。结果如表6所示。

表6黄丹菌质对小鼠尾出血时间的影响

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

三、黄丹菌质对小鼠尾部血栓形成的影响

实验动物：KM种小鼠50只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、正常组、黄背木耳/丹参混合药物组、黄背木耳空白对照组和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。给药第4天注射1.5％角叉菜胶于小鼠左右后肢脚掌皮下，每只脚掌0.03ml(0.06ml/只)，注射完毕后于18℃培养，继续给药3天，并于注射后24h，48h，72h测量小鼠全尾长度和尾部血栓长度，计算血栓率。

实验结果表明，黄丹菌质组与模型组比较，血栓长度明显缩短，差异极显著(P＜0.01)，丹参药材组也表现出一定趋势，说明丹参的确具有一定的活血化瘀功能，而黄丹菌质在此方面的药效更胜于丹参药材。结果如表7所示。

表7黄丹菌质对小鼠尾部血栓形成的影响

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

四、黄丹菌质对小鼠耳廓微循环的影响

实验动物：KM种小鼠50只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、正常组、黄背木耳/丹参混合药物组、黄背木耳空白对照组和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药前，各小鼠ip12.5％戊巴比妥钠0.4mg/kg麻醉，将小鼠右耳廓部用脱毛剂脱毛，耳廓平展于耳托上，64倍物镜观察，观察部位的确定：距耳廓边缘约1.5～2mm处，在平行于耳廓边缘方向，自中间细动脉开始右行约1mm范围内为观察部位。将测微尺(0-1000μm)置于此处。凡与该测微尺相交之血管均视为有效，对其进行BI.2000图像系统分析。选择流速稳定区域微动脉(A)、微静脉(V)各一条并标记，记录血管管径及血液流速。而后给药3d。在末次给药后0.5h，同法麻醉并测定标记血管管径及血液流速。分析给药前后管径及血液流速变化情况。以给药前后两次结果差值(ΔV，ΔA)及血流速度之差作为微循环改善情况的指标。实验数据进行t值检验和方差分析。

实验结果显示，各给药组对管径增加值与正常对照组进行比较，经统计学检验，均达到极显著性差异(P＜0.01)，小鼠微动脉、微静脉血液也明显加快。各给药组组对血液流速增加值与正常对照组进行比较，经统计学检验，均达到极显著性差异(P＜0.01)。结果如表8所示。

表8黄丹菌质对小鼠耳廓微循环的影响

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

五、黄丹菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

实验动物：KM种小鼠60只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、正常组、黄背木耳/丹参混合药物组、黄背木耳空白对照组和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后30min，200g/L乌拉坦1.0g/kg静脉注射麻醉，分离双侧颈总动脉及迷走神经，用手术线同时结扎，观察小鼠的存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。

实验结果显示，黄丹菌质可显著延长小鼠结扎双侧颈总动脉及迷走神经后的存活时间，与正常组比较差异显著(P＜0.05)，说明其可能是通过改善缺血脑组织的血氧供应，起到对缺血脑组织损伤起到保护作用的。结果如表9所示。

表9黄丹菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

六、黄丹菌质对断头小鼠喘息时间的影响

实验动物：KM种小鼠20只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、正常组、黄背木耳/丹参混合药物组、黄背木耳空白对照组和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续7d。末次给药1h后，自小鼠耳后根部快速断头，记录小鼠断头后喘息的时间(s)。

实验结果显示，黄丹菌质组相比正常组，断头后喘气时间明显延长，增幅约达到13.4％，提示其具有一定的抗脑缺血缺氧作用。结果如表10所示。

表10黄丹菌质对断头小鼠喘息时间的影响

注：与正常对照组相比：^＊＊P＜0.01，^＊P＜0.05。

七、黄丹菌质对脑缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响

实验动物：KM种小鼠20只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、模型组、假手术组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。①伊文思蓝标准曲线的制备：将伊文思蓝配制成系列浓度(0.39，0.78，1.56，3.12，6.24，12.48，24.96g/m1)，分光光度计620nm处测定吸光度(A)值，以浓度为横坐标，以吸光度(A)值为纵坐标，得回归直线方程。②小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量的测定：末次给药后1h，假手术组尾静脉注射伊文思蓝50mg/kg，分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉前5min，尾静脉注射伊文思蓝50mg/kg。结扎3h后断头，小心剥取两侧大脑半球，称重，加入0.5％NaSO₄3ml与丙酮7ml，匀浆，密封放置1h，3000rpm离心10min，取上清液，以丙酮-硫酸(3比7)混合液调零，620nm处测定吸光度。根椐标准曲线计算出脑内伊文思蓝的含量(g/g脑湿重)。

实验结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量明显降低；与模型组比较，黄丹菌质能显著降低小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量(P＜0.05)。结果如表11所示。

表11黄丹菌质脑缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响

与假手术组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

八、黄丹菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响

实验动物：KM种小鼠20只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为黄丹菌质组、模型组、假手术组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。①小鼠脑缺血后脑组织匀浆液的制备：末次给药后1h，假手术组分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉3h后断头，小心剥取两侧大脑半球，称重，按重量∶体积＝1∶9的比例加入预冷的生理盐水(4℃)，用组织匀浆器充分匀浆，将匀浆液以1500g，4℃离心12min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量，-70℃冻存备用。②脑组织SOD活性、MDA含量的测定：i.取1％大脑组织匀浆液，采用黄嘌呤氧化酶法(SOD检测试剂盒)，于波长550nm处分别测定各组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。ii.取1％大脑组织匀浆液，采用TBA比色法(MDA检测试剂盒)，于波长532nm处分别测定各组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。

实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑缺血后脑中MDA含量明显增高，SOD活性明显降低；与模型组比较，黄丹菌质能显著降低小鼠脑缺血后脑中MDA含量，显著提高脑组织SOD活性(P＜0.05)。试验结果如表12所示。

表12黄丹菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响

与假手术组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

九、黄丹菌质的毒性试验

1、给小鼠灌食最大给药浓度和剂量都不致死，不能测出黄丹菌质的半数致死量。

2、用黄丹菌质进行了大鼠致畸胎试验、Ames试验、小鼠骨髓微核试验和染色体畸变试验，证明该药无致畸和致突作用。

毒性时间结果证明本发明黄背木耳固体发酵物安全无毒。

上述各项试验结果充分表明，本发明黄背木耳固体发酵物不仅无明显毒副作用，而且在活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化和清除自由基、增强免疫促进代谢等方面，可具有明显优于单一的黄背木耳、丹参药物原料、也优于其常规方式混合(复方)药物的生物学功能，且原料来源丰富，提取和制备方法并无特殊要求和限制。

Claims (10)

1、黄背木耳固体发酵物，为培养基质上接种黄背木耳发酵而得，其培养基质包括碳源和氮源成分，其特征在于：在培养基质中加入了丹参。

2、根据权利要求1所述的黄背木耳固体发酵物，其特征在于：培养基质中加入重量百分比为10～85％的丹参。

3、根据权利要求2所述的黄背木耳固体发酵物，其特征在于：培养基质中加入重量百分比为70％的丹参。

4、根据权利要求1所述的黄背木耳固体发酵物，其特征在于：所述固体培养基质中的碳源和氮源成分以重量百分比计为玉米芯3％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，剩余部分为丹参。

5、根据权利要求4所述的黄背木耳固体发酵物，其特征在于：所述固体培养基质中的碳源和氮源成分以重量百分比计为玉米芯2％、麦麸24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，剩余部分为丹参。

6、根据权利要求1～5任一项所述的黄背木耳固体发酵物，其特征在于：其固体发酵的温度条件为15～25℃，发酵时间为30～50天。

7、以权利要求1所述的黄背木耳固体发酵物为活性成分制备而得的口服药物制剂或食品。

8、权利要求1所述的黄背木耳固体发酵物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

A、制备固体培养基质：培养基质中的碳源和氮源成分以重量百分比计为玉米芯3％～78％、麦麸8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用级石膏粉1％，剩余部分为丹参；

B、接黄背木耳于培养基质中发酵，得到包含菌丝体及培养基质成分在内的混合物。

9、根据权利要求8所述的黄背木耳固体发酵物的制备方法，其特征在于：步骤B所述的发酵条件为在15～25℃的温度条件下发酵30～50天。

10、权利要求1所述的黄背木耳固体发酵物在制备具有活血化瘀、抗炎镇痛、抗脂质过氧化、清除自由基、增强免疫促进代谢功效的药品、保健食品中的应用。