CN102274256B - 具有活血化瘀和抗氧化功效的菌质混合物、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

具有活血化瘀和抗氧化功效的菌质混合物、制备方法及应用。所说的菌质是由真菌灵芝在全药性培养基质川芎片上固体发酵后得到的灵芝菌丝体和培养基成分的混合物。制备方法是以含水量为总重量40％～60％的中药材川芎为培养基，将灵芝的原种接种在该培养基上，在适宜灵芝生长的条件下固体发酵后，收集包含灵芝菌丝体和培养基成分在内的全部菌质混合物。以该菌质为有效活性成分，分别于药物、食品或化妆品中可以接受的其它成分，可以得到活血化瘀和抗氧化功效的相应药物、功能食品或化妆品。

Description

具有活血化瘀和抗氧化功效的菌质混合物、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种由灵芝经固体发酵得到的菌质混合物、其制备方法以及在药物、功能食品或化妆品方面的应用。

背景技术

灵芝在我国已有几千年的历史。现已记载有灵芝科真菌4属103种，其中灵芝属77种，《中国药典》(2000年版)已收载赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(Ganoderma sinense)作为药用。灵芝子实体含有丰富的营养成分和药用成分，除含水分12.49％～13.02％外，还含有粗蛋白11.98％～13.87％，粗脂肪0.81％～1.96％，总糖7.34％～8.10％，其多糖含量为1.06％～1.33％，钙1550μg/g、镁483μg/g、铁180μg/g、锌44.7μg/g及磷37.5μg/g等人体必需的常量或微量元素，还含有18种常见氨基酸，总量为6.07％～6.38％，其中必需氨基酸含量丰富(E/T＝0.528～0.545)；另有少量萜类物质等。目前，灵芝的人工栽培技术已经普及，主要有袋料和椴木栽培两种方式，对产品的加工技术也日趋成熟，包括保健饮料(如灵芝茶、灵芝酒)、药品(如灵芝冲剂、灵芝丸、灵芝胶囊)、美容品等多种灵芝类产品已为人们认识、接受和使用。

目前对包括灵芝等多种药(食)用真菌代谢产物的研究，尤其是多糖类的抗肿瘤研究已有许多报道。对其生产研究长期以来主要是集中在液体深层发酵方面，主要借鉴抗生素生产工艺。虽然其生产效率较高，产品质量较稳定，但存在成本较高，耗能大，且易受污染，不易操作等问题。

固体发酵生产工艺使用的培养基，多是利用农副产品如麸、糠、甘蔗渣、玉米芯等，成本大大低于液体发酵，且由于其灭菌后可在自然条件下培养，污染率较低等优点，近年来已成为真菌生产研究的热点。早期的真菌固体发酵主要是固体培养，即将培养基装袋灭菌后接种真菌，收获子实体，培养基的主要功能是提供真菌生长所需营养物质，即碳源、氮源、矿质营养与维生素等成分。自20世纪七十年代后开始研究应用菌丝体，出现了无渣型和去渣型两类生产工艺。

近来有学者进一步提出了“菌质”的概念，即真菌在固体培养基上发酵后形成的既不同于单纯的菌丝体，也不同于培养基渣滓，而是包含了真菌菌丝体以其中的活性成分、真菌代谢产物和培养基成分在内的复杂成分发酵终产物体系。如，庄毅等在“药用真菌新型固体发酵工程与槐芪菌质的研制”(《中国药学杂志》2004(3)Vol.39，175-178)中报道了由槐耳菌和黄芪构成发酵组合生产槐芪菌质，进行了发酵中药材的筛选、发酵终点的确定实验，并对不同菌种接种同种基质后产生菌质的药效学比较、菌质多糖提取和清膏除杂以及这两者对同一药效的比较试验。

陈华珍等在“灵芪菌质发酵工艺初报”(《中西医结合学报》2004(3)，Vol.2，216)中报道了将灵芝分别在普通基质、药性基质(含黄芪)、富硒药性基质中发酵，对三种基质中菌质的有效部位多糖的含量进行测定及动态研究，比较其变化。谷坤睿等的“14个灵芝菌株的新型双向型固体发酵及菌质多糖含量测定”(《时珍国医国药》2005(4)，Vol.16，313)、刘学湘等的“灵芝和灵芪菌质多糖的含量动态变化初步分析”(《中医药学报》2005(6)，Vol.33，33)、以及郁帅陆等的“黄芪固体发酵中有效成分的变化”(《食品与药品》2007(03A)，Vol.9，8)等，分别报道了对相应菌质中的多糖、蛋白、三萜类等活性成分物质的测定及变化。

发酵，是通过微生物对有机物的作用，以获得某种或几种产品。由真菌固体发酵所生产的菌质，其实质是真菌与培养基质共同构成发酵组合物。一方面，其通过酶作用于发酵基质，分解基质成分，摄取营养，生长大量菌丝体；另一方面真菌的代谢过程既使基质被分解出现新成分，同时还可以合成新成分。这些新成分的性质可因不同真菌所具酶的差异而有所不同，并会受到基质的种类和/或性质，以及发酵条件的影响。发酵所形成的各种成分，有的可累积在菌丝体内(胞内)，有的则留在基质中或由菌丝体分泌到基质中去(胞外)，形成为既不同于单纯菌丝体、也不同于培养基质的更为复杂和丰富成分体系的发酵终产物——菌质，为进一步的充分利用和开发提供了广阔的基础。

将菌质生产和中草药应用紧密联系，将适当的中药材作为真菌固体发酵培养基或培养基的一部分成分，使其既提供真菌生长所需营养，同时又因真菌的分解和合成作用产生新的成分，使其性质发生变化；同时因不同种类真菌的生理代谢过程不同，基质中采用的中药材品种不同而成分和功效不同，因而可以得到不仅兼具真菌和中药材的功效、并可能产生新功效的药性菌质或兼有原有营养基质和中药材基质的全性菌质发酵终产物。

由于不同菌种与不同基质交叉组合可构成不同的发酵组合，可产生种类更为繁多的菌质，因此可成为中药材特别是菌物药开发的新途径，并可被应用于药物和/或功能性食品中。

发明内容

鉴于此，本发明将提供一种具有活血化瘀和抗氧化功效的灵芝菌质混合物，特别是一种由灵芝在全药性基质原料培养基质上经固体发酵得到菌质混合物，进一步还将提供该菌质混合物的制备方法，以及该菌质混合物在包括药物、功能性食品和化妆品等方面的应用。

本发明具有活血化瘀和抗氧化功效的菌质，是由真菌灵芝在全药性培养基质川芎片上固体发酵后得到的灵芝菌丝体和培养基成分的混合物。

川芎(Ligusticum Chuanxiong Hort.)为伞形科植物川芎的干燥根茎，是一味传统的中药品种，其性温、味辛，具有活血行气、祛风止痛的功能，常用于月经不调，经闭痛经，瘢瘕腹痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，头痛，风湿痹痛等病症的治疗。川芎中含挥发油、内酯、生物碱、酚等多种成分。近年来，有关川芎的药效学研究较多且日趋深入，发现在扩冠脉流量、促进微循环、血液流变学、抗血小板聚集、提高耐缺氧能力、保护缺血心肌肝肾损伤、抗动和脉粥样硬化、抗肿瘤、降血压、增强免疫等方面都具有显著疗效，目前已有包括注射、口服、贴剂等多种形式的药物制剂供使用。

本发明上述的灵芝发酵菌质，是由灵芝在全药性基质川芎上生长，通过川芎成分对灵芝菌丝体生长代谢过程的影响和灵芝真菌酶系对药物成分的改造这一双向性生物转化的固体发酵过程，得到包含菌丝及培养基质成分在内的灵芝/川芎菌质这一发酵终产物。

上述灵芝/川芎菌质的制备，可以含水量为总培养基重量的40％～60％的中药材川芎为培养基，将灵芝菌种按灵芝常规的培养方式接种在该培养基上，然后以常规培养方式，在适宜灵芝生长的条件下固体发酵后，即可收集得到包含灵芝菌丝体和培养基成分在内的全部菌质混合物。

上述制备中作为所说培养基的中药材川芎，一般可以在如川芎片、川芎颗粒或川芎粉等多种形式川芎原料中选择其中的至少一种。

上述的制备中，在川芎培养基上接种的灵芝菌种虽可有母种和原种等不同的选择，但实验结果显示，采用母种接种时菌丝的生长速度较缓慢，而采用灵芝原种(或称二级种)，即由农林副产物或麦粒、玉米粒等作为培养基在容器中进行繁殖得到的菌种接种，则可显著增强菌丝的活力，在在川芎培养基上的生长速度较快。因此以采用灵芝原种接种为优选。在22℃～27℃的灵芝生长条件下，通常经45～70天固体发酵后，即可收集得到包含灵芝菌丝体和培养基成分在内的全部菌质混合物。

实验结果表明，本发明上述的灵芝/川芎菌质可以具有在活血化瘀和抗氧化方面的显著功效。

以该菌质混合物或其提取物作为有效药用成分，单独或还可与药学中可以接受的辅助成分共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的药物；单独或可与保健品的常用辅料成分(如乳糖、淀粉、硬脂酸镁等赋形剂；蜂蜜、单糖浆等调味剂；山梨酸、苯甲酸等防腐剂)可以共同组成具有活血化瘀、抗氧化功效的保健品。所说该菌质混合物的提取物，一般可以为由常规的煎煮、回流、渗漉、浸泡等方式得到的相应水提取物或进一步的浓缩物。

以该菌质或混合物其提取物为活性成分，单独或可与食品中可以接受的其它成分(如各种粮食成分，允许的食用添加成分等)还可以共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的功能食品。此外，其单独或进一步与化妆品中可以接受的其它成分共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的化妆品。

上述的相关药物、保健品、食品、化妆品等，都可以通过目前相关行业的常规方式或工艺实现，对制备方法并无特别的要求或限制，也不存在任何技术困难或障碍。

以下结合附图所示实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是本发明灵芝/川芎菌质在固体发酵过程中菌丝体生长速度曲线。

图2是本发明灵芝/川芎菌质的固体发酵过程中还原性多糖含量动态变化曲线。

图3是本发明灵芝/川芎菌质的固体发酵过程中可溶性粗蛋白含量动态变化曲线。

具体实施方式

实施例1

灵芝/川芎菌质混合物的制备

培养基组成：川芎100％。

固体发酵条件：常温(15～25℃)。

制备：所用的灵芝常规发酵方式：母种由PDA斜面培养基保存。将中药材川芎(川芎片、川芎颗粒、川芎粉之一)，加水均匀搅拌，使总含水量为40-60％，装袋后压实，每袋装料200g，扎紧，115℃条件下高压保持1小时灭菌，或煮沸后保持24小时的常压灭菌。冷却后，无菌操作接入灵芝母种菌株，把接好种的袋料放在培养室培养，培养室内温度应保持在27℃。

对灵芝在药用川芎作为其发酵培养基上的生长情况，以及在不同生长时期川芎的培养基质中经固体发酵制备得到的本发明所说的灵芝/川芎菌质(简称灵芎菌质)的药理活性进行了考察。

发酵结果显示，川芎培养基质适于灵芝菌丝体生长，证明了在川芎培养基质上能作为制备本发明所说灵芝-川芎菌质混合物的发酵培养基，灵芝在其中均能较好地生长，但是生长速度较对照的玉米芯中生长速度慢。从接种开始记录灵芝菌丝体在固体发酵培养基上的平均生长速度，得到如图1所示的灵芝菌丝体生长曲线。

由图1可以看出，菌丝生长可分为四个阶段：(1)适应期(0-10d)：菌丝生长较慢，菌丝较纤弱；(2)旺盛期(11-35d)：菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；(3)下降期(35-50d)：菌丝生长速度急剧下降；(4)衰退期(50-70d)：菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色素。

以苯酚-硫酸比色法观察上述灵芎菌质固体发酵体系总多糖含量的动态变化：

(1)取样方法：从接种日起到满袋前，每隔10d每组合的固体发酵样品各取3袋，烘干打粉(40目)作为测试样品；满袋后，每隔5天取样一次，每个发酵样品取3袋，烘干打粉(40目)作为测试样品。

(2)供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉5g(约相当于多糖0.14g)，置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min后收集上清液，少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。②提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热(避免焦化)浓缩到约15ml，放冷至室温，加乙醇100ml，搅匀，放置使其沉淀15分钟。转移此溶液连同沉淀于离心管中，继续用少量80％乙醇以玻棒充分刮洗蒸发皿，洗液和沉淀同样转移至离心管中，以3000～4000rpm速度离心15min，弃去上清液，在离心管中加入少量80％乙醇，轻轻洗涤，同样离心弃去上清液(保留沉淀物)。然后将离心管(连同沉淀物)于50℃烘箱挥干乙醇，然后加热水溶解沉淀，转移至250ml量瓶中，继续用热水以玻棒充分刮洗离心管，洗液同样转移至250ml量瓶中，放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀即得供试品溶液。

(3)标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配制成0.1mg/ml的贮备液。精密吸取0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml分别置于10ml具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液6.0ml，立即摇匀，置沸水浴中保温30min，取出，置冰水浴中15min。于625nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度(μg/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取供试品溶液2.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算出样品中总多糖的含量(以葡萄糖计)。实验结果如图2所示。

图2结果显示，随着发酵时间的增长，各组合粗多糖含量基本呈逐渐上升趋势，从接种后10天到50天，变化较为剧烈；接种后50天到70天，多糖含量呈下降趋势。

以考马斯亮蓝法观察该灵芎菌质固体发酵体系可溶性粗蛋白含量动态变化：

(1)取样方法：从接种日起，每隔10d取各组的固体发酵样品2-4袋，按组分别混合后烘干打粉(40目)作为样品。

(2)供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉5g(约相当于多糖0.14g)，置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min，收集上清液，用少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。合并全部上清液置蒸发皿中，置水浴锅上浓缩到约20ml，放冷至室温。

(3)标准曲线的制作：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000μg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。精密吸取牛血清白蛋白标准溶液0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于具塞试管中加水定容至1ml，摇匀得牛血清白蛋白稀释液，各管分别加考马斯亮蓝工作液(新制)5ml，摇匀，以1.0ml水所制得的空白溶液做参比，于595nm波长处测定各溶液吸收度，以牛血清白蛋白稀释液的浓度(μg/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定：取供试品溶液1.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加考马斯亮蓝工作液，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取蛋白质浓度，再计算出样品中蛋白质的含量。实验结果如图3所示。

由图3结果可以看出，随着发酵时间的增长，各组合灵芎菌质混合物中的粗蛋白含量基本呈逐渐上升趋势，从接种后10天到40天，变化较为剧烈；接种后40天到70天，呈下降趋势，至第55天出现一个增加的高峰，但含量较10-40天的含量低。

上述试验结果显示，以全药用原料川芎作为培养基，使灵芝按常规方式在灵芝栽培时期(3～10月)于22℃～25℃的常温下进行的固体发酵，灵芝的生长均是正常和满意的。固体发酵时间一般可为45～60天，更好的是在固体发酵50～70天后，收集包含菌丝及培养基质成分在内的菌质混合物，都可以获得理想的效果。

以下的实验还进一步显示，本发明上述的灵芎菌质混合物(以下称为“灵芎菌质”)可以具有明显优于单一的川芎，以及将川芎与灵芝固体发酵物直接相互组合的混合物(以下称为灵/芎混合物)的生物学功能，而灵芎菌质的生物学功能随给药剂量的增加而升高。

实验1 灵芎菌质对小鼠凝血时间(CT)的影响

实验动物：KM种小鼠80只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为正常组(蒸馏水0.2ml/10g)、阳性组(阿司匹林50mg/kg)、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质含量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎含量为15g，灵芝固体发酵物15g的混合提取物，以下同)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，正常组每日给予等量水灌胃，连续10d。末次给药后1h用内径1mm玻璃毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血，自血液流人管中开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌上，每隔30s折断两端毛细管，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现时停止计时，所得时间即为CT。结果以X±S表示，组间行t检验。

实验结果：与正常组相比，灵芎菌质组有明显延长小鼠眼凝血时间的作用(P＜0.05，P＜0.01)，量效关系明显，提示其具备抗凝血作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表1所示。

表1 灵芎菌质对小鼠眼凝血时间(CT)的影响

注：与正常对照组相比：^**P＜0.01，^*P＜0.05。

实验2 灵芎菌质对小鼠尾出血时间的影响

实验动物：KM种小鼠80只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为正常组、阳性组(阿司匹林50mg/kg)、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后1h取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖1.5mm处剪断，用滤纸吸血直至吸不出血为止，记录断尾尖至吸不出血的时间即为尾出血时间。

实验结果：与正常组相比，灵芎菌质组有明显延长小鼠出血时间的作用(P＜0.05，P＜0.01)，量效关系明显，提示其具备延长出血时间作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表2所示。

实验3 灵芎菌质对小鼠尾部血栓形成的影响

实验动物：KM种小鼠50只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为模型组、阳性组(阿司匹林50mg/kg)、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。给药第4天注射50mg/kg角叉菜胶于小鼠左右后肢脚掌皮下，每只脚掌0.03ml(0.06ml/只)，注射完毕后在17℃的房间内饲养，继续给药3天，并于注射后24h，48h，72h测量小鼠全尾长度和尾部血栓长度，计算血栓率。

实验结果：与模型组相比，灵芎菌质组有明显缩短小鼠尾部血栓长度的作用(P＜0.05，P＜0.01)，量效关系明显，提示其具备抗血栓作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表3所示。

表2 灵芎菌质对小鼠尾出血时间的影响

注：与模型组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表3 灵芎菌质对小鼠尾部血栓形成的影响

注：与正常对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验4 灵芎菌质对小鼠耳廓微循环的影响

实验动物：KM种小鼠80只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为正常组、阳性组(阿司匹林50mg/kg)、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药前，各小鼠用12.5％戊巴比妥钠0.4mg/kg麻醉，将小鼠右耳廓部用脱毛剂脱毛，耳廓平展于耳托上，64倍物镜观察，观察部位的确定：距耳廓边缘约1.5～2mm处，在平行于耳廓边缘方向，自中间细动脉开始右行约1mm范围内为观察部位。将测微尺(0～1000μm)置于此处。凡与该测微尺相交之血管均视为有效，对其进行BI.2000图像系统分析。选择流速稳定区域微动脉(A)、微静脉(V)各一条并标记，记录血管管径及血液流速。而后给药3d。在末次给药后0.5h，同法麻醉并测定标记血管管径及血液流速。分析给药前后管径及血液流速变化情况。以给药前后两次结果差值(ΔV，ΔA)及血流速度之差作为微循环改善情况的指标。实验数据进行t值检验和方差分析。

实验结果：与正常组相比，灵芎菌质组可明显增加微血管管径(P＜0.01)，加快小鼠微动脉、微静脉血流速度(P＜0.01)，量效关系明显，提示其具备改善微循环作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表4所示。

表4 灵芎菌质对小鼠耳廓微循环的影响

注：与正常对照组相比：^**P＜0.01，^*P＜0.05。

实验5 灵芎菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

实验动物：KM种小鼠70只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为正常组、灵芎菌质高剂量组(15g/kg)、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后30min，200g/L乌拉坦1.0g/kg静脉注射麻醉，分离双侧颈总动脉及迷走神经，用手术线同时结扎，观察小鼠的存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。

实验结果：与正常组相比，灵芎菌质组有明显延长小鼠结扎双侧颈总动脉及迷走神经后的存活时间的作用(P＜0.05，P＜0.01)，量效关系明显，提示其具备改善缺血脑组织的血氧供应作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表5所示。

表5 灵芎菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用

注：与正常对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验6 灵芎菌质对断头小鼠喘息时间的影响

实验动物：KM种小鼠70只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为正常组、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续7d。末次给药1h后，自小鼠耳后根部快速断头，记录小鼠断头后喘息的时间(s)。

实验结果：与正常组相比，灵芎菌质组具有延长小鼠断头后喘气时间的作用的趋势，提示其具备一定抗急性耐缺氧作用，且随着川芎菌质剂量的增加其效果随之增加。结果如表6所示。

表6 灵芎菌质对断头小鼠喘息时间的影响

注：与模型组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验7 灵芎菌质抗氧化能力测评

1.灵芎菌质抗氧化功效检测样品制备

灵芎发酵产物粉碎后过40目筛，取粉末5g溶于100ml水，60℃超声提取1h后，3000g离心10min，过滤后收集滤液定容为5ml，即浓度为1g/ml，然后稀释成40-400mg/ml。

2.清除·OH自由基能力的测定

在试管中分别加入1mlpH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L)，0.4ml 6mmol/L的邻二氮菲溶液(无水乙醇配制)，充分混匀后，加入0.4ml 6mmol/L FeSO4溶液，加入后立即混匀。然后向其中加入0.5ml一定浓度的样品溶液，混匀，再加入0.5ml 0.1％的H₂O₂，最后补充体积至4ml，同时做空白试验。另再做损伤和未损伤管。其中损伤管中加入0.5ml 0.1％的H₂O₂，未损伤管不加H₂O₂，最后补充各体积至4ml。于37℃下保温1h，测在536nm下的吸光度，重复两次，计算平均值。羟自由基清除率＝(A_i-A)/(A₀-A)×100％。

A为不加样品时溶液的吸光值，A₀为不加样和H₂O₂时溶液的吸光值。注意浓度控制，先实验3-4倍浓度，再逐步稀释至最适浓度，控制温度。

3.提取物清除DPPH自由基能力的测定

取待测样品1ml和事先用95％乙醇配好的0.4mg/ml的DPPH自由基试剂1ml于10ml的玻璃试管中。样品加入后振动30s，37℃保温10min后517nm波长下测定其吸光值(A_i)。同时测定不加DPPH自由基试剂的样品空白吸光值(A_j)和加DPPH自由基试剂但不加样品的吸光值(A₀)，如表7所示。

样品对DPPH的清除百分比I＝1-[(A_i-A_j)/A₀]×100％。

实验结果：通过清除率推算出样品的EC₅₀。在清除·OH、DPPH自由基方面，灵芎菌质组的EC₅₀均低于灵/芎混合物组和川芎组，且随着菌质剂量的增加，其抗氧化效果随之增强，这说明灵芎菌质有较好的自由基清除能力，结果如表8所示。

表7 试剂盒样品添加表

表8 灵芎菌质清除·OH、DPPH自由基的EC₅₀试验结果

注：与模型组相比：^**P＜0.01，^*P＜0.05；与正常组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实验8 灵芎菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响

实验动物：KM种小鼠80只，体重20±2g。

实验方法：将小鼠分为模型组、假手术组、川芎高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃川芎生药含量为15g，以下同)、川芎中剂量组(10g/kg)、川芎低剂量组(5g/kg)；灵芎菌质高剂量组(15g/kg，即每1kg体重小鼠灌胃灵芎菌质量为15g，以下同)、灵芎菌质中剂量组(10g/kg)，灵芎菌质低剂量组(5g/kg)；灵/芎混合物高剂量组(15g/kg)、灵/芎混合物中剂量组(10g/kg)、灵/芎混合物低剂量组(5g/kg)，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。①小鼠脑缺血后脑组织匀浆液的制备：末次给药后1h，假手术组分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉3h后断头，小心剥取两侧大脑半球，称重，按重量∶体积＝1∶9的比例加入预冷的生理盐水(4℃)，用组织匀浆器充分匀浆，将匀浆液以1500g，4℃离心12min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量，-70℃冻存备用。②脑组织SOD活性、MDA含量的测定：i.取1％大脑组织匀浆液，采用黄嘌呤氧化酶法(SOD检测试剂盒)，于波长550nm处分别测定各组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。ii.取1％大脑组织匀浆液，采用TBA比色法(MDA检测试剂盒)，于波长532nm处分别测定各组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。

实施例3 灵芎菌质颗粒

原料：由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/川芎菌质混合物1kg

制备：将原料粉碎后或由常规方式水提醇沉后得到的浸膏提取物，与口服固体颗粒制剂的常规辅料(水溶性赋形剂、乙醇等)通过制粒、干燥、整粒、包装等过程，制成灵芎菌质颗粒。

实施例4 灵芎菌质片剂

原料：由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/川芎菌质混合物100g，

淀粉60g，乳糖30g，硬酯酸镁10g。

制备：将灵芝/川芎菌质混合物粉碎或水提醇沉后得到的浸膏提取物、淀粉、乳糖混匀并按常规方法制粒后，加入硬酯酸镁整粒，压片，共制成1000片，得到每片含灵芝/川芎菌质混合物100mg的片剂。

实施例5 灵芎面膜

原料：由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/川芎菌质混合物100g。

制备：将灵芝/川芎菌质混合物干燥、粉碎、过120目筛，灭菌、包装制得粉状面膜。使用时用100g～150g水或蜂蜜或蛋清或牛奶调成糊状，然后按面膜的使用方法往脸部均匀涂抹，半小时后用清水洗净。

实施例6 灵芎面膜贴

原料：由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/川芎菌质混合物100g。

制备：将灵芝/川芎菌质混合物干燥、粉碎、过60目筛。加入10倍量纯水浸泡半小时，加热至沸后，维持沸腾半小时，精滤药液。煮提三次，合并提取液备用。加热浓缩提取液至浸膏状，边搅拌边加入90％以上浓度乙醇，调节溶液含醇量为75％，停止搅拌，加盖密闭，静置24小时，使沉淀完全，滤取上清液。在上清液中加入总体积3％～5％的活性炭，加热回流脱色30分钟，滤净活性炭。将脱色后的溶液回收乙醇至无醇味即得灵芎提取液。

先将美白剂(如熊果苷或曲酸或L-抗坏血酸磷酸镁)2份和保湿剂(如芦荟提取液或卵磷脂或透明质酸或烷基葡糖苷)混匀，再加入8份灵芎提取液。用无纺布制成的面膜巾在最后混匀的溶液中浸泡30min，然后真空封装，灭菌即得。

实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑缺血后脑中MDA含量明显增高，SOD活性明显降低；与模型组比较，灵芎菌质能显著降低小鼠脑缺血后脑中MDA含量，并显著提高脑组织SOD活性(P＜0.05)。试验结果如表9所示。

表9 灵芎菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响

注：与假手术组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实验9 灵芎菌质的安全性性试验

1.给小鼠灌食最大给药浓度和剂量都不致死，不能测出灵芎菌质的半数致死量。

2.用灵芎菌质进行了Ames试验、小鼠骨髓微核试验和染色体畸变试验，证明该物质无致畸和致突作用。

3.用灵芎菌质进行30天喂养实验研究，证明该物质不会对实验动物引起有害效应，无毒副作用。

安全性实验结果证明本发明的灵芝/川芎菌质混合物安全无毒。

上述各项试验结果充分表明，本发明的灵芝/川芎全性菌质固体发酵混合物不仅无明显毒副作用，而且在活血化瘀方面，具有明显优于单一的灵芝、川芎药物原料、也优于其常规方式混合(复方)药物的生物学功能，其药理学功能随川芎在培养基质中的含量增加而增加，且原料来源丰富，提取和制备方法并无特殊要求和限制。

在上述研究实验的基础上，进一步可供参考的具体实施方式还可包括下述各实施例，其中的操作方式和条件可参考上述内容。

实施例2 灵芎菌质胶囊

原料：由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/川芎菌质混合物1kg

制备：将所说原料经过粉碎，过60目筛，装在胶囊壳中，制成胶囊。

Claims (8)

1.具有活血化瘀和抗氧化功效的菌质混合物，其特征是由真菌灵芝在全药性培养基质川芎片上固体发酵后得到的灵芝菌丝体和培养基成分的混合物。

2.制备权利要求1所述具有活血化瘀和抗氧化功效菌质混合物的方法，其特征是以含水量为总重量的40％～60％的中药材川芎为培养基，将灵芝菌种接种在该培养基上，在适宜灵芝生长的条件下固体发酵后，收集包含灵芝菌丝体和培养基成分在内的全部菌质混合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是作为所说培养基的中药材川芎为川芎片、川芎颗粒或川芎粉中的至少一种。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是在所说的中药材川芎培养基上，以灵芝原种进行接种。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是所说的固体发酵时间为45～70天。

6.权利要求1所述的菌质混合物在制备具有活血化瘀和抗氧化功效药物中的应用，其特征是以所说的菌质混合物或其提取物为有效药用成分，单独或与药学中可以接受的辅助成分共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的药物。

7.权利要求1所述的菌质混合物在制备具有活血化瘀和抗氧化功效食品中的应用，其特征是以所说的菌质混合物或其提取物为活性成分，单独或与食品中可以接受的其它成分共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的功能食品。

8.权利要求1所述的菌质混合物在制备具有活血化瘀和抗氧化功效化妆品中的应用，其特征是以所说的菌质混合物或其提取物为活性成分，单独或与化妆品中可以接受的其它成分共同组成具有活血化瘀和抗氧化功效的化妆品。

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