CN101472939B - 假脯氨酸二肽 - Google Patents

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Abstract

本文公开了从式(II)的氨基酸衍生物开始制备式(I)的假脯氨酸二肽的三步方法，在式(I)中R1是α-氨基酸侧链，R2是氨基保护基并且R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，R5是氢或甲基，在式(II)中R1和R2如上所述。假脯氨酸二肽可以用作Ser、Thr和Cys的可逆保护基并且因此在肽化学中是万能工具。

Description

假脯氨酸二肽
本发明涉及新的制备下式化合物的方法
Figure G2007800227899D00011
式I的假脯氨酸二肽可以用作Ser、Thr和Cys的可逆保护基并且被证明是肽化学领域中克服某些内在问题的万能工具[JACS 1996，118，9218-9227]。肽序列中ΨPro的存在引起了被认为是分子间聚集来源的β-折叠结构的破坏。在肽组装例如Fmoc固相肽合成中引起溶剂化和偶联动力学的增加使链延长容易，特别是对于包含“困难序列”的肽。
本发明的目的是提供式I的假脯氨酸二肽的短的并且技术上可行的合成，该合成获得了高产率的产物并且不需要任何色谱纯化步骤。
用下文列出的方法实现了该目的。制备下式化合物的方法
Figure G2007800227899D00012
其中R1是α-氨基酸侧链，R2是氨基保护基并且R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，R5是氢或甲基，
包括
a)将下式的氨基酸衍生物用丝氨酸或苏氨酸转化
Figure G2007800227899D00013
其中R1和R2如上所述，并且将产生的二肽结晶为下式的铵盐
Figure G2007800227899D00021
其中R1、R2和R5如上所述并且
R6、R7和R8独立地选自氢、C1-4-烷基或C3-7-环烷基，条件是R6、R7和R8不都是氢，在下面的步骤中
b)在酸的存在下将游离酸从式III的铵盐中释放出来并且通过萃取除去胺并且
c)在酸催化剂的存在下，与选自下列的化合物进行环合
Figure G2007800227899D00022
其中R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，条件是R3和R4不都是氢，R9a和R9b独立地是C1-4-烷基，R10表示C1-4-烷基、C1-4-烷酰基或芳基并且R11是氢或C1-3-烷基。
应当进一步理解的是丝氨酸或苏氨酸可以以它们的L-或D-构型，作为外消旋体或以它们的异构体的多种混合物应用。优选应用L-构型。
术语“C1-4-烷基”表示具有一至四个碳原子的支链或直链一价饱和的脂肪族烃基。该术语进一步的示例性基团是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“C3-7-环烷基”表示包含3至7个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
术语“芳基”涉及苯基或萘基，优选苯基，其可以任选被卤素、羟基、CN、CF3、NO2、NH2、N(H，烷基)、N(烷基)2、羧基、氨基羰基、烷基、烷氧基、芳基和/或芳基氧基单或多取代。优选的芳基是苯基。
术语“烷酰基”涉及C1-4-烷基羰基，例如乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、仲丁酰基和叔丁酰基，优选乙酰基。
用于R1的术语“氨基酸侧链”特别表示选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、氨基异丁酸和脯氨酸的α-氨基酸侧链。
应当理解的是具有羟基的氨基酸侧链中的羟基任选被下文定义的羟基保护基保护。具有另外的氨基的侧链中的氨基任选被下文定义的氨基保护基保护。
R1优选表示缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸侧链。更优选的是丝氨酸和苏氨酸。
术语“氨基保护基”表示通常用于阻止氨基反应性的任何取代基。适合的氨基保护基在Green T.，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，第7章，John Wiley and Sons，Inc.，1991，309-385中描述。适合的氨基保护基是Fmoc、Cbz、Moz、Boc、Troc、Teoc或Voc。优选的氨基保护基是Fmoc。
术语“羟基保护基”表示通常用于阻止羟基反应性的任何取代基。适合的羟基保护基在Green T.，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，第1章，John Wiley and Sons，Inc.，1991，10-142中描述。适合的羟基保护基是叔丁基、苄基、TBDMS或TBDPS。优选的羟基保护基是叔丁基。
下表中列出了在说明书和权利要求中应用的缩略语的含义：
 
Fmoc 9-芴基甲氧基羰基-
Boc 叔丁氧基羰基-
Cbz 苄酯基
Z 苄基氧基羰基
tBU 叔丁基
Moz 对甲氧基苄基氧基羰基
Troc 2，2，2-三氯乙氧基羰基
Teoc 2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基
Voc 乙烯基氧基羰基
TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基醚
 
TBDPS 叔丁基二苯基甲硅烷基醚
HBTU O-苯并三唑N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
EDC (3-二甲基氨基-丙基)-乙基-碳二亚胺(盐酸盐)
DIC N，N’-二异丙基碳二亚胺
DCC N，N’-二环己基碳二亚胺
步骤a)
在第一步骤a)中，将下式的氨基酸衍生物与丝氨酸或苏氨酸反应
其中R1和R2如上所述，并且将产生的二肽结晶为下式的铵盐
其中R1、R2、R5、R6、R7和R8如上所述。
式II的氨基酸衍生物通常是可商购获得的化合物。根据R1和R2的优选，适合的式II的氨基酸衍生物是Fmoc-L-Ser(tBu)-OH或Fmoc-L-Thr(tBu)-OH。
在与丝氨酸或苏氨酸偶联之前，将式II的氨基酸衍生物用活化剂适当活化。
适合的活化剂可以选自DIC/HOSu、DIC/五氟苯酚、DIC/HOBt、DCC/HOSu、DCC/五氟苯酚、DCC/HOBt、EDC(xHCl)/HOSu或HBTU/HOBt。优选的偶联剂是DIC/HOSu。相对于1当量的式I的氨基酸衍生物，DIC通常以1.0至1.4当量的量应用并且HOSu通常以1.0至1.8当量的量应用。
活化反应通常在-5℃至25℃的温度下在适合的有机溶剂的存在下进行，所述的有机溶剂例如乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮或四氢呋喃，优选乙酸乙酯。
然后，与丝氨酸或苏氨酸，优选与L-丝氨酸或L-苏氨酸的偶联可以在10℃至30℃的温度下在有机溶剂的存在下进行，所述的有机溶剂例如乙酸乙酯、丙酮或四氢呋喃或它们和水的混合物。优选的溶剂是丙酮和水的混合物。
丝氨酸或苏氨酸与式II的氨基酸衍生物的比通常选择在1.5至3.0比1、优选2.0比1的范围内。反应混合物的pH适当设定值为7.5至9.0。
式III的铵盐通过在先前形成的二肽中加入下式的胺而发生，
Figure G2007800227899D00051
其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-4-烷基或C3-7-环烷基，条件是R6、R7和R8不都是氢。
适合的式V的胺是其中R6、R7和R8独立地选自氢、乙基或环丙基，条件是R6、R7和R8不都是氢的那些。环己基胺、二环己基胺和三乙胺是优选的胺。二环己基胺是应用的最优选的式V的胺。结晶通常是在适合的有机溶剂中进行，所述的有机溶剂例如低级醇(如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇)或乙酸乙酯或四氢呋喃。优选的溶剂是乙醇。
式III的铵盐先前没有描述过并且因此是本发明进一步的实施方案。
优选的铵盐是式III的二环己基铵盐，其中R1和R2如上所述，R5是氢或甲基，R6是氢并且R7和R8是环己基。更优选的是式III化合物，其中：
a)R1表示具有O-tBu保护的L-丝氨酸侧链，R2是Fmoc，R5是H，R6是氢并且R7和R8是环己基。
b)R1表示具有O-tBu保护的L-丝氨酸侧链，R2是Fmoc，R5是甲基，R6是氢并且R7和R8是环己基。
c)R1表示具有O-tBu保护的L-苏氨酸侧链，R2是Fmoc，R5是H，R6是氢并且R7和R8是环己基。
d)R1表示具有O-tBu保护的L-苏氨酸侧链，R2是Fmoc，R5是甲基，R6是氢并且R7和R8是环己基。
步骤b)
在随后的步骤b)中，二肽的游离酸在酸的存在下释放并且将式V的质子化的胺通过萃取除去。特别的是，式III的铵盐的游离酸在无机酸的存在下释放，溶于有机溶剂，同时将胺通过用水和/或无机盐的水溶液萃取除去。
适合的无机酸是硫酸水溶液或HCl水溶液，优选硫酸水溶液。
用于溶解游离酸的适合的有机溶剂可以选自乙酸乙酯、叔丁基甲基醚或二氯甲烷。已经发现叔丁基甲基醚是优选的溶剂。
通常将包含游离酸的有机相用水和/或无机盐的水溶液、例如氯化钠洗涤数次以将胺完全除去。
步骤c)
在步骤c)中，在步骤b)中获得的二肽的游离酸的环合是在酸催化剂的存在下与选自下列的化合物进行的
Figure G2007800227899D00061
其中R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，条件是R3和R4不都是氢，R9a和R9b独立地是C1-4-烷基，R10表示C1-4-烷基、C1-4-烷酰基或芳基并且R11是氢或C1-3-烷基。
环合优选是与式IVa和IVc的化合物进行的，更优选的化合物选自2，2-二甲氧基丙烷、2-甲氧基丙烯或2-乙酰氧基丙烯，其中2，2-二甲氧基丙烷是最优选的化合物。
式IV化合物理想是以相对于在步骤b)中获得的二肽的6.0至16.0当量、优选7.0至10.0当量的量应用。
适合的酸催化剂选自甲磺酸、㈩樟脑-10-磺酸、对甲苯磺酸或对甲苯磺酸吡啶鎓，而优选甲磺酸。酸催化剂通常以相对于在步骤b)中获得的二肽的0.05至0.30当量、优选0.10至0.20当量的量应用。
环合是在回流温度下在有机溶剂的存在下进行的，所述的有机溶剂例如四氢呋喃、二氯甲烷或甲苯，优选四氢呋喃。
目标产物的分离和处理可以通过应用本领域技术人员已知的方法进行。
以下实施例说明本发明而不限制本发明。
实施例
实施例1
将25g(64.9mmol)Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(1)、9.66g(83.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和180mL乙酸乙酯加入至安装有机械搅拌器、Pt-100温度计、回流冷凝器、滴液漏斗和氮气入口的1000mL双层夹套玻璃反应器中。将产生的悬浮液冷却至0℃。在15分钟内加入10.49g(83.1mmol)二异丙基碳二亚胺的20mL乙酸乙酯溶液。将产生的混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下再搅拌1小时并且取样。将溶剂在夹套温度最高为50℃下减压(约220mbar)完全除去。将残留物在内部温度为35℃至40℃下用250mL丙酮处理，冷却至20℃并且用13.5mL水处理。将pH用1.0mL1M HCl调节至pH2-3并且将产生的混合物在20℃下搅拌12小时并且取样。然后将悬浮液冷却至-5℃至0℃并且在该温度下搅拌1小时。将沉淀过滤并且将反应器和过滤器用50mL的冷丙酮(0℃)冲洗。在20℃下，将澄清并且无色的滤液在60分钟内加入至13.57g(127.8mmol)L-丝氨酸和13.63g(257mmol)碳酸钠的122.5mL水溶液中。将产生的混合物在20℃下搅拌1小时并且取样。将pH用28g HCl(37％)调节至pH2-3并且将有机溶剂在夹套温度最高为50℃下减压(<250mbar)除去。将产生的悬浮液在35℃至40℃下用125mL乙酸乙酯处理并且将产生的澄清二相溶液冷却至20℃。将各相分离并且将有机相用总共250mL乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用总共225mL NaCl水溶液(10％w/w)洗涤3次。将产生的有机溶液浓缩并且将溶剂在夹套温度最高为50℃下减压几乎完全除去。将部分溶剂(75mL)在夹套温度最高为50℃下减压(约170mbar)再次除去后，将残留物溶于250mL乙醇中。将产生的溶液用462.5mL乙醇处理并且冷却至20℃。加入约20％(约29.5mL)11.83g(63.9mmol)二环己基胺的118mL乙醇溶液。在混合物中加入晶种从而产物开始沉淀。将悬浮液在室温下搅拌1小时并且随后将剩余的二环己基胺溶液在至少2小时内缓慢加入。将滴液漏斗用25mL乙醇冲洗。将悬浮液在该温度下搅拌过夜后，将内部温度在4小时内降低至0℃。将沉淀用抽滤过滤，将滤饼用117.5mL冷(0℃)乙醇洗涤并且真空(50℃，20mbar)干燥，得到35.7g(产率82％，从(S)-3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-丙酸开始，基于HPLC的纯度为96.8％(w/w))(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基-氨基]-3-羟基-丙酸二环己基-铵盐(3)，为无色固体。
HPLC分析应用纯(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基-氨基]-3-羟基-丙酸二环己基-铵盐(3)作为外标进行。HPLC条件：柱XBridge C18(Waters)，4.6×150mm，3.5μm；紫外检测206nm；溶液梯度：水(A)，20mM KH2PO4-缓冲液，pH2.5(B)，乙腈(C)；流速1.0mL/分钟；20℃。
梯度：
 
T[分钟] A[％] B[％] C[％]
0 45 15 40
2 45 15 40
14 5 15 80
25 5 15 80
保留时间：
(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基-氨基]-3-羟基-丙酸二环己基-铵盐(3)8.4分钟
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(1)11.6分钟
该HPLC方法产生(3)的游离酸的含量值。从该值，计算了相应的二环己基铵盐的含量，假定游离酸和二环己基铵的化学计量比为1:1。
用十二烷作为内标的GC分析用于测定二环己基胺的含量。GC条件：柱熔融二氧化硅，100％聚二甲基硅氧烷，1μm，L＝15m，ID＝0.25mm；载气氢气，压力：53kPa，线性速度：73cm/s，分流比：1:100。
温度程序：
 
加热速率[℃/分钟] 终止温度[℃] 在终止温度下等温步骤的持续时间[分钟]        
0.0 40 1
 
50 240 5
0.0 320 10
保留时间：
十二烷4.10分钟
二环己基胺4.90分钟
实施例2
将25.0g(37.0mmol)(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3-羟基-丙酸二环己基铵盐(3)、100mL叔丁基甲基醚和4.70g硫酸(96％)的44.3mL水溶液加入至安装有机械搅拌器、Pt-100温度计、回流冷凝器、带有棉花过滤的滴液漏斗和氮气入口的500mL双层夹套玻璃反应器中。将混合物在室温下搅拌90分钟。将水相分离并且将有机相用总共76mL氯化钠水溶液(0.5％-w/w)洗涤2次并且再用38mL水洗涤。将有机溶剂在减压(500-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全除去。将泡沫状残留物溶于100mL四氢呋喃中并且将溶剂再次在减压(500-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全除去。将残留物溶于450mL四氢呋喃中并且将产生的澄清溶液用35.4g(333mmol)2，2-二甲氧基丙烷和0.65g(6.7mmol)甲磺酸处理。将混合物在85℃的夹套温度下在回流下加热，同时将溜出液通过73g分子筛(0.4nm)。16小时后，将淡黄色溶液冷却至20℃并且取样，并且将混合物用0.828g(8.14mmol)三乙胺处理并且搅拌10分钟。将溶剂在减压(350-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全除去。将残留物用100mL叔丁基甲基醚处理并且再次在减压(350-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全浓缩。将残留物溶于175mL叔丁基甲基醚中并且冷却至20℃至25℃。将溶液用87.5mL水处理并且搅拌10分钟。将各相分离并且将有机相在减压(350-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全浓缩。将泡沫状残留物溶于100mL叔丁基甲基醚中并且在减压(350-100mbar)并且在50℃的夹套温度下完全浓缩。将该步骤用总共200mL叔丁基甲基醚重复两次。将残留物在20℃至25℃下溶于45.2mL叔丁基甲基醚中并且用22.6mL异丙醇处理。在该温度下，将溶液用175mL戊烷处理，加入晶种，然后保持搅拌至少15分钟，并且再次在1小时内用200mL戊烷缓慢处理。将产生的溶液搅拌4至16小时，然后在1-2小时内冷却至0℃并且在该温度下再搅拌2小时。将沉淀用抽滤过滤，并且将滤饼用总共60mL冷(0℃)戊烷分两次洗涤并且真空(50℃，20mbar)干燥，得到14.3g(产率75％，从(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3-羟基-丙酸二环己基-铵盐开始，基于HPLC纯度为98.7％(w/w))(S，S)-3-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基氨基)-丙酰基]-2，2-二甲基-噁唑烷-4-甲酸(4)，为无色固体。
HPLC分析应用纯(S，S)-3-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基氨基)-丙酰基]-2，2-二甲基-噁唑烷-4-甲酸(4)作为外标进行。HPLC条件：柱XBridge C18(Waters)，4.6×150mm，3.5μm；紫外检测206nm；溶液梯度：水(A)，20mM KH2PO4-缓冲液，pH2.5(B)，乙腈(C)；流速1.0mL/分钟；20℃。
梯度：
 
T[分钟] A[％] B[％] C[％]
0 27 15 58
1 27 15 58
6 20 15 65
10 5 15 80
20 5 15 80
20.1 70 15 15
25 70 15 15
保留时间：
(S，S)-3-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基氨基)-丙酰基]-2，2-二甲基-噁唑烷-4-甲酸(4)7.3分钟
(S，S)-2-[3-叔丁氧基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基-氨基]-3-羟基-丙酸二环己基-铵盐(3)3.0分钟
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(1)5.6分钟

Claims (16)

1.制备下式化合物的方法
Figure FSB00000800996300011
其中R1是α-氨基酸侧链，R2是氨基保护基并且R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，条件是R3和R4不都是氢，R5是氢或甲基，该方法包括
a)将下式的氨基酸衍生物用丝氨酸或苏氨酸转化
Figure FSB00000800996300012
其中R1和R2如上所述，并且将产生的二肽结晶为下式的铵盐
Figure FSB00000800996300013
其中R1、R2和R5如上所述并且
R6、R7和R8独立地选自氢、C1-4-烷基或C3-7-环烷基，条件是R6、R7和R8不都是氢，在下面的步骤中
b)在酸的存在下将游离酸从式III的铵盐中释放出来并且通过萃取除去胺并且
c)在酸催化剂的存在下，与选自下列的化合物进行环合
Figure FSB00000800996300014
其中R3和R4独立地选自氢或C1-4-烷基，条件是R3和R4不都是氢，R9a和R9b独立地是C1-4-烷基，R10表示C1-4-烷基、C1-4-烷酰基或芳基并且R11是氢或C1-3-烷基。
2.权利要求1的方法，其特征在于R1是选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的侧链。
3.权利要求1的方法，其特征在于R2选自Fmoc、Cbz、Moz、Boc、Troc、Teoc和Voc。
4.权利要求1的方法，其特征在于式II的氨基酸衍生物在它与丝氨酸或苏氨酸偶联之前用活化剂活化。
5.权利要求4的方法，其特征在于活化剂选自DIC/HOSu、DIC/五氟苯酚、DIC/HOBt、DCC/HOSu、DCC/五氟苯酚、DCC/HOBt、EDC(xHCl)/HOSu或HBTU/HOBt。
6.权利要求5的方法，其特征在于活化剂是DIC/HOSu。
7.权利要求1的方法，其特征在于丝氨酸或苏氨酸与式II的氨基酸衍生物的比选择在1.5至3.0比1的范围内。
8.权利要求1的方法，其特征在于式III的铵盐通过在二肽中加入下式的胺形成
Figure FSB00000800996300021
其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-4-烷基或C3-7-环烷基，条件是R6、R7和R8不都是氢。
9.权利要求8的方法，其特征在于R6、R7和R8独立地选自氢、乙基或环己基，条件是R6、R7和R8不都是氢。
10.权利要求8的方法，其特征在于加入二环己基胺。
11.权利要求8的方法，其特征在于结晶在选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯或四氢呋喃的有机溶剂中进行。
12.权利要求1的方法，其特征在于式III的铵盐的游离酸在无机酸的存在下释放，溶于有机溶剂，同时将胺通过用水和/或无机盐的水溶液萃取除去。
13.权利要求1的方法，其特征在于环合用2，2--二甲氧基丙烷、2-甲氧基丙烯或2-乙酰氧基丙烯进行。
14.权利要求13的方法，其特征在于环合用2，2-二甲氧基丙烷进行。
15.权利要求1的方法，其特征在于用于环合的酸催化剂选自甲磺酸、(+)樟脑-10-磺酸、对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶
Figure FSB00000800996300031
。
16.权利要求1的方法，其特征在于环合在有机溶剂的存在下进行。
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