CN107176970B - 一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，属于肽的合成技术领域。所述方法包括如下步骤：(1)将经Fmoc保护过的氨基酸，与丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的一种进行反应生成二肽；(2)将步骤(1)所得二肽在酸性树脂的催化下与2,2‑二甲氧基丙烷进行缩合反应，所得产物经过滤除去酸性树脂，然后经浓缩分离得到目标产物伪脯氨酸杂环肽。本发明提供的伪脯氨酸杂环肽合成方法，不需要反复成盐，解盐，产物的纯化也不需要反复柱层析，终产品的收率可达90％，纯度可达97％，具备反应操作简单，反应收率高，产品杂质含量少，制备成本低廉等特点，能够适应工业化生产。所述伪脯氨酸杂环肽的结构示为：

Description

一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法
技术领域
本发明属于肽的合成技术领域，具体涉及一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法。
背景技术
生物合成的多肽和蛋白质中所有的氨基酸序列均以Trans构型的状态存在；在核糖体中蛋白质生物合成形成二级结构中已经开始形成，并且是一个快速的过程，而Cis/Trans异构化是蛋白质总体折叠速率的瓶颈。在多肽序列中，脯氨酸同其前的氨基酸残基所形成的酰胺肽键称为肽脯酰胺键(Xaa-Pro bond)，Cis肽键在蛋白中很少见，但是含有脯氨酸的Xaa-Pro bond却含有10-30％的Cis式比率，在短链多肽溶液中，Cis/Trans构象的比率甚至相等。
Xaa-Pro bond的这种不寻常的Cis/Trans比率的分配，可用脯氨酸的特殊结构来解释。脯氨酸与一般的α-氨基酸不同，其没有自由的α-氨基，而是以亚氨基连接在α碳原子上，因此是一种α-亚氨基酸。Xaa-Pro Bond的Cis/Trans平衡，对环境条件的变化很敏感，有众多的影响因素。这表明Cis/Trans异构化的Xaa-Pro肽键往往是参与决定各种蛋白质折叠和复性反应速度的步骤。Cis/Trans是Xaa-Pro bond最为稳定的两种构象，这种Cis到Trans的转换，可以形象地称其为分子开关，在生命现象发挥着重大的调控作用。这种转换影响的因素非常多，可能会导致一些蛋白结构、活性变化，从而引发疾病，如癌症，老年痴呆症。鉴于Cis/Trans的重要性不仅在高分子结构中如蛋白质，而且在规模较小的分子肽样多肽等一些模型系统中已经提出了准确了解以分子为基础的动力学过程。
实现这一途径的方法是用非天然类似物替换Pro，以增大Pro在多肽和蛋白质骨架中的影响作用，例如通过ψPro提高Xaa-Pro键中的Cis构象的比率。除了为Ser、Thr和Cys提供一个正交保护技术(ψPro的脯氨酰环对强酸敏感，遇强酸时ψPro的脯氨酰环裂解)，还能为多肽和蛋白质的固相合成(SPPS)提供二级结构扰乱剂。另外，有研究显示：替代的杂环原子Xaa-ψPro肽键的Cis构象的含量和比率的增加可能有助于减少肽键之间的电子密度和不同的环型折叠。
科学证实伪脯氨酸二肽可以用作Ser、Thr和Cys的可逆保护基并且被证明是肽化学领域中克服某些内在问题的万能工具。肽序列中ψPro的存在引起了认为是分子间聚集来源的β-折叠结构的破坏。在肽组装例如Fmoc固相肽合成中引起溶剂化和偶联动力学的增加使链长延长容易，特别是对于包含“困难序列”的肽。
将伪脯氨酸二肽用于多肽药物的合成已有文献报道，中国专利CN 102942625 A报道了一种艾塞那肽的固相合成方法，采用氨基树脂作为载体，在偶联溶剂中依肽序连接伪脯氨酸二肽，制得侧链全保护的艾塞那肽氨基树脂，最后裂解脱除侧链保护基，得到艾塞那肽药物。专利CN 104017064 A公开了一种制备特立帕肽的方法，在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc-Phe-树脂，然后通过固相合成法在肽序的16-17位氨基酸引入伪脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψMe,MePro)-OH，最终得到纯度高的特立帕肽。专利CN 104418948 A公开了一种多肽药物DiaPep277的合成方法，以树脂P作为载体，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P树脂，然后通过与一个伪脯氨酸二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe,MePro)-OH进行偶联，最终得到DiaPep277多肽。上述文献中的多肽药物的合成均应用到了伪脯氨酸二肽(是一种杂环肽)，但是关于伪脯氨酸二肽的合成方法并未报道。
关于伪脯氨酸杂环肽的合成：有文献(CN 101472939 A)经过反复成盐缩合，操作复杂，总收率低；另有文献记载可采用对甲苯磺酸或者吡啶对甲苯磺酸盐进行催化，但是利用常规的酸催化缩合所造成的弊端是必须除尽酸才能得到高纯度的产品。而要除掉酸，必须有水分参与，而杂环二肽产品在酸水体系中稳定性极差，容易分解成原料，导致产品的收率低，很难得到理想收率和纯度的目标品。文献方法经回流反应20小时后，仍然反应不完全，而且产物杂质多，成份复杂，需要柱层析纯化，产物收率不到40％。
因此，能否避开酸水共存的体系，提供一种既能使得催化反应顺利进行，又能保证目标产物收率高，杂质成分少的杂环肽的合成方法，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，具备反应过程简单，产品收率高，杂质含量少，且无需碱溶液后处理，制备成本低廉，能够适应工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，包括如下步骤：
(1)将经氨基保护的α-氨基酸与丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的一种进行反应生成二肽；
(2)将步骤(1)所得二肽在催化剂的作用下与2,2-二甲氧基丙烷进行缩合反应，所述催化剂为Dowex 50树脂；
(3)将缩合反应所得物经过滤除去催化剂，然后经浓缩分离得到目标产物伪脯氨酸杂环肽。
其中，所述伪脯氨酸杂环肽具有如下结构式Ⅰ：
其中，R1是氨基保护基，R2是α-氨基酸侧链，X是O或S；当X是O时，R3是H或CH3，当X是S时，R3是H。
本发明采用酸性树脂Dowex 50树脂作为二肽缩合反应的催化剂，发现该树脂催化剂既能很好地催化缩合反应形成伪脯氨酸杂环肽，所得伪脯氨酸杂环肽又能不经过碱处理就能很好地除去催化剂，后处理简单，伪脯氨酸杂环肽的收率高达90％，纯度达97％。
进一步的，所述催化剂Dowex 50树脂的用量为二肽质量分数的5～10％。
进一步的，步骤(2)中所述缩合反应的操作为：将步骤(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，向其中加入催化剂Dowex 50树脂，然后在搅拌状态下加热回流1～3h。
进一步的，步骤(2)中所述浓缩分离的操作为：将反应结束滤去催化剂的反应液进行浓缩，浓缩后的剩余物在乙酸乙酯-石油醚中进行重结晶，得到目标产物。
进一步的，对α-氨基酸的氨基采用Fmoc进行保护。
进一步的，步骤(1)中将丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸的羧基先进行苄基保护后再与α-氨基酸反应生成二肽。
进一步的，步骤(3)在缩合反应结束后，还包括脱除苄基的步骤，操作如下：将缩合反应产物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量的5％Pd-C催化剂和2～3当量的甲酸，于室温下搅拌12h，反应结束后停止反应，滤除催化剂，再进行浓缩分离操作。
本发明的有益效果在于：本发明提供的伪脯氨酸杂环肽的合成方法，选取酸性Dowex 50树脂作为缩合反应的催化剂，制备得到了伪脯氨酸杂环肽，经检测，所得伪脯氨酸杂环肽产品的收率可达85％以上，纯度达96％以上。产物中杂质含量少，且后处理简单，无需碱液去除酸，与现有的合成方法(CN 101472939A)相比，产物的获得不需要反复成盐和解盐，产物的纯化也无需反复柱层析，工艺成本大大降低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
按照以下方法合成伪脯氨酸杂环肽(Ⅰ)：
(1)将经Fmoc保护的异亮氨酸(N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸)，与丝氨酸反应生成二肽，其中丝氨酸的羧基经过苄基保护，二肽的合成方法按照现有的常规方法，得到二肽的结构式如下：
其中，Bn为苄基；
(2)将步骤(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，然后向其中加入催化剂Dowex 50树脂，催化剂用量为二肽质量分数的5％，然后加热回流搅拌2h，采用薄层监测缩合反应是否完毕；
(3)将缩合反应产物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量的5％Pd-C催化剂和2当量的甲酸，室温下搅拌12小时左右，采用薄层监测，反应完毕后停止反应，对所得产物进行过滤除去Dowex 50树脂，然后经浓缩分离，得到白色固体残余物，将该白色固体残余物在乙酸乙酯-石油醚中进行柱层析，然后经重结晶，得到目标产物伪脯氨酸杂环肽(Ⅰ)。
伪脯氨酸杂环肽(Ⅰ)的结构式如下：
经测定，伪脯氨酸杂环肽(Ⅰ)的收率为85.7％，纯度为97.1％。
氢谱测定结果为：H1-NMR
7.74(dd,1H)；7.73(dd,1H)；7.56(dd,1H)；7.54(dd,1H)；7.34-7.38(m,)；7.31-7.26(s,1H)；5.58-5.56(d,1H)；5.12-5.19(t,1H),4.29-4.40(m,3H),4.14-4.17(t,1H)；3.93-3.97(q,2H),1.43-1.56(t,3H),1.59-1.62(t,3H),0.90-0.92(t,3H)。
实施例2
按照以下方法合成伪脯氨酸杂环肽(Ⅱ)：
(1)将经Fmoc保护的异亮氨酸(N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸)，与苏氨酸反应生成二肽，其中苏氨酸的羧基经过苄基保护，二肽的合成方法按照现有的常规方法，得到二肽的结构式如下：
其中，Bn为苄基；
(2)将步骤(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，然后向其中加入催化剂Dowex 50树脂，催化剂用量为二肽质量分数的10％，然后加热回流搅拌2h，采用薄层监测缩合反应是否完毕；
(3)将缩合反应产物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量5％的Pd-C催化剂和3当量的甲酸，室温下搅拌12小时左右，采用薄层监测，反应完毕后停止反应，对所得产物进行过滤除去Dowex 50树脂，然后经浓缩分离，得到白色固体残余物，将该白色固体残余物在乙酸乙酯-石油醚中进行柱层析，然后经重结晶，得到目标产物伪脯氨酸杂环肽(Ⅱ)。
伪脯氨酸杂环肽(Ⅱ)的结构式如下：
经测定，伪脯氨酸杂环肽(Ⅱ)的收率为87.1％，纯度为97.6％。
实施例3
按照以下方法合成伪脯氨酸杂环肽(Ⅲ)：
(1)将经Fmoc保护的亮氨酸(Fmoc-L-亮氨酸)，与半胱氨酸反应生成二肽，其中半胱氨酸的羧基经过苄基保护，二肽的合成方法按照现有的常规方法，得到二肽的结构式如下：
其中，Bn为苄基；
(2)将步骤(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解后，向其中加入催化剂Dowex50树脂，催化剂用量为二肽质量分数的5％，然后加热回流搅拌2h，采用薄层监测缩合反应是否完毕；
(3)将缩合反应产物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量5％的Pd-C催化剂和2当量的甲酸，室温下搅拌12小时左右，采用薄层监测，反应完毕后停止反应，对所得产物进行过滤除去Dowex 50树脂，然后经浓缩分离，得到白色固体残余物，将该白色固体残余物在乙酸乙酯-石油醚中进行柱层析，然后经重结晶，得到目标产物伪脯氨酸杂环肽(Ⅲ)。
伪脯氨酸杂环肽(Ⅲ)的结构式如下：
经测定，伪脯氨酸杂环肽(Ⅲ)的收率为90.7％，纯度为97.3％。

Claims (6)

1.一种树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将经氨基保护的α-氨基酸与丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的一种进行反应生成二肽，其中丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的羧基在反应前先通过苄基进行保护；
(2)将步骤(1)所得二肽在催化剂Dowex 50树脂的作用下与2,2-二甲氧基丙烷进行缩合反应，将缩合反应的产物溶于甲醇溶液中，向其中加入Pd-C催化剂和甲酸，于室温下搅拌从而脱除苄基，得到含杂环的具有脯氨酸部分属性的杂环肽又称伪脯氨酸；
(3)对所得产物进行过滤除去Dowex 50树脂，然后经浓缩分离得到目标产物为伪脯氨酸杂环肽；
其中，所述伪脯氨酸杂环肽具有如下结构式Ⅰ：
其中，R1是氨基保护基，R2是α-氨基酸侧链，X是O或S；当X是O时，R3是H或CH3，当X是S时，R3是H。
2.根据权利要求1所述的树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，所述催化剂Dowex 50树脂的用量为二肽质量分数的5～10％。
3.根据权利要求1或2所述的树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，所述缩合反应的操作为：将步骤(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，向其中加入催化剂Dowex 50树脂，然后在搅拌状态下加热回流1～3h。
4.根据权利要求1或2所述的树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，所述浓缩分离的操作为：将缩合反应后的反应液进行浓缩，浓缩所得残余物经过乙酸乙酯-石油醚快速柱层析后，重结晶得到目标产物。
5.根据权利要求1或2所述的树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，所述氨基保护基是Fmoc保护基。
6.根据权利要求1所述的树脂催化法合成伪脯氨酸杂环肽的方法，其特征在于，步骤(2)在缩合反应结束后，包括脱除苄基的步骤，操作如下：将缩合反应产物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量5％的Pd-C催化剂和2～3当量的甲酸，于室温下搅拌12h。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046239A1 (fr) * 1999-02-05 2000-08-10 Debiopharm S.A. Derives de cyclosporine et procede de preparation desdits derives
CN101472939A (zh) * 2006-06-28 2009-07-01 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 假脯氨酸二肽
CN102159587A (zh) * 2008-10-07 2011-08-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 假脯氨酸二肽

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046239A1 (fr) * 1999-02-05 2000-08-10 Debiopharm S.A. Derives de cyclosporine et procede de preparation desdits derives
CN101472939A (zh) * 2006-06-28 2009-07-01 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 假脯氨酸二肽
CN102159587A (zh) * 2008-10-07 2011-08-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 假脯氨酸二肽

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pseudo-Prolines as a Solubilizing, Structure-Disrupting Protection Technique in Peptide Synthesis;Torsten Wo1hr等;《J. Am. Chem. Soc.》;19961231;第118卷(第39期);第9218-9227页 *
昆虫激肽伪脯氨酸类似物的合成及其构效关系的相关研究;张波;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20111215;全文 *

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