ES2359527T3 - Dipéptidos de la pseudoprolina. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula: en donde R 1 es una cadena lateral de un alpha amino-ácido, R 2 es un grupo amino protector, y R 3 y R 4 están seleccionados independientemente entre sí, del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R 5 es hidrógeno o metilo, el cual comprende a) la conversión de un derivado de aminoácido de fórmula en donde R 1 y R 2 son como se ha indicado más arriba, con serina o treonina, y cristalizando el dipéptido resultante como sal de amonio de fórmula en donde R 1 , R 2 y R 5 son como se ha indicado más arriba, y R 6 , R 7 y R 8 son independientemente entre sí, seleccionados del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, con la condición de que no todos los R 6 , R 7 y R 8 sean hidrógeno, en un paso subsiguiente, b) liberando el ácido libre de la sal de amonio de fórmula III en presencia de un ácido y eliminando la amina por extracción, y c) efectuando el cierre del anillo con un compuesto seleccionado entre en donde R 3 y R 4 se seleccionan, independientemente entre sí, del grupo formado por hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, con la condición de que ambos R 3 y R 4 no sean hidrógeno, R 9a y R 9b son, independientemente entre sí, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R 10 tiene el significado de alquilo de 1 al 4 átomos de carbono, alcanoilo de 1 a 4 átomos de carbono, o arilo, y R 11 es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, en presencia de un catalizador ácido.

Description

Dipeptidos de la pseudoprolina La invención se refiere a un nuevo procedimiento para la fabricación de un compuesto de fórmula

imagen1

10 Los dipéptidos de la pseudo prolina de fórmula I pueden emplearse como grupos reversibles de protección para Ser, Thr y Cys, confirmando que son herramientas versátiles para solventar algunos problemas intrínsecos en el campo de la química de los péptidos [JACS 1996, 118, 9218-9227]. La presencia de la ΨPro dentro de una secuencia de un péptido da como resultado la disolución de las estructuras de hojas β consideradas como una fuente de agregación intermolecular. La mayor solvatación resultante y el acoplamiento de los cinéticos en el conjunto de péptidos como

15 por ejemplo la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, facilitan el alargamiento de la cadena especialmente en los péptidos que contienen "secuencias difíciles".

El objeto de la presente invención es el de proporcionar una síntesis breve y técnicamente viable de los dipéptidos de la pseudo prolina de forma I, la cual permite la obtención del producto con un alto rendimiento y sin ningún paso

20 de purificación cromatográfica.

El objetivo se ha conseguido con el procedimiento como se indica más adelante. El procedimiento para la fabricación de un compuesto de fórmula

25

imagen1

30 en donde R1 es una cadena lateral de un alpha amino-ácido, R2 es un grupo amino protector, y R3 y R4 están seleccionados independientemente entre sí, entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 9 átomos de carbono, R5 es hidrógeno o metilo, comprende

a) la conversión de un derivado de aminoácido de fórmula

35

imagen1

en donde R1 y R2 son como se ha indicado más arriba, con serina o treonina, y cristalizando el dipéptido resultante como sal de amonio de fórmula

imagen1

en donde R1, R2 y R5 son como se ha indicado más arriba, y R6, R7 y R8 están independientemente entre sí, seleccionados entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo 5 de 1 a 4 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, con la condición de que no todos los R6, R7 y R8 sean hidrógeno, en un paso subsiguiente,

b) liberando el ácido libre de la sal de amonio de fórmula III en presencia de un ácido y eliminando la amina por extracción, y

10

c) efectuando el cierre del anillo con un compuesto seleccionado entre

imagen1

15 en donde R1 y R4 se seleccionan, independientemente entre sí, entre el grupo formado por hidrógeno o alquilo de 1 al 4 átomos de carbono, con la condición de que ambos R3 y R4 no sean hidrógeno, R9a y R9b son, independientemente entre sí, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R10 tiene el significado de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcanoilo de 1 a 4 átomos de carbono, o arilo, y R11 es hidrógeno o alquilo de 1 a

20 3 átomos de carbono, en presencia de un catalizador ácido.

Se comprende además que la serina o treonina pueden emplearse, bien en su configuración L ó bien en su configuración D, como racemato, o en mezclas varias de sus isómeros. De preferencia se emplea la configuración L.

25 El término "alquilo de 1 a 4 átomos de carbono", se refiere a un radical hidrocarburo alifático saturado monovalente de cadena ramificada o lineal, de uno a cuatro átomos de carbono. Ejemplos de este término son los radicales metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, y t-butilo.

El término "cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono" se refiere a un grupo cicloalquilo que contiene de 3 a 7 átomos 30 de carbono, como por ejemplo el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo o el cicloheptilo.

El término "arilo" se refiere a un grupo fenilo o naftilo, de preferencia el grupo fenilo, el cual puede opcionalmente ser mono o múltiple substituido con halógeno, hidroxilo, CN, CF3, NO2, NH2, N(H,alquilo), N(alquilo)2, carboxilo, aminocarbonilo, alquilo, alcoxilo, arilo y/o ariloxilo. De preferencia, el grupo arilo es fenilo.

35 El término "alcanoilo" se refiere a un grupo alquilo carbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, como por ejemplo el acetilo, el n-propanoilo, el isopropanoilo, el n-butanoilo, el s-butanoilo y el t-butanoilo, de preferencia el acetilo.

El término "cadena lateral de un aminoácido" empleado para el R1, se refiere particularmente a cadenas laterales de

40 alpha aminoácidos, seleccionados del grupo formado por valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, arnina, ácido aspártico, alanina, serina, treonina, tirosina, triptófano, cisteína, glisina y ácido aminoisobutírico.

Se comprende que en las cadenas laterales de los amino-ácidos que llevan un grupo hidroxilo, este grupo hidroxilo

45 esté opcionalmente protegido por un grupo hidroxiprotector como se define más adelante. En las cadenas laterales que llevan grupos amino adicionales, el grupo amino está opcionalmente protegido por un grupo aminoprotector como se define más adelante.

R1 está de preferencia como cadena lateral de la valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, alanina, serina, treonina, tirosina y triptófano. Los más preferidos son la serina y la treonina.

El término "grupo amino protector" se refiere a cualquier substituyente convencionalmente empleado para inhibir la

5 reactividad del grupo amino. Grupos amino protectores adecuados están descritos por Green T., en "Protective Groups in Organic Synthesis" ("Grupos protectores en síntesis orgánica"), capítulo 7, John Wiley e hijos, Inc., 1991, 309-385. Grupos amino protectores adecuados son por ejemplo, el Fmoc, Cbz, Moz, Boc, Troc, Teoc ó Voc. El grupo amino protector preferido es el Fmoc.

10 El término "grupo hidroxilo protector" se refiere a cualquier substituyente convencionalmente empleado para inhibir la reactividad del grupo hidroxilo. Grupos protectores de hidroxilo adecuados están descritos por Green T., "Protective Groups in Organic Synthesis" ("Grupos protectores en síntesis orgánica"), capítulo 1, John Wiley e hijos, Inc., 1991, 10-142. Grupos hidroxilo protectores adecuados son por ejemplo el t-butilo, el bencilo, el TBDMS ó el TBDPS. El grupo hidroxilo protector preferido es el t-butilo.

15 El significado de las abreviaciones empleadas en la descripción y en las reivindicaciones es como se indica en la tabla siguiente:

Fmoc

9-fluorenilmetoxicarbonilo

Boc

t-butoxicarbonilo

Cbz

Carbobenciloxilo

Z

Benciloxicarbonilo

tBU

t-butilo

Moz

p-metoxibenciloxicarbonilo

Troc

2,2,2-tricloroetoxicarbonilo

Teoc

2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo

Voc

Viniloxícarbonilo

TBDMS

t-butildimetilsililéter

TBDPS

t-butildifenilsililéter

HBTU

O-benzotriazol N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluor-fosfato

HOBt

1-hidroxibenzotriazol

HOSu

N-hidroxisuccinimida

EDC

(3-dimetilamino-propil)-etil-carbodiimida (hidrocloruro)

DIC

N,N'-diisopropilcarbodiimida

DCC

N,N'-diciclohexilcarbodiimida

20 Paso a) En el primer paso a), un derivado de aminoácido de fórmula

25 en donde R1 y R2 son como se ha indicado más arriba, se hace reaccionar con serina o treonina, y el dipéptido resultante se cristaliza como sal de amonio, de fórmula

imagen1

imagen1

en donde R1, R2, R5, R6, R7 y R8 son como se ha indicado más arriba.

Los derivados de aminoácido de fórmula II son compuestos que se encuentran por regla general comercialmente 5 disponibles. Derivados de aminoácido adecuados de fórmula II de acuerdo con las preferencias dadas para R1 y R2 son el Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, ó el Fmoc-L-Thr(tBu)-OH.

Antes de la copulación con la serina o treonina, el derivado de aminoácido de fórmula II se activa convenientemente con un reactivo activador.

10 Reactivos activadores adecuados pueden seleccionarse del grupo formado por el DIC/HOSu, DIC/pentafluorfenol, DIC/HOBt, DCC/HOSu, DCC/pentafluorfenol, DCC/HOBt, EDC(xHCl)/HOSu ó HBTU/HOBt. El agente de copulación preferido es el DIC/HOSu. El DIC se emplea habitualmente en una cantidad de 1,0 a 1,4 equivalentes y el HOSu se emplea habitualmente en una cantidad de 1,0 a 1,8 equivalentes referidos a un equivalente del derivado de

15 aminoácido de fórmula I.

Por regla general, la reacción de activación se realiza en presencia de un disolvente orgánico adecuado, como por ejemplo el acetato de etilo, la N,N-dimetilformamida, la acetona o el tetrahidrofurano, de preferencia el acetato de etilo a una temperatura de -5 °C a 25 °C.

20 La copulación con serina o treonina, de preferencia con L-serina ó L-treonina, puede realizarse a una temperatura de 10 °C a 30 °C en presencia de un disolvente orgánico, como por ejemplo el acetato de etilo, la acetona o el tetrahidrofurano o mezclas de los mismos con agua. El disolvente preferido es una mezcla de acetona y agua.

25 La relación entre la serina o la treonina y el derivado de aminoácido de fórmula II, se selecciona habitualmente en el margen de 1,5 a 3,0 a 1, de preferencia 2,0 a 1. El pH de la mezcla de reacción se ajusta convenientemente a un valor de 7,5 a 9,0.

La formación de la sal de amonio de fórmula III tiene lugar mediante la adición al dipéptido previamente formado, de 30 una amida de fórmula

imagen1

en donde R6, R7 y R8, independientemente entre sí, se seleccionan entre el grupo formado por halógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, con la condición de que no todos los R6, R7 y R8 sean hidrógeno.

35

Aminas adecuadas de fórmula V son aquellas en las que R6, R7 y R8, independientemente entre sí, se seleccionan entre el grupo formado por hidrógeno, etilo o ciclohexilo, con la condición de que no todos los R6, R7 y R8 sean hidrógeno. La ciclohexilamina, la diciclohexilamina y la trietilamina son las aminas preferidas; la diciclohexilamina es la amina de fórmula V empleada con mayor preferencia. La cristalización se efectúa habitualmente en disolventes

40 orgánicos adecuados como por ejemplo en alcoholes inferiores como el metanol, etanol, n-propanol o i-propanol o en acetato de etilo o tetrahidrofurano. El disolvente más preferido es el etanol.

Las sales de amonio preferidas son las sales de diciclohexilamonio de fórmula III, en donde R1 y R2 son como se ha descrito más arriba, R5 es hidrógeno o metilo, R6 es hidrógeno y R7 y R8 son ciclohexilo. Más preferidos son los 45 compuestos de fórmula III en donde:

a) R1 significa la cadena lateral de la L-serina con una protección O-tBu, R2 es Fmoc, R5 es H, R6 es hidrógeno, y R7 y R8 son ciclohexilo. b) R1 significa la cadena lateral de la L-serina con una protección O-tBu, R2 es Fmoc, R5 es metilo, R6 es 50 hidrógeno, y R7 y R8 son ciclohexilo. c) R1 significa la cadena lateral de la L-treonina con una protección O-tBu, R2 es Fmoc, R5 es H, R6 es hidrógeno, y R7 y R8 son ciclohexilo. d) R1 significa la cadena lateral de la L-treonina con una protección O-tBu, R2 es Fmoc, R5 es metilo, R6 es hidrógeno, y R7 y R8 son ciclohexilo.

55

Paso b)

En el subsiguiente paso b), el ácido libre del dipéptido se libera en presencia de un ácido, y la amina protonada de

fórmula V se separa mediante extracción. Particularmente, el ácido libre de la sal de amonio de fórmula III se libera en presencia de un ácido mineral, se extrae con un disolvente orgánico mientras que la amina se separa por extracción con agua y/o una solución acuosa de un ácido mineral.

5 Los ácidos minerales adecuados son el ácido sulfúrico acuoso o el HCl acuoso, de preferencia el ácido sulfúrico acuoso.

El disolvente orgánico adecuado para la extracción del ácido libre puede seleccionarse entre el grupo formado por acetato de etilo, t-butil metil éter o cloruro de metileno. El t-butil metil éter se ha encontrado que es el disolvente 10 preferido.

La fase orgánica que contiene el ácido libre se lava por regla general varias veces con agua y/o una solución acuosa de una sal mineral, como por ejemplo el cloruro de sodio con el fin de separar completamente la amina.

15 Paso c)

En el paso c), el cierre del anillo del ácido libre del dipéptido obtenido en el paso b) se efectúa con un compuesto seleccionado entre

imagen2

en donde R3 y R4, independientemente entre sí, se seleccionan entre el grupo formado por hidrogeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, con la condición de que ambos R3 y R4 no sean hidrógeno, R9a y R9b, independientemente entre sí, son alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R10 tiene el significado de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,

25 alcanoilo de 1 a 4 átomos de carbono, o arilo, y R11 es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, en presencia de un catalizador ácido.

De preferencia, el cierre del anillo se efectúa con compuestos de fórmula IVa y IVc, con mayor preferencia los compuestos se seleccionan del 2,2-dimetoxipropano, 2-metoxipropeno ó 2-acetoxipropeno, en donde el 2,230 dimetoxipropano es el compuesto más preferido.

Idealmente, los compuestos de fórmula IV se emplean en una cantidad del 6,0 a 16,0 equivalentes, de preferencia 7,0 a 10,0 equivalentes en relación con el dipéptido obtenido en el paso b).

35 Catalizadores ácidos adecuados se seleccionan del grupo formado por ácido metansulfónico, ácido (+)alcanfor-10sul-fónico, ácido p-toluensulfónico o piridinio p-toluensulfonato, de los cuales el ácido metansulfónico es el preferido. El catalizador ácido se aplica normalmente en una cantidad de 0,05 a 0,30 equivalentes, de preferencia a 0,10 a 0,20 equivalentes en relación al dipéptido obtenido en el paso b).

40 El cierre del anillo se efectúa en presencia de un disolvente orgánico, como por ejemplo en tetrahidrofurano, cloruro de metileno o tolueno, de preferencia en tetrahidrofurano a temperatura de reflujo.

El aislamiento y elaboración del producto diana puede efectuarse empleando métodos que ya son conocidos por los expertos de la técnica.

45

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos

50 Ejemplo 1 Un reactor de vidrio de doble camisa, de 1000 ml, equi-pado con un agitador mecánico, un termómetro de Pt-100, un condensador de reflujo, un embudo de goteo, y una entrada de nitrógeno, se cargó con 25 g (64,9 mmoles) de Fmoc-L-Ser (tBu)-OH (1), 9,66 g (83,1 mmoles) de N-hidroxisuccinimida y 180 ml de acetato de etilo. La suspensión resultante se enfrió a 0 °C. Una solución de 10,49 g (83,1 mmoles) de diisopropil-carbodiimida en 20 ml de acetato de

55 etilo se añadió a los 15 minutos. La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 2 horas y a continuación durante otra hora a temperatura ambiente y se extrajo una muestra. El disolvente se eliminó completamente a presión reducida (aproximadamente 220 mbars) a una temperatura máxima de la camisa de 50 °C. El residuo se trató con 250 ml de

acetona y una temperatura interna de 35 °C a 40 °C, se enfrió a 20 °C y se trató con 13,5 ml de agua. El pH se ajustó a 1,0 ml de HCl 1M a pH 2-3 y la mezcla resultante se agitó durante 12 horas a 20 °C y se tomaron muestras. La suspensión se enfrió a continuación de -5 °C a 0 °C y se agitó durante 1 hora a esta temperatura. El precipitado se eliminó por filtración y el reactor y el filtro se enjuagaron con 5 ml de acetona fría (0 °C), el filtrado transparente e 5 incoloro se añadió a 20 °C en 60 minutos a una solución de 13,57 g (127,8 mmoles) de L-serina y 13,63 g (257 mmoles) de carbonato de sodio en 122,5 ml de agua. La mezcla resultante se agitó durante 1 hora a 20 °C y se tomaron muestras. El pH se ajustó con 28 g de HCl (37%) a un pH 2-3, y el disolvente orgánico se eliminó a presión reducida (< 250 mbars) a una temperatura máxima de la camisa de 50 °C. La suspensión resultante se trató de 35 °C a 40 °C con 125 ml de acetato de etilo y la solución bifásica transparente resultante se enfrió a 20 °C. Las fases 10 se separaron y la fase orgánica se extrajo dos veces con un total de 250 ml de acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron tres veces con un total de 225 ml de NaCl acuoso (10% p/p). La solución orgánica resultante se concentró y el disolvente se eliminó casi completamente a presión reducida a una temperatura máxima de la camisa de 50 °C. El residuo se disolvió en 250 ml de etanol, y de la solución resultante se eliminó una parte del disolvente (75 ml) de nuevo a presión reducida (aproximadamente 170 mbars) a una temperatura máxima de la 15 camisa de 50°. La solución resultante se trató con 462,5 ml de etanol y se en-frió a 20 °C. Se añadió aproximadamente un 20% (aproximadamente 29,5 ml) de una solución de 11,83 g (63,9 mmoles) de diciclohexilamina en 118 ml de etanol. La mezcla se sembró, después de lo cual el producto empezó a precipitar. La suspensión se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se añadió lentamente el resto de la solución de diciclohexilamina durante por lo menos 2 horas. El embudo de goteo se enjugó con 25 ml de etanol. La 20 temperatura interna se bajó a 0 °C en 4 horas, después de lo cual se agitó la suspensión durante la noche a esta temperatura. El precipitado se filtró con succión, la torta del filtro se lavó con 117,5 ml de etanol frío (0 °C) y se secó al vacío (50 °C, 20 mbars) obteniéndose 35,7 g (rendimiento 82% partiendo del ácido (S)-3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren9-ilmetoxicarbonil-ami-no)-propiónico de 96,8% (p/p) de pureza, basada en la HPCL), de la sal de diciclohexilamonio del ácido (S,S)-2-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-propionil-ami-no]-3-hidroxi-propiónico (3),

25 como un sólido incoloro.

El análisis HPLC se efectuó empleando un estándar externo de la sal de diciclohexil-amonio del ácido (S,S)-2-[3-tercbutoxi-2-(9-H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-propionil-ami-no]-3-hidroxipropiónico, pura (3). Condiciones para la HPLC: columna XBridge C18 (Waters), 4,6 x 150 mm, 3,5 µm; detección UV 206 nm; soluciones para el gradiente:

30 agua (A),tampónde KH2PO420mM,pH2,5(B),acetonitrilo(C);1,0ml/minuto;20°C.

Gradiente:

T [min]

A [%] B [%] C [%]

0

45 15 40

2

45 15 40

14

5 15 80

25

5 15 80

35 Tiempos de retención:

Sal de diciclohexil-amonio del ácido (S,S)-2-[3-terc-butoxi-2-(9-H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-propionil-ami-no]3-hidroxi-propiónico (3): 8,4 minutos Fmoc-L-Ser(tBu)-OH (1): 11,6 minutos

40 Este método de HPLC da como resultado un valor para el ensayo del ácido libre de (3). A partir de este valor, se calcula el ensayo de la correspondiente sal de diciclohexil-amonio, asumiendo una relación estequiométrica de 1:1 entre el ácido libre y el diciclohexilamonio.

45 Se utiliza un análisis GC empleando un estándar interno de dodecano, para medir el contenido en diciclohexilamina. Condiciones para la GC: columna de sílice fundido, 100% de polidimetilsiloxano, 1 µm, L = 15 m, ID = 0,25 mm; gas portador hidrógeno, presión: 53 kPa, velocidad lineal: 73 cm/segundo, relación de split: 1: 100.

Programa de temperaturas:

50

Velocidad de calentamiento [grados Celsius/minuto]

Temperatura final [ºC] Duración del paso isotérmi-co a la temperaturas final [minutos]

0,0

40 1

50

240 5

0,0

320 10

Tiempos de retención: Dodecano: 4,10 minutos

Diciclohexilamina: 4,90 minutos

Ejemplo 2

5 Un reactor de vidrio de doble camisa, de 500 ml, equipado con un agitador mecánico, un termómetro de Pt-100, un condensador de reflujo, un embudo de goteo con un filtro de algodón, y una entrada de nitrógeno, se cargó con 25,0 g (37,0 mmoles) de sal de diciclohexilamonio del ácido (S,S)-2-[3-terc-butoxi-2-(9-H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)pro-pionil-amino]-3-hidroxi-propiónico (3), 100 ml de terc-butíl metil éter y una solución de 4,70 g de ácido sulfúrico (96%) en 44,3 ml de agua. La mezcla se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente. La fase acuosa se

10 separó y la fase orgánica se lavó dos veces con un total de 76 ml de cloruro de sodio acuoso (0,5% p/p) y de nuevo con 38 ml de agua. El disolvente orgánico se eliminó completamente a presión reducida (500 – 100 mbar) y a una temperatura de la camisa de 50 °C. El residuo espumoso se disolvió en 100 ml de tetrahidrofurano y el disolvente se eliminó de nuevo completamente a presión reducida (500 -100 mbars) y una temperatura de la camisa de 50 °C. El residuo se disolvió en 450 ml de tetrahidrofurano y la solución transparente resultante se trató con 35,4 (333

15 mmoles) de 2,2 dimetoxipropano y 0,65 g (6,7 mmoles) de ácido metansulfónico. La mezcla se calentó a reflujo a una temperatura de la camisa de 85 °C, conduciendo el destilado sobre 73 g de tamiz molecular (0,4 nm). Después de 16 horas la solución de color ligeramente amarillo, se enfrió a 20°y se sacó una muestra, y la mezcla se trató con 0,828 g (8,14 mmoles) de trietilamina y se agitó durante 10 minutos. El disolvente se eliminó completamente a presión reducida (350 -100 mbars) y a una temperatura de la camisa de 50 °C. El residuo se trató con 100 ml de

20 terc-butilmetiléter y se concentró de nuevo completamente a presión reducida (350 -100 mbars) y a una temperatura de la camisa de 50 °C. El residuo se disolvió en 175 ml de terc-butilmetileter y se enfrió de 20 °C a 25 °C. La solución se trató con 87,5 ml de agua y se agitó durante 10 minutos. Las fases se separaron y la fase orgánica se concentró completamente a presión reducida (350 – 100 mbars) y a una temperatura de la camisa de 50 °C. El residuo espumoso se disolvió en 100 ml de terc-butilmetiléter y se concentró completamente a presión reducida

25 (350-100 mbars) y a una temperatura de la camisa de 50 °C. Este paso se repitió dos veces con un total de 200 ml de terc-butilmetiléter. El residuo se disolvió en 45,2 ml de terc-butilmetiléter de 20 °C a 25 °C y se trató con 22,6 ml de isopropanol. A esta temperatura, la solución se trató con 175 ml de pentano, se sembró, se continuó agitando durante por lo menos 15 minutos, y de nuevo se trató lentamente con 200 ml de pentano durante 1 hora. La solución resultante se agitó de 4 a 16 horas y a continuación se enfrió a 0 °C durante 1-2 horas, y de nuevo se agitó durante

30 otras 2 horas a esta temperatura. El precipitado se filtró con succión, la torta del filtro se lavó en dos veces con un total de 60 ml de pentano frío (0 °C) y se secó al vacío (50 °C, 20 mbars), obteniéndose 14,3 g (rendimiento 75%, partiendo de la sal de diciclohexil-amonio del ácido (S,S)-2-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-propionilamino]-3-hidroxipropiónico, 98,7% (p/p) de pureza, basada en la HPLC) del ácido (S,S)-3-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9il-metoxicarbonilamino)-propionil]-2,2-dimetil-oxazolidin-4-carboxílico (4) como un sólido incoloro.

35 El análisis HPLC se efectuó empleando un estándar externo del ácido (S,S)-3-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-propionil]-2,2-dimetil-oxazolidina-4-carboxílico (4) puro. Condiciones de la HPLC: columna XBridge C18 (Waters), 4,6 x 150 mm, 3,5 µm; detección UV 206 nm; soluciones para el gradiente: agua (A), tampón de KH2PO4 20 mM, pH 2,5 (B), acetonitrilo (C); flujo 1,0 ml/minuto; 20 °C.

40

Gradiente:

T [min]

A [%] B [%] C [%]

0

27 15 58

1

27 15 58

6

20 15 65

10

5 15 80

20

5 15 80

20,1

70 15 15

25

70 15 15

Tiempos de retención:

45

Ácido (S,S)-3-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9-il-metoxi-carbonilamino)-propionil]-2,2-dimetil-oxazolidina-4-carboxílico (4): 7,3 minutos Sal de diciclohexil-amonio del ácido (S,S)-2-[3-terc-butoxi-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-propionil-ami-no]3-hidroxi-propiónico (3): 3,0 minutos.

50 Fmoc-L-Ser (tBu)-OH (1): 5,6 minutos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula:

   imagen1

   10 en donde R1 es una cadena lateral de un alpha amino-ácido, R2 es un grupo amino protector, y R3 y R4 están seleccionados independientemente entre sí, del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R5 es hidrógeno o metilo, el cual comprende

   a) la conversión de un derivado de aminoácido de fórmula

   15

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   en donde R1 y R2 son como se ha indicado más arriba, con serina o treonina, y cristalizando el dipéptido resultante como sal de amonio de fórmula

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   en donde R1, R2 y R5 son como se ha indicado más arriba, y R6, R7 y R8 son independientemente entre sí, seleccionados del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, con la condición de que no todos los R6, R7 y R8 sean hidrógeno, en un paso subsiguiente,

   25 b) liberando el ácido libre de la sal de amonio de fórmula III en presencia de un ácido y eliminando la amina por extracción, y c) efectuando el cierre del anillo con un compuesto seleccionado entre

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   30 en donde R3 y R4 se seleccionan, independientemente entre sí, del grupo formado por hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, con la condición de que ambos R3 y R4 no sean hidrógeno, R9a y R9b son, independientemente entre sí, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, R10 tiene el significado de alquilo de 1 al 4 átomos de carbono, alcanoilo de 1 a 4 átomos de carbono, o arilo, y R11 es hidrógeno

   35 o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, en presencia de un catalizador ácido.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque, R1 es una cadena lateral seleccionada entre el grupo formado por valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, ácido aspártico, alanina, serina, treonina, tirosina, triptófano, cisteína, glicina y ácido

   5 aminoisobutírico.
3. 3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque, R2 está seleccionado entre el grupo formado por Fmoc, Cbz, Moz, Boc, Troc, Teoc y de Voc.

   10 4. Procedimiento de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, el derivado de aminoácido de fórmula II se activa antes de su copulación con serina o treonina con un reactivo activador.
4. 5. Procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque, el reactivo activador está seleccionado del grupo

   formado por DIC/HOSu, DIC/pentafluorfenol, DIC/HOBt, DCC/ HOSu, DCC/pentafluorfenol, DCC/HOBt, 15 EDC(xHCl)/HOSu ó HBTU/ HOBt.
5. 6. Procedimiento de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque, el reactivo activador es el DIC/HOSu.
6. 7. Procedimiento de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque, la relación entre la serina o la treonina y el 20 derivado de aminoácido de fórmula I, se selecciona en el margen de 1,5 a 3,0 a 1.
7. 8. Procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, la sal de amonio de fórmula III se forma por adición al dipéptido de una amina de fórmula

   25

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   en donde R6, R7 y R8 son independientemente entre sí, seleccionados del grupo formado por hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, con la condición de que no todos los R6, 30 R7 y R8 sean hidrógeno.

8. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 8, caracterizado porque, R6, R7 y R8 son independientemente entre sí, seleccionados del grupo formado por hidrógeno, etilo o ciclohexilo, con la condición de que no todos los R6, R7 y R8 sean hidrógeno.

9. 10.

   Procedimiento de las reivindicaciones 8 a 9, caracterizado porque, se añade diciclohexilamina.

10. 11.

    Procedimiento de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque, la cristalización tiene lugar en un

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    disolvente orgánico seleccionado entre el grupo formado por metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, acetato de 40 etilo o tetrahidrofurano.

11. 12.

    Procedimiento de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque, el ácido libre de la sal de amonio de fórmula III, se libera en presencia de un ácido mineral, se extrae con un disolvente orgánico, mientras que la amina se elimina por extracción con agua y/o una solución acuosa de una sal mineral.

12. 13.

    El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque, el cierre del anillo se efectúa con 2,2dimetoxipropano, 2-metoxipropeno, ó 2-acetoxipropeno.

    45
13. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, caracterizado porque, el cierre del anillo tiene lugar con el 2,2-di50 metoxipropano.
14. 15. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque, el catalizador ácido para el cierre del anillo se selecciona entre el grupo formado por el ácido metansulfónico, el ácido (+)alcanfor-10-sulfónico, el ácido p-toluensulfónico, el p-toluensulfonato de piridinio.

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15. 16. El procedimiento de las reivindicaciones 1 y 13 a 15, caracterizado porque, el cierre del anillo se efectúa en presencia de un disolvente orgánico.