CN101460619A - 核苷酸链的修饰方法 - Google Patents

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Abstract

在将作为修饰对象的核苷酸链和具有与构成所述核苷酸链的碱基不同的特定碱基的核苷酸加入到缓冲液而得的混合液中，使对所述核苷酸向所述核苷酸链的3′末端的附加进行催化的酶、特异地作用于所述核苷酸的分解酶和修饰所述核苷酸链的所需的修饰物质共存，在将所述核苷酸附加到所述核苷酸链的3′末端的同时，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸链的3′末端形成对于所述修饰物质具有结合能力的官能团，用所述修饰物质直接对形成有所述官能团的核苷酸链的3′末端进行修饰。在混合液中使3步反应连续地进行，可以实现操作的简便化、短时间化。

Description

核苷酸链的修饰方法
技术领域
本发明涉及核苷酸链的修饰方法，特别是涉及用修饰物质直接修饰核苷酸链的3′末端来对核苷酸链进行标签化、标记化、固定化的方法。
背景技术
一直以来，基因分析中采用放射性同位素作为用于对DNA、RNA、寡核苷酸、核酸等核苷酸链进行标签化、标记化的修饰物质，但由于存在因半衰期产生的使用时间的限制、使用场所的限制、被放射线照射的问题、废弃的问题等，因此趋向于减少其使用。近年来，作为替代放射性同位素的修饰物质，广泛采用荧光素等荧光物质或生物素等。
作为修饰核苷酸链的5′末端的方法，提出有将5′末端的磷酸基作为官能团通过化学的交联缩合反应来用修饰物质进行修饰的方法(例如，非专利文献1～2(在后列举，下同))。此外，还提出了通过在核苷酸链的化学合成时引入赋予了修饰物质的磷酸基来修饰核苷酸链的方法(例如，专利文献1～4和非专利文献3～4)，该方法同时可以应对核苷酸链的化学合成的自动化，所以被广泛应用。
然而，修饰5′末端的上述方法中，对于1分子核苷酸链只能用1分子修饰物质进行修饰，交联缩合反应也需要较长时间。关于核苷酸链的化学合成时进行修饰的方法，虽然化学合成被认为最大核苷酸数可以达到130，但该合成方法中核苷酸逐一层叠聚合，1次的层叠聚合效率最高也就99％，因此合成的核苷酸数越大则合成收率越低，为了获得足够的收量，必须限制核苷酸数(例如，非专利文献5)。另外，检测基因时利用碱性磷酸酶的显色或发光反应因灵敏度高而被广泛采用(例如非专利文献6～7)，但因为碱性磷酸酶具有引发核苷酸链的5′末端的脱磷酸化反应的性质，所以使修饰物质从核苷酸链离解，对于修饰了5′末端的核苷酸链无法利用碱性磷酸酶。
除了修饰5′末端的方法之外，还提出有利用核苷酸链的复制反应、转录反应，通过引入预先用修饰物质修饰了的核苷酸来获得用修饰物质修饰了的核苷酸链的方法。复制反应中，可以例举以往的基于放射性同位素的标签化、标记化中所采用的切口平移法、随机引物法、引物延伸法等，利用DNA聚合酶的复制反应引入预先用修饰物质实施了修饰处理的脱氧核糖核苷-5′-三磷酸来代替放射性同位素；在转录反应中，利用RNA聚合酶的转录反应引入预先用修饰物质实施了修饰处理的核糖核苷-5′-三磷酸(例如专利文献5～8和非专利文献6、8～9)。这些修饰方法具有操作简便、核苷酸链的修饰量高、修饰物质稳定、修饰物质不因碱性磷酸酶而离解的优点，因此作为适合于基因分析的方法被广泛采用。另外，这些修饰方法可以与聚合酶链式反应、即所谓PCR法或RNA扩增反应并用，从而同时实现基因的扩增反应和标签化、标记化反应(例如，非专利文献10～12)，因此被广泛应用于统称为DNA微阵列的基因的综合分析(例如，专利文献9～10和非专利文献13～15)。
但是，上述的基于复制反应或转录反应的修饰方法是引入预先用修饰物质修饰了的核苷酸、即拟似的核苷酸的方法，所以引入效率比原来的核苷酸差，并用PCR时扩增效率也比原来的核苷酸差(例如，专利文献8和非专利文献16)，修饰物质的引入量也是随机的，为每1分子核苷酸链12～25分子(例如，非专利文献17)，修饰量的再现性存在问题。此外，由于在核苷酸链内赋予修饰物质，基因分析的杂交中，即核苷酸链形成双链时，修饰物质产生的位阻不可避免。另外，预先用修饰物质修饰了的核苷酸的合成复杂，不是任何人都可以容易地进行合成的(例如，非专利文献8、18)，因而修饰物质的种类受到限定。
作为其它的修饰方法，还有不像上述的利用复制反应或转录反应的修饰方法那样需要作为模板的核苷酸链，在没有模板的情况下通过核苷酸的附加反应修饰核苷酸链的方法。例如，有利用末端脱氧核苷酸转移酶，使预先用修饰物质实施了修饰处理的脱氧核糖核苷-5′-三磷酸或双脱氧核糖核苷-5′-三磷酸加尾于核苷酸链的3′末端的方法(例如，非专利文献19～21)；利用RNA连接酶，使预先用修饰物质实施了修饰处理的脱氧核糖核苷-3′，5′-二磷酸或核糖核苷-3′，5′-二磷酸加尾的方法(例如，专利文献11和非专利文献22)。其中，使双脱氧核糖核苷-5′-三磷酸加尾的方法或者使核糖核苷-3′，5′-二磷酸加尾的方法仅能对1分子核苷酸链修饰1分子修饰物质，但使预先用修饰物质修饰了的脱氧核糖核苷-5′-三磷酸加尾的方法能够对1分子核苷酸链用多分子的修饰物质进行修饰。
但是，这样使预先用修饰物质修饰了的脱氧核糖核苷三磷酸加尾的方法由于修饰了的核苷酸的附加数根据反应条件而随机，而且还形成不需要的核苷酸序列，因此也在基因分析的杂交中成为错配的主要原因。此外，像上述的利用复制反应或转录反应的修饰方法中说明的那样，预先用修饰物质修饰了的核苷酸不是任何人都可以容易地进行合成的，因而修饰物质的种类受到限定。
在核苷酸链的3′末端引入修饰物质除了上述的加尾之外，还可以通过化学合成法来实现，该情况下不会形成不需要的核苷酸序列。但是，无法避免对于化学合成法已经提到的收量和核苷酸链长的限制的问题。
核苷酸链的修饰不仅用于标签化、标记化，也为了将核苷酸链固定于基板上而进行。作为固定化用的基板，以往采用进行加工而使其具有疏水性和正电荷的硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯等的基板，通过核苷酸链和基板的疏水键以及核苷酸链的磷酸基(带负电)和带正电的基板的静电偶合，核苷酸链被固定于基板。
该固定化方法中，核苷酸链越长，则每1分子核苷酸链的基板占有率越高，因此基板单位面积的固定化量越少，产生固定于基板的核苷酸链离解等问题。于是，采用如下的方法：通过用具有官能团的修饰物质修饰核苷酸链的末端的同时，预先在基板表面形成对应于所述官能团的结合基团，使修饰物质的官能团和基板表面的结合基团交联缩合，从而将核苷酸链以共价键固定于基板表面(例如，专利文献12～15和非专利文献23)。该方法与以往的疏水键和静电偶合相比，可以更稳定且牢固地将核苷酸链固定化。作为官能团-结合基团的组合，可以采用氨基-羧基、氨基-异硫氰酸酯基、氨基-醛基、氨基-琥珀酰亚胺基、氨基-环氧基等。
但是，用具有官能团的修饰物质修饰核苷酸链的5′末端的情况下，由于介以磷酸基，因此产生上述的问题，即由于核苷酸链因磷酸酶而离解，因此基于发光反应的检测困难。用具有官能团的修饰物质修饰核苷酸链的3′末端的情况下，也产生上述的问题，即为了能够通过化学合成来合成且获得足够的收量，核苷酸链长受到限制。
作为解决以上的核苷酸链的标签化、标记化、固定化的方法，有直接用修饰物质对核苷酸链的3′末端部分进行修饰的方法(参照专利文献16)。该方法如下：在核苷酸链的3′侧附加2个以上的具有尿嘧啶碱基的核苷酸，将附加了的核苷酸用尿嘧啶DNA糖苷酶分解而在3′末端形成醛基，通过该醛基和修饰物质所具有的氨基的反应而生成共价键，从而直接用修饰物质对核苷酸链的3′末端进行修饰。
(专利文献)
1：日本专利1651975号公报
2：日本专利1706289号公报
3：日本专利1780550号公报
4：日本专利1845794号公报
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9：日本专利3272365号公报
10：日本专利特表2002-538836号公报
11：日本专利特开平5-331185号公报
12：日本专利特开2000-63154号公报
13：日本专利特开2001-66304号公报
14：日本专利特开2003-161731号公报
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16：日本专利特开2003-246794号公报
(非专利文献)
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发明的揭示
如上所述，对于核苷酸链的修饰方法提出有各种方法，这些方法各有长短，存在使用者不得不根据用途选择修饰方法的负担。简而言之，介以磷酸基对核苷酸链的5′末端进行修饰的方法存在稳定性的问题，在核苷酸链的化学合成中对5′末端或3′末端实施修饰处理的方法存在核苷酸链长的限制和收量的问题。利用复制反应或转录反应的方法的用途限定于从一开始就用荧光物质等修饰物质对核苷酸链进行标签化、标记化，其复制效率和转录效率也存在问题。附加预先用修饰物质修饰了的核苷酸的加尾法形成不需要的核苷酸序列。为了将核苷酸链固定于基板，理想的是用具有在与基板表面的结合基团之间生成共价键的官能团的修饰物质对核苷酸链进行修饰，但该修饰中上述的问题也无法避免。
专利文献10记载的方法虽然不论核苷酸链的链长怎样，都可以直接用任意的修饰物质对核苷酸链的3侧进行修饰，但在附加反应、分解反应和修饰反应中分别需要进行采用反应条件的改变和乙醇沉淀等的试样回收，至修饰反应结束需要10小时以上。
本发明是解决上述问题的发明，其目的在于在直接用修饰物质对核苷酸链的3末端进行修饰时，使反应条件的改变达到最低限度，缩短所需时间。
为了解决上述课题，本发明的核苷酸的修饰方法的特征在于，在将作为修饰对象的核苷酸链和具有与构成所述核苷酸链的碱基不同的特定碱基的核苷酸加入到缓冲液而得的反应混合液中，使对所述核苷酸向所述核苷酸链的3′末端的附加进行催化的酶、特异地作用于所述核苷酸的分解酶和修饰所述核苷酸链的所需的修饰物质共存，在将所述核苷酸附加到所述核苷酸链的3′末端的同时，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸链的3′末端形成对于所述修饰物质具有结合能力的官能团，用所述修饰物质直接对形成有所述官能团的核苷酸链的3′末端进行修饰。不在中途分离混合液中的反应产物等而进行一系列的反应，用修饰物质直接修饰核苷酸链，所以可以实现操作的简便化、短时间化，也不受核苷酸链长的限制，因此便利性高。
可以从最初开始就混合作为修饰对象的核苷酸链、核苷酸、修饰物质和两种酶，使附加反应、分解反应和修饰反应同时进行；也可以将作为修饰对象的核苷酸链、核苷酸和两种酶混合而使附加反应和分解反应同时进行，在分解反应后的混合液中加入修饰物质来进行修饰反应。
本发明的特征在于，作为活化对附加反应进行催化的酶的活化因子，添加不阻碍修饰物质的修饰反应的活化因子。这是因为反应混合液理想的是采用不含3步反应的反应阻碍因子的组成。
本发明的特征在于，使反应混合液中包含使对附加反应进行催化的酶的反应活性温和的缓冲剂成分。这是为了防止在核苷酸链的3′末端过度附加具有特定碱基的核苷酸，使分解所附加的核苷酸的序列的后续的分解反应变得容易进行。
对附加反应进行催化的酶为末端脱氧核苷酸转移酶时，活化因子可以使用除钴离子以外的2价金属阳离子。这是因为只要不是钴离子，在修饰物质具有上述基团的情况下也可以防止沉淀。优选使用锰离子或镁离子。
对附加反应进行催化的酶为末端脱氧核苷酸转移酶时，作为缓冲剂成分，可以优选使用4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-吗啉代乙磺酸或3，3-二甲基戊二酸。
附加的核苷酸的特定碱基可以是原来的(天然的)构成核苷酸链的核苷酸中所不含的碱基，即，不是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，而是这些碱基经烷基化、脱氨基化、卤化、羟基化或氧化等而得的突变碱基。如果是具有这样的特定碱基的核苷酸，则特异的分解酶对其作用时，作为修饰对象的核苷酸链本身可以维持初始的状态。
作为分解酶，可以使用DNA糖苷酶或DNA修复酶。藉此，所附加的核苷酸的序列中，发生碱基的脱离、脱氧核糖的开环和3′位磷酸基的离解，在核苷酸链的3′末端形成醛基。附加的核苷酸为2′-脱氧尿苷-5′-一磷酸时，分解酶可以优选使用尿嘧啶DNA糖苷酶。
修饰物质可以是具有-NH2的物质。这是因为即使不采用特别的催化反应，存在于修饰物质中的-NH2也与醛基等自发地进行交联结合反应。例如，在醛和-NH2之间形成席夫碱。
修饰物质可以是对核苷酸链进行标签化、标记化的物质。所述修饰物质可以是荧光性物质、维生素、脂质、氨基酸、寡肽、蛋白质或生物体外源性物质。
修饰物质可以是为了使核苷酸链结合于基板而介于其间的物质。所述修饰物质可以是具有氨基和巯基的化合物。此外，可以是具有氨基和通过水解而形成硅烷醇基的烷氧基硅烷基的化合物。
具体来说，本发明的核苷酸的修饰方法中，可以混合具有任意的碱基序列的核苷酸链、具有特定碱基的核苷酸、对所述核苷酸向所述核苷酸链的3′末端的附加反应进行催化的酶、作为作用于所述核苷酸的DNA糖苷酶或DNA修复酶的分解酶、以及对于通过以所述酶所附加的核苷酸被所述分解酶分解而形成于所述核苷酸链的3′末端的醛基具有结合能力的修饰物质。
此外，可以在加入有具有任意的碱基序列的核苷酸链的缓冲液中混合2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、末端脱氧核苷酸转移酶及其活化因子和尿嘧啶DNA糖苷酶，对该反应混合液进行加热处理或碱处理后，在该经过处理的反应混合液中混合具有H2N-的修饰物质。
如果采用本发明的核苷酸链的修饰方法，则可以在将核苷酸链保持于原来的状态、即不追加多余的核苷酸的情况下，简便地以较短时间用所需的修饰物质进行修饰。不论核苷酸链是单链还是双链都可以。
附图的简单说明
图1是表示本发明的核苷酸链的修饰方法的原理的反应模式图。
图2是表示利用图1的反应来对核苷酸链进行标签化、标记化的过程的反应模式图。
图3是表示利用图1的反应来将核苷酸链固定于贵金属基板的过程的反应模式图。
图4是表示本发明的核苷酸链的修饰方法的各反应过程中的反应状况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5是表示本发明的核苷酸链的修饰方法中的酶活化因子的影响的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图6是表示本发明的核苷酸链的修饰方法的加尾反应中的酶活化因子和缓冲剂成分的影响的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
实施发明的最佳方式
以下，基于附图对本发明的实施方式进行说明。
首先，参照图1对本发明的核苷酸链的修饰方法的原理进行说明。图中的X表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中的任意的碱基，U表示尿嘧啶碱基。n表示任意的自然数，m表示0或任意的自然数。
在加入有具有任意的碱基序列的核苷酸链(I)的缓冲液中混合以下式
Figure A200780020081D00121
表示的2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸(以下略作dUTP)、末端脱氧核苷酸转移酶(以下略作TdT)、尿嘧啶-DNA糖苷酶(以下略作UDG)和活化TdT的活化因子。作为活化因子，理想的是使用作为2价阳离子的镁离子或锰离子。
藉此，通过TdT的聚合酶作用，在核苷酸链(I)的3′末端呈直链状连续地加尾2个以上的以下式
表示的2′-脱氧尿苷-5′-一磷酸(以下略作dUMP)，生成核苷酸链(II)。同时，通过UDG的作用，所加尾的dUMP的尿嘧啶碱基被离解的同时，脱氧核糖的糖苷键被水解，生成具有醛基的核苷酸链(III)。通过预先使TdT酶和UDG酶共存，可以在以TdT使dUMP加尾的同时，使所加尾的dUMP立即进入到以UDG进行分解的反应。
接着，将含生成的核苷酸链(III)的反应混合液在90～100℃进行5～15分钟的加热处理，或者实施在反应混合液中滴加氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液等强碱溶液的碱处理。藉此，分解了的加尾部分离解，获得在作为起始物质的核苷酸链(I)的3′末端直接形成有醛基的核苷酸链(IV)。
最后，在含核苷酸链(IV)的反应混合液中混合具有H2N-的修饰物质(图中的Y表示构成修饰物质的化合物、分子或物质的其余部分)。藉此，存在于修饰物质的-NH2和形成于核苷酸链的3′末端的醛基在无特别的催化反应的情况下自发地进行交联结合反应，在-NH2和醛基之间形成席夫碱，获得用修饰物质直接修饰了3′末端的不含多余的核苷酸的核苷酸链(V)。
还有，作为上述的TdT的活化因子，以往广泛采用钴离子，但确认钴离子与这样修饰核苷酸链的具有-NH2的修饰物质形成不溶性的沉淀物，因此理想的是本发明中避免采用钴离子。
本发明中作为TdT的活化因子所优选采用的所述的镁离子和锰离子不会与修饰物质形成不溶性的沉淀物。镁离子和锰离子的酶活化能力虽然比钴离子低，但通过采用这样的离子，反而可以限制基于TdT的dUMP的加尾量，因此可以使以加尾于核苷酸链的dUMP为底物的基于UDG的反应容易进行，即可以通过UDG迅速地消化底物。dUMP通过呈直链状连续地对作为修饰对象的核苷酸链加尾2个以上，可以起到尿嘧啶DNA糖苷酶底物的作用。
如上所述，在不分离反应混合液中的成分和反应产物的情况下进行一系列的反应，可以用修饰物质直接对核苷酸链的3′末端进行修饰，能够实现操作的简化、短时间化。
与以往的方法相比，本发明的核苷酸链的修饰方法由于不是利用复制反应或转录反应来引入修饰物质的方法，因此不像引入反应那样修饰物质的修饰量依赖于核苷酸链的链长。此外，与基于交联缩合反应的修饰5′末端的方法(例如，Nucleic Acids Res.13卷1529页1985年)相比，修饰时间可以大幅缩短。另外，与在核苷酸链的化学合成中同时修饰5′末端的方法相比，也可以避免在化学合成中成为课题的核苷酸链的链长、即核苷酸数的限制(合成收率)的问题。基于这些原因，该方法在需要核苷酸链的标签化、标记化、固定化等的基因分析等中是有用的。
核苷酸链的主链(除3′末端以外的部分)中不存在修饰物质，所以基因分析中，在修饰了的核苷酸链和其靶核苷酸链之间形成双链时，也可以避免修饰物质引起的双链形成的位阻的产生。
如果作为目标的核苷酸链是可化学合成的链长为数十核苷酸的核苷酸链，则也可以通过预先合成具有特定的碱基序列的核苷酸链，从而省略第1步反应(核苷酸链(I)→核苷酸链(II))。
为了对核苷酸链进行标签化、标记化，例如如图2所示，使在被广泛用作修饰物质的生物素的末端形成有氨氧基的N-氨氧基甲基羰基肼基-D-生物素(A)(以下略作氨氧基生物素)与核苷酸链(IV)反应，则作为核苷酸链(V)，可以获得在3′末端直接结合有生物素的核苷酸链。这样进行了生物素标记的核苷酸链可以良好地用作用于杂交等基因分析的探针或靶。
为了对核苷酸链进行固定化，例如如图3所示，通过使例如8-氨基-1-辛硫醇(B)等具有氨基的硫醇与在3′末端具有醛基的核苷酸链(IV)反应，从而使醛基和氨基之间发生缩合，获得在核苷酸链的3′末端直接结合有8-氨基-1-辛硫醇(残基)的修饰核苷酸链(V)。
接着，通过用滴加等方法使该具有巯基的核苷酸链(V)与金等贵金属的基板(C)接触，从而可以形成巯基和贵金属的牢固的共价键，将核苷酸链(V)固定于基板(C)。通过这样操作，可以将以贵金属作为基板的电化学测定法、石英振子微平衡法、表面等离子体共振法等测定方法用于基因分析。
采用贵金属等的金属基板或形成有金属薄膜的玻璃或塑料的支承体的情况下，可以将存在具有与金属基板或金属薄膜的结合性的巯基和具有与核苷酸链的结合性的-NH2这两者的8-氨基-1-辛硫醇等氨基烷基硫醇用作修饰物质。
此外，采用玻璃基板的情况下，可以将存在由水解而生成具有与玻璃的结合性的硅烷醇基的甲氧基硅烷基或乙氧基硅烷基等烷氧基硅烷基和具有与核苷酸链的结合性的-NH2这两者的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷等硅烷偶联化合物用作修饰物质。
以上，对使具有尿嘧啶碱基的dUMP加尾，然后使UDG作用而将dUMP分解的例子进行了说明，但也可以使用如以下的表1中所例举的具有通过天然的核苷酸链中所含的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的烷基化、脱氨基化、卤化、羟基化或氧化等突变而生成的天然的核苷酸链中所不含的碱基的核苷酸(即，除2′-脱氧腺苷-5′-一磷酸、2′-脱氧胞苷-5′-一磷酸、2′-脱氧鸟苷-5′-一磷酸和2′-脱氧胸苷-5′-一磷酸以外的2′-脱氧核糖核苷-5′-一磷酸)。
若更具体地例举，即上述的尿嘧啶是存在于胞嘧啶的4位的碳上的氨基发生脱氨基化而突变为羰基所得的碱基。同样地，存在于腺嘌呤的6位的碳上的胺发生脱氨基化而突变为羰基所得的碱基是次黄嘌呤，腺嘌呤的3位的氮发生甲基化的突变所得的碱基是3-甲基腺嘌呤，鸟嘌呤的8位的碳氧化而突变为羰基所得的碱基是8-氧鸟嘌呤(各碱基的符号标注基于国际纯化学和应用化学联合会(IUPAC)的基准)。
组合这些核苷酸的加尾和特异地作用于同一核苷酸的DNA糖苷酶或DNA修复酶，也可以在保持修饰反应前的初始的核苷酸链的结构和构成的状态下于核苷酸链的3′末端形成醛基，能够用具有针对醛基的结合基团(-NH2基等)的修饰物质直接进行修饰。
[表1]
 
核苷酸的碱基 适用的DNA糖苷酶·DNA修复酶
·尿嘧啶·5-羟基尿嘧啶·5，6-二羟基尿嘧啶·5-氟尿嘧啶 ·尿嘧啶DNA糖苷酶
·次黄嘌呤 ·次黄嘌呤DNA糖苷酶
·3-甲基腺嘌呤·3-乙基腺嘌呤 ·3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶I型
·3-甲基腺嘌呤·次黄嘌呤·3-甲基鸟嘌呤·7-甲基鸟嘌呤·1，N6-桥亚乙基腺嘌呤·8-氧鸟嘌呤·7-乙基嘌呤·3-乙基嘌呤·7，3-二乙基嘌呤·1-羧乙基腺嘌呤·7-羧乙基鸟嘌呤·O2-甲基嘧啶·7-(2-乙氧基乙基)鸟嘌呤·7-(2-羟基乙基)鸟嘌呤·7-(2-氯乙基)鸟嘌呤·1，2-双(7-脒基)乙烷·3-乙硫基乙基嘌呤·N2，3-桥亚乙基鸟嘌呤·N2，3-亚乙烯基鸟嘌呤·5-羟甲基尿嘧啶·5-甲酰基尿嘧啶·1，N4-亚乙烯基胞嘧啶·1，N2-亚乙烯基鸟嘌呤·3，N2-亚乙烯基鸟嘌呤 ·3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型
·胸腺嘧啶二醇·5，6-二氢胸腺嘧啶·5，6-二羟基二氢胸腺嘧啶·羟基胞嘧啶·尿素·5-羟基-5-甲基乙内酰脲·6-羟基-5，6-二羟基嘧啶·5-羟基尿嘧啶·5-羟基-6-氢胸腺嘧啶·5，6-二氢尿嘧啶·尿嘧啶二醇·5-羟基-6-氢尿嘧啶 ·核酸内切酶III
·8-氧鸟嘌呤·7，8-二氢-8-氧鸟嘌呤·8-氧腺嘌呤·甲酰氨基鸟嘌呤·甲基甲酰氨基鸟嘌呤 ·8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶
·7-甲基鸟嘌呤·1，6-二氨基-5-甲酰氨基嘧啶·甲酰氨基鸟嘌呤·甲基甲酰氨基鸟嘌呤·甲酰氨基腺嘌呤·8-氧腺嘌呤·8-氧鸟嘌呤·7，8-二氢-8-氧鸟嘌呤·羟基胞嘧啶·5-羟基尿嘧啶·黄曲霉素结合咪唑开环状鸟嘌呤·咪唑开环状N-2-氨基芴-8-鸟嘌呤 ·甲酰氨基嘧啶DNA糖苷酶
·8-氧鸟嘌呤·腺嘌呤/鸟嘌呤错配 ·MutY-DNA糖苷酶
·1，N4-亚乙烯基胞嘧啶·尿嘧啶/鸟嘌呤错配 ·错配尿嘧啶DNA糖苷酶
·嘧啶二聚体 ·嘧啶二聚体DNA糖苷酶
·胸腺嘧啶/鸟嘌呤错配·鸟嘌呤/鸟嘌呤错配 ·胸腺嘧啶DNA糖苷酶
修饰物质具有针对形成于核苷酸链的官能团的结合基团即可，官能团如上所述为醛基的情况下，可以适当采用例如氨基(H2N-)、肼基(H2NHN-)或氨氧基(H2NO-)等含H2N-的基团。
作为用于标签化、标记化的修饰物质，除了上述的氨氧基生物素(维生素)之外，还可以使用作为具有氨氧基的荧光物质的荧光素、德克萨斯红(Texas Red)、若丹明、以Cy3和Cy5为代表的花青类化合物或者非荧光性的洋地黄毒苷等。如果用荧光性物质修饰核苷酸链，则对于基因分析、特别是荧光原位杂交(FISH法)是有用的。还有，生物素为维生素的一例，洋地黄毒苷为脂质的一例。
氨基酸、寡肽、蛋白质也具有氨基，因此可以使用。氨基酸中，由于具有荧光性，可以优选使用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。不具有荧光性的氨基酸和肽等也可以通过使荧光素等(以下称为标记化合物)结合于侧链来使用。
肽存在对应于构成其的氨基酸的数量的侧链，因此可以使多个标记化合物结合。例如，3个赖氨酸连接而成的三聚赖氨酸在侧链中存在3个氨基，因此可以任意地修饰共计3个具有羧基、琥珀酰亚胺基等的标记化合物。
作为蛋白质，例如可以使用碱性磷酸酶、过氧化物酶或具有有色性、荧光性的藻红蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、水母发光蛋白等。
并不局限于肽(包括蛋白质)，也可以将具有氨基的烷基、烯丙基、环烷烃、芳香族、糖类等烃类用标记化合物修饰而得的物质用作修饰物质来修饰核苷酸链。
除此之外，在表面形成有氨基的金胶体、银胶体等贵金属胶体或者以磁性微粒、聚苯乙烯珠等高分子微粒为代表的微粒等生物体外源性物质也可以用作核苷酸链的修饰物质。
用于结合到基板上的修饰物质只要具有针对形成于核苷酸链的官能团的结合基团和针对基板的结合基团即可，例如若是具有氨基和巯基的化合物，则可以无特别限定地进行使用。上述的氨基烷基硫醇是其具体例子。氨基和巯基间的烃残基可以是直链状、分支状、环状、烯丙基链状、芳香环状等各种形态，其碳数、氨基的位置等可以改变。
基板在石英振子微平衡法和表面等离子体共振法等中广泛采用金基板，但并不局限于此，除金之外，还可以使用铂、银等贵金属或铜、钯、铟、镍、铁、铝及它们的合金等。
作为修饰物质，可以使用具有氨基的硅烷偶联化合物，通过它可以将核苷酸链固定于玻璃、硅、二氧化硅、氧化铝、云母以及聚苯乙烯、尼龙、环氧树脂等高分子树脂等的基板上，也可以适用于以往的各种基因分析方法。
硅烷偶联化合物只要是具有氨基和烷氧基硅烷基(例如甲氧基硅烷基、乙氧基硅烷基等)的化合物，即可与烷基硫醇同样，在对结构等没有特别限定的情况下使用。可使用的硅烷偶联化合物例如有γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷等。
本来不具有氨基、氨氧基或肼基的物质通过介以具有这些结合基团的合适的间隔基团(spacer)，也可以修饰核苷酸链。例如，具有羧基的物质通过介以1，2-二氨基乙烷、1，6-二氨基己烷等具有二氨基结构的物质作为间隔基团，可以修饰核苷酸链。另外，具有氰基的物质或者像格利雅(Grignard)试剂那样具有卤化镁的物质也可以用作修饰物质。
以下，例举具体的实施例对本发明进行更详细的说明。
(实施例1)
作为修饰对象的核苷酸链采用核苷酸数25的单链化学合成寡聚脱氧核苷酸(委托日本西格玛奥德里奇公司进行合成)。该核苷酸链的碱基序列自5′末端起为CTTATGATTTTTGTGTGAACCTCCC，是与人骨骼肌肌球蛋白重链1的DNA碱基序列5786～5810位(美国国家生物技术信息中心的GenBank，因特网网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)，登录号:NM_005963，2004年2月至今)的序列互补的碱基序列。A、G、T、C分别表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶。
将2.5μM上述的核苷酸链、1u(单位)/μl TdT(法门塔斯公司(Fermentas社)制)、0.2u/μl UDG(纽英伦生物技术公司(New England BioLabs社)制)、1mM dUTP、2mM氯化镁(各自的最终浓度)混合于50mM4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氢氧化钾缓冲液(pH7.2)中(总量50μl)，在37℃使其反应2小时，在100℃进行15分钟的加热处理。接着，添加氨氧基生物素(株式会社同仁化学研究所(同仁化学研究所)制)至2mM，将该反应混合液稀释至作为修饰对象的核苷酸链达到2μM后，在37℃使其反应1小时。氯化镁是由于需要2价金属阳离子作为TdT的活化因子而添加的。
通过7M尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(《分子克隆(第2版)》11.23页1989年)追踪该核苷酸修饰过程。采用含7M尿素和5％甘油的15％聚丙烯酰胺，缓冲液采用89mM Tris-硼酸、2mM乙二胺四乙酸钠。核苷酸链的检测通过SYBRGold(英杰公司(Invitrogen社)制)染色实施。结果示于图4。
泳道1表示分子量标记(普洛麦格公司(Promega社)制)的电泳图案，泳道2表示未处理的核苷酸链的电泳图案，泳道3表示在37℃反应2小时后的核苷酸链的电泳图案，泳道4表示在100℃进行15分钟的加热处理后的核苷酸链的电泳图案，泳道5表示用生物素进行修饰处理后的核苷酸链的电泳图案。
泳道1的分子量标记包含10nt～100nt(以10nt为间隔，10nt表示核苷酸数10)的核苷酸链，图中的箭头分别表示100nt、80nt、50nt、30nt、20nt和10nt的电泳迁移位置。泳道2中所示的未处理的核苷酸链为25nt。
泳道3中，核苷酸链为27～30nt左右。这表示通过使TdT和UDG共存于反应混合液中，依次进行了dUMP向核苷酸链的加尾反应和所加尾的dUMP的分解反应。
泳道4中，核苷酸链长恢复到25nt。这表示被UDG分解了的dUMP通过加热处理而离解。
泳道5中，与泳道2和泳道4的核苷酸链相比，核苷酸链的迁移率变慢。该结果被解释为因为用生物素直接修饰核苷酸链的5′末端时电泳的迁移率变慢(Chollet A.等，Nucleic Acids Res.13卷1529页1985年等)，所以表示核苷酸链被用生物素修饰。这是因为伴随dUMP的离解，在核苷酸链的3′末端形成醛基，该醛基和氨氧基反应，不需要特别的催化剂，自发地进行交联结合反应，在作为-NH2的一种的氨氧基和醛基之间形成席夫碱，从而核苷酸链的3′末端被直接用生物素修饰。
以上的实施例1中所示的核苷酸链的碱基序列的构成、链长、修饰物质的种类、反应条件、反应组成(缓冲液等)仅仅是本发明的示例，并不局限于这些例子，可以任意地进行改变。
(比较例1)
将2.5μM(最终浓度，下同)核苷酸链、1u/μl TdT、0.2u/μl UDG、1mM dUTP混合的操作与实施例1相同，但预先添加1mM氨氧基生物素，TdT的活化因子采用2mM氯化钴，在0.1M二甲胂酸钾缓冲液(pH7.2)的缓冲下于37℃保持30分钟。
与实施例1同样地通过7M尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳法追踪该核苷酸修饰过程。结果示于图5。
泳道1为与实施例1相同的分子量标记，标记于泳道1旁的箭头分别表示100nt、50nt、30nt、20nt和10nt的电泳迁移位置。
泳道2表示未处理的核苷酸链，泳道3表示实施了修饰处理的核苷酸链。
泳道2和泳道3中所示的核苷酸链间未发现电泳迁移率的差异。这表示泳道3的核苷酸链没有被用生物素修饰，即未发生TdT的加尾反应。
接着，在不加入核苷酸链、附加的核苷酸、酶的情况下，采用氨氧基生物素作为修饰物质，考察与活化因子和缓冲液的组合是否合适。结果示于以下的表2。
[表2]
与氨氧基生物素的不溶性配合物形成
 
氯化钴 氯化镁 氯化锰
(+) (-) (-)
(+)：有沉淀
(-)：无沉淀
作为缓冲液，采用上述的二甲胂酸钾时和采用实施例1中使用的4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氢氧化钾等时，作为活化因子，即使使氯化镁或氯化锰和氨氧基生物素共存，也都不会沉淀，若与氯化钴共存，则都产生褐色的沉淀。这被认为是因为钴离子和氨氧基生物素的氨基反应，形成不溶性的配合物。
该结果意味着，采用钴离子作为活化因子的情况下，在核苷酸链的3′末端形成醛基等官能团后，必须将该核苷酸链通过乙醇沉淀或其它方法与钴离子分离，难以立即进行基于修饰物质的修饰反应。
与之相对，采用镁离子或锰离子的情况下，不会因与具有-NH2的修饰物质反应而产生不溶性的沉淀物。因此，在核苷酸链的3′末端形成醛基等官能团后，可以不进行采用乙醇沉淀等的核苷酸链的回收操作或者采用凝胶过滤等的反应混合液组成的置换操作，在该同一反应混合液中混合修饰物质来立即进行修饰反应。
(比较例2)
除了使用以下所示的含活化因子的各种缓冲液(总量50μl)以外，与实施例1同样地进行操作，使dUMP加尾于核苷酸链上。
缓冲液1：含2mM氯化镁的50mM4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氢氧化钾缓冲液(pH7.2)(以下称为含镁磺酸缓冲液)
缓冲液2：含2mM氯化锰的50mM4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氢氧化钾缓冲液(pH7.2)(以下称为含锰磺酸缓冲液)
缓冲液3：含2mM氯化钴的0.1M二甲胂酸钾缓冲液(pH7.2)(以下称为含钴二甲胂酸钾缓冲液)
与实施例1同样地通过7M尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳法追踪采用各缓冲液的反应混合液的30分钟间隔的经时变化(30分钟、60分钟、90分钟、120分钟)。结果示于图6。
泳道1为与实施例1相同的分子量标记，标记于泳道1旁的箭头分别表示100nt、50nt、30nt、20nt和10nt的电泳迁移位置。泳道2表示未处理的核苷酸链。
泳道3～6分别表示采用含镁磺酸缓冲液时的核苷酸链的经时变化(30分钟、60分钟、90分钟、120分钟)；泳道7～10分别表示采用含锰磺酸缓冲液时的核苷酸链的经时变化(30分钟、60分钟、90分钟、120分钟)；泳道11～14分别表示采用含钴二甲胂酸钾缓冲液时的核苷酸链的经时变化(30分钟、60分钟、90分钟、120分钟)。
如图6所示，dUMP的加尾反应效率在采用含钴二甲胂酸钾缓冲液时最高，采用含锰磺酸缓冲液时次之，采用含镁磺酸缓冲液时最低。一直以来，在TdT的反应中钴离子-二甲胂酸缓冲液的组合显示出最高的反应活性(例如，Bollum F.J.著《酶(The Enzymes)》10卷145页1974年学术出版社(Academic Press))，结果与之一致。
但是，如果是像本发明方法这样以在核苷酸链的3′末端形成醛基等官能团为目的，反而理想的是TdT的反应效率低的方法，因为用于作为后续反应的采用UDG的分解反应的底物量减少。这是为了防止过度附加如dUMP等核苷酸，使分解所附加的核苷酸的后续反应变得容易进行。
因此，从TdT的反应效率、钴离子是使修饰物质沉淀的主要原因以及二甲胂酸本身是砷化合物的角度来看，理想的是避免钴离子-二甲胂酸缓冲液的组合。
因此，使用TdT作为对附加反应进行催化的酶的情况下，其活化因子理想的是使用例如锰离子或镁离子等除钴以外的2价金属阳离子，藉此可以防止修饰物质的沉淀。此外，理想的是使用例如4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸等使TdT的反应活性温和的缓冲剂成分。可以使用2-吗啉代乙磺酸等好的缓冲剂或3，3-二甲基戊二酸等。
这些缓冲剂由于在其化学结构中不具有氨基，因此可以避免由被广泛用作缓冲剂的如2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(通称Tris)等具有-NH2的缓冲剂产生的修饰反应的阻碍。
以上的实施例中，以dUMP的加尾反应为例，示例了对于TdT的酶活化能力并不太好的活化因子和使反应温和地进行的缓冲液成分的组合，但本发明中所用的缓冲液成分和TdT活化因子的组合并不局限于此。在具有表1所示的碱基的2′-脱氧核苷-5′-一磷酸的加尾反应中，可以适当采用加尾反应温和地进行的缓冲液成分和除钴离子以外的TdT活化因子的组合。
此外，通过化学合成或复制反应所获得的核苷酸链有时在其序列中形成天然的核苷酸中所不存在的具有表1所示的碱基的核苷酸。例如，核苷酸链的复制反应中在该核苷酸链的碱基序列中存在大量鸟嘌呤或胞嘧啶的情况下，通过复制反应引入具有鸟嘌呤的核苷酸成为复制效率下降的主要原因，因此利用具有次黄嘌呤来代替鸟嘌呤的核苷酸(例如，Nucleic Acids Res.21卷4427页1993年)。这样通过复制反应所获得的核苷酸链在其序列中存在次黄嘌呤，如果通过本发明的核苷酸链的修饰方法加尾示例的具有次黄嘌呤的核苷酸，则作为修饰对象的核苷酸链也通过后续的分解反应被分解。这样的情况下，适当选择具有除次黄嘌呤以外的碱基的核苷酸来进行加尾反应即可。用于后续的分解反应的DNA糖苷酶或DNA修复酶对具有作为其底物的碱基的核苷酸具有特异性，因此可以避免作为修饰对象的核苷酸链的分解。
产业上利用的可能性
本发明的核苷酸链的修饰方法可以在不受限于核苷酸链的链长且保持核苷酸链原来的状态的情况下，用任意的修饰物质定量、稳定且简便地在短时间内修饰作为修饰对象的核苷酸链的3′末端，所以在需要核苷酸链的标签化、标记化、固定化等的基因分析等中是有用的。
序列表
<110>松下电器产业株式会社(MATSUSHITA ELECTRIC INDUSTRIAL CO.，LTD)
<120>核苷酸链的修饰方法
<130>2892080059
<150>JP2006-156731
<151>2006-06-06
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的寡聚脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<223>人骨骼肌肌球蛋白重链1中的5786～5810位的互补序列
<300>
<308>NM_005963
<309>2004-02-02
<313>(5786)..(5810)
<400>1
Figure A200780020081D00241

Claims (17)

1.核苷酸链的修饰方法，其特征在于，在将作为修饰对象的核苷酸链和具有与构成所述核苷酸链的碱基不同的特定碱基的核苷酸加入到缓冲液而得的反应混合液中，使对所述核苷酸向所述核苷酸链的3′末端的附加进行催化的酶、特异地作用于所述核苷酸的分解酶和修饰所述核苷酸链的所需的修饰物质共存，在将所述核苷酸附加到所述核苷酸链的3′末端的同时，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸链的3′末端形成对于所述修饰物质具有结合能力的官能团，用所述修饰物质直接对形成有所述官能团的核苷酸链的3′末端进行修饰。
2.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，作为活化对附加反应进行催化的酶的活化因子，添加不阻碍修饰物质的修饰反应的活化因子。
3.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，使反应混合液中包含使对附加反应进行催化的酶的反应活性温和的缓冲剂成分。
4.如权利要求2所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，对附加反应进行催化的酶为末端脱氧核苷酸转移酶时，活化因子使用除钴离子以外的2价金属阳离子。
5.如权利要求4所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，活化因子是锰离子或镁离子。
6.如权利要求3所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，对附加反应进行催化的酶为末端脱氧核苷酸转移酶时，作为缓冲剂成分，使用4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-吗啉代乙磺酸或3，3-二甲基戊二酸。
7.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，附加的核苷酸的特定碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶经烷基化、脱氨基化、卤化、羟基化或氧化而得的突变碱基。
8.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，分解酶是DNA糖苷酶或DNA修复酶，由此形成的官能团是醛基。
9.如权利要求7所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，附加的核苷酸为2′-脱氧尿苷-5′-一磷酸时，分解酶使用尿嘧啶DNA糖苷酶。
10.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质具有-NH2。
11.如权利要求1或9中的任一项所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质是对核苷酸链进行标签化、标记化的物质。
12.如权利要求10所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质是荧光性物质、维生素、脂质、氨基酸、寡肽、蛋白质或生物体外源性物质。
13.如权利要求1或9中的任一项所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质是为了使核苷酸链结合于基板而介于其间的物质。
14.如权利要求12所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质是具有氨基和巯基的化合物。
15.如权利要求13所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，修饰物质是具有氨基和通过水解而形成硅烷醇基的烷氧基硅烷基的化合物。
16.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，混合具有任意的碱基序列的核苷酸链、具有特定碱基的核苷酸、对所述核苷酸向所述核苷酸链的3′末端的附加反应进行催化的酶、作为作用于所述核苷酸的DNA糖苷酶或DNA修复酶的分解酶、以及对于通过以所述酶所附加的核苷酸被所述分解酶分解而形成于所述核苷酸链的3′末端的醛基具有结合能力的修饰物质。
17.如权利要求1所述的核苷酸链的修饰方法，其特征在于，在加入有具有任意的碱基序列的核苷酸链的缓冲液中混合2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、末端脱氧核苷酸转移酶及其活化因子和尿嘧啶DNA糖苷酶，对该反应混合液进行加热处理或碱处理后，在该经过处理的反应混合液中混合具有H2N-的修饰物质。
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