CN101450107A - 乌药叶总黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

乌药叶总黄酮提取物及其制备方法和应用属于生物制药技术领域。乌药叶总黄酮提取方法的步骤是：将药材粉碎，加水煎煮提取，滤渣取液，提取液过大孔树脂或聚酰胺柱，乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩后，得到含总黄酮的浸膏。本方法具有简便，成本低，提取得到的总黄酮含量高，适用于工业化生产等特点。乌药叶总黄酮提取物在体内、体外试验中具有显著的抗氧化和保肝活性，可以在制备保健食品或保健药品，以及制备各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的治疗药物中应用。

Description

乌药叶总黄酮提取物及其制备方法和应用

一、技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种从中药材乌药叶中提取总黄酮的方法及其应用。

二、背景技术

乌药Lindera aggregate(Sims)Kosterm.为樟科(Lauraceae)山胡椒属(Lindera)植物，分布于江苏、浙江、台湾、福建、广东等省，以浙江省天台县较为著名，称天台乌药。其干燥块根入药，性温味辛，具有顺气止痛、温肾散寒之功效。但其叶的临床应用及药学研究较少，文献记载乌药叶可用于治疗急性蜂窝组织炎、乳房炎及臀痈，与益胃止痛方配伍可治疗慢性胃炎。有关乌药叶生物活性的现代科学研究较少，其有效成分亦不清楚。尚未见关于乌药叶总黄酮的提取工艺及其活性的报道。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是1、提供一种可大量获得乌药叶中总黄酮的简单易行的可用于工业化生产的总黄酮的提取方法。2、提供利用上述方法获得的乌药叶总黄酮提取物。3、提供该乌药叶总黄酮提取物在制备保健食品或保健药品中的应用以及在制备各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的治疗药物中应用。

本发明的技术方案：

1、本发明所述乌药叶总黄酮提取物为从中药材乌叶中经粉碎、浸泡、煎煮、吸咐、洗脱、挥干得到的总黄酮浸膏，总黄酮含量大于60％。

2、本发明所述乌药叶中总黄酮的提取方法为：

(1)将乌药叶药材粉碎后，加水浸泡后，煎煮提取，滤渣取液。

(2)将步骤(1)中的提取液过大孔树脂或聚酰胺柱，用10％～95％(重量)的乙醇水溶液洗脱，洗脱液挥干溶剂得到总黄酮浸膏。

在步骤(1)中，提取前将药材粉碎成粗粉；所用的提取液水，其用量是所用药材的10～100倍(重量)，优选25～40倍；药材的浸泡时间是1～24小时，优选1-6小时；煎煮提取1～10次，优选1-5次，每次0.2～2小时。

在步骤(2)中，所用的吸附树脂是聚酰胺或各种型号的大孔吸附树脂；洗脱液浓度10％～95％(重量)的乙醇水溶液，优选50％～80％乙醇水溶液，最优选60％乙醇水溶液。

3、本发明与现有技术相比，其有益效果是：采用本发明的乌药叶中总黄酮提取物的提取方法，无论在提取率、总黄酮的含量、提取工艺的简便性、提取成本等各方面均具有明显的优势，适用于工业化生产。提取物可以在制备保健食品或保健药品，以及制备各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的治疗药物中应用。

四、附图说明

图1 LA-flavone在化学模拟体系中的总抗氧化能力和清除超氧阴离子自由基的能力(x±s，n＝3)

图2 RT-PCR分析CCl₄肝损伤小鼠肝组织中thioredoxin，heme oxygenase-1和peroxiredoxin-1的表达

五、具体实施方式

下面是本发明的实施例，但本发明不仅限于所述实施例。

实施例1：将乌药叶药材粉碎成粗粉，用药材重量40倍的水煎煮提取3次，每次0.5小时，过滤，冷却，合并提取液。提取液过LSA-10大孔树脂(西安蓝深生产)柱，用60％乙醇洗脱，洗脱液挥去溶剂后蒸干。得乌药叶总黄酮浸膏，含量为91％。

实施例2：将乌药叶药材粉碎成粗粉，用药材重量25倍的水煎煮提取2次，每次1小时，过滤，冷却，合并提取液。提取液过聚酰胺柱，用70％乙醇洗脱，洗脱液挥去溶剂后蒸干。得乌药叶总黄酮浸膏，含量为86％。

综上所述，本发明的乌药叶中总黄酮的提取方法，能有效地从乌药叶中提取得到总黄酮，提取物中总黄酮含量高于60％，而且工艺简单可行，成本低，适用于工业化生产。

如上描述了本发明所公开的乌药叶中总黄酮的提取方法，但需理解其中包含了本领域技术人员所理解的变化和改变，这些变化和改变也包含在权利要求所限定的本发明的范围内。

实施例3：用上述实施例1的提取方法得到的乌药叶总黄酮提取物进行药理活性试验，药理结果与分析，以证明乌药叶总黄酮提取物在制备保健食品或保健药品，以及制备各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的治疗药物中应用。

1、乌药叶总黄酮提取物的药理试验

(1)化学模拟体系中总抗氧化能力及抗超氧阴离子自由基活力单位的测定

以75％乙醇为阴性对照，槲皮素(quercetin)作为阳性药，将槲皮素及乌药叶总黄酮分别溶于75％乙醇中，制成一定浓度梯度的样品液，分别为：槲皮素：10^-10g/ml、10^-9g/ml、10^-8g/ml；乌药叶总黄酮：10^-10g/ml、5×10^-10g/ml、10^-9g/ml、5×10^-9g/ml、10^-8g/ml、5×10^-8g/ml、10^-7g/ml。

按照总抗氧化能力(TAOC)测定试剂盒说明书，测定反应体系A520，并计算总抗氧化能力单位(在37℃时，每分钟每毫升样品液使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位)。

按照抗超氧阴离子自由基测试盒说明书，测定反应体系中A550，并计算抗超氧阴离子自由基活力单位(在反应体系中，每升样品液在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg的维生素C所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位)。

(2)对小鼠CCl₄急性肝损伤的影响

取小鼠60只，随机分成6组：I组为正常对照组(空白组)，II组为肝损伤对照组，分别给予生理盐水20ml/kg，III组为阳性对照组，给予50mg/kg槲皮素(蒸馏水溶解，超声助溶)，IV、V和VI组分别为乌药叶总黄酮低、中、高剂量治疗组，分别给予50、100和200mg/kg乌药叶总黄酮(蒸馏水溶解，超声助溶)。上述各组每天灌胃1次，连续7d，每次给药前称重，末次给药2h后，II-VI组按5ml/kg腹腔注射体积分数为6％的CCl₄橄榄油溶液1次，禁食不禁水18h，摘眼球取血后断颈处死小鼠，离心得血清，准备检测各指标ALT、AST、TAOC、SOD、MDA，按试剂盒说明书进行检测。取肝右叶组织，提取总RNA，RT-PCR检测抗氧化相关基因的表达。引物合成：根据GenBank登录的小鼠thioredoxin(抗细菌硫氧还原蛋白)，heme oxygenase-1(血红素加氧酶-1)，peroxiredoxin-1(过氧化物酶-1)基因以及β-actin基因的全长cDNA序列，通过Primer Premier 5.0软件设计，并经GenBank BLAST进行同源性检索后，由上海英骏生物技术有限公司上海合成部合成。序列如下：thioredoxin，F：5’-GCACGGGAAGGTGGTCAT-3’，R：5’-GCTGGTCCTCGTCCTTGATC-3’，在409-557位点，预计扩增片段长度149bp；heme oxygenase-1，F：5’-TCACAGATGGCGTCACTT-3’，R：5’-GAGGACCCACTGGAGGA-3’，在819-947位点，预计扩增片段长度129bp；peroxiredoxin，F：5’-ATCCTCCTTGTTTCTTGG-3’，R：5’-TTTACCCTCTTGACTTTACT-3’，在201-362位点，预计扩增片段长度162bp；β-actin，F：5’-CGACAGGATGCAGAAGGAGA-3’，R：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3’，在1010-1164位点，预计扩增片段长度155bp。从小鼠肝右叶剪取约0.1g肝组织加入1ml Trizol试剂，提取组织总RNA，测定A260/A280比值在1.8-2.0之间，说明RNA样品纯度理想。采用逆转录试剂盒合成cDNA，分别取cDNA模板1μl，PCR扩增thioredoxin，heme oxygenase-1，peroxiredoxin-1，β-actin基因。Thioredoxin，heme oxygenase-1，β-actin基因扩增设定反应程序如下：94℃，5min→[94℃，30s→56℃，30s→72℃，30s](循环30次)→72℃，10min；peroxiredoxin-1基因扩增设定PCR反应程序如下：94℃，5min→[94℃，30s→52℃，30s→72℃，30s](循环30次)→72℃，10min。PCR反应结束后取20μl反应液于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，EB染色，紫外拍摄观察电泳条带。

2、乌药叶总黄酮提取物的药理结果与分析

(1)化学模拟体系中乌药叶总黄酮的总抗氧化能力和抗超氧阴离子自由基活力乌药叶总黄酮与槲皮素进行对照研究，两者在浓度梯度范围内均随浓度的升高表现出增强的抗氧化能力和抗超氧阴离子自由基能力。从图1A中可看出，在低浓度下，随着浓度的增加，乌药叶总黄酮的总抗氧化能力呈微弱的增强趋势，当乌药叶总黄酮浓度达5×10^-8g/ml时，总抗氧化能力表现明显增强。图1B表明，乌药叶总黄酮抗超氧阴离子自由基能力的剂量依赖性较强，随着浓度的增加呈现出明显的上升趋势。

(2)对CCl₄致化学性肝损伤小鼠血清ALT，AST的影响

乌药叶总黄酮对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT，AST的影响，见表1。小鼠腹腔注射CCl₄诱导后18h，模型对照组小鼠血清中ALT和AST水平显著高于正常对照组。与模型对照组相比，乌药叶总黄酮各剂量组与槲皮素阳性对照组血清中ALT和AST显著降低，并呈现一定的剂量依赖关系。

(3)对CCl₄致化学性肝损伤小鼠血清TAOC，SOD，MDA的影响

小鼠腹腔注射CCl₄诱导后18h，模型对照组小鼠血清的TAOC和SOD活性显著低于正常对照组，MDA含量显著高于正常对照组水平。乌药叶总黄酮各剂量组与槲皮素阳性对照组可显著升高血清TAOC和SOD活性，并使肝脏中MDA水平显著降低(表2)。

(4)调节抗氧化相关基因的表达

由图2可见，与正常对照组相比，CCl₄处理后，小鼠肝组织中的thioredoxin，heme oxygenase-1，peroxiredoxin-1表达水平下降，乌药叶总黄酮可增强受损肝组织中thioredoxin，heme oxygenase-1和peroxiredoxin-1的表达，并呈现出一定的剂量相关性。

(5)讨论

CCl₄是常用的化学性肝损伤诱导剂，通过细胞色素P450起作用，在肝细胞内形成活性的三氯甲基基团(CCl₃ ⁺)，在有氧条件下进一步形成高度活性的三氯甲基过氧化自由基(CCl₃O₂)，诱发脂质过氧化从而损害肝细胞的细胞膜，使内源性转氨酶释放到细胞外，导致血清中的转氨酶活性显著升高，并导致细胞因子和氧自由基的释放；同时，激活Kupffer细胞及中性粒细胞，影响肝细胞的DNA合成和分裂，引起急性肝损伤。该模型是体内检测药物抗氧化作用的一种常用方法。

我们的研究表明，乌药叶总黄酮可明显降低CCl₄肝损伤小鼠血清转氨酶活性和脂质过氧化中间产物MDA的产生，并显著增强TAOC水平和SOD活性，说明乌药叶总黄酮能通过清除自由基，抑制脂质过氧化而在体内起到抗氧化作用。此外我们还发现，乌药叶总黄酮在化学模拟体系内，具有较强的还原能力，能清除化学反应诱导的活性氧，说明乌药叶总黄酮可以通过自身的还原性保护生物体内的其他还原性成分而发挥抗氧化作用。

为了进一步研究乌药叶总黄酮的抗氧化机制，我们选择了三种抗氧化相关基因thioredoxin，heme oxygenase-1，peroxiredoxin-1，进行mRNA表达量的考察。在细胞内的氧化还原调节系统中，thioredoxin，heme oxygenase-1，peroxiredoxin-1都是应对氧化压力的抗氧化蛋白。Thioredoxin是一种普遍存在的蛋白，已被证实能在peroxiredoxin的配合下清除单线态氧，羟自由基和过氧化氢。细胞在压力情况下将血红素催化生成胆红素及一氧化碳的过程中，heme oxygenase-1是必需的。peroxiredoxin-1是巯基特异性的抗氧化剂，它与血红素的结合后，活性被抑制。研究表明，heme oxygenase-1和peroxiredoxin-1共存能确保对方的抗氧化活性。在我们的实验中，乌药叶总黄酮能显著提高CCl₄降低的thioredoxin，hemeoxygenase-1，peroxiredoxin-1的mRNA的表达，这表明增强内源性的抗氧化酶活性是乌药叶总黄酮抗氧化作用的机制之一。

综上，乌药叶总黄酮能通过清除自由基，抑制脂质过氧化产生抗氧化作用，从而保护CCl₄所致小鼠急性肝损伤，其机制与调节抗氧化相关基因的表达有关。这些结果提示，该总黄酮提取物可在制备保健食品或保健药品，以及制备各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的治疗药物中应用。

表1 LA-flavone对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST的影响(x±s，n＝10)

^*p<0.05vs CCl₄；^**p<0.01vs CCl₄

表2 LA-flavone对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠血清中总抗氧化能力(TAOC)，SOD，MDA的影响(x±s，n＝10)

7.4±1.9^**

^*p<0.05vs CCl₄；^**p<0.01vs CCl₄。

Claims (4)

1、一种乌药叶总黄酮提取物，其特征是从中药材乌叶中经粉碎、浸泡、煎煮、吸咐、洗脱、挥干得到的总黄酮浸膏，总黄酮含量大于60％。

2、根据权利要求1所述的总黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法包含以下步骤：

(1)将乌药叶药材粉碎成粗粉，加水浸泡，所用的提取液水的用量是所用药材的重量的10-100倍，浸泡时间是1-24小时，煎煮提取1-10次，每次0.2-2小时，过滤、冷却、合并提取液；

(2)将步骤(1)中的提取液过大孔树脂或聚酰胺柱，用10％～95％(重量)的乙醇水溶液洗脱，洗脱液挥干去溶剂后蒸干得到乌药叶总黄酮浸膏。

3、权利要求1所述乌药叶总黄酮提取物在制备保健食品或保健药品中的应用。

4、权利要求1所述乌药叶总黄酮提取物在制备治疗各种急慢性病毒性肝炎、化学性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎的药物中的应用。

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