CN105193935A - 一种乌药叶提取物的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乌药叶提取物的制备方法及其用途，所述制备方法包括以下步骤：(1)选取乌药叶药材，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，浓缩，浓缩液采用大孔树脂吸附和乙醇洗脱，洗脱液浓缩，干燥，得中间体；(2)中间体用pH6-7溶液溶解，上聚酰胺树脂柱进行吸附和乙醇洗脱，洗脱液浓缩，干燥，即得。所述乌药叶提取物中含有槲皮苷，含量大于50％，并同时含有槲皮素-3-葡萄糖-(1-2)-鼠李糖苷和山奈酚-3-鼠李糖苷。本发明所述乌药叶提取物制备工艺路线经济合理、质量可控性强，容易实现工业化生产。所述乌药叶提取物具有优良抗氧化作用，可应用于制备相关功效的药品或保健食品。

Description

一种乌药叶提取物的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种乌药叶提取物，本发明同时涉及该提取物的制备方法及其在抗氧化功效方面的应用，属保健食品与生物医药领域。

技术背景

乌药是樟科山胡椒属植物，以块根入药，具有行气止痛，温肾散寒的功效，用于治疗寒凝气滞，胸腹胀痛，气逆喘急，膀胱虚冷，遗尿尿频，疝气疼痛，经寒腹痛等症。乌药以浙江省天台县所产为道地药材，又称天台乌药、台乌药。此外，乌药嫩叶也可作为茶饮，具有防治心脑血管疾病的效果，近年来已批准作为新资源食品、新食品原料使用。

乌药叶主要含有黄酮类、倍半萜内酯类、单糖苷类、挥发油类等成分。发明人对乌药叶进行了长期研发，从乌药叶中分离鉴定了多种化学成分(罗镭等，乌药叶化学成分的研究，中草药，2009，40：856-858)，并发现乌药叶总黄酮具有抗氧化、扩张血管、降低血清胆固醇、增加冠脉流量、抗心率失常等多种作用(张琳等，治疗心脑血管疾病的中药提取物的制备方法及其用途，专利号ZL200710070623.6)，但其药效物质有待阐释。在近期研究中，进一步发现乌药叶精制总黄酮是其主要有效物质，作为一种新资源食品提取物具有开发利用潜力，因而对其提取物的制备工艺进行深入研究，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺和质量可控的乌药叶提取物。

本发明提供的乌药叶提取物制备方法包括以下工艺步骤：

(1)选取乌药叶药材，采用水或乙醇-水混合溶媒进行提取，浓缩，浓缩液采用大孔树脂吸附，先用水或10-20％乙醇洗脱，再用40-75％乙醇洗脱，收集40-75％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得中间体；

(2)取由(1)所得中间体，用pH6-7溶液溶解，上聚酰胺树脂柱进行吸附，先用水或10-20％乙醇洗脱，再用40-80％乙醇洗脱，收集40-80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。

所述工艺步骤(1)可参考徐婵娟(乌药叶乙醇提取物体外抗氧化及槲皮苷纯化工艺的研究，浙江大学硕士学位论文，2015)等已公开文献方法进行。所述提取溶媒可采用常规的水或乙醇-水混合溶媒提取，其中优选50-70％乙醇混合溶媒提取。所述吸附剂优选非极性或弱极性大孔树脂，洗脱时先用水洗或10-20％乙醇洗脱除去杂质后，再用40-75％乙醇洗脱，其中优选采用60-80％乙醇进行洗脱。

所述工艺步骤(2)中，所述吸附剂选用聚酰胺，洗脱时先用水或10-20％乙醇洗脱除去杂质后，再用40-80％乙醇洗脱，其中优选采用50-70％乙醇进行洗脱。所述乌药叶提取物中，主要含有槲皮苷(1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1-2)-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(3)等黄酮类成分，其中槲皮苷的含量大于50％，化合物2、3的含量均大于5％。

本发明同时对所述乌药叶提取物(WYE)的体内外抗氧化作用进行了考察。实验结果证明，WYE(125-500μM)可以显著保护人脐静脉内皮细胞株免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤；WYE注射给药(4-16mg/kg)对老龄大鼠具有显著体内抗氧化作用；WYE起效的主要机制在于增加抗氧化酶SOD和GSH的含量。结果表明所述乌药叶提取物具有优良的抗氧化作用，因而可以应用于具有抗氧化功能的相关药物或保健食品中。

本发明内容通过大量实验研究和工艺优化分析完成，并对提取物中主要活性成分进行了定量分析。所述乌药叶提取物具有有效成分含量高、制备工艺容易产业化、产品质量可控等显著优势。以下述具体实施例进行说明。

附图说明

附图为实施例1中乌药叶提取物的液相色谱图。图中，色谱峰1-3依次为槲皮苷(1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1-2)-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(3)。

具体实施方式

本发明所述的乌药叶提取物是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1：乌药叶提取物的制备

乌药叶于2012年采自浙江天台山(批次CC20120801)，经鉴定为乌药(CynanchumchinenseR.Br.)干燥叶。乌药叶提取物的制备：

(1)称取10kg乌药叶药材，加入20倍量70％乙醇回流提取2次，每次提取时间2h，提取液合并减压浓缩至40L，上AB-8型大孔树脂(柱体积20L/BV)，依次用5BV水、3BV60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得中间体420g(槲皮苷含量6.8％)；

(2)取(1)所得中间体20g，上聚酰胺树脂(100～200目，柱体积120mL/BV)柱，依次用4BV水、3BV20％乙醇、3BV50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得乌药叶提取物(WYE)1.86g。

乌药叶提取物中主成分测定：采用Agilent1260InfinitySeries高效液相色谱仪；DAD检测器，检测波长320nm；色谱柱为CosmosilAR-II-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流速1mL·min^-1，柱温35℃。流动相为0.5％磷酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～25min，25％B→60％B；25～30min，60％B→95％B；30～40min，95％B)。WYE的HPLC色谱图参见附图。

经与槲皮苷等对照品及文献(徐婵娟，乌药叶乙醇提取物体外抗氧化及槲皮苷纯化工艺的研究，浙江大学硕士学位论文，2015)比较，确定WYE样品中主要成分为槲皮苷(1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1-2)-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(3)；主成分1-3的含量按槲皮苷计，依次为69.1％、7.15％、11.5％。

实施例2：乌药叶提取物的制备

乌药叶提取物的制备：

(1)同实施例1；

(2)取(1)所得中间体20g，上聚酰胺树脂(100～200目，柱体积120mL/BV)柱，依次用5BV水、3BV乙醇(70％)洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得乌药叶提取物2.32g。经HPLC分析，乌药叶提取物样品中主要成分1-3的含量按槲皮苷计，依次为54.3％、5.65％、9.58％。

实验例1：乌药叶提取物的体外抗氧化作用考察

将人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)以30000个/孔接种于96孔板中，实验分正常对照组和不同浓度乌药叶提取物(WYE，取自实施例1)组，每组复6孔，接种16小时后，给药组换加含有H₂O₂和不同浓度WYE的无血清培养基200μL/孔，使H₂O₂终浓度为1.5mM，WYE终浓度为0、62.5、125、250、500μM，继续孵育3h，收集各组细胞培养液，检测培养液中SOD和GSH含量；在96孔板种加入无血清培养基，MTT法检测细胞活率。实验重复三次，用SPSS17.0软件对实验数据进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。实验结果如下表。

表1乌药叶提取物对HUVEC氧化损伤的保护作用(均数±标准差)

注：**P＜0.05，***P＜0.01与模型组相比

结果表明：WYE(125-500μM)同时给药可以显著保护HUVEC免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤，主要机制在于增加SOD和GSH抗氧化酶的含量。

实验例2：乌药叶提取物的体内抗氧化作用考察

取老龄SD雄性大鼠(18周龄)50只，分为灯盏花素注射液(4.0mg/kg)、空白对照组、取自实施例1的WYE给药组(低、中、高分别为4、8、16mg/kg)，尾静脉注射连续给药14天，14天后禁食不禁水12小时，眼眶取血，分离血清，检测血清中的SOD、GSH和MDA含量。

表2乌药叶提取物对SD雄性大鼠的体内抗氧化保护作用(均数±标准差)

注：**P＜0.05，***P＜0.01与模型组相比。

结果表明：WYE注射给药(1-16mg/kg)对老龄雄性大鼠具有显著体内抗氧化作用。

Claims (6)

1.一种乌药叶提取物，特征在于所述乌药叶提取物由以下步骤制备获得：

(1)选取乌药叶药材，采用水或乙醇-水混合溶媒进行提取，浓缩，浓缩液采用大孔树脂吸附，先用水或10-20％乙醇洗脱，再用40-75％乙醇洗脱，收集40-75％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得中间体；

(2)取由(1)所得中间体，用pH6-7溶液溶解，上聚酰胺树脂柱进行吸附，先用水或10-20％乙醇洗脱，再用40-80％乙醇洗脱，收集40-80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。

2.根据权利要求1的乌药叶提取物，特征在于所述乌药叶提取物中含有槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1-2)-α-L-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，其中槲皮苷含量大于50％。

3.根据权利要求2的乌药叶提取物，特征在于所述乌药叶提取物中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-(1-2)-α-L-鼠李糖苷含量大于5％。

4.根据权利要求2的乌药叶提取物，特征在于所述乌药叶提取物中山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷含量大于5％。

5.根据权利要求1的乌药叶提取物，特征在于所述步骤(2)中采用50-70％乙醇洗脱。

6.根据权利要求1的乌药叶提取物及其组合物在制备药品或保健食品中的应用，特征在于所述乌药叶提取物具有抗氧化作用。