CN101440358A - 防止无血清微载体细胞聚集的培养物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种防止无血清微载体细胞聚集的培养物，包括微载体或含微载体的培养基，其特征在于在微载体上包覆水解胶原蛋白，在按常规时配入常规细胞培养基，或者在含微载体的培养基中直接加入水解胶原蛋白。使用本发明的培养物在微载体培养哺乳动物细胞的过程中，具有下列优点：①在无血清和无蛋白培养条件下，能防止Ctodex1等微载体的聚集，促进细胞的贴壁、伸展和生长。②扩大了在无血清培养下微载体的品种使用范围，可以使用价格低廉的微载体培养细胞，达到科研及生产的要求。③降低生产成本，使微载体无血清或无蛋白大规模培养哺乳动物细胞应用于以细胞为基质的疫苗生产及其它生物制品的生产中。④在低血清及正常血清微载体培养细胞过程中，添加此成分可防止微载体弱聚集，促进细胞贴壁生长。

Description

防止无血清微载体细胞聚集的培养物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养物，尤其是一种能够有效防止无血清微载体细胞培养过程中，微载体易通过细胞连接出现聚集的培养物，属于生物制品技术领域。

背景技术

培养哺乳动物细胞对生产生物制品如：疫苗、酶、激素、抗体是十分重要的。大多数动物细胞是贴壁依赖性细胞，需要贴壁后才能生长和增殖。传统的培养贴壁依赖性细胞是在培养皿或转瓶中进行的。随着病毒疫苗及基因工程蛋白等生物制品需求量的增加，发展新的系统并更大规模的培养细胞已成为一种必然。自从1967年Van Wezel发明微载体以来，用微载体培养细胞的技术不断取得进步，每毫升可培养出上亿个细胞。

微载体培养细胞相比其他大规模培养细胞方法具有很多优点：1.微载体可提供较大的比表面积，通过改变微载体的使用浓度来提高单位体积培养细胞的数量，以此来获得细胞基质产品的高产量。2.细胞增殖与传代可以只在一个高产容器内进行，而不是多个低产容器，以充分利用培养基，达到节约培养基的目的。3.容易操作及控制多个细胞培养条件，如：pH、PO2、pCO2等。4.取样操作简单易行。5.因为微载体颗粒容易沉降，所以收获细胞和下游产品的纯化操作容易进行。6.微载体培养细胞可选择不同的规模，容易放大培养规模。

用微载体大规模培养细胞虽有如此多的优点，但仍存在下列问题：1.在无血清条件下，微载体颗粒聚集成团现象较为严重，甚至影响了细胞的贴壁和生长；2.在低血清条件下，细胞在微载体上的贴壁及生长状况并不理想；3.在无血清条件下，市场上可供选用的微载体数目有限，而且价格大都比较昂贵。

在哺乳动物细胞培养中，培养基(液)是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。随着细胞培养技术发展和应用范围的扩大，对各种培养液的要求也越来越严格。现在大多数人工和合成培养基需要加入不同浓度的血清才能培养细胞。血清除了提供细胞生长的营养条件外，还能促进细胞DNA的合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子。但由于血清成分非常复杂，对一些要求较高的基础性研究的结果影响较大。同时血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制性物质，对细胞有去分化作用，影响细胞某些功能的表达。尤其是血清中可能带有外源因子，如疯牛病病毒等。在以细胞为基质生产疫苗的过程中，血清中的某些成分会严重影响病毒感染细胞的效果，如流感病毒、甲肝病毒等。因而，很多培养研究工作者都在研制、寻求不含血清的无血清或无蛋白的培养液。目前已商品化的无血清培养液有Sigma公司的MCDB131，它可用于培养内皮细胞，还有Biofluids公司的LHC-9，主要用于培养器官上皮细胞等。

无血清和无蛋白微载体培养细胞则综合了微载体培养细胞和无血清培养细胞两者的优点，表现出极大优势，但实际操作过程中仍存在下列问题：①无血清条件下接种细胞后，微载体易通过细胞连接出现聚集成团的现象，一旦聚集成团将影响细胞在微载体上的均匀贴壁。②接种细胞时，一部分贴壁于微载体上的细胞不能及时伸展而凋亡。③在无血清条件下，微载体的聚集成团会严重影响细胞的贴壁和生长。如；在用无血清微载体培养Vero细胞时，Cytodex 1、Cytodex 2等都会不同程度的聚集成团。

在微载体培养过程中，为改善细胞的贴壁性能以及促进细胞的生长，可采用下列途径；用胶原或明胶来包覆微载体，如Cytodex 3，但价格昂贵，而且细胞贴壁也不理想，还会产生弱的载体聚集。

用胶原包覆微载体后能显著改善细胞的贴壁和生长，而且细胞容易从微载体上用酶消化下来。目前几种胶原包覆的微载体已商品化，如：SoloHillm胶原包被微载体和法玛西亚的Cytodex 3。专利“胶原包覆载体的制备工艺”(US 4,994,388)，应用胶原包裹核心球粒(微载体半成品)经过了两个步骤：包裹和固定，即核心球粒先悬浮在酸性胶原溶液(0.01-0.1N醋酸)中，再使溶液蒸发干燥。干燥的、胶原包裹的核心球粒再悬浮在含蛋白交联剂(如戊二醛)的溶液中，使得胶原交联固定。在此专利中应用的是胶原或变性胶原，它是三条α-肽链组成的三螺旋结构，且不溶于水，只有在酸性环境中才能溶解。

应用明胶包覆微载体亦能显著改善细胞的贴壁和生长。在专利“包覆细胞培养基质的工艺”(Pub.No：WO/2004/056976)中，明胶包覆过程跟上述US 4,994,388专利相似。此专利中的明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，分子量范围是约40kDa至200kDa单肽链。

发明内容

为克服现有技术的无血清培养细胞过程中微载体易成团，从而影响细胞贴壁生长的不足，本发明提供一种能防止无血清微载体细胞聚集的培养物。

本发明的难点在于：

A、解决水解胶原蛋白包覆在微载体上的问题。

B、如何在浩瀚无比的化合物中寻找出对细胞生长既无毒性，又能有效预防细胞培养过程中的微载体聚集成团，而且能促进细胞贴壁生长的一种化合物。

C、解决如何应用水解胶原蛋白的问题：一是包覆在微载体上后使用；二是直接加入到培养基中使用。

本发明通过下列技术方案实现：一种防止无血清微载体细胞聚集的培养物，包括微载体或含微载体的培养基，其特征在于：

A、将微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为1～20％的水解胶原蛋白溶液中3～6小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

B、将A步骤所得水解胶原蛋白微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为0.5～5％的蛋白交联剂溶液中，1～4小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，干燥后得包覆有水解胶原蛋白的微载体，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物；或者

C、将水化膨胀后的微载体Cytodex1，按50-100ml/g的量，放入质量浓度为1～2‰的水解胶原蛋白溶液中，浸泡至少4小时，得包覆有水解胶原蛋白的微载体，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物；或者

D、在含有浓度为1-5g/L的微载体Cytodex1培养基中，按1～2‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，即得培养物。

所述B步骤的蛋白交联剂为戊二醛、羟甲基磷化氢、碳化二亚胺和PFP-ester中的一种或几种。

所述水解胶原蛋白采用分子量为400Da～19kDa的水解胶原蛋白，是小分子单肽链，且易溶于水。

所述微载体为市购的Cytodex1、Cytodex2或Cytodex3。

所述培养物通过下列具体步骤得到：

(1)将微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为1～20％的水解胶原蛋白溶液中3～6小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

(2)将(1)步骤所得水解胶原蛋白微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为0.5～5％的蛋白交联剂溶液中1～4小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，得水解胶原蛋白包裹的微载体；

(3)将上述(2)步骤的水解胶原蛋白包裹的微载体加热至80～100℃，直至水解胶原蛋白包裹的微载体干燥，临用前用磷酸盐缓冲夜(PBS)反复洗涤微载体，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物。

所述培养物还通过下列具体步骤得到：

(1)将干燥的微载体，按50-100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下至少浸泡3小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，余下的微载体按30-50ml/g的量，用新鲜的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS换洗1～3次，在0.05～0.1MPa，15～20min，，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按50-100ml/g的量，放入在36.5～37.5℃温度下预热的培养基即：含有质量浓度为1～2‰的水解胶原蛋白的培养基中，浸泡至少4个小时，并每隔15～20分钟晃动一次，之后待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，按常规量配入常规细胞培养基后即得培养物，备用。

所述培养物也可通过下列具体步骤得到：

(1)将干燥微载体按50-100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下至少浸泡3小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余的微载体按30-50ml/g的量，用新鲜无钙镁离子磷酸盐缓冲液PBS换洗1～3次，在0.05～0.1MPa，15～20min，条件下，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按20-50ml/g的量，放入在36.5～37.5℃温度下预热的培养基中漂洗，待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，备用；

(3)将经过上述(2)步骤处理的微载体，按1-5g/L的量配入常规的细胞培养基中，再按1～2‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，得培养，备用。

用本发明提供的培养物培养细胞时，其接种细胞浓度为5×10⁴～2×10⁵个/ml。

本发明水解胶原蛋白的用量为；每克微载体Cytodex1用的水解胶原蛋白固体粉末的有效量为0.1～2克，水解胶原蛋白用量减少，则贴壁及生长效果不明显；水解胶原蛋白用量过多，则会影响渗透压，对细胞生长不利。用微载体Cytodex3时，因其已用胶原包被，具有比较优良的促细胞贴壁性能，所以加入少量水解胶原蛋白，即每克微载体加入0.05g水解胶原蛋白，即会显著改善微载体的成团现象。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述方案，即在无血清微载体细胞培养基中，加入包覆有水解胶原蛋白的微载体，或者在微载体细胞培养基中，直接加入水解胶原蛋白后，避免了无血清或无蛋白微载体培养哺乳动物细胞过程中的微载体成团现象，最大限度地降低了因微载体成团对细胞生长造成的影响，使细胞可以更好的贴壁生长，且贴壁及生长状况良好，细胞密度可达5×10⁶个/ml，适用于大规模细胞培养，同时可选择价格低廉、种类多的微载体，较大程度地降低了生产成本，具有节能、降耗、增效等优点。

在用微载体Cytodex 1无血清培养Vero细胞时，当不采用本发明提供的培养物及制备方法时，微载体成团现象严重，细胞贴壁状态差，1天后未贴壁细胞坏死，2天后已贴壁细胞大多脱落坏死。而当采用本发明提供的培养物及制备方法时，细胞的贴壁状态与生长状态可以达到有血清Cytodex 1培养条件的效果。

本发明的水解胶原蛋白有比较宽的分子量范围，小的可为分子多肽400Da，大的可与明胶相仿20kDa。实验中应用小至2000Da水解胶原蛋白，大至5000Da水解胶原蛋白都取得了明显的无血清微载体细胞培养效果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

(1)将微载体按10g/L的量，悬浮在质量浓度为2％的水解胶原蛋白溶液中3小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

(2)将(1)步骤所得水解胶原蛋白微载体按10g/L的量，悬浮在质量浓度为0.5％的蛋白交联剂溶液中4小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，得水解胶原蛋白包裹的微载体；

(3)将上述(2)步骤的水解胶原蛋白包裹的微载体加热至80～100℃，直至水解胶原蛋白包裹的微载体干燥，使用时用PBS反复洗涤微载体，再干燥后，按3g/L量配入到无血清培养基中，即得培养物；

(4)按接种细胞浓度为5×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集。

实施例2

(1)将微载体按40g/L的量，悬浮在质量浓度为20％的水解胶原蛋白溶液中3小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

(2)将(1)步骤所得水解胶原蛋白微载体按40g/L的量，悬浮在质量浓度为5％的蛋白交联剂溶液中1小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，得水解胶原蛋白包裹的微载体；

(3)将上述(2)步骤的水解胶原蛋白包裹的微载体加热至80～100℃，直至水解胶原蛋白包裹的微载体干燥，使用时用PBS反复洗涤微载体，再干燥后，按5g/L量配入到无血清培养基中，即得培养物；

(4)按接种细胞浓度为2×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集。

实施例3

(1)将干燥的微载体，按50ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温下浸泡4小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，余下的微载体按50ml/g的量，用新鲜的无钙镁离子的PBS换洗2次，在0.05MPa，15min，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按50ml/g的量，放入在36.5℃温度下预热的培养基即：含有质量浓度为1‰的水解胶原蛋白的培养基中，浸泡至少4个小时，并每隔20分钟晃动一次，之后待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，按3g/升量配入到无血清培养基中，备用；

(4)按接种细胞浓度为5×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集，细胞密度可达到5×10⁶个/ml。

实施例4

(1)将干燥的微载体，按100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下浸泡3小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，余下的微载体按50ml/g的量，用新鲜的无钙镁离子的PBS换洗2次，在0.1MPa，20min，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按50-100ml/g的量，放入在37.5℃温度下预热的培养基即：含有质量浓度为2‰的水解胶原蛋白的培养基中，浸泡至少4个小时，并每隔15分钟晃动一次，之后待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，按5g/升量配入到无血清培养基中，即得培养物，备用；

(3)按接种细胞浓度为3×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集，细胞密度可达到4×10⁶个/ml。

实施例5

(1)将干燥微载体按50ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下浸泡3～4小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余的微载体按30ml/g的量，用新鲜无钙镁离子PBS换洗3次，在0.08MPa，180min，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按20ml/g的量，放入在36.5℃温度下预热的培养基中漂洗，待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，备用；

(3)将经过上述(2)步骤处理的微载体，按1g/L的量配入常规的细胞培养基中，再按1‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，得培养，备用；

(4)按接种细胞浓度为5×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集，细胞密度可达到2×10⁶个/ml。

实施例6

(1)将干燥微载体按100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的液PBS中，室温下浸泡5小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余的微载体按50ml/g的量，用新鲜无钙镁离子磷酸盐缓冲液PBS换洗3次，在0.08MPa，17min，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按50ml/g的量，放入在37.5℃温度下预热的培养基中漂洗，待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，备用；

(3)将经过上述(2)步骤处理的微载体，按5g/L的量配入常规的细胞培养基中，再按2‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，得培养，备用；

(4)按接种细胞浓度为2×10⁵个/ml的量，在上述培养物中接种细胞后，即可培养细胞，培养过程中不会造成微载体的聚集，细胞密度可达到4×10⁶个/ml。

实施例7

搅拌瓶无血清培养Vero细胞

第一步：微载体的准备

称取0.3克干燥微载体Cytodex1浸泡在30ml无钙镁离子的PBS中充分膨胀、水化，室温下至少3小时。倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余微载体换洗15ml新鲜无钙镁离子PBS，继续用15ml新鲜无钙镁离子的PBS，换掉旧PBS，后以115℃，15min条件高压蒸汽灭菌消毒。

用之前，待水化好的微载体沉降后，轻轻倒掉上清。用15ml暖培养基漂洗一下微载体。待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到100ml搅拌瓶中备用。

第二步：细胞培养

接上步，搅拌瓶中的0.3克微载体浸泡于40ml无血清培养基(来源于SAFC，其中再添加1‰胶原蛋白)中。种入10⁷个Vero细胞，轻轻混匀(37℃)。细胞贴壁吸附过程以30转/分钟的速度搅拌。2小时后，将细胞培养体积扩大到100ml，搅拌速度改为40转/分钟，正常培养细胞。每隔两天换一次培养基。

细胞吸附过程中微载体有聚集成团现象，1.5小时后聚集现象消失，微载体呈现单颗粒分散状态，此时取样观察知绝大部分细胞已贴附于微载体上。在细胞的培养过程中，取样进行细胞计数，细胞密度可达2×10⁶个/ml。

实施例8

发酵罐无血清培养Vero细胞和流感病毒

第一步：微载体的准备

称取4.5克干燥微载体Cytodex 1浸泡在450ml无钙镁离子的PBS中充分膨胀、水化，室温下至少3小时。倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余微载体换洗200ml新鲜无钙镁离子PBS，继续用200ml新鲜无钙镁离子的PBS换掉旧PBS，再以115℃，15min条件高压蒸汽灭菌消毒。

用之前，待水化好的微载体沉降后，倒掉上清。用400ml暖培养基(含2‰胶原蛋白)浸泡微载体至少4个小时，每隔20分钟晃动一下。4小时后待微载体沉降，倒掉上清，将微载体转移到2L的Sartorius发酵罐中备用。

第二步：接种细胞

接上步，发酵罐中的4.5克微载体浸泡于600ml无血清培养基(来源于Hyclone)中。种入2×10⁸个Vero细胞，以30转/分钟的速度搅拌(37℃)使细胞贴壁。2小时后，将细胞培养体积扩大到2L，搅拌速度改为50转/分钟，控制细胞培养温度、pH、溶氧等条件，正常培养细胞。每隔两天换一次培养基。

细胞吸附过程中微载体无聚集现象，微载体呈现单颗粒分散状态，此时取样可观察到绝大部分细胞已贴附于微载体上。在细胞的培养过程中，取样进行细胞计数。

第三步：病毒培养

取样观察知90％微载体已长满细胞，细胞密度约10⁶个/ml时准备接种病毒。停止搅拌，待微载体沉降后，抽弃上清液至细胞培养体积400ml，加入效价384的流感病毒H1N1病毒液2ml，30转/分钟的低搅拌速度搅拌2小时(37℃)，使病毒吸附于细胞，再加入病毒维持液至2L，增大搅拌速度至50转/分钟，控制培养温度、pH、溶氧等条件培养病毒。两天后补加TPCK胰酶10毫升。

第四步：收获病毒

约3-4天，取样观察细胞是否病变。停止搅拌，待微载体沉降后，吸取上清液(勿丢弃，其中亦含病毒)，加入流感病毒收获液50ml，增大搅拌速度为90转/分钟，搅拌20分钟使细胞脱落，静置，收集细胞悬液，再重复操作两次，将细胞收集完全，反复冻融3次，合并病毒培养上清，测得其血凝效价为1：1024。

Claims (7)

1、一种防止无血清微载体细胞聚集的培养物，包括微载体或含微载体的培养基，其特征在于：

A、将微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为1～20％的水解胶原蛋白溶液中3～6小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

B、将A步骤所得水解胶原蛋白微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为0.5～5％的蛋白交联剂溶液中，1～4小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，干燥后得包覆有水解胶原蛋白的微载体，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物；或者

C、将水化膨胀后的微载体，按50-100ml/g的量，放入质量浓度为1～2‰的水解胶原蛋白溶液中，浸泡至少4小时，得包覆有水解胶原蛋白的微载体，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物；或者

D、在含有浓度为1-5g/L的微载体Cytodex1培养基中，按1～2‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，即得培养物。

2、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述B步骤的蛋白交联剂为戊二醛、羟甲基磷化氢、碳化二亚胺和PFP-ester中的一种或几种。

3、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述水解胶原蛋白采用分子量为400Da～19kDa的水解胶原蛋白。

4、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述微载体为市购的Cytodex1、Cytodex2或Cytodex3。

5、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述培养物经过下列步骤：

(1)将微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为1～20％的水解胶原蛋白溶液中3～6小时，之后加热至80～100℃，直至溶液蒸发干燥，得水解胶原蛋白微载体；

(2)将(1)步骤所得水解胶原蛋白微载体按10～40g/L的量，悬浮在质量浓度为0.5～5％的蛋白交联剂溶液中1～4小时，使水解胶原蛋白交联固定在微载体上，得水解胶原蛋白包裹的微载体；

(3)将上述(2)步骤的水解胶原蛋白包裹的微载体加热至80～100℃，直至水解胶原蛋白包裹的微载体干燥，之后用水反复洗涤微载体，再干燥后，按常规量配入常规细胞培养基中，即得培养物。

6、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述培养物经过下列步骤：

(1)将干燥的微载体，按50-100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下至少浸泡3小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，余下的微载体按30-50ml/g的量，用新鲜的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS换洗1～3次，在0.05～0.1MPa，15～20min，，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按50-100ml/g的量，放入在36.5～37.5℃温度下预热的培养基即：含有质量浓度为1～2‰的水解胶原蛋白的培养基中，浸泡至少4个小时，并每隔15～20分钟晃动一次，之后待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，按常规量配入常规细胞培养基后即得培养物。

7、根据权利要求1所述的防止无血清微载体细胞聚集的培养物，其特征在于所述培养物经过下列步骤：

(1)将干燥微载体按50-100ml/g的量，浸泡在无钙镁离子的磷酸盐缓冲液PBS中，室温下至少浸泡3小时，使微载体充分膨胀、水化；倒掉浮在溶液表面的微载体，剩余的微载体按30-50ml/g的量，用新鲜无钙镁离子磷酸盐缓冲液PBS换洗1～3次，在0.05～0.1MPa，15～20min，条件下，高压蒸汽灭菌消毒，备用；

(2)将经过上述(1)步骤处理的微载体，按20-50ml/g的量，放入在36.5～37.5℃温度下预热的培养基中漂洗，待微载体沉降后，倒掉上清，将微载体转移到细胞培养容器中，备用；

(3)将经过上述(2)步骤处理的微载体，按1-5g/L的量配入常规的细胞培养基中，再按1～2‰的质量比，直接加入水解胶原蛋白，得培养物。