CN109762802A - 一种细胞载体颗粒聚集体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞载体颗粒聚集体及其制备方法。所述细胞载体颗粒聚集体由细胞载体颗粒聚集而成，且具有特定形状；特定形状包括片状和块状；细胞载体颗粒聚集体具有优异的复水性以及复水后良好的分散性。本发明细胞载体颗粒聚集体中的细胞载体颗粒内部具有多孔连通性，并且弹性、抗挤压能力极大。通过压制制成聚集体后，加入极少量的液体载体颗粒便可快速分散成单独的载体支架，物化性质不产生任何改变；不添加任何其他成分，通过成型方法得到的聚集体的表面不存在粉末，使其静电尽量减少，避免粉末产品的静电产生，造成损失；且可以药板的形式单片定量灭菌保存，也可将聚集体以瓶装的形式多片定量灭菌保存，独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作。

Description

一种细胞载体颗粒聚集体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞载体颗粒聚集体及其制备方法。
背景技术
细胞载体颗粒(直径一般为1～1000um)指的是能使用与贴壁细胞生长或共培养的微珠。目前市面上微载体均以粉末状的形式使用、储存和包装。由于其为微米级别的微珠，干粉状态下易存在大量的静电，因此在使用或运输过程中极容易造成微载体粉末的飞溅，有效质量减少，污染周边环境的同时其自身也会受到污染。粉末状微载体保存也较为困难，自身的性质限制其无论使用任何包装都会造成大量的不必要损耗。使用时较为困难，在称量等诸多工序中均需要很多计量设备等作为辅助工具，费时费力。因此，需要提供一种细胞载体颗粒的聚集体，以方便细胞培养的使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞载体颗粒聚集体及其制备方法，本发明将粉末状态下的细胞载体颗粒聚集成型形成聚集体，所述聚集体避免了微载体粉末在使用、包装、运输等过程中产生的问题(如大量静电产生，使用称量过程中易发生飞溅、静电吸附于容器壁或操作工具，难于操作，造成损失等)，又有利于细胞培养过程中，满足微载体定量使用及单独灭菌的需求。
本发明所述的“细胞载体颗粒”指的是由人工合成的生物材料和/或天然生物材料制备得到的微载体，直径为1～1000um；
所述人工合成的生物材料为选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA4000)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种；
所述天然生物材料为选自胶原、蛋白多糖、糖蛋白、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、透明质酸、层连接蛋白、纤维连接蛋白或组织脱细胞化材料中的至少一种。
本发明所提供的细胞载体颗粒聚集体，由细胞载体颗粒聚集而成，且具有特定形状。
所述特定形状包括片状和块状；
所述片状或所述块状的截面形状可为圆形、圆柱形、正方形、菱形、三角形、椭圆形、多角形或多边形等；
所述细胞载体颗粒聚集体具有优异的复水性以及复水后良好的分散性。
本发明细胞载体颗粒聚集体可按照下述方法进行制备：
细胞载体颗粒在外力作用下聚集成型，即得到所述细胞载体颗粒聚集体。
具体地，可采用冲压成型的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型。
所述冲压成型的条件如下：
冲压模具为斜平冲模具、浅弧冲模具、深弧冲模具或全平冲模具；
冲压成型机上冲的调节范围为0～50mm，下冲的调节范围为0～50mm；
压力为0～200KN，根据需要制备出硬度适当的细胞载体颗粒聚集体；
具体可采用自动式冲压成型机，电机摇杆转动一周出成品一片。
冲压成型机是采用量体积的方法定容、定量的。
具体地，可采用模具成型的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型。
所述模具成型的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶剂混合后装填于模具中；然后将所述模具置于烘箱中烘干，即得到所述细胞载体颗粒聚集体；
所述水或所述有机溶剂的添加量可为所述细胞载体颗粒质量的5～100倍；
所述有机溶剂可为甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇等溶剂；
所述烘箱的温度可为30～200℃，时间可为12～96小时，即可得到单位质量一致、形状相同、坚实稳定的所述细胞载体颗粒聚集体。
具体地，可采用冷冻干燥的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型。
所述冷冻干燥的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶剂混合后制成特定形状，然后进行冷冻得到冷冻体；将所述冷冻体经冻干即得所述细胞载体颗粒聚集体；
所述水或所述有机溶剂的添加量可为所述细胞载体颗粒质量的5～100倍；
所述有机溶剂可为甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇等溶剂；
置于冷冻容器中进行冷冻，在0～-196℃的调节下进行低温冷冻，形成所述冷冻体；
置于冻干机中进行冻干2～96小时即得到细胞载体颗粒聚集体。
具体地，可采用脱水蒸发的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型；
所述脱水蒸发的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶液混合后制成特定形状，然后经脱水蒸发即得所述细胞载体颗粒聚集体；
所述水或所述有机溶剂的添加量可为所述细胞载体颗粒质量的5～100倍；
所述有机溶剂可为甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇等溶剂；
可采用室温自然脱水的方式，如在室温挥发持续1～7天，可获得外形规则，坚实稳定的细胞载体颗粒聚集体；
可采用烘箱中烘干的方式，如在箱烘干可持续烘干2～96小时，可获得外形规则，坚实稳定的细胞载体颗粒聚集体。
本发明细胞载体颗粒聚集体，其中的细胞载体颗粒内部具有多孔连通性，并且弹性、抗挤压能力极大。通过压制制成聚集体后，加入极少量的液体载体颗粒便可快速分散成单独的载体支架，物化性质不产生任何改变。通过扫描电镜观察对比细胞载体在聚集成型前粉末状态、聚集成片状聚集体、聚集体吸水分散冻干成粉等三种状态，微载体经过冲压聚集后，其外观成球性、多孔连通性及分散性等均保持冲压聚集前性状，有利于后续的细胞贴壁培养等。所以本发明细胞载体颗粒聚集体的复水性极强，且复水后具有良好的分散性，聚集前后细胞载体颗粒的物理性质不发生改变。
本发明细胞载体颗粒聚集体不添加任何其他成分，通过成型方法得到的聚集体的表面不存在粉末，使其静电尽量减少，美观且方便使用，避免粉末产品的静电产生，造成损失。
本发明细胞载体颗粒聚集体可以药板的形式单片定量灭菌保存，也可将聚集体以瓶装的形式多片定量灭菌保存，独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作。
附图说明
图1为本发明实施例1中细胞载体颗粒的图片。
图2为本发明实施例1中细胞载体颗粒冲压成型后的图片。
图3为本发明实施例1中细胞载体颗粒聚集体遇液体分散的初始状态。
图4为本发明实施例1中细胞载体颗粒聚集体遇液体分完全散的状态。
图5为本发明实施例1中细胞载体颗粒的SEM扫描电镜图。
图6为本发明实施例1中细胞载体颗粒聚集体的SEM扫描电镜图。
图7为本发明实施例1中细胞载体颗粒聚集体经液体分散后的颗粒的SEM扫描电镜图。
图8为本发明实施例2中细胞载体颗粒装入圆柱形聚集模具内的图片。
图9为本发明实施例2中细胞载体颗粒模具成型后的图片。
图10为本发明实施例2中细胞载体颗粒聚集体遇液体分散后的图片。
图11为本发明实施例3中细胞载体颗粒吸水聚集后的图片。
图12为本发明实施例3中细胞载体颗粒冷冻成型后的图片。
图13为本发明实施例3中细胞载体颗粒聚集体遇液体分散后的图片。
图14为本发明实施例4中细胞载体颗粒吸水聚集后的图片。
图15为本发明实施例4中细胞载体颗粒脱水蒸发成型后的图片。
图16为本发明实施例4中细胞载体颗粒聚集体遇液体分散后的图片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的细胞载体颗粒是按照下述方法制备的：
反应溶液的配制：将PEGDA4000粉末室温下溶于DPBS溶液中，得到预聚溶液；再将预聚溶液与过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基二乙胺混合，充分混匀，得到反应溶液；其中，PEGDA4000在反应溶液中的浓度为10g/100ml，过硫酸铵在反应溶液中的浓度为0.5g/100ml；N,N,N',N'-四甲基二乙胺在反应溶液中的浓度为0.05g/100ml。
阵列式细胞载体颗粒的制备：将制作好的细胞载体颗粒模具放置于冰盒上方，取200ul配制好的反应溶液均匀的滴加在PMMA模具上，用盖玻片将模具表面上的反应液缓慢均匀的刮进模具内的孔隙中。将填充好PEGDA反应液的模具在-20℃条件下冷冻20h，反应结束后转入冷冻干燥机(-50℃，20pa)干燥30min，得到白色多孔细胞载体颗粒，直径为1～1000um。
实施例1、冲压聚集成型
冲压聚集成型机为自动式冲压聚集成型机，电机摇杆转动一周出成品一片。冲压聚集成型机是采用量体积的方法定容、定量的。
先在天平上称量20mg细胞载体颗粒，再将称好的材料倒入冲压成型机的进料处，选取斜平冲成型模具。调节冲压聚集成型机上冲，调节范围为0～50mm，调节冲压聚集成型机下冲，调节范围0～50mm。运行冲压聚集成型机的把手，使材料填满，调节压力值，压力值可控制在0～200KN范围之内，开启电机，电机摇杆摇动一周完成一次冲压聚集成型。自动冲压聚集成型机可连续匀速冲压聚集成型，冲压聚集成型速率为1～10秒/片。冲压聚集成型完成后将聚集体放入事先准备好的器皿中。
本实施例成型得到的聚集体的图片如图2所示，图1为成型前粉末状的细胞载体颗粒的图片。
通过本实施例的方法，单位聚集体的质量是可以通过调节下冲的高度，即调节材料的体积大小来控制聚集体的质量。
上述制备过程中，要注意以下操作：
(1)冲压聚集成型的时候要调大冲压聚集成型力度(调节上冲高度可调节冲压聚集成型力度，左下右上)，将片聚集的紧实，这样可以使聚集好的片不会因受到小幅度冲击而散开。
(2)调整片状聚集体质量时，一定要注意保持摇杆是向上90°垂直于水平面的。
(3)冲压聚集成型时要注意观察模具内材料是否填充满，如果没有填充满需要将把手往回摇晃使材料填满模具，以保证压出来的每片的质量准确。
(4)因为冲压聚集成型机是量体积称重的，所以需要更换模具才能冲压聚集成型出所需求的质量，质量范围可控制在1mg～1000mg。
本实施例制备的聚集体放入器皿内，将器皿放置摇床上反复震荡，摇床转速在0～1000rmp范围内，连续震荡96h也不会产生松散等现象，可见，本实施例制备的聚集体塑形稳定，不易松散，单位质量稳定且可调节。
向本实施例制备的聚集体中加入极少量的液体，聚集体便可快速分散成单独的载体支架，物化性质不产生任何改变，图3所示为聚集体遇液体分散的初始状态，图4所示为聚集体遇液体分完全散的状态。图5所示为冲压成型前细胞载体颗粒的SEM扫描电镜图，图6所示为冲压成型后细胞载体颗粒聚集体的SEM扫描电镜图，图7所示为经过冲压成型、液体分散、冻干后的细胞载体粉末颗粒的SEM扫描电镜图，通过这三种状态的扫描电镜观察对比，可以看出，细胞载体颗粒经过冲压成型后，其外观成球性、多孔连通性及分散性等均保持冲压前性状，从而有利于后续的细胞贴壁培养等。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体便于包装、运输，避免粉末产品的静电产生，造成损失；独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作；可定量成型，便于应用。
实施例2、模具成型
取一定质量粉末状细胞载体颗粒，加入去离子水(添加量为细胞微载体重量的50倍)，通过辅助工具，使其均匀平整的铺满模具，模具为圆柱形(还可为圆形、正方形、菱形、三角形、椭圆形、多角形及多边形等)。将装有一定质量的细胞载体颗粒的模具(如图8所示)放入60℃的烘箱内，持续烘干96小时，获得单位质量一致、形状相同、坚实稳定的细胞载体颗粒聚集体，如图9所示。
将本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体放入水中，可快速分散为单独细胞载体颗粒的状态，如图10所示，结果表明其外形以及物理性质不发生任何改变。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体接触液体后迅速吸水分散的性质，便于后续的细胞贴附培养。
经对比细胞载体颗粒成型前、成型后以及复水分散后的SEM扫描电镜，可以看出，本实施例中细胞载体颗粒经过模具成型后，其外观成球性、多孔连通性及分散性等均保持冲压前性状。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体便于包装、运输，避免粉末产品的静电产生，造成损失；独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作；可定量成型，便于应用。
实施例3、冻干干燥成型
取一定质量粉末状微载体，加入去离子水(添加量为细胞微载体重量的100倍)，通过使用辅助工具使其聚集成为形状规则的块状体，如图11所示；将聚集体放入冷冻容器内，在0～-196℃的低温冷冻的过程中，形成块状冷冻体；将冷冻好的聚集体放入冻干机内，冻干96小时，取出后则形成了冷冻干燥后的聚集体，如图12所示。
将本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体放入水中，可快速分散为单独微载体颗粒的状态，如图13所示，结果表明其外形以及物理性质不发生任何改变。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体接触液体后迅速吸水分散的性质，便于后续的细胞贴附培养。
经对比细胞载体颗粒成型前、成型后以及复水分散后的SEM扫描电镜，可以看出，本实施例中细胞载体颗粒经过冻干干燥成型后，其外观成球性、多孔连通性及分散性等均保持冲压前性状。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体便于包装、运输，避免粉末产品的静电产生，造成损失；独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作；可定量成型，便于应用。
实施例4、脱水蒸发成型
取一定质量粉末状微载体，加入去离子水(添加量为细胞微载体重量的20倍)，通过辅助工具，使其外形规则的块状体，如图14所示；将一定质量的块状细胞微载体放置室温自然脱水蒸发，室温挥发持续7天，获得外形规则，坚实稳定的细胞微载体聚集体，如图15所示。
将本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体放入水中，可快速分散为单独微载体颗粒的状态，如图16所示，结果表明其外形以及物理性质不发生任何改变。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体接触液体后迅速吸水分散的性质，便于后续的细胞贴附培养。
经对比细胞载体颗粒成型前、成型后以及复水分散后的SEM扫描电镜，可以看出，本实施例中细胞载体颗粒经过脱水蒸发成型后，其外观成球性、多孔连通性及分散性等均保持冲压前性状。
本实施例制备的细胞载体颗粒聚集体便于包装、运输，避免粉末产品的静电产生，造成损失；独立包装灭菌，便于细胞培养无菌操作；可定量成型，便于应用。

Claims (10)

1.一种细胞载体颗粒聚集体，其特征在于：所述细胞载体颗粒聚集体由细胞载体颗粒聚集而成。
2.根据权利要求1所述的细胞载体颗粒聚集体，其特征在于：所述细胞载体颗粒聚集体具有特定形状。
3.根据权利要求2所述的细胞载体颗粒聚集体，其特征在于：所述特定形状包括片状和块状；
所述细胞载体颗粒聚集体具有优异的复水性以及复水后良好的分散性。
4.权利要求1-3中任一项所述细胞载体颗粒聚集体的制备方法，包括如下步骤：
细胞载体颗粒在外力作用下聚集成型，即得到所述细胞载体颗粒聚集体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：采用冲压成型的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述冲压成型的条件如下：
冲压模具为斜平冲模具、浅弧冲模具、深弧冲模具或全平冲模具；
冲压成型机上冲的调节范围为0～50mm，下冲的调节范围为0～50mm；
压力为0～200KN。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：采用模具成型的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述模具成型的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶剂混合后装填于模具中；然后将所述模具置于烘箱中烘干，即得到所述细胞载体颗粒聚集体。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：采用冷冻干燥的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型；
所述冷冻干燥的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶剂混合后制成特定形状，然后进行冷冻得到冷冻体；将所述冷冻体经冻干即得所述细胞载体颗粒聚集体。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：采用脱水蒸发的方法将所述细胞载体颗粒聚集成型；
所述脱水蒸发的步骤如下：
所述细胞载体颗粒与水或易挥发的有机溶液混合后制成特定形状，然后经脱水蒸发即得所述细胞载体颗粒聚集体。
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