CN101421293A - 含有肽脂质的载体和使用该载体将化合物引入细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够将化合物高效地引入细胞的低毒性的载体，所述载体包含由(I)式所代表的肽脂质，以及使用该载体将化合物引入细胞的方法：其中R1是氨基酸或具有1－10个氨基酸残基的肽，R2是任何氨基酸的侧链，条件是R2具有羧基，所述羧基可以是含有具有1－30个碳原子的烃基的酯，R3是具有1－30个碳原子的烃基。
Description
技术领域
本发明涉及一种由含有肽脂质的脂质体组成的载体，该载体适于将化合物(如核酸)有效地引入细胞，本发明也涉及使用该载体将化合物引入细胞的方法。
背景技术
近来，各种疾病(如脑部疾病、AIDS和遗传性疾病)已得到深入研究并且这些疾病中许多疾病的成因和相关基因已被揭示。与此伴随的更大的希望在基础研究领域已经寄予针对所阐明的靶基因的功能的基因传递上，以及在先进医学领域中已经寄予用于疾病的基因治疗。
磷酸钙试剂、DEAE-葡聚糖试剂、脂质体试剂(例如，脂质转染胺2000、脂质转染物，等等)等被认为是市场上可以买到的用于将基因递送入培养细胞的试剂。然而，在很多情况下，它们有细胞毒性，表现出低的向正常细胞的引入效率以及具有由于血清的存在而降低引入效率的问题。而且，这些试剂不适用于面向实验动物和人的基因递送。虽然使用装置的方法(例如，微注射法、电穿孔法、粒子轰击(基因枪)方法等)显示比较高的引入效率，但是存在这些方法需要昂贵的装置和大量技术人员、处理量低等问题。因为使用病毒载体的基因递送方法在正常细胞中具有优越的引入效率和基因表达能力，所以它们在基因治疗中最具吸引力。然而，由于病毒在体内的致病性(例如，诱发肿瘤)和病毒免疫原性(通过中和抗体而失活)，因此需要更安全的基因递送技术。
本发明的发明人已研究并发现阳离子脂质能够将质粒DNA或siRNA高效地引入培养细胞或原生细胞，以及报道阳离子脂质适于将质粒(WO 2005/054486)和适于将siRNA(日本专利申请No.2004-356071)从它们自己的阳离子脂质集合(JP-B-1984767)引入。此外，本发明的发明人发现使用糖脂可以将基因高效地引入培养细胞(日本专利申请号2005-080759)。
发明的公开
本发明的目的在于提供一种能够将化合物经济、容易、安全和有效地引入细胞的低毒性的新型化合物-载体，以及提供一种不使用专用设备，使用所述载体将化合物引入细胞的方法。
为了达到上述目的，本发明的发明人独立设计并合成了一种肽脂质的集合(系了肽部分的合成脂质)，并且发现该肽脂质适于在集合中引入质粒DNA和siRNA。这些适于引入核酸的肽脂质表现出优越的引入效率(即使在10％血清的存在下)和比已知的使用共轭磷脂的引入试剂低的细胞毒性。本发明的发明人基于这些发现进行了进一步的调查研究，从而完成了本发明。
因此，本发明提供：
(1)由下式(I)所代表的化合物：
其中R1是氨基酸或具有1-10个氨基酸残基的肽，R2是任何氨基酸的侧链，条件是R2具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30个碳原子的烃基的酯，和R3是具有1-30个碳原子的烃基；
(2)上述(1)的化合物，其中R1是氨基酸或具有1-5个氨基酸残基的肽；
(3)上述(1)或(2)的化合物，其中R1含有至少一种选自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一个或多个残基；
(4)上述(3)的化合物，其中R1的N-末端氨基酸选自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp；
(5)上述(4)的化合物，其中R1的N-末端氨基酸是Arg或Lys；
(6)上述(1)-(5)中任意一项的任意化合物，其中R2是-CH2COOR4或-C2H4COOR4(其中R4是具有1-30个碳原子的烃基)；
(7)上述(6)的化合物，其中R4是具有10-20个碳原子的无支链的烷基或无支链的不饱和烃基；
(8)上述(1)-(7)中任意一项的任意化合物，其中R3是具有10-20个碳原子的无支链的烷基或无支链的不饱和烃基；
(9)用于将感兴趣的化合物引入细胞的载体，其含有至少一种上述(1)-(8)的化合物；
(10)上述(9)的载体，其中所述感兴趣的化合物是核酸；
(11)上述(10)的载体，其中所述核酸是质粒DNA、cDNA或反义DNA、或siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA或RNA复制子；
(12)上述(9)的载体，其中所述感兴趣的化合物是肽或蛋白质；
(13)上述(9)-(12)中任意一项的载体和感兴趣化合物的复合物；
(14)用于将感兴趣的化合物引入细胞的方法，所述方法包括使上述(13)的复合物与细胞接触；和
(15)用于将感兴趣的化合物引入人或非人接受者体内的细胞中的方法，所述方法包括向接受者给予上述(13)的复合物。
通过使用本发明的用于将化合物引入细胞的载体，即使在血清存在下，也可以非常高效地将化合物引入细胞。而且，由于本发明的肽脂质具有在细胞和生命组织中可降解(生物可降解性)的分子结构，这导致它的低细胞毒性，因此本发明的肽脂质在安全性上也优于病毒载体和市场上可以买到的引入试剂。
附图简述
图1显示肽脂质的头部长度对质粒DNA进入CHO细胞(图1A)和HC细胞(图1B)的引入效率的影响。
图2显示本发明的肽脂质和脂质转染胺2000在siRNA进入CHO-EGFP细胞的引入效率和对CHO-EGFP细胞的细胞毒性上的剂量-从属性，其中柱状图显示相对的EGFP表达(％)而线形图显示细胞存活力(％)。
图3显示肽脂质的头部长度对siRNA进入CHO-EGFP细胞的引入效率的影响。
图4显示具有碱性氨基酸头部的肽脂质对质粒DNA进入细胞的引入效率的影响。
图5显示具有各种连接物的肽脂质对siRNA进入CHO-EGFP细胞的引入效率和对CHO-EGFP细胞的细胞毒性的影响，其中白色柱形显示相对的EGFP表达(％)而黑色柱形显示细胞存活力(％)。
图6显示肽脂质的尾部长度对质粒DNA进入CHO细胞(图6A)和HC细胞(图6B)的引入效率的影响。
图7显示具有不饱和烃基的肽脂质对质粒DNA进入细胞的引入效率的影响。
图8显示具有树状聚体型氨基酸序列的肽脂质对质粒DNA进入细胞的引入效率的影响。
实施本发明的最佳方式
本发明的用于将化合物引入细胞的载体(以下也称为本发明的载体)的特征在于其含有肽脂质，所述肽脂质具有由任意氨基酸或肽组成的头部通过含有任意氨基酸的连接物部分与由任意烃链组成的尾部相连接的结构。具体地说，本发明的载体的特征在于其含有由下式(I)所代表的化合物：
其中R1是氨基酸或具有1-10个氨基酸残基的肽，R2是任何氨基酸的侧链，条件是R2具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30个碳原子的烃基的酯，并且R3是具有1-30个碳原子的烃基。也就是说，R1相当于头部，-NHCH(R2)CO-相当于连接物并且OR3相当于尾部。
优选地，R1是氨基酸或具有1-5个氨基酸残基的肽。构成R1的氨基酸可以是20种天然存在的氨基酸(Gly、Ara、Leu、Ile、Val、Arg、Lys、Glu、Gln、Asp、Asn、Cys、Met、His、Pro、Phe、Tyr、Thr、Ser、Trp)，或修饰或非天然的氨基酸(例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等)。当氨基酸在除了C-末端以外的位置具有羧基(或羧酸酯)时，羧基可以被酰胺化或酯化。作为用于这一情况的酯的实例，可以提到C1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等；C3-8环烷基，例如环戊基、环己基等；C6-12芳基，例如苯基、α-萘基等；苯基-C1-2烷基，例如苄基、苯乙基等；C7-14芳烷基，例如α-萘基-C1-2-烷基(如-萘甲基)；新戊酰氧基甲基；等等。
此外，N-末端氨基酸或R1的任何构成氨基酸的氨基可以用保护基(例如，C1-6酰基，如C1-6烷酰基，如甲酰基和乙酰基)保护；以及分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)可以用合适的保护基(例如，C1-6酰基，如C1-6烷酰基，如甲酰基和乙酰基，等等)保护。
R1可以是无支链或支链的(树状聚体型)肽。例如，当R1含有在侧链上具有氨基的氨基酸(如Arg和Lys)时，支链可以通过氨基与其它氨基酸或肽的羧基结合而形成。由于树状聚体型肽可以在N-末端具有两个或多个Arg/Lys，所以树状聚体型肽可带有更多正电荷并更有利，例如在肽直接与带负电荷的核酸或蛋白质结合时。同样，当R1含有在侧链上具有羧基的氨基酸(如Glu和Asp)时，支链可以通过羧基与其它氨基酸或肽的氨基结合而形成。而且，当R1含有Cys时，支链可以通过在Cys和其它Cys或含有Cys的肽之间的二硫键形成。
在一个优选的实施方案中，R1可以包含带正电荷的氨基酸(例如，Arg和Lys)，因此考虑其可以直接与带负电荷的核酸或蛋白质结合。
在另一个优选的实施方案中，R1可以包含在侧链中具有硫醇基的氨基酸(例如，Cys)，因此考虑其可以通过二硫键与硫醇化的核酸或蛋白质结合。二硫键在细胞内被还原，感兴趣的化合物、核酸或蛋白质可以被容易地释放出来。此外，载体本身在组织或细胞中的行为和载体与感兴趣的化合物(如核酸)结合时的结构变化可以通过用荧光(例如，FITC、若丹明、Cy3等)修饰半胱氨酸等的硫醇基进行观察。
在另一个优选的实施方案中，R1可以包含对金属具有高度亲和性的氨基酸(例如，Met和His)，因此考虑其可以与用金属修饰(例如，螯合作用)的核酸等结合。
在另一个优选的实施方案中，R1可以包含在侧链中具有羟基的氨基酸(例如，Thy、Thr和Ser)，因此考虑其可以通过氢键等与感兴趣化合物、核酸或蛋白质侧链中的官能团结合。
在另一个优选的实施方案中，R1可以包含带负电荷的氨基酸(例如，Glu和Asp)，因此考虑其可以与用核酸-结合蛋白等(如组蛋白)修饰的核酸结合，所述被修饰的核酸由于结合蛋白而具有净正电荷。
视情况还优选使用除了上述提到的那些氨基酸以外的氨基酸。例如，用于细胞识别的信号肽、神经递质γ-氨基丁酸(GABA)等可以用于提高载体和靶细胞之间的相互作用。
优选地，R1含有至少一种选自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一个或多个残基。虽然这些氨基酸可以位于R1中的任意位置，只要它们对感兴趣的化合物、核酸或蛋白质，或者靶细胞有影响，但是最好是它们中至少一个位于N-末端。因此，R1的N-末端氨基酸优选为Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu或Asp，更优选为Arg或Lys。
R2的实例包括以上描述R1的天然存在的氨基酸或者修饰或非天然的氨基酸的侧链，优选在侧链上具有羧基的氨基酸，例如Glu和Asp。更优选地，本发明的肽脂质是其中在连接物侧链上的羧基被具有1-30个碳原子的饱和或不饱和的醇酯化的化合物。也就是说，优选R2是-CH2COOR4或-C2H4COOR4，其中R4是具有1-30个原子的烃基。
在此使用的术语“烃基”包括具有1-30个碳原子的烃基，例如“烷基”、“环烷基”、“链烯基”、“环烯基”、“炔基”、“芳基”、“芳烷基”、“环烷基烷基”等。这些烃基可以被一个或多个合适的取代基所取代。这些取代基的实例包括，但不限于C1-C6烷基、C1-C6链烯基、C1-C6炔基、C6芳基、C2-C5杂芳基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基、CN、OH、氧基、卤素、COOH、NH2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、NH(C6芳基)、N(C6芳基)2、CHO、CO(C1-C6烷基)、CO(C6芳基)、COO(C1-C6烷基)、COO(C6芳基)等。
“烷基”的实例包括，但不限于“无支链或支链的C1-30烷基”，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
“环烷基”的实例包括，但不限于“C3-8环烷基”，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
“链烯基”的实例包括，但不限于“无支链或支链的C2-30链烯基”，如乙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等。
“环烯基”的实例包括，但不限于“C3-8环烯基”，如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。
“炔基”的实例包括，但不限于“无支链或支链的C2-30炔基”，如乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一碳炔基、十二碳炔基、十三碳炔基、十四碳炔基、十五碳炔基、十六碳炔基、十七碳炔基、十八碳炔基、十九碳炔基、二十碳炔基、二十一碳炔基、二十二碳炔基、二十三碳炔基、二十四碳炔基、二十五碳炔基、二十六碳炔基、二十七碳炔基、二十八碳炔基、二十九碳炔基、三十碳炔基等。
“芳基”的实例包括，但不限于“C6-14芳基”，如苯基、1-萘基、2-萘基、菲基、蒽基等。
“芳烷基”的实例包括，但不限于“C7-30芳烷基(即C6-24芳基-C1-6烷基)”，如苄基、苯乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基、(1-萘基)甲基、2-(1-萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基等。
“环烷基烷基”的实例包括，但不限于“C3-8环烷基-C1-6烷基”，如环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、环庚基甲基、环辛基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基、2-环庚基乙基、2-环辛基乙基等。
R3和R4优选是具有10-20个碳原子的无支链的饱和烃基(即，正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基、正二十一烷基、正二十二烷基、正二十三烷基、正二十四烷基、正二十五烷基、正二十六烷基、正二十七烷基、正二十八烷基、正二十九烷基和正三十烷基)或无支链的不饱和烃基(例如，单不饱和烃基如反-2-丁烯-1-基、顺-9-十四碳烯-1-基、顺-9-十六碳烯-1-基、顺-9-十八碳烯-1-基、顺-11-十八碳烯-1-基、顺-9-二十碳烯-1-基、顺-13-二十二碳烯-1-基和顺-15-二十四碳烯-1-基，二不饱和的烃基如顺-9-顺-12-十八碳二烯-1-基，三不饱和烃基如顺-9-顺-12-顺-15-十八碳三烯-1-基和顺-9-顺-11-顺-13-十八碳三烯-1-基，四不饱和烃基如顺-4-顺-8-顺-12-顺-15-十八碳四烯-1-基和顺-5-顺-8-顺-11-顺-14-二十碳四烯-1-基，五不饱和烃基如顺-7-顺-10-顺-13-顺-16-顺-19-二十二碳五烯-1-基，六不饱和烃基如顺-4-顺-7-顺-10-顺-13-顺-16-顺-19-二十二碳六烯-1-基等)。更优选地，R3和R4是具有12-16个碳原子的无支链的烷基(即，正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基和正十六烷基)或具有10-20个碳原子的无支链的不饱和烃基(例如，顺-9-十四碳烯-1-基、顺-9-十六碳烯-1-基、顺-9-十八碳烯-1-基、顺-9-十八碳烯-1-基、顺-11-十八碳烯-1-基、顺-9-二十碳烯-1-基、顺-13-二十二碳烯-1-基、顺-9-顺-12-十八碳二烯-1-基、顺-9-顺-12-顺-15-十八碳三烯-1-基、顺-9-顺-11-顺-13-十八碳三烯-1-基、顺-4-顺-8-顺-12-顺-15-十八碳四烯-1-基、顺-5-顺-8-顺-11-顺-14-二十碳四烯-1-基、顺-7-顺-10-顺-13-顺-16-顺-19-二十二碳五烯-1-基、顺-4-顺-7-顺-10-顺-13-顺-16-顺-19-二十二碳六烯-1-基等)。R3和R4可以是相同的基团。
作为由下式(I)所代表的化合物的具体实例，举例说明下列化合物等，但不限制于此：
由式(I)所代表的化合物可通过已知的肽合成方法和酯化反应方法结合来生产。例如，使连接物的氨基酸(NH2-CH(R2)-COOH)的α-羧基与所需的醇(R3-OH)缩合以制备氨基酸酯，然后可将肽链在氨基酸酯的氨基方向上延长以合成R1肽，或氨基酸酯可与预先合成的R1肽缩合。肽合成的方法可以是例如任何固相合成和液相合成方法。R1肽可以通过使构成R1的部分肽或氨基酸和剩余部分缩合而生成，以及当产物具有保护基时，除去保护基。在此，保护基的缩合和去除可以通过本身已知的方法来完成，例如以下(i)和(ii)中描述的方法。
(i)M.Bodanszky和M.A.Ondetti：Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York(1966)
(ii)Schroeder和Luebke：The Peptide，Academic Press，New York(1965)
具体地，例如所述化合物可以根据Kanegae和Akao公开的方法(“Design and Synthesis of the Artificial Peptide-Lipids HavingAdamantane Group”，The Research Reports of Fukuoka IndustrialTechnology Center in 1998，第113-116页)来合成。
本发明的载体含有一种上述提到的肽脂质分子。所述载体也可包含两种或多种组合在一起的上述提到的肽脂质分子。此外，所述载体还可以包含除了上述提到的肽脂质分子以外的分子，例如两亲分子(例如，由生物膜衍生而来的磷脂如磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等)、阳离子脂质分子、表面活性剂(例如，CHAPS、胆酸钠、辛基糖苷、N-D-葡萄糖-N-甲基烷酰胺等)、聚乙二醇、糖脂、肽脂质、蛋白质等，只要不失去本发明的优点，如将感兴趣化合物引入细胞的高引入效率和低的细胞毒性。
将本发明的载体提供为其中上述提到的肽脂质分子被组织化的组件，或其中上述提到的肽脂质分子被完全分散在分散介质中的形式(即溶液或悬浮液)。“组织化”是指构成载体的分子(包括肽脂质)相互通过非共价键(如疏水键)结合。组织化组件的实例包括由载体-构成分子的疏水性部分、脂质体、多层囊、带状组件、扁圆形组件、片状组件、杆状组件及其混合物之间的疏水键合所形成的双层膜。完全分散所述载体-构成分子的分散介质的实例包括有机溶剂，如乙醇、甲醇和DMSO。
本发明的载体可以被制备成分子的组件，通过将上述肽脂质分子分散在合适的分散介质中，例如含水溶剂，并且如果需要，进行诱发组织化的操作来进行。所述“诱发组织化的操作”的实例包括，但不限于各种本身已知的方法，如超声处理、加热、涡流、注入醚、弗氏压碎法、胆酸法、Ca2+融合、冻融法和反相蒸发[这些方法的详细描述在例如“Liposomes”的第2章：Preparation of Liposomes(由Sunamoto和Iwamoto编写)，Nojima，Sunamoto，and Inoue，eds.(Nankodo，1988年出版)以及其它地方]。在特定条件下，也可以让包括肽脂质的载体-构成分子自发地集合在含水溶剂中以形成组件(自组织)，而不进行上面描述的人工诱发组织的操作。虽然通过自组织得到的组件通常是上面描述的各种形式的混合物，但是也可以通过在特定条件下进行上述诱发组织化的操作来形成单一形式的组件。
或者，本发明的载体可以在完全分散的分子状态下，通过将上面描述的肽脂质分子溶解在含有有机溶剂(如乙醇、甲醇或DMSO)的溶液中进行制备。
上面描述的肽脂质分子的品种可以根据所引入的化合物(在此也称为“感兴趣的化合物”)来视情况进行选择；当引入质粒DNA时可选择的化合物的实例包括，但不限于上面描述的RE-C12、RGE-C12、RE-C14、RE-C16、KE-C14、KE-油酰基等，而当引入siRNA时可选择的化合物的实例包括，但不限于RE-C12、RGE-C12、RGGE-C12、RE-C14、RGD-C12等。
上述用于制备本发明载体的肽脂质分子的混合比例不受限制，基于所有载体-构成分子的摩尔比，所述混合比例是例如大约0.01-10，优选大约0.1-1。
在实施方案的优选方式中，用于制备本发明载体的上述肽脂质分子是固体、凝胶、液体等，但是不应理解为限制本发明。用于分散肽脂质分子的分散介质的实例包括，但不限于含水溶剂如水(去离子水等)、盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)，或本领域技术人员对于普通细胞培养所使用的介质(例如，RPMI1640、DMEM、HAM F-12、Eagle’s介质等)、有机溶剂如乙醇、甲醇或DMSO，含水溶剂和有机溶剂的混合溶剂，等等。虽然含水溶剂优选不含诸如血清的蛋白质组分，但是也可能通过预先进行聚赖氨酸处理等处理除去蛋白质组分来防止载体-构成分子包括肽脂质分子组织化的抑制，或随后的在被引入细胞的化合物和肽脂质分子组件之间的复合物形成。当被引入细胞的化合物是核酸(如RNA或DNA)或肽基化合物(如寡肽或蛋白质)时，核酸分解酶(如核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶)或蛋白质(肽)分解酶(如肽酶或蛋白酶)的混合会降低感兴趣化合物的稳定性；因此，优选对含水溶剂进行热处理以在肽脂质分子分散前灭活这些酶。热处理的实例包括，但不限于在大约50至大约100℃处理大约5分钟至大约3小时。因此，含水溶剂优选允许进行热处理的溶剂。通常用于将核酸引入细胞的各种培养肉汤往往不允许除去酶(如核糖核酸酶)；但是，即使分散在含有化合物(如NaCl或氯化钾)的水溶液时，本发明的肽脂质分子在后来的细胞内引入操作中也表现出高的引入效率。因此，在将例如核酸或肽基化合物的化合物引入细胞时，所述含水溶剂优选是含有上述化合物等的水溶液。
虽然含水溶剂的pH值不受限制，但是优选在pH值4至10的范围内，更优选在pH值6至8的范围内。
在实施方案的优选方式中，含有肽脂质的脂质体是通过如下面详细描述的(1)超声处理或(2)热处理制备的。
(1)超声处理方法
首先，将上面描述的肽脂质分子溶于有机溶剂(例如，氯仿等)，将得到的溶液放在例如茄形瓶的容器中；使用旋转蒸发器等在减压条件下蒸发掉溶剂，从而在容器壁的表面上形成脂质薄膜。将含水溶剂(例如，磷酸盐缓冲液(pH值7.0)等)加入到所述膜，随后摇动以使膜膨胀，然后使用例如涡旋搅拌器等进行分离，得到多层脂质体的悬浮液。为了除去分解的脂质等，可使用葡聚糖凝胶2B、4B或G-50柱等进行凝胶过滤。
通过在冰浴或水浴中使用超声发生器(探针型、浴盆式等)在高输出(例如，大约100至大约200W)下超声处理得到的多层脂质体悬浮液大约1至大约2分钟(例如，1分钟超声处理周期和30秒钟间隔重复大约二至四次等)，可以制备几乎均匀的单层脂质体。
在本发明的肽脂质分子中，含有肽脂质的脂质体可以容易地仅仅通过以下方法来制备：将适当量的肽脂质粉末转移到试管，加入MiliQ水等(以达到大约20mM的最终浓度)，然后进行与上面描述相同的超声处理。
(2)热处理方法
含有肽脂质的脂质体可以容易地通过以下方法来制备：将适当量的上述肽脂质分子的粉末转移到试管，加入MiliQ水等(以达到大约20mM的最终浓度)，然后将混合物在大约90℃加热大约15分钟。
可以考虑所用肽脂质分子的种类等来视情况对含有肽脂质的脂质体中肽脂质分子浓度进行调整，肽脂质分子的浓度通常在1-200mM范围内，优选1-100mM，并且更优选1-50mM。
如果浓度太低，则形成不足量的含有肽脂质的脂质体；如果浓度太高，则肽脂质分子会沉淀。
本发明的载体可含有适当的添加剂，只要添加剂的加入不影响本发明的任何优点，如化合物引入细胞的高效率和低的细胞毒性。当本发明的载体用于将化合物引入活体细胞的目的时，添加剂必须是药学上可接受的添加剂。例如，可以使用在常规已知的脂质体制剂中配制所用的各种药用添加剂。
本发明的载体(可以按如上描述得到)用作在低毒性下将化合物有效地引入细胞的药物。使用本发明的载体可将任何化合物引入细胞，例如可以提到核酸、肽、脂质、肽脂质、糖、生物活性物质、药物(阿霉素(抗肿瘤药物)、柔红霉素(抗肿瘤药物)、长春新碱(抗肿瘤药物)、长春碱(抗肿瘤药物)、依达比星(抗肿瘤药物)、二丁卡因(局部麻醉剂)、普萘洛尔(β-阻断剂)、奎尼丁(抗心律失常治疗剂)、多巴胺(高血压强心剂)、丙咪嗪(抗抑郁药)、苯海拉明(抗组胺剂)、奎宁(抗疟药)、氯喹(抗疟药)、双氯芬酸(抗炎药)等)、用于化妆品等的保湿剂(甘露糖醇等)、其它合成或天然的化合物等。
能够使用本发明的载体而被引入细胞中的特别优选的化合物是核酸。可以使用任何核酸，无论是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合的核酸、DNA/RNA杂合体，还是其它。虽然核酸可以是单链至三链的，但是优选单链或双链的。核酸可以是另外类型的核苷酸，即嘌呤或嘧啶碱的N-糖苷，或具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市场上可以买到的肽核酸(PNA)等)或含有特殊键的其它低聚物(但是，所述低聚物含有具有让碱基配对或碱基连接以在DNA和RNA中发现的方式排列的核苷酸)等等。此外，核酸还可以是在其中加入了已知的修饰的核酸，例如具有本领域已知标记的核酸、具有帽的核酸、甲基化的核酸、具有一个或多个被类似物取代的天然存在核苷酸的核酸、用分子内核苷酸修饰的核酸，例如，具有非电荷键的核酸(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、具有电荷键或含硫键的核酸(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，例如具有蛋白质侧链基团的核酸(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、糖(例如，单糖等)等等，具有插入化合物的核酸(例如，吖啶、补骨脂素等)、含有螯合物的核酸(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷基化剂的核酸，或具有修饰键的核酸(例如，端基异构型核酸等)。
例如，根据使用目的可视情况选择任何种类的DNA，其实例包括质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC等，优选质粒DNA、cDNA和反义DNA，更优选质粒DNA。环状DNA(如质粒DNA)在用限制性内切核酸酶等适当消化后还可以用作线状DNA。此外，根据使用目的可视情况选择任何种类的RNA，其实例包括siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等，优选siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA和RNA复制子。
核酸的大小不受限制；虽然可以引入非常宽范围的核酸，从巨型核酸分子(例如，大小在大约107kbp)如染色体(人工染色体等)到低分子量的核酸(例如，大小在大约5bp)，但是考虑到将核酸引入细胞的效率，优选大小不超过15kbp。例如，举例说明高分子的核酸如质粒DNA的大小在2-15kbp，优选2-10kbp。举例说明低分子量的核酸如siRNA的大小在5-1000bp，优选5-500bp，并且更优选5-200bp。
核酸可以是天然存在的或合成的核酸；条件是大小不超过大约100bp，核酸可以使用通常使用的自动核酸合成仪通过磷酸三乙基方法、磷酸二酯方法等方法进行合成。
虽然用于本发明的核酸不受限制，但是优选用本领域技术人员通常所用的方法进行纯化。
本发明的载体用于将预防和/或治疗的(以下简写为预防/治疗的)化合物引入活体细胞的实施方式的实例包括利用用于预防和/或治疗，包括通常所说的基因治疗的化合物，在体内给予，意在预防和/或治疗疾病。因此，在本发明实施方案的优选方式中，使用本发明的载体引入细胞的化合物具有对特定疾病的预防/治疗活性。此类化合物的实例包括核酸、肽、脂质、糖类、生物活性物质、药物以及其它天然或合成的化合物。
如上所述，基因疗法可以粗略地分为意在补充缺失的遗传信息的基因疗法和意在控制病因基因(靶基因)表达的基因疗法。
例如，当能够控制靶基因表达的化合物是低分子的核酸时，低分子核酸的例子为siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核糖酶、诱杀低聚核苷酸(例如，包含可通过转录因子或转录抑制因子识别和结合的碱基序列的低聚核苷酸)等等。
当能够控制靶基因表达的化合物是肽或蛋白质时，肽/蛋白质的例子为与靶基因结合以控制所述基因转录的肽/蛋白质、与mRNA或靶基因的初始转录产物结合以控制其翻译成蛋白质的肽/蛋白质、或能够增强控制靶基因表达的受体的信号的肽基配体、或能够阻断信号的类似肽/蛋白质的拮抗剂，等等。
或者，对疾病具有预防/治疗活性的化合物可以是能够控制病因蛋白活性的化合物。此类化合物的实例包括，但不限于作为靶受体蛋白配体的肽/蛋白质、非肽基化合物(例如，脂肪酸、甾体激素等)、具有激动或拮抗活性的各种天然或合成的化合物、模拟激酶磷酸化位置的部分氨基酸序列的肽等。
本发明还提供本发明载体和被引入细胞的化合物的复合物，所述化合物优选为如上描述的化合物。
当上面描述的载体用于将化合物引入细胞时，所述载体和感兴趣的化合物相互接触以形成载体和感兴趣化合物的复合物(以下也简称为“复合物”)。复合物可以通过任何相互作用来形成，只要复合物能稳定地存在，以及只要感兴趣化合物(核酸、肽等)通过例如核酸酶、肽酶等的分解被抑制。例如，当感兴趣的化合物是带负电荷的化合物如核酸或肽时，可使用含有带正电荷的肽脂质的载体，通过基于静电相互作用的非共价键形成复合物。当感兴趣的化合物是带正电荷或不带电荷的化合物时，可使用含有带负电荷的肽脂质的载体，通过基于静电相互作用的非共价键形成复合物。或者，具有载体的复合物还可以通过插入中间的其它相互作用或者通过预先将感兴趣的化合物与带负电荷的化合物结合来形成。其它相互作用的实例包括，但不限于上述关于R1的构成氨基酸的实施方案优选方式的相互作用。
关于复合物的形成，当载体是脂质体时，例如化合物可以以结合脂质体的形式或并入脂质体的形式，优选以并入脂质体的形式形成所述复合物。
上述载体和感兴趣的化合物复合物是通过混合含有载体的含水溶剂和感兴趣的化合物，然后培养所述混合物而得到的。含水溶剂的种类与上面描述的相同。
培养期间的温度优选被设置在与上述制备含有肽脂质的脂质体的方法相同的温度范围。
可以考虑所用肽脂质分子的种类等视情况对上述载体在混合物中的浓度进行调整，载体的浓度通常在1-200mM，优选1-100mM，更优选1-50mM，更加优选5-50mM，以及最优选10-30mM范围内。
如果浓度太低，则形成不足量的稳定的复合物；如果浓度太高，则载体会沉淀。
可以考虑所用化合物的种类和大小(分子量)等视情况对感兴趣的化合物在混合物中的浓度进行调整；当化合物是核酸时，它的浓度通常在大约0.01至大约100ng/μL的范围内。
当化合物是DNA时，它的浓度通常在3-100ng/μL的范围内。例如，当DNA是普通的质粒DNA(大小为大约3kbp)时，混合物中DNA的浓度优选在10-90ng/μL的范围内，更优选20-80ng/μL，更加优选30-70ng/μL，以及最优选40-60ng/μL。
如果浓度太低，则被引入细胞的DNA不能表现出预期的功能；如果浓度太高，则核酸的引入效率反而会下降。
即使所述化合物是DNA，也可以考虑到RNA的大小等来视情况对它的浓度进行调整；当RNA的大小为大约几千个碱基对时，在上述混合物中的RNA的浓度通常在3-100ng/μL，优选10-90ng/μL，更优选20-80ng/μL，更加通常30-70ng/μL，以及最优选40-60ng/μL的范围内。
特别地，当核酸为大约20至大约200bp大小像siRNA时，核酸的浓度通常在1-500nM，优选20-400nM，更优选20-300nM，更加优选20-200nM，以及最优选20-100nM的范围内。
如果浓度太低，则被引入细胞的RNA不能表现出预期的功能；如果浓度太高，则核酸的引入效率反而会下降。
可以考虑到所用试剂的种类以及其它条件来视情况对在含有载体和感兴趣化合物的含水溶剂混合之后的培养时间进行调整，培养时间通常在0.5-500分钟的范围内，优选0.5-200分钟，更优选0.5-120分钟，更加优选0.5-60分钟，以及最优选1-45分钟。
如果培养时间太短，则在感兴趣的化合物和载体之间形成的复合物不足；如果培养时间太长，则形成的复合物有时变得不稳定；在这两种情况中，感兴趣化合物的引入效率都会下降。
通过上面描述的步骤，可以得到含有用于将感兴趣的化合物引入细胞的载体和化合物的混合物(以下也描述为“含有复合物的溶液”)。
此外，通过将上述步骤得到的复合物和细胞相互接触，将包含在复合物中的感兴趣的化合物可以引入细胞。
虽然上面描述的“细胞”种类不受限制，无论它们衍生于原核生物或真核生物，但是优选衍生于真核生物。真核生物的种类也不受限制，例子有脊椎动物如哺乳动物，包括人类(人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、禽类(小鸡、鸵鸟等)、两栖动物(蛙等)和鱼类(斑马鱼(zebrafish)、克鲤鱼等)，无脊椎动物如昆虫(蚕、蛾、果蝇等)，植物，微生物如酵母，等等。更优选，本发明的细胞是动物或植物细胞，更优选哺乳动物细胞。
所述细胞可以是培养的细胞系的细胞，包括癌细胞，从个体或组织分离的细胞，或组织或组织部分的细胞。所述细胞还可以是粘附细胞或非粘附细胞。
用于将复合物和细胞相互接触的步骤会在下面被更详细地描述。
将细胞在与复合物接触之前先在合适的介质中悬浮几天，并在适宜的条件下培养。在与复合物接触时，细胞可以处于或不处于对数生长期。
虽然在接触时使用的培养肉汤可以是含血清的介质或无血清的介质，但优选的是介质中的血清浓度不超过30％，优选不超过20％。这是因为蛋白质如血清在介质中过量存在会阻碍复合物和细胞的接触。
接触时的细胞密度不受限制，并且可以考虑到细胞的种类等来视情况对其进行调整，通常在0.1 x 105至5 x 105细胞/毫升的范围内，优选0.1 x 105至4 x 105细胞/毫升，更优选0.1 x 105至3 x 105细胞/毫升，更加优选0.2 x 105至3 x 105细胞/毫升，以及最优选0.2 x 105至2 x 105细胞/毫升。
将上述含有复合物的溶液加入到由此制备的含有细胞的介质中。所加入的含有复合物的溶液的量不受限制，并且可以考虑到细胞计数等来视情况对其进行调整，通常在每毫升介质添加1-1000μL的范围内，优选1-500μL，更优选1-300μL。更加优选1-200μL，以及最优选1-100μL。
在将含有复合物的溶液加入介质中之后，培养细胞。在考虑到细胞的种类的情况下视情况调整培养期间的温度、湿度、CO2浓度等。就哺乳动物细胞而言，正常条件为大约37℃的温度、大约95％的湿度和大约5％的CO2浓度。
也可以考虑到所用细胞的种类以及其它条件来视情况对培养时间进行调整，其通常在1-72小时的范围内，优选1-60小时，更优选1-48小时，更加优选1-40小时，以及最优选1-32小时。
如果上述培养时间太短，则感兴趣化合物向细胞内的引入量不足；如果培养时间太长，则细胞会变得更加无力。
通过上述培养方法将所述化合物引入细胞；优选地，用新鲜介质替换原有介质进行连续培养，或将新鲜介质加入到介质中进行培养。当所述细胞具有哺乳动物起源时，新鲜介质优选含有血清或营养要素。
可以考虑到被引入化合物的预期功能等来视情况对用于进一步培养的时间进行调整；当所述化合物是质粒DNA如表达载体时，时间通常在8-72小时范围内，优选8-60小时，更优选8-40小时，更加优选8-36小时，以及最优选12-32小时。当所述化合物是能够控制靶基因表达的低分子的核酸如siRNA时，时间通常在0-72小时范围内，优选0-60小时，更优选0-48小时，更加优选0-36小时，以及最优选0-32小时。
如上所述，通过使用本发明载体和化合物的复合物，不仅可将化合物在体外引入细胞，而且可在体内引入细胞。因此，通过向接受者给予所述复合物，复合物到达并接触靶细胞，从而导致在体内将包含在复合物中的化合物引入细胞。
可以被给予复合物的接受者不受限制，例子有脊椎动物如哺乳动物，包括人类(人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、禽类(小鸡、鸵鸟等)、两栖动物(蛙等)和鱼类(斑马鱼、克鲤鱼等)，无脊椎动物如昆虫(蚕、蛾、果蝇等)，植物等。优选地，复合物的接受者是人或其它哺乳动物。
给予所述复合物的方法不受限制，只要复合物到达并接触靶细胞以便将包含在复合物中的感兴趣的化合物引入细胞；考虑到感兴趣化合物的种类、靶细胞的种类和位置等可视情况选择本身已知的给予方法(口服给予、肠胃外给予(静脉内给予、肌内给予、局部给予、经皮给予、皮下给予、腹膜内给予、喷雾等)等等)。
所述复合物的剂量不受限制，只要化合物向细胞内的引入可以实现，以及考虑到接受者的种类、给予方法、感兴趣化合物的种类、靶细胞的种类和位置等可以视情况选择复合物的剂量。就口服给予而言，基于所述复合物，对于人(称重60kg)的每次给予的通常剂量是例如大约0.001mg至10000mg。就肠胃外给予(例如，静脉内给予等)而言，基于所述复合物，对于人(称重60kg)的每次给予的通常剂量是例如大约0.0001mg至3000mg。就其它动物而言，可以给予每60kg体重折算的剂量。
因为通过利用本发明的载体使以很高的效率将化合物引入细胞成为可能，所以本发明提供含有用于在体外或体内向细胞引入化合物的载体的试剂。所述试剂可以被提供为研究试剂、药用试剂等。通过使用上述方法中的试剂，可容易地将所需的化合物引入细胞。
当本发明的载体被用作用于向细胞引入化合物的试剂时，可作为制剂通过常规方法进行制备。
当所述试剂提供为研究试剂时，本发明的载体可以被提供为例如无菌溶液或在水或其它生理上可接受的液体(例如，上述水溶性溶剂、有机溶剂如乙醇、甲醇和DMSO、水溶性溶剂和有机溶剂的混合物，等等)中的悬浮液。所述试剂可以视情况含有本身已知的生理上可接受的添加剂，如填充剂、赋形剂、抗菌剂、稳定剂和粘合剂。
当所述试剂被提供为药用试剂时，本发明的载体可以以口腔制剂的方式(例如，片剂、胶囊等)或非肠道制剂(例如，可注射的制剂、喷雾等)，或以通用的制剂设计所需的单位剂量形式通过与已知的药学上可接受的添加剂(如载体、调味剂、填充剂、赋形剂、抗菌剂、稳定剂和粘合剂)混合来制造。
可在片剂、胶囊等中混合的添加剂的实例包括粘合剂如明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯胶，填充剂如结晶纤维素，膨胀剂如玉米淀粉、明胶、海藻酸等，润滑剂如硬脂酸镁，甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精，调味剂如薄荷、akamono油或樱桃等可以使用。当制剂单位形式是胶囊时，上述类型的材料可以进一步地含有液体载体如油或脂肪。用于可注射制剂的含水溶液的例子有盐水、含有葡萄糖和其它助剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的等渗溶液等，并且可用于与合适的增溶剂组合，合适的增溶剂例如为醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，多乙氧基醚TM、HCO-50)等。油性液体的例子有芝麻油、豆油等，并且可用于与增溶剂(如苯甲酸苄基酯或苄醇)组合。
上述试剂还可以与例如缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲溶液)、抚慰剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如，苄醇、苯酚等)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸等)等等进行配制。
包含在这些试剂中的本发明载体的用量不受限制，只要在所述载体用于上述方法时，可以实现向细胞引入化合物；用量可以根据剂型的种类、被引入化合物的种类等视情况进行选择。
或者，包含在本发明试剂中的载体可以是具有期望被引入细胞的化合物的复合物。
本发明的载体还可以提供为用于向细胞引入化合物的试剂盒。所述试剂盒可以进一步地包含可用于利用本发明的载体向细胞引入化合物的方法的任何试剂等(例如，上述含水溶剂、带有制剂方案的说明书、反应容器等)。通过使用所述试剂盒，根据上面描述的方法，可容易地将所需的化合物引入细胞。
实施例
下面通过实施例来详细地解释本发明，但不应理解为以任何方式限制本发明。
实施例1：肽脂质的合成和制备
(1)肽脂质的合成(RE-C12合成法)
将氨基酸(L-谷氨酸；E)、脂肪醇(十二烷醇；C12-OH)和对甲苯磺酸混合在甲苯溶剂中，在回流条件下在装有Dean-Stark分水器的反应容器中加热混合物。通过脱水缩合形成酯键。通过冷却(4℃)沉淀E-C12的对甲苯磺酸酯的晶体，通过过滤收集并用冷的甲苯洗涤，得到白色晶体。然后，将用Boc(Boc-Arg(Boc)2-OH)保护的氨基酸与E-C12在二甲基甲酰胺溶剂中在HOBt、WSC和TEA共存的条件下缩合。通过硅胶柱色谱纯化合成的物质(Boc-Arg(Boc)2-Glu-C12)，并用三氟乙酸除去Boc保护以得到Arg-Glu-C12(RE-C12)。NMR用于鉴定。通过类似的方法合成其它肽脂质。
(2)肽脂质水溶液的制备
溶解各种肽脂质以得到各种1.3mM的肽脂质水溶液(1.0ml)并用超声处理分散。
实施例2：使用具有各种头部长度的肽脂质向培养细胞引入质粒DNA
将培养细胞(CHO细胞、HC细胞)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(CHO细胞；10％含有FBS的DMEM介质，HC细胞；10％含有FBS的DMEM/F-12介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将质粒DNA(pCMV-IE-hsGFP；购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，1μg/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。使各种1.3mM肽脂质(RE-C12、RGE-C12、RGGE-C12、RGGGE-C12、RE-C14、RGE-C14、RGGE-C14、RGGGE-C14，各5μl)与上述质粒DNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-DNA复合物。将复合物加入上述细胞并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图1中。发现使用肽脂质作为载体导致GFP在细胞中非常频繁的表达并且质粒DNA被高效率地引入细胞。
实施例3：使用各种浓度的肽脂质向培养细胞引入siRNA所产生的细胞毒性
将培养细胞(CHO-EGFP细胞；以组成方式表达荧光蛋白EGFP的CHO细胞，它们通过常规方法制备)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
抗-EGFP-siRNA(购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，50pmol/孔)分别与25μl 150mM NaCl溶液(对于肽脂质)和DMEM介质(125μl)(对于脂质转染胺2000)混合。将各种1.3mM肽脂质(RE-C12、RGE-C12，各2-6μl)和脂质转染胺2000(购买于Invitrogen；LipoA2000)(1-5μl)与上述siRNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到RE-C12—RNA复合物、RGE-C12—RNA复合物和脂质转染胺2000—RNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用显微镜观察细胞并通过台盼蓝染色来确定细胞死亡。结果显示在图2中。当肽脂质用作载体时，根本没有观察到细胞毒性，没有发现在细胞存活力方面与未引入的细胞有显著性差异，因此认为肽脂质具有低的细胞毒性。而且，当肽脂质被用作载体时，EGFP表达被siRNA明显地抑制，它的能力等于或高于脂质转染胺2000，并且发现siRNA被非常有效地引入了细胞。实施例4：使用具有各种头部长度的肽脂质向培养细胞引入siRNA
将培养细胞(CHO-EGFP细胞；表达组成荧光蛋白EGFP的CHO细胞，它们通过常规方法制备)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
抗-EGFP-siRNA(购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，50pmol/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。将各种1.3mM肽脂质(RE-C12、RGE-C12、RGGE-C12、RGGGE-C12、RE-C14、RGE-C14、RGGE-C14、RGGGE-C14，各5μl)与上述siRNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-RNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图3中。当肽脂质被用作载体时，EGFP表达被siRNA明显地抑制，并且发现siRNA被非常有效地引入细胞中。
实施例5：使用具有碱性氨基酸头部的肽脂质向培养细胞引入质粒DNA
将培养细胞(CHO细胞)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将质粒DNA(pCMV-IE-hsGFP，购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，1μg/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。将各种1.3mM肽脂质(RE-C14、KE-C14，各5μl)与上述质粒DNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-DNA复合物。将复合物加入上述细胞并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图4中。当使用将Arg或Lys设计为头部的肽脂质时，GFP非常频繁地在细胞中对两种脂质进行表达，并且发现质粒DNA被非常有效地引入细胞中。
实施例6：使用具有各种连接物的肽脂质向培养细胞引入siRNA
将培养细胞(CHO-EGFP细胞；表达组成荧光蛋白EGFP的CHO细胞，它们通过常规方法制备)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将抗-EGFP-siRNA(购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，50pmol/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。将各种1.3mM肽脂质(RGE-C12、RGD-C12，各5μl)和脂质转染胺2000(购买于Invitrogen；LipoA2000)(5μl)与上述siRNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到RGE-C12—RNA复合物、RGD-C12—RNA复合物和脂质转染胺2000—RNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图5中。当使用设计为Glu或Asp作为连接物的肽脂质时，EGFP表达被siRNA明显地抑制，siRNA非常有效地在细胞中表达，它们的能力高于脂质转染胺2000的能力，并且发现它们在细胞毒性方面有优势。
实施例7：使用具有各种尾部长度的肽脂质向培养细胞引入质粒DNA
将培养细胞(CHO细胞，HC细胞)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(CHO细胞；10％含有FBS的DMEM介质，HC细胞；10％含有FBS的DMEM/F-12介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将质粒DNA(pCMV-IE-hsGFP，购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，1μg/孔)分别与25μl 150mM NaCl溶液(对于肽脂质)和DMEM介质(125μl)(对于脂质转染胺2000)混合。将各种1.3mM肽脂质(RE-C10、RE-C12、RE-C14、RE-C16，各5μl)和脂质转染胺2000(购买于Invitrogen；LipoA2000)(2.5μl，根据方案)与上述DNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到RE-C10—DNA复合物、RE-C12—DNA复合物、RE-C14—DNA复合物、RE-C16—DNA复合物和脂质转染胺2000—DNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图6中。当使用设计为具有C10至C16尾部长度的肽脂质时，GFP在细胞中表达，并且发现质粒DNA被非常有效地引入细胞中。
实施例8：使用尾部具有不饱和烃基的肽脂质向培养细胞引入质粒DNA
将培养细胞(CHO细胞)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将质粒DNA(pCMV-IE-hsGFP，购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，1μg/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。将各种1.3mM肽脂质(KE-C14、KE-油酰基，各5μl)与上述质粒DNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-DNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图7中。当使用设计为具有不饱和烃基作为尾部的肽脂质时，GFP同样在细胞中表达，并且发现质粒DNA被非常有效地引入细胞中。
实施例9：使用具有树状聚体型氨基酸序列的肽脂质向培养细胞引入质粒DNA
将培养细胞(CHO细胞)(1 x 105细胞/孔)在24孔板中预培养24小时(10％含有FBS的DMEM介质)，然后在引入时将介质与0.5ml新鲜的10％含有FBS的介质进行交换。
将质粒DNA(pCMV-IE-hsGFP，购买于NIPPON GENE CO.，LTD.，1μg/孔)与25μl 150mM NaCl溶液混合。将各种1.3mM肽脂质(RE-C12、R2KE-C12、(RG)2KE-C12，各5μl)与上述质粒DNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-DNA复合物。将复合物加入到上述提到的细胞中并将混合物在5％ CO2保温箱中在37℃培养24小时。第二天，用荧光显微镜观察细胞并通过流动血细胞计数器测定荧光细胞。结果显示在图8中。当使用设计为具有树状聚体型氨基酸序列作为头部的肽脂质时，GFP同样在细胞中表达，并且发现质粒DNA被非常有效地引入细胞中。
实施例10：使用肽脂质将siRNA引入小鼠
将Cy3-标记的siRNA(400pmol，购买于Dharmacon)与200μl 150mM NaCl溶液混合，1.3mM肽脂质(RE-C12)(16μl)与上述siRNA溶液混合并将混合物培养5分钟以得到肽脂质-RNA复合物。将其从尾部静脉注入Balb/c小鼠(15周大)。在小鼠中，在试验浓度下没有观察到急性毒性。四小时后，将小鼠尸体剖检并除去各个组织(心脏、肺、肝、肾、脾)，将其切成小块并用荧光显微镜观察。结果显示在表1中。当肽脂质被用作载体时，siRNA可以被引入体内的各个组织。引入肝和脾的效率特别高。
表1：使用肽脂质将siRNA引入小鼠的效果
| 器官 | 评价 |
| 心脏 | 5％ |
| 肺 | 10％ |
| 肝 | 25％ |
| 肾 | 5％ |
| 脾 | 30％ |
工业实用性
因为本发明的载体显示低的细胞毒性并且在细胞内的化合物引入方面效率很高，所以它可用作高效的向细胞内引入研究和药用用途的化合物的试剂。
Claims (15)
1、由下式(I)所代表的化合物：
其中R1是氨基酸或具有1-10个氨基酸残基的肽，R2是任何氨基酸的侧链，条件是R2具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30个碳原子的烃基的酯，并且R3是具有1-30个碳原子的烃基。
2、权利要求1的化合物，其中R1是氨基酸或具有1-5个氨基酸残基的肽。
3、权利要求1或2的化合物，其中R1含有至少一种选自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一个或多个残基。
4、权利要求3的化合物，其中R1的N-末端氨基酸选自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp。
5、权利要求4的化合物，其中R1的N-末端氨基酸是Arg或Lys。
6、权利要求1-5中任意一项的任意化合物，其中R2是-CH2COOR4或-C2H4COOR4(其中R4是具有1-30个碳原子的烃基)。
7、权利要求6的化合物，其中R4是具有10-20个碳原子的无支链的烷基或无支链的不饱和烃基。
8、权利要求1-7中任意一项的任意化合物，其中R3是具有10-20个碳原子的无支链的烷基或无支链的不饱和烃基。
9、用于将感兴趣的化合物引入细胞的载体，所述载体含有至少一种权利要求1-8的化合物。
10、权利要求9的载体，其中所述感兴趣的化合物是核酸。
11、权利要求10的载体，其中所述核酸是质粒DNA、cDNA或反义DNA、或siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA或RNA复制子。
12、权利要求9的载体，其中所述感兴趣的化合物是肽或蛋白质。
13、权利要求9-12中任意一项的载体和感兴趣化合物的复合物。
14、用于将感兴趣的化合物引入细胞的方法，所述方法包括使权利要求13的复合物与细胞接触。
15、用于将感兴趣的化合物引入人或非人接受者体内的细胞中的方法，所述方法包括向接受者给予权利要求13的复合物。
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