KR101320735B1 - 펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법 - Google Patents

펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101320735B1
KR101320735B1 KR1020087024133A KR20087024133A KR101320735B1 KR 101320735 B1 KR101320735 B1 KR 101320735B1 KR 1020087024133 A KR1020087024133 A KR 1020087024133A KR 20087024133 A KR20087024133 A KR 20087024133A KR 101320735 B1 KR101320735 B1 KR 101320735B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
compound
peptide
carrier
cis
Prior art date
Application number
KR1020087024133A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090008201A (ko
Inventor
겐이치 구스모토
이타루 하마치
가즈미 사사모토
데츠유키 아카오
무네타카 이시야마
다카히로 나가타
지즈 이케다
다케시 이도
사토코 야마시타
리에코 구로다
도모유키 이시카와
Original Assignee
도진도 래보라토리즈
후쿠오카켄
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도진도 래보라토리즈, 후쿠오카켄 filed Critical 도진도 래보라토리즈
Publication of KR20090008201A publication Critical patent/KR20090008201A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101320735B1 publication Critical patent/KR101320735B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • A61K49/0047—Green fluorescent protein [GFP]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은, 화합물을 세포 내로 저 독성으로 고 효율적으로 도입할 수 있는 담체로서 하기 식으로 표시되는 펩티드 지질을 함유한 담체, 및 상기 담체를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다:
Figure 112008069163579-pct00007
{식 중, R1 은 아미노산 또는 1-10 개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드이고, R2 는 임의의 아미노산의 측쇄이고, R2 가 카르복실기를 갖는 경우, 상기 카르복실기는 탄소수 1-30 의 탄화수소기를 가진 에스테르일 수 있고, R3 은 탄소수 1-30 의 탄화수소기이다}.
펩티드 지질, 리포좀, 담체

Description

펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법 {PEPTIDE LIPID-CONTAINING CARRIER AND METHOD FOR INTRODUCING COMPOUND INTO CELLS USING SAME}
본 발명은 핵산 등의 화합물을 세포 내로 효율적으로 도입하는데 적합한 펩티드 지질-함유 리포좀 (liposome) 으로 이루어진 담체 (carrier), 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법에 관한 것이다.
최근, 뇌 질환, AIDS 및 유전 질환과 같은 다양한 질환들이 강도높게 연구되어, 이들의 원인이 되는 관련된 다수의 유전자가 밝혀졌다. 이와 함께, 기초 연구 분야에서는 표적 유전자의 기능의 해명에 초점을 맞춘 유전자 전달에, 및 고등 의학 분야에서는 질환에 대한 유전자 치료에 큰 기대를 걸었다.
배양된 세포 내로의 유전자 전달을 위한 시판중인 시약으로서는 인산칼슘 시약, DEAE-덱스트란 시약, 리포좀 시약 (예컨대, Lipofectamine 2000, Lipofectin 등) 등이 공지되어 있다. 그러나, 많은 경우에, 이들은 세포독성이 있고, 정상 세포 내로의 도입 효율이 낮으며, 혈청의 존재 하에서 도입 효율이 감소되는 문제가 있다. 게다가, 이들 시약들은 실험 동물 및 인간 내로의 유전자 전달에 적용가능하지 않다. 미세주입법, 전기천공법, 입자사출 (유전자 총) 방법 등과 같은 장치를 이용한 방법은 상대적으로 높은 도입 효율을 나타내지만, 이들은 고비용의 장치 및 많은 기술을 필요로 하고 처리량이 적은 등의 문제점이 있다. 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 기법은 정상 세포 내로의 도입 효율 및 상기 세포 내에서의 유전자 발현 능력이 뛰어나기 때문에, 유전자 치료에서 가장 큰 주목을 받고 있다. 그러나, 생체내에서의 바이러스의 병원성 (예컨대, 종양 유발) 및 면역원성 (중화 항체에 의한 불활성화) 때문에, 보다 안전한 유전자 전달 기법이 요구된다.
본 발명자들은 플라스미드 DNA 또는 siRNA 를 배양된 또는 일차 세포 내로 고 효율로 도입할 수 있는 양이온성 지질을 연구 및 개발하였고, 양이온성 지질 자체의 레퍼토리 (JP-B-1984767) 로부터 플라스미드 도입에 적합한 것 (WO 2005/054486) 및 siRNA 의 도입에 적합한 것 (일본 특허 출원 제 2004-356071 호) 을 보고하였다. 나아가, 본 발명자들은 당지질을 이용하여 유전자를 배양된 세포 내로 고효율로 도입할 수 있다는 것을 발견하였다(일본 특허 출원 제 2005-080759 호).
본 발명의 목적은 화합물을 세포 내로 저 독성으로 저비용으로 용이하고도 안전하게 효율적으로 도입할 수 있는 신규한 화합물-담체를 제공하고, 상기 담체를 사용하여 특별한 장비를 사용하지 않고 화합물을 세포 내로 도입하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 언급한 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 펩티드 지질들의 레퍼토리 (펩티드 부분을 구속하는 합성 지질들) 를 독자적으로 고안 및 합성하고, 상기 레퍼토리에서 플라스미드 DNA 의 도입에 적합한 것들 및 siRNA 의 도입에 적합한 것들을 발견하였다. 핵산의 도입에 적합한 이들 펩티드 지질들은 10% 혈청의 존재 하에서도 뛰어난 도입 효율을 나타내었고, 복합 인지질을 사용하는 공지의 도입 시약들과 비교하여 낮은 세포독성을 나타내었다. 본 발명자들은 이들 발견에 기초하여 추가적인 조사를 수행하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:
(1) 하기 화학식 (I) 로 표시되는 화합물:
Figure 112008069163579-pct00001
{식 중, R1 은 아미노산 또는 1-10 개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드이고, R2 는 임의의 아미노산의 측쇄이고, R2 가 카르복실기를 갖는 경우, 상기 카르복실기는 탄소수 1-30 의 탄화수소기를 가진 에스테르일 수 있고, R3 은 탄소수 1-30 의 탄화수소기이다};
(2) 상기 (1) 에 있어서, 식 중, R1 이 아미노산 또는 1-5 개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드인 화합물;
(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 식 중, R1 이 Arg, Lys, Cys, Met, His, Tyr, Glu 및 Asp 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 하나 이상의 잔기를 포함하는 화합물;
(4) 상기 (3) 에 있어서, 식 중, R1 의 N-말단 아미노산이 Arg, Lys, Cys, Met, His, Tyr, Glu 및 Asp 로 이루어진 군에서 선택되는 화합물;
(5) 상기 (4) 에 있어서, 식 중, R1 의 N-말단 아미노산이 Arg 또는 Lys 인 화합물;
(6) 상기 (1)-(5) 중 어느 하나에 있어서, 식 중, R2 가 -CH2COOR4 또는 -C2H4COOR4 (식 중, R4 는 탄소수 1-30 의 탄화수소기임) 인 화합물;
(7) 상기 (6) 에 있어서, 식 중, R4 가 탄소수 10-20 의 비분지형 알킬 또는 비분지형 불포화 탄화수소기인 화합물;
(8) 상기 (1)-(7) 중 어느 하나에 있어서, 식 중, R3 이 탄소수 10-20 의 비분지형 알킬 또는 비분지형 불포화 탄화수소기인 화합물;
(9) 상기 (1)-(8) 의 화합물 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 내로 관심 화합물을 도입하기 위한 담체;
(10) 상기 (9) 에 있어서, 상기 관심 화합물이 핵산인 담체;
(11) 상기 (10) 에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, cDNA 또는 안티센스 DNA, 또는 siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, 안티센스 RNA 또는 RNA 레플리콘 (replicon) 인 담체;
(12) 상기 (9) 에 있어서, 상기 관심 화합물이 펩티드 또는 단백질인 담체;
(13) 상기 (9)-(12) 중 어느 하나의 담체와 관심 화합물과의 복합체;
(14) 상기 (13) 의 복합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내로 관심 화합물을 도입하는 방법; 및
(15) 상기 (13) 의 복합체를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비(非)-인간 대상 내의 세포 내로 관심 화합물을 도입하는 방법.
세포 내로 화합물을 도입하기 위한 본 발명의 담체를 이용하면, 혈청의 존재 하에서도 상기 화합물을 세포 내로 매우 고 효율로 도입시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드 지질은 세포 및 살아있는 조직 내에서 분해가능한 (생체분해성) 분자 구조를 가져 세포독성이 낮기 때문에, 또한 안전성에 있어서 바이러스 벡터 및 시판중인 도입 시약보다 우수하다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 펩티드 지질의 머리부분 (head) 의 길이가 CHO 세포 (도 1A) 및 HC 세포 (도 1B) 내로의 플라스미드 DNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2 는 CHO-EGFP 세포 내로의 siRNA 의 도입 효율 및 상기 세포에 대한 세포독성에 있어서 본 발명의 펩티드 지질 및 Lipofectamine 2000 의 용량 의존성을 나타내는데, 이 때 막대 그래프는 상대적인 EGFP 발현 (%) 을 나타내고, 선 그래프는 세포 생존율 (%) 을 나타낸다.
도 3 은 펩티드 지질의 머리부분의 길이가 CHO-EGFP 세포 내로의 siRNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4 는 염기성 아미노산 머리부분을 가진 펩티드 지질이 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5 는 다양한 연결자 (connector) 를 가진 펩티드 지질이 CHO-EGFP 세포 내로의 siRNA 의 도입 효율에 미치는 영향 및 상기 세포에 대한 세포독성을 나타내는 것으로서, 이 때 백색 막대는 상대적인 EGFP 발현 (%) 을 나타내고, 흑색 막대는 세포 생존율 (%) 을 나타낸다.
도 6 은 펩티드 지질의 꼬리부분 (tail) 의 길이가 CHO 세포 (도 6A) 및 HC 세포 (도 6B) 내로의 플라스미드 DNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7 은 불포화 탄화수소기를 가진 펩티드 지질이 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8 은 덴드리머 타입 아미노산 서열을 가진 펩티드 지질이 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 양식
세포 내로 화합물을 도입하기 위한 본 발명의 담체 (이하, "본 발명의 담체" 로도 지칭됨) 는 임의의 아미노산 또는 펩티드로 이루어진 머리 부분이 임의의 아미노산을 포함하는 연결자 부분을 통해 임의의 탄화수소 사슬로 이루어진 꼬리 부분에 결찰된 구조를 가진 펩티드 지질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 담체는 하기 화학식 (I) 으로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다:
Figure 112008069163579-pct00002
{식 중, R1 은 아미노산 또는 1-10 개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드이고, R2 는 임의의 아미노산의 측쇄이고, R2 가 카르복실기를 갖는 경우, 상기 카르복실기는 탄소수 1-30 의 탄화수소기를 가진 에스테르일 수 있고, R3 은 탄소수 1-30 의 탄화수소기이다}. 즉, R1 은 머리부분에 해당하고, -NHCH(R2)CO- 는 연결자에 해당하고, OR3 은 꼬리부분에 해당한다.
바람직하게는, R1 은 아미노산 또는 1-5 개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드이다. R1 을 구성하는 아미노산은 20 개의 자연 발생 아미노산 (Gly, Ara, Leu, Ile, Val, Arg, Lys, Glu, Gln, Asp, Asn, Cys, Met, His, Pro, Phe, Tyr, Thr, Ser, Trp), 또는 변형 또는 비정상 (nonnative) 아미노산 (예컨대, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록시리신, 노르발린, 노르류신, 오르니틴 등) 일 수 있다. 상기 아미노산이 C-말단이 아닌 다른 위치에서 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖는 경우, 상기 카르복실기는 아미드화 또는 에스테르화될 수 있다. 이 경우 사용되는 에스테르의 예로서는, C1-6 알킬기, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등; C3-8 시클로알킬기, 예를 들어, 시클로펜틸, 시클로헥실 등; C6-12 아릴기, 예를 들어, 페닐, α-나프틸 등; 페닐-C1-2 알킬기, 예를 들어, 벤질, 펜에틸 등; C7-14 아르알킬기, 예를 들어, α-나프틸메틸과 같은 α-나프틸-C1-2-알킬기; 피발로일옥시메틸기; 등을 언급할 수 있다.
나아가, R1 의 N-말단 아미노산 또는 임의의 구성 아미노산의 아미노기는 보호기 (예를 들어, C1-6 아실기, 예컨대 포르밀기 및 아세틸기와 같은 C1-6 알카노일) 로 보호될 수 있고; 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기 (예를 들어, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 도 적절한 보호기 (예를 들어, C1-6 아실기, 예컨대 포르밀기 및 아세틸기와 같은 C1-6 알카노일기, 등) 로 보호될 수 있다.
R1 은 비분지형 또는 분지형 (덴드리머 타입) 펩티드일 수 있다. 예를 들어, R1 이 Arg 및 Lys 과 같은 측쇄 상에 아미노기를 가진 아미노산을 포함하는 경우, 상기 아미노기를 다른 아미노산 또는 펩티드의 카르복실기에 결합시켜 분지형 사슬을 형성시킬 수 있다. 덴드리머 타입 펩티드는 N-말단에 2 개 이상의 Arg/Lys 를 갖기 때문에, 이는 더욱 양으로 하전될 수 있는데, 이는, 예를 들어, 상기 펩티드가 음전하를 가진 핵산 또는 단백질에 직접 결합하는 경우 유리할 수 있다. 또한, R1 이 Glu 및 Asp 와 같은 측쇄 상에 카르복실기를 가진 아미노산을 포함하는 경우, 상기 카르복실기를 다른 아미노산 또는 펩티드의 아미노기에 결합시켜 분지형 사슬을 형성시킬 수 있다. 나아가, R1 이 Cys 를 포함하는 경우, 상기 Cys 와 다른 Cys 또는 이를 포함한 펩티드 간의 이황화 결합을 통해 분지형 사슬을 형성시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, R1 은, 음전하를 가진 핵산 또는 단백질에 직접 결합할 수 있다는 점에서, 양으로 하전된 아미노산 (예컨대, Arg 및 Lys) 을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, R1 은, 이황화 결합을 통해 티올화 핵산 또는 단백질에 결합할 수 있다는 점에서, 측쇄에 티올기를 가진 아미노산 (예컨대, Cys) 을 포함할 수 있다. 상기 이황화 결합은 세포 내에서 환원되어, 관심 화합물, 핵산 또는 단백질은 용이하게 방출될 수 있다. 또한, Cys 등의 티올기를 형광물질 (예컨대, FITC, 로다민, Cy3 등) 로 개질하여 조직 또는 세포에서의 담체 자체의 거동 및 핵산 등의 관심 화합물에 결합시 상기 담체의 구조적 변화를 관찰할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, R1 은, 금속으로 개질된 (예컨대, 킬레이트화) 핵산 등에 결합할 수 있다는 점에서, 금속에 대한 친화성이 높은 아미노산 (예컨대, Met 및 His) 을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, R1 은, 수소 결합 등을 통해 관심 화합물, 핵산 또는 단백질의 측쇄에 있는 작용기에 결합할 수 있다는 점에서, 측쇄에 히드록실기를 가진 아미노산 (예컨대, Thy, Thr 및 Ser) 을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, R1 은, 히스톤과 같은 핵산-결합 단백질 등으로 개질된 핵산 (상기 결합 단백질 때문에 양의 알짜 전하를 가짐) 에 결합할 수 있다는 점에서, 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, Glu 및 Asp) 을 포함할 수 있다.
또한 적절한 경우 상기 언급한 것 이외의 아미노산을 사용하는 것도 바람직하다. 예를 들어, 담체와 표적 세포 간의 상호작용을 향상시키기 위해 세포 인식을 위한 신호 펩티드, 신경전달물질 γ-아미노부티르산 (GABA) 등을 이용할 수 있다.
바람직하게는, R1 은 Arg, Lys, Cys, Met, His, Tyr, Glu 및 Asp 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 하나 이상의 잔기를 포함한다. 이들 아미노산은 관심 화합물, 핵산 또는 단백질, 또는 표적 세포와 상호작용할 수 있는 한 R1 내의 임의의 위치에 위치할 수 있으나, 이들 중 적어도 하나는 N-말단에 위치하는 것이 바람직하다. 따라서, R1 의 N-말단 아미노산은 바람직하게는 Arg, Lys, Cys, Met, His, Tyr, Glu 또는 Asp 중 하나, 더욱 바람직하게는 Arg 또는 Lys 이다.
R2 의 예로서는, R1 에 대해 상기 언급한 자연 발생 아미노산 또는 변형 또는 비정상 아미노산의 측쇄를 들 수 있으나, 바람직하게는, 측쇄 상에 카르복실기를 가진 아미노산, 예를 들어, Glu 및 Asp 이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 펩티드 지질은 상기 연결자의 측쇄 상의 카르복실기가 탄소수 1-30 의 포화 또는 불포화 알콜로 에스테르화된 화합물이다. 즉, R2 가 -CH2COOR4 또는 -C2H4COOR4 (식 중, R4 는 탄소수 1-30 의 탄화수소기임) 인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 상기 용어 "탄화수소기"에는 탄소수 1-30 의 탄화수소기, 예를 들어, "알킬기", "시클로알킬기", "알케닐기", "시클로알케닐기", "알키닐기", "아릴기", "아르알킬기", "시클로알킬알킬기" 등이 포함된다. 이들 탄화수소기는 하나 이상의 적당한 치환기로 치환될 수 있다. 이러한 치환기의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C6 아릴, C2-C5 헤테로아릴, C3-C6 시클로알킬, C1-C6 알콕시, CN, OH, 옥소, 할로, COOH, NH2, NH(C1-C6 알킬), N(C1-C6 알킬)2, NH(C6 아릴), N(C6 아릴)2, CHO, CO(C1-C6 알킬), CO(C6 아릴), COO(C1-C6 알킬), COO(C6 아릴), 등이 포함된다.
"알킬기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "비분지형 또는 분지형 C1-30 알킬기", 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 아이코사닐 (icosanyl), 헤니코사닐 (henicosanyl), 도코사닐, 트리코사닐, 테트라코사닐, 펜타코사닐, 헥사코사닐, 헵타코사닐, 옥타코사닐, 노나코사닐, 트리아콘틸 (triacontyl) 등이 포함된다.
"시클로알킬기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "C3-8 시클로알킬기", 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등이 포함된다.
"알케닐기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "비분지형 또는 분지형 C2-30 알케닐기", 예컨대 비닐, 알릴, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 트리데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 노나데세닐, 아이코세닐 (icosenyl), 헤니코세닐 (henicosenyl), 도코세닐, 트리코세닐, 테트라코세닐, 펜타코세닐, 헥사코세닐, 헵타코세닐, 옥타코세닐, 노나코세닐, 트리아콘테닐 등이 포함된다.
"시클로알케닐기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "C3-8 시클로알케닐기", 예컨대, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐, 시클로옥테닐 등이 포함된다.
"알키닐기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "비분지형 또는 분지형 C2-30 알키닐기", 예컨대 에티닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐, 운데시닐, 도데시닐, 트리데시닐, 테트라데시닐, 펜타데시닐, 헥사데시닐, 헵타데시닐, 옥타데시닐, 노나데시닐, 아이코시닐 (icosynyl), 헤니코시닐 (henicosynyl), 도코시닐, 트리코시닐, 테트라코시닐, 펜타코시닐, 헥사코시닐, 헵타코시닐, 옥타코시닐, 노나코시닐, 트리아콘티닐 등이 포함된다.
"아릴기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "C6-14 아릴기", 예컨대 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 펜안트릴, 안트릴 등이 포함된다.
"아르알킬기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "C7-30 아르알킬기 (즉, C6-24 아릴-C1-6 알킬기)", 예컨대 벤질, 펜에틸, 3-페닐프로필, 4-페닐부틸, (1-나프틸)메틸, 2-(1-나프틸)에틸, 2-(2-나프틸)에틸 등이 포함된다.
"시클로알킬알킬기"의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, "C3-8 시클로알킬-C1-6 알킬기", 예컨대 시클로프로필메틸, 시클로부틸메틸, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸, 시클로헵틸메틸, 시클로옥틸메틸, 2-시클로프로필에틸, 2-시클로부틸에틸, 2-시클로펜틸에틸, 2-시클로헥실에틸, 2-시클로헵틸에틸, 2-시클로옥틸에틸 등이 포함된다.
R3 및 R4 는 바람직하게는 탄소수 10-20 의 비분지형 포화 탄화수소기 (즉, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, n-에이코사닐, n-헤니코사닐, n-도코사닐, n-트리코사닐, n-테트라코사닐, n-펜타코사닐, n-헥사코사닐, n-헵타코사닐, n-옥타코사닐, n-노나코사닐 및 n-트리아콘틸) 또는 비분지형 불포화 탄화수소기 (예컨대, 모노-불포화 탄화수소기, 예컨대 trans-2-부텐-1-일, cis-9-테트라데센-1-일, cis-9-헥사데센-1-일, cis-9-옥타데센-1-일, cis-11-옥타데센-1-일, cis-9-에이코사엔-1-일, cis-13-도코사엔-1-일 및 cis-15-테트라코사엔-1-일, 디-불포화 탄화수소기, 예컨대 cis-9-cis-12-옥타데크디엔-1-일, 트리-불포화 탄화수소기, 예컨대 cis-9-cis-12-cis-15-옥타데크트리엔-1-일 및 cis-9-cis-11-cis-13-옥타데크트리엔-1-일, 테트라-불포화 탄화수소기, 예컨대 cis-4-cis-8-cis-12-cis-15-옥타데크테트라엔-1-일 및 cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-에이코사테트라엔-1-일, 펜타-불포화 탄화수소기, 예컨대 cis-7-cis-10-cis-13-cis-16-cis-19-도코사펜타엔-1-일, 헥사-불포화 탄화수소기, 예컨대 cis-4-cis-7-cis-10-cis-13-cis-16-cis-19-도코사헥사엔-1-일 등) 이다. 더욱 바람직하게는, R3 및 R4 는 탄소수 12-16 의 비분지형 알킬 (즉, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실 및 n-헥사데실) 또는 탄소수 10-20 의 비분지형 불포화 탄화수소 (예컨대, cis-9-테트라데센-1-일, cis-9-헥사데센-1-일, cis-9-옥타데센-1-일, cis-9-옥타데센-1-일, cis-11-옥타데센-1-일, cis-9-에이코사엔-1-일, cis-13-도코사엔-1-일, cis-9-cis-12-옥타데크디엔-1-일, cis-9-cis-12-cis-15-옥타데크트리엔-1-일, cis-9-cis-11-cis-13-옥타데크트리엔-1-일, cis-4-cis-8-cis-12-cis-15-옥타데크테트라엔-1-일, cis-5-cis-8-cis-11-cis-14-에이코사테트라엔-1-일, cis-7-cis-10-cis-13-cis-16-cis-19-도코사펜타엔-1-일, cis-4-cis-7-cis-10-cis-13-cis-16-cis-19-도코사헥사엔-1-일 등) 기이다. R3 및 R4 는 동일한 기일 수 있다.
상기 화학식 (I) 로 표시되는 화합물의 특정 예로서, 하기 화합물들이 예시되나, 이들에 제한되는 것은 아니다:
Figure 112008069163579-pct00003
Figure 112008069163579-pct00004
Figure 112008069163579-pct00005
등.
상기 화학식 (I) 로 표시되는 화합물은 공지의 펩티드 합성법 및 에스테르화법을 조합하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 연결자의 아미노산 (NH2-CH(R2)-COOH) 의 α-카르복실기를 원하는 알콜 (R3-OH) 과 축합시켜 아미노산 에스테르를 제조한 후, 상기 아미노산 에스테르의 아미노기 측 상에서 펩티드 사슬을 연장시켜, R1 펩티드를 합성할 수 있고, 또는 상기 아미노산 에스테르를 사전 합성된 R1 펩티드와 축합시킬 수 있다. 상기 펩티드 합성 방법은, 예를 들어, 고체상 합성 및 액체상 합성 중 임의의 것일 수 있다. R1 펩티드는, R1 을 구성하는 일부 펩티드 또는 아미노산 및 나머지 부분을 축합하고, 생성물이 보호기를 갖는 경우, 상기 보호기를 제거함으로써 제조가능하다. 여기서, 축합 및 보호기 제거는 자체 공지된 방법, 예를 들어, 하기 (i) 및 (ii) 에 기재된 방법으로 이루어질 수 있다.
(i) M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(ii) Schroeder 및 Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
구체적으로, 예를 들어, 상기 화합물은 문헌 [Kanegae 및 Akao, "Design and Synthesis of the Artificial Peptide-Lipids Having Adamantane Group", The Research Reports of Fukuoka Industrial Technology Center, 1998, pp. 113-116] 에 개시된 방법에 따라 합성가능하다.
본 발명의 담체는 상기 언급한 펩티드 지질 분자들 중 1 종을 포함한다. 또한, 상기 담체는 상기 언급한 펩티드 지질 분자들의 2 종 이상을 조합하여 포함할 수 있다. 나아가, 상기 담체는, 세포 내로의 관심 화합물의 고 도입 효율 및 저 세포독성과 같은 본 발명의 이점을 상실하지 않는 것인 한, 상기 언급한 펩티드 지질 분자 이외의 분자, 예를 들어, 양친매성 분자 (예컨대, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 등과 같은 생체막에서 유래한 인지질), 양이온성 지질 분자, 계면활성제 (예컨대, CHAPS, 콜산나트륨, 옥틸글루코시드, N-D-글루코-N-메틸알칸아미드 등), 폴리에틸렌 글리콜, 당지질, 펩티드 지질, 단백질 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 담체는 상기 언급한 펩티드 지질 분자들이 조직화된 집합체 (assembly) 로서, 또는 상기 언급한 펩티드 지질 분자들이 분산 매질 중에 완전히 분산된 형태 (즉, 용액 또는 현탁액) 로 제공된다. "조직화"란, 상기 펩티드 지질을 포함하는 담체-구성 분자들이 소수 결합과 같은 비공유 결합을 통해 서로 집합되는 것을 의미한다. 상기 조직화된 집합체의 예로서는, 담체-구성 분자들의 소수성 부분들 간의 소수 결합에 의해 형성된 이중층 막, 리포좀, 다층 소포체 (vesicle), 리본-모양 집합체, 원반-모양 집합체, 층상 (lamellar) 집합체, 간상 (rod-shaped) 집합체 및 이들의 혼합물이 포함된다. 상기 담체-구성 분자들을 완전히 분산시키는 분산 매질의 예에는, 에탄올, 메탄올 및 DMSO 와 같은 유기 용매가 포함된다.
상기 기술한 펩티드 지질 분자들을 적절한 분산 매질, 예를 들어, 수성 용매 중에 분산시키고, 필요할 경우, 조직화를 유도하는 작업을 수행함으로써 본 발명의 담체를 분자들의 집합체로 제조할 수 있다. "조직화를 유도하는 작업"의 예에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 자체 공지된 다양한 방법, 예컨대 초음파 처리, 가열, 볼텍싱 (vortexing), 에테르 주입, 프렌치 가압법 (French press method), 콜산법, Ca2+ 융합, 동결 및 해동법, 및 역상 증발이 포함된다[이들 방법들에 대한 상세는, 예를 들어, 하기 및 기타에 제공된다: Chapter 2: Preparation of Liposomes (Sunamoto 및 Iwamoto 저), "Liposomes", Nojima, Sunamoto, 및 Inoue, eds. (Nankodo, 1988 발행)]. 특정 상황 하에서는, 또한, 상기 기술한 조직화를 인공적으로 유도하는 작업 수행없이 상기 펩티드 지질을 포함한 담체-구성 분자를 수성 용매 중에서 자발적으로 조립되어 집합체를 형성하도록 (자기-조직화하도록) 하는 것도 가능하다. 자기-조직화에 의해 수득되는 집합체는 보통 상기 기술한 다양한 형태들의 혼합물이지만, 또한 특정 상황하에서는 상기 기술한 조직화를 유도하는 작업을 수행함으로써 단일한 형태의 집합체를 형성시키는 것도 가능하다.
다르게는, 상기 기술한 펩티드 지질 분자를 에탄올, 메탄올, 또는 DMSO 와 같은 유기 용매를 함유한 용액 중에 용해시킴으로써 본 발명의 담체를 완전히 분산된 분자 상태로 제조할 수 있다.
상기 기술한 펩티드 지질 분자의 화학종은 상기 도입되는 화합물 (본원에서는 또한 "관심 화합물"로도 지칭됨) 에 따라 적절하게 선택될 수 있는데; 선택가능한 화합물의 예에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 DNA 를 도입하는 경우에는 상기 기술한 RE-C12, RGE-C12, RE-C14, RE-C16, KE-C14, KE-올레일 등이, 및 siRNA 를 도입하는 경우에는 RE-C12, RGE-C12, RGGE-C12, RE-C14, RGD-C12 등이 포함된다.
본 발명의 담체를 제조하는데 사용되는 상기 기술한 펩티드 지질 분자의 혼합 비율은 제한이 없지만, 예를 들어, 모든 담체-구성 분자들에 대한 몰비를 기준으로 약 0.01 내지 10, 바람직하게는 약 0.1 내지 1 이다.
바람직한 구현 양식에서, 본 발명의 담체를 제조하는데 사용되는 상기 기술한 펩티드 지질 분자는 고체, 겔, 액체 등이나, 이는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 펩티드 지질 분자를 분산시키기 위한 분산 매질의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 수성 용매, 예컨대 물 (탈이온수 등), 염수, 인산 완충 식염수 (PBS), 또는 통상의 세포 배양을 위해 당업자에 의해 사용되는 매질 (예컨대, RPMI1640, DMEM, HAM F-12, 이글 배지 등), 유기 용매, 예컨대 에탄올, 메탄올, 또는 DMSO, 수성 용매 및 유기 용매의 혼합 용매, 등이 있다. 상기 수성 용매에는 바람직하게는 혈청과 같은 단백질 성분이 부재하지만, 또한 폴리리신 처리 등에 의해 단백질 성분을 사전 제거함으로써, 상기 펩티드 지질 분자를 포함한 담체-구성 분자의 조직화, 또는 그 후의 세포 내로 도입된 화합물 및 상기 펩티드 지질 분자들의 집합체 간의 복합체 형성에 대한 저해를 방지하는 것도 가능하다. 상기 세포 내로 도입된 화합물이 RNA 또는 DNA 와 같은 핵산, 또는 올리고펩티드 또는 단백질과 같은 펩티드성 화합물인 경우, RNase 또는 DNase 와 같은 핵산-분해 효소 또는 펩티다제 또는 프로테아제와 같은 단백질- (펩티드)-분해 효소가 섞임에 의해 상기 관심 화합물의 안정성은 감소하고; 따라서, 상기 펩티드 지질 분자의 분산 전에 상기 수성 용매를 열 처리하여 이들 효소를 불활성화하는 것이 바람직하다. 상기 열 처리의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 약 50 내지 약 100℃ 에서의 약 5 분 내지 약 3 시간의 처리를 들 수 있다. 따라서, 상기 수성 용매는 바람직하게는 상기 열 처리를 용인하는 것이다. 핵산을 세포에 도입하는데 통상 사용되는 각종 배양액은 종종 RNase 와 같은 효소의 제거를 용인하지 않지만; 그러나, 심지어 NaCl 또는 염화칼륨과 같은 화합물을 함유한 수성 용액에 분산되는 경우에도, 본 발명에서의 펩티드 지질 분자는 이후의 세포내 도입 작업에서 고 도입 효율을 나타낸다. 따라서, 핵산 또는 펩티드성 화합물과 같은 화합물을 세포 내로 도입하는 경우, 수성 용매는 바람직하게는 상기 기술한 화합물 등을 함유한 수용액이다.
상기 수성 용매의 pH 는 제한이 없지만, pH 4 내지 10 의 범위, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 8 의 범위인 것이 바람직하다.
바람직한 구현 양식에서는, 펩티드-지질-함유 리포좀은 하기 상세히 기술되는 (1) 초음파 처리 또는 (2) 열 처리에 의해 제조된다.
(1) 초음파 처리 방법
먼저, 상기 기술한 펩티드 지질 분자를 유기 용매 (예컨대, 클로로포름 등) 에 용해시키고, 생성된 용액을 가지-모양 플라스크 등의 용기에 넣는다; 상기 용매를 회전식 증발기 등을 사용하여 감압하에서 증발 제거하여 상기 용기의 벽 표면에 얇은 지질막을 형성시킨다. 수성 용매 (예컨대, 인산 완충 용액 (pH 7.0) 등) 를 상기 막에 첨가한 후, 진탕하여 상기 막을 팽창시키고, 그 후 이를, 예를 들어, 볼텍스 믹서 등을 사용하여 분리하여, 다층 리포좀의 현탁액을 수득한다. 상기 분해된 지질 등을 제거하기 위해, Sephadex 2B, 4B 또는 G-50 컬럼 등을 사용하여 겔 여과를 수행할 수도 있다.
상기 생성된 다층 리포좀 현탁액을 얼음조 또는 수조 상에서 초음파분쇄기 (sonicator) (탐침형, 욕조형 등) 를 사용하여 약 1 내지 약 2 분간 (예컨대, 1-분 초음파 처리 및 30-초 간격의 주기를 약 2 내지 4 회 반복함 등) 고출력으로 (예컨대, 약 100 내지 약 200 W) 초음파처리함으로써, 거의 균일한 단층 리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명의 펩티드 지질 분자에서, 적절한 양의 그의 분말을 튜브에 옮기고, MiliQ 물 등을 (최종 농도가 약 20 mM 가 되도록) 첨가하고, 상기 기술한 바와 동일한 초음파 처리를 수행함으로써 펩티드-지질-함유 리포좀을 단독으로 용이하게 제조할 수 있다.
(2) 열 처리 방법
적절한 양의 상기 기술한 펩티드 지질 분자의 분말을 튜브에 옮기고, MiliQ 물 등을 (최종 농도가 약 20 mM 가 되도록) 첨가하고, 상기 혼합물을 약 90℃에서 약 15 분간 가열함으로써 펩티드-지질-함유 리포좀을 제조할 수 있다.
상기 수득된 펩티드-지질-함유 리포좀 내의 펩티드 지질 분자 농도는 사용된 펩티드 지질 분자의 종류 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있는데, 보통은 1 내지 200 mM, 바람직하게는 1 내지 100 mM, 및 더욱 바람직하게는 1 내지 50 mM 범위이다.
상기 농도가 너무 낮으면, 충분한 양의 펩티드-지질-함유 리포좀이 형성되지 않고; 상기 농도가 너무 높으면, 상기 펩티드 지질 분자가 침전될 수 있다.
본 발명의 담체는, 그의 첨가로 인해 세포로의 화합물 도입의 고 효율성 및 낮은 세포독성과 같은 본 발명의 이점 중 어느 것에라도 영향을 주지 않는 한 적절한 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 담체를 생체의 세포 내로 화합물을 도입하기 위해 사용하는 경우에, 상기 첨가제는 약학적으로 허용가능한 것이어야 한다. 예를 들어, 통상적으로 알려진 리포좀 제제에서의 제형을 위한 각종 약학적 첨가제를 사용할 수 있다.
상기 기술한 바와 같이 수득할 수 있는 본 발명의 담체는, 화합물을 세포 내로 저 독성으로 효율적으로 도입하기 위한 약물로서 유용하다. 본 발명의 담체를 사용하여 임의의 화합물을 세포 내로 도입할 수 있는데; 예를 들어, 핵산, 펩티드, 지질, 펩티드 지질, 당, 생체활성 물질, 약물 (독소루비신 (항종양 약물), 다우노루비신 (항종양 약물), 빈크리스틴 (항종양 약물), 빈블라스틴 (항종양 약물), 이다루비신 (항종양 약물), 디부카인 (국소 마취제), 프로프라놀롤 (β 차단제), 퀴니딘 (항부정맥 치료제), 도파민 (강심제 고혈압성), 이미프라민 (항우울제), 디펜히드라민 (항히스타민제), 퀴닌 (항말라리아제), 클로로퀸 (항말라리아제), 디클로페낙 (항염증성 약물) 등), 화장품용 보습제 등 (만니톨 등), 기타 합성 또는 천연 화합물 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 담체를 사용하여 세포 내로 도입할 수 있는 특히 바람직한 화합물은 핵산이다. DNA, RNA, DNA-RNA 키메라 핵산, DNA/RNA 혼성체 등, 임의의 핵산이 사용가능하다. 핵산은 단일가닥 내지 삼중가닥일 수 있으나, 바람직하게는 단일가닥 또는 이중가닥이다. 핵산은, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 또 다른 타입의 뉴클레오티드, 또는 비(非)-뉴클레오티드 골격을 가진 다른 올리고머 (예컨대, 시판중인 펩티드 핵산 (PNA) 등) 또는 특수한 결합을 포함한 또 다른 올리고머 (그러나, 상기 올리고머는 DNA 및 RNA 에서 발견되는 염기 대합 (base pairing) 또는 염기 부착 (base attachment) 을 가능하게 하는 배열을 가진 뉴클레오티드를 포함함) 등일 수 있다. 나아가, 상기 핵산은 또한 공지의 변형이 가해진 것, 예를 들어, 당업계에 공지된 마커를 가진 것, 캡 (cap) 을 가진 것, 메틸화된 것, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드가 유사체로 치환된 것, 분자내 뉴클레오티드로 변형된 것, 예를 들어, 비(非)-전하 결합을 가진 것 (예컨대, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 결합 또는 황-함유 결합 (예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 예를 들어, 단백질의 측쇄기를 가진 것 (뉴클레아제, 뉴클레아제 저해제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등), 당 (예컨대, 단당류 등) 등, 삽입성 화합물을 가진 것 (예컨대, 아크리딘, 소랄렌 (psoralen) 등), 킬레이트 화합물을 가진 것 (예컨대, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 (oxidizing) 금속 등), 알킬화제를 가진 것, 또는 변형된 결합을 가진 것 (예컨대, α 아노머 타입 핵산 등).
예를 들어, 임의 종류의 DNA 를 사용 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있는데; 예로서는 플라스미드 DNA, cDNA, 안티센스 DNA, 염색체 DNA, PAC, BAC 등이 있으며, 플라스미드 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA 가 바람직하고, 플라스미드 DNA 가 더욱 바람직하다. 또한, 플라스미드 DNA 와 같은 원형 DNA 도 제한 엔도뉴클레아제 등으로 적절하게 절단한 후 선형 DNA 로서 사용가능하다. 또한, 임의 종류의 RNA 를 사용 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있는데; 예로서는 siRNA, miRNA, shRNA, 안티센스 RNA, 메신저 RNA, 단일 가닥 RNA 게놈, 이중 가닥 RNA 게놈, RNA 레플리콘, 전이 RNA, 리보솜 RNA 등이 있으며, siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, 안티센스 RNA 및 RNA 레플리콘이 바람직하다.
핵산의 크기는 제한이 없으며; 염색체 (인공 염색체 등) 와 같은 거대 핵산 분자 (예컨대, 약 107 kbp 크기) 로부터 저분자 핵산 (예컨대, 약 5 bp 크기) 까지의 넓은 범위의 핵산을 도입할 수 있으나, 세포 내로의 핵산 도입의 효율을 고려할 때 상기 크기는 15 kbp 이하인 것이 바람직하다. 예를 들어, 플라스미드 DNA 와 같은 고분자 핵산의 크기는 2 내지 15 kbp, 바람직하게는 2 내지 10 kbp 로 예시된다. siRNA 와 같은 저분자 핵산의 크기는 5 내지 1000 bp, 바람직하게는 5 내지 500 bp, 및 더욱 바람직하게는 5 내지 200 bp 로 예시된다.
상기 핵산은 자연 발생적인 것 또는 합성적인 것일 수 있는데; 만약 크기가 100 bp 이하이면, 상기 핵산은 흔히 사용되는 자동 핵산 합성기를 사용하여 포스포트리에틸 방법, 포스포디에스테르 방법 등으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 핵산은 제한이 없으나, 당업자들에 의해 흔히 사용되는 방법으로 정제된 것이 바람직하다.
본 발명의 담체를 예방 및/또는 치료 (이하, "예방/치료"로 약기함) 화합물을 생체의 세포 내로 도입하기 위해 사용하는 구현 양식의 예로서는, 질환의 예방 및/또는 치료를 목적으로 한, 생체내 투여에서의, 소위 말하는 유전자 치료를 포함하는 예방 및/또는 치료를 위한 화합물의 사용이 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현 양식에서, 본 발명의 담체를 사용하여 상기 세포 내로 도입된 화합물은 특정 질환에 대한 예방/치료 활성을 지닌다. 이러한 화합물의 예로서는, 핵산, 펩티드, 지질, 당, 생체활성 물질, 약물, 및 기타 천연 또는 합성 화합물이 있다.
상기 기술한 바와 같이, 유전자 치료는 대략 하기로 나뉠 수 있다: 결여된 유전 정보를 보충하기 위한 것 및 질환에 대한 임의적 (casual) 유전자 (표적 유전자) 의 발현을 제어하기 위한 것.
예를 들어, 표적 유전자의 발현을 제어할 수 있는 화합물이 저분자 핵산인 경우, 상기 저분자 핵산의 예로서는 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 미끼 (decoy) 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 전사 인자 또는 전사 억제 인자가 인식하여 결합할 수 있는 염기 서열이 포함된 올리고뉴클레오티드) 등이 있다.
표적 유전자의 발현을 제어할 수 있는 화합물이 펩티드 또는 단백질인 경우, 상기 펩티드/단백질의 예로서는, 표적 유전자에 결합하여 상기 유전자의 전사를 제어하거나, 또는 표적 유전자의 mRNA 또는 초기 전사 산물에 결합하여 그의 단백질로의 번역을 제어하는 펩티드/단백질, 또는 상기 표적 유전자의 발현을 제어하는 수용체로부터의 신호를 강화할 수 있는 펩티드성 리간드, 또는 상기 신호를 차단할 수 있는 길항제-유사 펩티드/단백질 등이 있다.
다르게는, 질환에 대한 예방/치료 활성을 지닌 화합물은 상기 질환에 대한 임의적 단백질의 활성을 제어할 수 있는 것일 수 있다. 이러한 화합물의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 표적 수용체 단백질에 대한 리간드인 펩티드/단백질, 비(非)-펩티드성 화합물 (예컨대, 지방산, 스테로이드 호르몬 등), 작동제 (agonist) 또는 길항제 활성을 지닌 각종 천연 또는 합성 화합물, 키나아제의 인산화 부위의 일부 아미노산 서열을 모방하는 펩티드 등이 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 담체와 세포 내로 도입시킬 화합물, 바람직하게는 상기 언급한 바의 화합물과의 복합체를 제공한다.
화합물을 세포 내로 도입하기 위해서 상기 기술한 담체를 사용하는 경우, 상기 담체 및 상기 관심 화합물을 서로 접촉시켜, 상기 담체와 상기 관심 화합물과의 복합체 (이하, 단순히 "복합체"로도 지칭함) 를 형성한다. 상기 복합체는, 안정적으로 존재할 수 있는 한, 및 상기 관심 화합물 (핵산, 펩티드 등) 의, 예를 들어, 뉴클레아제, 펩티다제 등에 의한, 분해가 억제되는 한, 어떠한 상호작용에 의해서도 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 관심 화합물이 핵산 또는 펩티드와 같은 음으로 하전된 화합물인 경우, 양으로 하전된 펩티드 지질을 함유한 담체를 사용하여 정전기적 상호작용에 기초한 비공유 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다. 상기 관심 화합물이 양으로 하전되어 있거나 또는 비(非)-하전된 경우, 음으로 하전된 펩티드 지질을 함유한 담체를 사용하여 정전기적 상호작용에 기초한 비공유 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다. 다르게는, 상기 담체를 가진 복합체는 또한 또 다른 상호작용을 개재시켜, 또는 상기 관심 화합물을 사전에 음으로 하전된 화합물에 결합시켜 형성할 수도 있다. 기타 상호작용의 예로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, R1 에 대한 구성 아미노산의 바람직한 구현 양식에 대하여 상기 기술한 상호작용을 들 수 있다.
상기 복합체의 형태에 관해서는, 예를 들어, 상기 담체가 리포좀인 경우, 상기 화합물은 상기 리포좀에 결합한 형태로 또는 상기 리포좀 내에 혼입된 형태로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 상기 리포좀 내에 혼입된 형태이다.
상기 기술한 담체 및 상기 관심 화합물의 복합체는 상기 관심 화합물 및 상기 담체를 함유한 수성 용매를 혼합하고, 당해 혼합물을 인큐베이션함으로써 수득된다. 상기 수성 용매의 종류는 상기 기술한 바와 동일하다.
상기 인큐베이션 동안의 온도는 바람직하게는 상기 기술한 펩티드-지질-함유 리포좀의 제조 방법에서와 동일한 온도 범위로 설정한다.
상기 혼합물 중의 상기 기술한 담체의 농도는 사용된 펩티드 지질 분자의 종류 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있으며, 보통은 1 내지 200 mM, 바람직하게는 1 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 50 mM, 및 가장 바람직하게는 10 내지 30 mM 범위이다.
상기 농도가 너무 낮으면, 충분한 양의 안정한 복합체가 형성되지 않고; 상기 농도가 너무 높으면, 상기 담체가 침전될 수 있다.
상기 혼합물 중의 상기 관심 화합물의 농도는 사용되는 화합물의 종류 및 크기 (분자량) 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있는데; 상기 화합물이 핵산인 경우, 이의 농도는 보통 약 0.01 내지 약 100 ng/㎕ 범위이다.
상기 화합물이 DNA 인 경우, 이의 농도는 보통 3 내지 100 ng/㎕ 범위이다. 예를 들어, 상기 DNA 가 통상의 플라스미드 DNA (크기가 약 3 kbp) 인 경우, 상기 혼합물 중의 상기 DNA 농도는 바람직하게는 10 내지 90 ng/㎕, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 ng/㎕, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 70 ng/㎕, 및 가장 바람직하게는 40 내지 60 ng/㎕ 범위이다.
상기 농도가 너무 낮으면, 세포 내로 도입되는 상기 DNA 가 예기된 기능을 발휘할 수 없으며; 상기 농도가 너무 높으면, 반대로 핵산 도입 효율이 저하된다.
상기 화합물이 RNA 인 경우에도, 이의 농도는 상기 RNA 의 크기 등을 고려하여 적절하게 설정될 수 있는데; 상기 RNA 의 크기가 약 수 kbp (kilobase pair) 인 경우, 상기 기술한 혼합물 중의 상기 RNA 농도는 보통 3 내지 100 ng/㎕, 바람직하게는 10 내지 90 ng/㎕, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 ng/㎕, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 70 ng/㎕, 및 가장 바람직하게는 40 내지 60 ng/㎕ 범위이다.
특히, 상기 핵산이 siRNA 와 같이 약 20 내지 약 200 bp 로 작은 경우, 상기 핵산의 농도는 보통 1 내지 500 nM, 바람직하게는 20 내지 400 nM, 더욱 바람직하게는 20 내지 300 nM, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 200 nM, 및 가장 바람직하게는 20 내지 100 nM 범위이다.
상기 농도가 너무 낮으면, 세포 내로 도입되는 상기 RNA 가 예기된 기능을 발휘할 수 없으며; 상기 농도가 너무 높으면, 반대로 핵산 도입 효율이 저하된다.
상기 관심 화합물 및 상기 담체를 함유한 수성 용매를 혼합한 후의 인큐베이션 시간은 사용되는 시약의 종류 및 기타 조건들을 고려하여 적절하게 설정할 수 있으며, 보통 0.5 내지 500 분, 바람직하게는 0.5 내지 200 분, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 120 분, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 60 분, 및 가장 바람직하게는 1 내지 45 분 범위이다.
상기 인큐베이션 시간이 너무 짧으면, 상기 관심 화합물 및 상기 담체 간의 복합체 형성이 불충분하고; 상기 인큐베이션 시간이 너무 길면, 형성되는 복합체가 일부 경우 불안정해지고; 두 경우 모두, 상기 관심 화합물에 대한 도입 효율이 감소한다.
상기 기술한 단계에 의해, 상기 관심 화합물 및 이를 세포 내로 도입하는데 사용되는 담체를 함유한 혼합물 (이하, 또한 "복합체-함유 용액"으로도 기술됨) 을 수득할 수 있다.
나아가, 상기 기술한 단계에서 수득한 복합체 및 세포를 서로 접촉시켜, 상기 복합체에 함유된 상기 관심 화합물을 세포 내로 도입시킬 수 있다.
상기 기술한 "세포"의 종류는 이들이 유래된 것이 원핵생물이건 또는 진핵생물이건 제한이 없지만, 진핵생물이 바람직하다. 진핵생물의 종류 또한 제한이 없으며, 척추동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물 (인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 소 등), 조류 (닭, 타조 등), 양서류 (개구리 등), 및 어류 (제브라피쉬 (zebrafish), 킬리피쉬 (killifish) 등), 무척추동물, 예컨대 곤충류 (누에, 나방, 초파리 등), 식물, 효모와 같은 미생물 등으로 예시된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서의 대상 세포는 동물 또는 식물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이다.
상기 세포는 암 세포를 비롯한 배양된 세포주의 세포, 개체 또는 조직에서 단리한 세포, 또는 조직 또는 조직 분획의 세포일 수 있다. 상기 세포는 또한 부착성 세포 또는 비(非)-부착성 세포일 수 있다.
상기 복합체 및 세포를 서로 접촉시키는 단계는 하기에서 보다 상세히 기술될 것이다.
상기 세포를 상기 복합체와 접촉시키기 전에 적절한 배지 중에서 수일간 현탁시키고, 적절한 조건 하에서 배양한다. 상기 복합체와의 접촉 시점에서, 상기 세포는 로그대수기일 수도 있고 아닐 수도 있다.
상기 접촉 시점에서 사용되는 배양액은 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있으나, 상기 배지 중의 혈청 농도는 30% 이하인 것이 바람직하고, 바람직하게는 20% 이하이다. 그 이유는, 배지 중에 혈청과 같은 단백질이 과량으로 존재하면 이로 인해 상기 복합체 및 세포의 접촉이 저해될 수 있기 때문이다.
상기 접촉시의 세포 밀도는 제한이 없으며, 세포의 종류 등을 고려하여 적절히 설정될 수 있는데, 보통 0.1x105 내지 5x105 세포/mL, 바람직하게는 0.1x105 내지 4x105 세포/mL, 더욱 바람직하게는 0.1x105 내지 3x105 세포/mL, 더욱 더 바람직하게는 0.2x105 내지 3x105 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 0.2x105 내지 2x105 세포/mL 범위이다.
상기 기술한 복합체-함유 용액을 상기와 같이 제조한 세포-함유 배지에 첨가한다. 첨가되는 복합체-함유 용액의 양은 제한이 없으며, 세포수 등을 고려하여 적절하게 설정될 수 있고, 보통 배지 1 mL 당 1 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 1 내지 500 ㎕, 더욱 바람직하게는 1 내지 300 ㎕, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 200 ㎕, 및 가장 바람직하게는 1 내지 100 ㎕ 범위이다.
상기 복합체-함유 용액을 상기 배지에 첨가한 후, 세포를 배양한다. 배양 동안의 온도, 습도, CO2 농도 등은 세포의 종류를 고려하여 적절하게 설정한다. 포유동물 세포의 경우, 정상 조건은 약 37℃ 온도, 약 95% 습도, 및 약 5% CO2 농도이다.
배양 시간 또한 사용되는 세포의 종류 및 기타 조건들을 고려하여 적절하게 설정할 수 있고, 보통 1 내지 72 시간, 바람직하게는 1 내지 60 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 48 시간, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 40 시간, 및 가장 바람직하게는 1 내지 32 시간 범위이다.
상기 기술한 배양 시간이 너무 짧으면, 상기 관심 화합물의 상기 세포 내로의 도입이 불충분하고; 상기 배양 시간이 너무 길면, 상기 세포는 활기가 덜해질 수 있다.
상기 화합물을 상기 기술한 배양에 의해 상기 세포 내로 도입하는데; 바람직하게는, 상기 배지를 새로운 배지로 대체하여, 또는 상기 배지에 새로운 배지를 첨가하여 상기 배양을 지속한다. 상기 세포가 포유동물 기원인 경우, 상기 새로운 배지는 바람직하게는 혈청 또는 영양 인자를 함유한다.
상기 추가 배양 시간은 도입되는 화합물의 예기되는 기능 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있는데; 상기 화합물이 발현 벡터와 같은 플라스미드 DNA 인 경우, 상기 시간은 보통 8 내지 72 시간, 바람직하게는 8 내지 60 시간, 더욱 바람직하게는 8 내지 48 시간, 더욱 더 바람직하게는 8 내지 36 시간, 및 가장 바람직하게는 12 내지 32 시간 범위이다. 상기 화합물이 siRNA 와 같은 표적 유전자의 발현을 제어할 수 있는 저분자 핵산인 경우, 상기 시간은 보통 0 내지 72 시간, 바람직하게는 0 내지 60 시간, 더욱 바람직하게는 0 내지 48 시간, 더욱 더 바람직하게는 0 내지 36 시간, 및 가장 바람직하게는 0 내지 32 시간 범위이다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 담체 및 화합물의 복합체를 사용함으로써, 상기 화합물을 시험관내뿐 아니라 생체내에서도 세포 내로 도입할 수 있다. 즉, 상기 복합체를 수용자에 투여함으로써, 상기 복합체는 표적 세포에 이르러 그에 접촉하게 되고, 이에 의해 생체내에서 상기 복합체에 함유된 화합물의 상기 세포 내로의 도입이 일어난다.
상기 복합체가 투여될 수 있는 수용자는 제한이 없으며, 척추동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물 (인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 소 등), 조류 (닭, 타조 등), 양서류 (개구리 등), 및 어류 (제브라피쉬, 킬리피쉬 등), 무척추동물, 예컨대 곤충류 (누에, 나방, 초파리 등), 식물 등으로 예시된다. 바람직하게는, 상기 복합체의 수용자는 인간 또는 또 다른 포유동물이다.
상기 복합체를 투여하는 방법은, 상기 복합체가 표적 세포에 이르러 접촉하게 되어, 상기 복합체에 함유된 상기 관심 화합물이 상기 세포 내로 도입될 수 있는 한 제한이 없으며; 관심 화합물의 종류, 표적 세포의 종류 및 부위 등을 고려하여, 자체 공지된 투여 방법 (경구 투여, 비경구 투여 (정맥내 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 분무 등) 등) 을 적절하게 선택할 수 있다.
상기 복합체의 투여량은, 상기 세포 내로의 상기 화합물의 도입이 이루어질 수 있는 한 제한이 없으며, 수용자의 종류, 투여 방법, 관심 화합물의 종류, 표적 세포의 종류 및 부위 등을 고려하여, 적절하게 선택할 수 있다. 경구 투여의 경우, 예를 들어, 인간 (체중 60 kg) 에 있어서 1회 투여당 보통의 투여량은 상기 복합체를 기준으로 약 0.001 mg 내지 10000 mg 이다. 비경구 투여 (예컨대, 정맥내 투여 등) 의 경우, 예를 들어, 인간 (체중 60 kg) 에 있어서 1회 투여당 보통의 투여량은 상기 복합체를 기준으로 약 0.0001 mg 내지 3000 mg 이다. 또 다른 동물의 경우, 60-kg 체중당 전환된 투여량을 투여할 수 있다.
본 발명의 담체를 사용하면 세포 내로 화합물을 매우 고 효율로 도입하는 것이 가능해지기 때문에, 본 발명은 시험관내 또는 생체내에서 세포 내로 화합물을 도입하기 위한 담체를 함유한 작용제를 제공한다. 상기 작용제는 연구 시약, 약제 등으로 제공될 수 있다. 상기 기술한 방법에서 상기 작용제를 사용함으로써, 원하는 화합물을 세포 내로 용이하게 도입할 수 있다.
본 발명의 담체를 세포 내로 화합물을 도입하는 작용제로서 사용하는 경우, 이는 통상의 방법에 의해 제형물로서 제조될 수 있다.
상기 작용제가 연구 시약으로서 제공되는 경우, 본 발명의 담체는 그대로, 또는 예를 들어, 물 또는 기타 생리학상으로 허용가능한 액체 (예컨대, 상기 기술한 수용성 용매, 에탄올, 메탄올 및 DMSO 와 같은 유기 용매, 상기 수용성 용매 및 유기 용매의 혼합물 등) 중의 현탁액 또는 멸균 용액으로 제공될 수 있다. 상기 작용제는 자체 공지된 생리학상으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 충전제, 비히클, 방부제, 안정화제, 및 결합제를 적절하게 함유할 수 있다.
상기 작용제가 약제로서 제공되는 경우, 본 발명의 담체는, 일반적으로 허용되는 제제 설계에 요구되는 단위 투여 형태에서, 경구 제제 (예컨대, 정제, 캡슐 등) 또는 비경구 제제 (예컨대, 주사 제제, 분사 제제 등) 로서, 그대로, 또는 담체, 착향제, 충전제, 비히클, 방부제, 안정화제 및 결합제와 같은 공지의 약학적으로 허용가능한 첨가제와의 블렌드로서 제조될 수 있다.
정제, 캡슐 등에서 블렌딩될 수 있는 첨가제의 예로서는 젤라틴, 옥수수전분, 트라가칸트 및 아카시아와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 충전제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽윤제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노 오일 (akamono oil) 또는 체리와 같은 착향제, 등을 사용할 수 있다. 상기 제형 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 기술한 타입의 물질은 오일 또는 지방과 같은 액체 담체를 추가로 함유할 수 있다. 주사 제제용 수성 용액의 예는 염수, 글루코오스 및 또 다른 보조물 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 을 함유한 등장성 용액 등이고, 이는 적절한 가용화제, 예를 들어, 알콜 (예컨대, 에탄올), 폴리알콜 (예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비(非)-이온성 계면활성제 (예컨대, Polysorbate 80TM, HCO-50) 등과 조합하여 사용할 수 있다. 상기 유성 액체의 예는, 참깨유, 대두유 등이고, 이는 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알콜과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다.
상기 기술한 작용제는 또한, 예를 들어, 완충제 (예컨대, 인산 완충 용액, 아세트산나트륨 완충 용액), 진정제 (예컨대, 염화 벤즈알코늄, 염산 프로카인 등), 안정화제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질 알콜, 페놀 등), 산화방지제 (예컨대, 아스코르브산 등) 등과 함께 제형화될 수 있다.
이들 작용제에 함유되는 본 발명의 담체의 양은, 상기 담체를 상기 기술한 방법에서 사용할 때 세포 내로의 화합물의 도입을 성취할 수 있는 한, 제한이 없으며; 상기 양은 투여 형태의 종류, 도입되는 화합물의 종류 등에 따라 적절하게 선택가능하다.
다르게는, 본 발명의 작용제에 함유되는 담체는 세포 내로 도입시키기를 바라는 화합물과의 복합체일 수 있다.
본 발명의 담체는 또한 화합물을 세포 내로 도입시키기 위한 키트로서 제공될 수 있다. 상기 키트는 본 발명의 담체를 사용하여 화합물을 세포 내로 도입시키는 방법에서 사용될 수 있는 임의의 시약, 등 (예컨대, 상기 기술한 수성 용매, 제조 프로토콜이 기재된 사용 설명서, 반응 용기 등) 을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트를 사용함으로써, 상기 기술한 방법에 따라 원하는 화합물을 세포 내로 용이하게 도입할 수 있다.
본 발명을 실시예를 들어 하기에서 상세히 설명하나, 이는 어떤 방식으로든 한정적인 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 펩티드 지질의 합성 및 제조
(1) 펩티드 지질의 합성 (RE-C12 의 합성 방법)
아미노산 (L-글루탐산; E), 지방 알콜 (도데실 알콜; C12-OH) 및 p-톨루엔술폰산을 톨루엔 용매 중에 혼합하고, 혼합물을 Dean-Stark 트랩이 장치된 반응 용기 중에서 환류하에 가열하였다. 탈수 축합으로 에스테르 결합을 형성시켰다. 냉각(4℃)시켜 E-C12 의 p-톨루엔술포네이트의 결정을 침전시키고, 여과로 수집하고, 저온의 톨루엔으로 세정하여 백색 결정을 수득하였다. 그 후, Boc 로 보호된 아미노산 (Boc-Arg(Boc)2-OH) 을 HOBt, WSC 및 TEA 의 공존 하에서 디메틸포름아미드 용매 중에서 E-C12 와 축합시켰다. 합성된 물질 (Boc-Arg(Boc)2-Glu-C12) 을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 상기 Boc 보호를 트리플루오로아세트산으로 제거하여 Arg-Glu-C12(RE-C12) 를 수득하였다. NMR 을 사용하여 정체를 확인하였다. 유사한 방법으로 다른 펩티드 지질들을 합성하였다.
(2) 펩티드 지질 수용액의 제조
다양한 펩티드 지질을 용해하여 각종 1.3 mM 펩티드 지질 수용액 (1.0 ml) 을 생성하고, 이를 초음파 처리로 분산하였다.
실시예 2 머리부분 길이가 다양한 펩티드 지질들을 사용한, 플라스미드 DNA 의 배양된 세포 내로의 도입
배양된 세포 (CHO 세포, HC 세포) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(CHO 세포; 10% FBS-함유 DMEM 배지, HC 세포; 10% FBS-함유 DMEM/F-12 배지), 도입시에 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
플라스미드 DNA (pCMV-IE-hsGFP; NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매함, 웰당 1 ㎍) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RE-C12, RGE-C12, RGGE―C12, RGGGE―C12, RE-C14, RGE-C14, RGGE―C14, RGGGE―C14, 각 5 ㎕) 을 상기 언급한 플라스미드 DNA 용액과 혼합하고, 상기 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 ― DNA 복합체를 생성하였다. 상기 복합체를 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 상기 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 형광성 세포를 유세포 분석기 (flow cytometer) 로 측정하였다. 결과는 도 1 에 나타나 있다. 담체로서 펩티드 지질을 사용함에 의해 세포 내에서 GFP 가 고빈도로 발현되고 상기 세포 내로 플라스미드 DNA 가 고 효율로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 3 다양한 농도의 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로의 siRNA 의 도입에 의한 세포독성
배양된 세포 (CHO―EGFP 세포; 구성적으로 형광인 단백질 EGFP 를 발현하는 CHO 세포로서, 통상의 방법으로 제조함) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
항-EGFP-siRNA (NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 50 pmol) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액 (펩티드 지질용) 및 DMEM 배지 (125 ㎕) (Lipofectamine 2000 용) 와 각각 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RE-C12, RGE-C12, 각각 2-6 ㎕) 및 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 으로부터 구매; LipoA2000) (1-5 ㎕) 을 상기 언급한 siRNA 용액들과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, RE-C12 - RNA 복합체, RGE-C12 - RNA 복합체 및 Lipofectamine 2000 - RNA 복합체를 생성하였다. 상기 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물들을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 상기 세포를 현미경으로 관찰하고, 트리판 블루 (trypan blue) 염색으로 세포 사멸을 결정하였다. 그 결과는 도 2 에 나타나 있다. 담체로서 펩티드 지질을 사용한 경우, 세포독성은 전혀 관찰되지 않았고, 세포 생존율에 있어서 비(非)-도입 세포와의 유의미한 차이는 나타나지 않았으며, 따라서, 펩티드 지질은 세포독성이 낮은 것으로 나타났다. 나아가, 담체로서 펩티드 지질을 사용한 경우, siRNA 에 의해 EGFP 발현이 현저히 억제되었는데, 이 때 그의 능력은 Lipofectamine 2000 와 동등하거나 또는 그보다 더 높았고, siRNA 는 세포 내로 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 4 다양한 머리부분 길이를 가진 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로의 siRNA 의 도입
배양된 세포 (CHO―EGFP 세포; 구성적으로 형광성인 단백질 EGFP 를 발현하는 CHO 세포로서, 통상의 방법으로 제조함) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
항-EGFP-siRNA (NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 50 pmol) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RE-C12, RGE-C12, RGGE―C12, RGGGE―C12, RE-C14, RGE-C14, RGGE―C14, RGGGE―C14, 각각 5 ㎕) 을 상기 언급한 siRNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 ― RNA 복합체들을 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 유세포 분석기로 형광 세포를 측정하였다. 결과는 도 3 에 나타나 있다. 담체로서 펩티드 지질을 사용한 경우, siRNA 에 의해 EGFP 발현이 현저히 억제되었으며, siRNA 는 세포 내로 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 5 염기성 아미노산 머리부분을 가진 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입
배양된 세포 (CHO 세포) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
플라스미드 DNA (pCMV-IE-hsGFP, NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 1 ㎍) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RE-C14, KE-C14, 각각 5 ㎕) 을 상기 언급한 플라스미드 DNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 - DNA 복합체들을 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고 유세포 분석기로 형광성인 세포를 측정하였다. 결과는 도 4 에 나타나 있다. Arg 또는 Lys 이 머리부분으로서 설계된 펩티드 지질들을 사용한 경우, 상기 두 지질 모두에 있어서 GFP 가 세포 내에서 고도로 빈번히 발현되었고, 플라스미드 DNA 가 상기 세포 내로 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 6 다양한 연결자를 가진 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로 siRNA 의 도입
배양된 세포 (CHO―EGFP 세포; 구성적으로 형광성인 단백질 EGFP 를 발현하는 CHO 세포로서, 통상의 방법으로 제조함) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
항-EGFP-siRNA (NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 50 pmol) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RGE-C12, RGD-C12, 각각 5 ㎕) 및 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 으로부터 구매; LipoA2000) (5 ㎕) 을 상기 언급한 siRNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, RGE-C12 ― RNA 복합체, RGD-C12 ― RNA 복합체 및 Lipofectamine 2000 ― RNA 복합체를 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 유세포 분석기로 형광 세포를 측정하였다. 결과는 도 5 에 나타나 있다. 연결자로서 Glu 또는 Asp 를 갖도록 고안된 펩티드 지질을 사용한 경우, siRNA 에 의해 EGFP 발현이 현저히 억제되었으며, siRNA 는 세포 내에서 고도로 효율적으로 발현되었는데, 이 때 이들의 능력은 Lipofectamine 2000 보다 더 높았으며, 이들은 세포독성에서 우수한 것으로 나타났다.
실시예 7 꼬리부분 길이가 다양한 펩티드 지질들을 사용한, 배양된 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입
배양된 세포 (CHO 세포, HC 세포) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(CHO 세포; 10% FBS-함유 DMEM 배지, HC 세포; 10% FBS-함유 DMEM/F-12 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
플라스미드 DNA (pCMV-IE-hsGFP, NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 1 ㎍) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액 (펩티드 지질용) 및 DMEM 배지 (125 ㎕) (Lipofectamine 2000 용) 와 각각 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (RE-C10, RE-C12, RE―C14, RE―C16, 각각 5 ㎕) 및 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 으로부터 구매; LipoA2000) (2.5 ㎕, 프로토콜에 따름) 을 상기 언급한 DNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, RE-C10 - DNA 복합체, RE-C12 - DNA 복합체, RE―C14 - DNA 복합체, RE―C16 - DNA 복합체 및 Lipofectamine 2000 - DNA 복합체를 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 유세포 분석기로 형광 세포를 측정하였다. 결과는 도 6 에 나타나 있다. C10 내지 C16 의 꼬리부분 길이를 갖도록 고안된 펩티드 지질을 사용한 경우, 상기 세포 내에서 GFP 가 발현되었고, 상기 세포 내로 플라스미드 DNA 가 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 8 꼬리부분으로서 불포화 탄화수소기를 가진 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입
배양된 세포 (CHO 세포) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
플라스미드 DNA (pCMV-IE-hsGFP, NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 1 ㎍) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질들 (KE-C14, KE-올레일, 각각 5 ㎕) 을 상기 언급한 플라스미드 DNA 용액과 혼합 하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 ― DNA 복합체들을 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 유세포 분석기로 형광 세포를 측정하였다. 결과는 도 7 에 나타나 있다. 꼬리부분으로서 불포화 탄화수소기를 갖도록 고안된 펩티드 지질을 사용한 경우, GFP 가 또한 상기 세포 내에서 발현되었으며, 상기 세포 내로 플라스미드 DNA 가 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 9 덴드리머 타입 아미노산 서열을 가진 펩티드 지질을 사용한, 배양된 세포 내로의 플라스미드 DNA 의 도입
배양된 세포 (CHO 세포) (1x105 세포/웰) 를 24 웰 플레이트 중에서 24 hr 동안 예비 인큐베이션하고(10% FBS-함유 DMEM 배지), 도입시 상기 배지를 0.5 ml 의 새로운 10% FBS-함유 배지로 교환하였다.
플라스미드 DNA (pCMV-IE-hsGFP, NIPPON GENE CO., LTD. 로부터 구매, 웰당 1 ㎍) 를 25 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하였다. 다양한 1.3 mM 펩티드 지질 (RE-C12, R2KE―C12, (RG)2KE―C12, 각각 5 ㎕) 을 상기 언급한 플라스미드 DNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 ― DNA 복합체들을 생성하였다. 복합체들을 상기 언급한 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24 hr 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 유세포 분석기로 형광 세포를 측정하였다. 결과는 도 8 에 나타나 있다. 덴드리머 타입 아미노산 서열을 머리부분으로서 갖도록 고안된 펩티드 지질을 사용한 경우, 역시, GFP 가 상기 세포 내에서 발현되었고, 상기 세포 내로 플라스미드 DNA 가 고도로 효율적으로 도입된 것으로 나타났다.
실시예 10 펩티드 지질을 사용한, 마우스 내로의 siRNA 의 도입
Cy3-표지된 siRNA (400 pmol, Dharmacon 로부터 구매) 를 200 ㎕ 의 150 mM NaCl 용액과 혼합하고, 1.3 mM 펩티드 지질 (RE-C12) (16 ㎕) 을 상기 언급한 siRNA 용액과 혼합하고, 혼합물을 5 분간 인큐베이션하여, 펩티드 지질 - RNA 복합체를 생성하였다. 이를 Balb/c 마우스 (15-주령) 의 꼬리 정맥에 주입하였다. 상기 마우스에서, 상기 시험된 농도에서 급성 독성은 관찰되지 않았다. 4 시간 후, 상기 마우스를 해부하고, 각 조직 (심장, 폐, 간, 신장, 비장) 을 적출하여, 작은 조각들로 절단하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 결과는 표 1 에 나타나 있다. 담체로서 펩티드 지질을 사용한 경우, siRNA 가 상기 신체 내의 각 조직 내로 도입될 수 있었다. 간 및 비장으로의 도입 효율이 특히 우수하였다.
마우스 내로 siRNA 를 도입함에 있어서 펩티드 지질을 사용한 효과
기관 평가
심장 5%
폐 10%
간 25%
신장 5%
비장 30%
본 발명의 담체는 낮은 세포독성을 나타내며 화합물의 세포내 도입에 있어서 고 효율성이기 때문에, 연구 및 제약 용도를 위한, 화합물의 고도 효율적인 세포내 도입용 시약으로서 유용하다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
    Figure 112013024536716-pct00018
    Figure 112013024536716-pct00019
    Figure 112013024536716-pct00020
    및
    Figure 112013024536716-pct00021
  2. 제 1 항의 화합물을 하나 이상 포함하는, 세포 내로 관심 화합물을 도입하기 위한 담체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 관심 화합물이 핵산인 담체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산이 플라스미드 DNA, cDNA 또는 안티센스 DNA, 또는 siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, 안티센스 RNA 또는 RNA 레플리콘 (replicon) 인 담체.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 관심 화합물이 펩티드 또는 단백질인 담체.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 담체와 관심 화합물과의 복합체.
  7. 제 6 항의 복합체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 단리된 세포 내로 관심 화합물을 도입하는 방법.
  8. 제 6 항의 복합체를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 비(非)-인간 대상 내의 세포 내로 관심 화합물을 도입하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
KR1020087024133A 2006-03-01 2006-03-01 펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법 KR101320735B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2006/304514 WO2007099650A1 (en) 2006-03-01 2006-03-01 Peptide lipid-containing carrier and method for introducing compound into cells using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090008201A KR20090008201A (ko) 2009-01-21
KR101320735B1 true KR101320735B1 (ko) 2013-10-21

Family

ID=37023395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087024133A KR101320735B1 (ko) 2006-03-01 2006-03-01 펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8299129B2 (ko)
JP (1) JP4911416B2 (ko)
KR (1) KR101320735B1 (ko)
CN (1) CN101421293B (ko)
CA (1) CA2644552C (ko)
WO (1) WO2007099650A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9393315B2 (en) 2011-06-08 2016-07-19 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity
AU2008308679B2 (en) * 2007-10-02 2015-01-29 Marina Biotech, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2009148955A2 (en) * 2008-05-29 2009-12-10 Mdrna, Inc Multi-arm amines and uses thereof
ES2727583T3 (es) * 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
JP5733647B2 (ja) 2011-03-30 2015-06-10 福岡県 遺伝子導入補助剤及びそれを用いた遺伝子導入法
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
US9314532B2 (en) 2012-08-10 2016-04-19 University Of North Texas Health Science Center Drug delivery vehicle
WO2022215758A1 (ja) * 2021-04-09 2022-10-13 相互薬工株式会社 脂質および組成物
CN114181200B (zh) * 2021-11-24 2023-09-29 华中科技大学 一种具有高效基因转染效率的阳离子脂质体及制备与应用
CN114874294B (zh) * 2022-03-25 2024-01-30 圣诺生物医药技术(苏州)有限公司 一种多肽化合物、多肽脂质纳米递送系统及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030068379A1 (en) * 2001-08-08 2003-04-10 Li Frank Q. Multifunctional carrier for the delivery of a pharmacological agent or genetic material into a cell

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH553751A (de) 1970-05-19 1974-09-13 Stamicarbon Verfahren zur herstellung von aspartylaminosaeure-estern.
NL7116543A (ko) * 1970-12-05 1972-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd
NL7411563A (nl) * 1973-09-06 1975-03-10 Hoechst Ag Werkwijze voor het bereiden van synthetisch gemodificeerde trypsine-inhibitoren.
JPS5929069B2 (ja) * 1976-01-20 1984-07-18 武田薬品工業株式会社 ジペプチドエステルの製造法
DE2748295A1 (de) * 1977-10-27 1979-05-03 Bayer Ag Neue derivate des bpti
DE2806954A1 (de) * 1978-02-18 1979-08-30 Bayer Ag Neue derivate des bpti, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
ATE67769T1 (de) * 1983-01-25 1991-10-15 Ciba Geigy Ag Neue peptidderivate.
EP0451791A2 (de) * 1990-04-12 1991-10-16 Hoechst Aktiengesellschaft Langwirksame Liposomenpräparate von Peptidarzneistoffen und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP2620727B2 (ja) * 1990-10-26 1997-06-18 富士写真フイルム株式会社 ペプチド脂質
JP2694399B2 (ja) * 1991-05-20 1997-12-24 富士写真フイルム株式会社 ペプチド誘導体
AU666789B2 (en) 1992-12-28 1996-02-22 Takeda Chemical Industries Ltd. 2-amino-6,7-dihydroxy-4-thiaheptanoic acid derivatives, production and use thereof
CA2128552A1 (en) * 1993-07-22 1995-01-23 Hida Tsuneaki Derivatives of 6,7-dihydroxy-4-thiaheptanoic acid and their use
EP0641776A3 (en) * 1993-09-08 1997-05-02 Takeda Chemical Industries Ltd Thioglycerol derivatives.
US7060708B2 (en) 1999-03-10 2006-06-13 New River Pharmaceuticals Inc. Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
WO2005054486A1 (ja) * 2003-12-05 2005-06-16 Fukuoka Prefectural Government 遺伝子導入試薬調製法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030068379A1 (en) * 2001-08-08 2003-04-10 Li Frank Q. Multifunctional carrier for the delivery of a pharmacological agent or genetic material into a cell

Also Published As

Publication number Publication date
CA2644552C (en) 2013-05-28
JP4911416B2 (ja) 2012-04-04
CN101421293A (zh) 2009-04-29
CN101421293B (zh) 2013-09-25
US8299129B2 (en) 2012-10-30
US20090170960A1 (en) 2009-07-02
JP2009528258A (ja) 2009-08-06
CA2644552A1 (en) 2007-09-07
WO2007099650A1 (en) 2007-09-07
KR20090008201A (ko) 2009-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101320735B1 (ko) 펩티드 지질-함유 담체 및 이를 이용하여 화합물을 세포 내로 도입하는 방법
Zhang et al. A prostate cancer-targeted polyarginine-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of microRNA
EP1003558B1 (en) Lipid-polyamide conjugates and compositions for nucleic acid delivery
US10207005B2 (en) Photodynamic therapy composition
AU2004305111A1 (en) Cell transfecting formulations of small interfering RNA, related compositions and methods of making and use
JP2010533170A (ja) 化合物を種々の選択された臓器、組織又は腫瘍細胞に標的化するための分子
KR101755617B1 (ko) 삼차원 자기조립 핵산 나노입자 구조를 갖는 약물전달체
JP2006254877A (ja) 糖脂質を含んだキャリア及びそれを用いた遺伝子導入法
JP5382682B2 (ja) 薬物送達複合体
JP5733647B2 (ja) 遺伝子導入補助剤及びそれを用いた遺伝子導入法
US20220331441A1 (en) Tumor-Targeting Polypeptide Nanoparticle Delivery System for Nucleic Acid Therapeutics
Yan et al. Arginine-rich peptide based nanoparticles with bridge-like structure: Enhanced cell penetration and tumor therapy effect
US20130011448A1 (en) System for improved delivery of gene modulating compounds
KR101000358B1 (ko) 인테그린 αⅤβ３ 결합성 지질 유도체 및 그를 포함하는 지질 나노입자
Yu et al. Microenvironment-responsive DNA-conjugated albumin nanocarriers for targeted therapy
Xie et al. EGFR-targeted and gemcitabine-incorporated chemogene for combinatorial pancreatic cancer treatment
Zabel et al. siRNA Therapeutics for Protein Misfolding Diseases of the Central Nervous System
KR101814879B1 (ko) 유전자 전달체 및 그 제조방법
Hoogenboezem Development of Albumin-Hitchhiking siRNA Conjugates for Therapeutic Mcl-1 Silencing in Triple Negative Breast Cancer
WO2023048572A1 (en) Targeted lipid nanoparticle formulations
JP2006158314A (ja) 化合物の細胞内導入用キャリア剤およびそれを用いた化合物の細胞内導入方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161004

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170927

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190906

Year of fee payment: 7