JPWO2012147714A1 - ｐＨ応答性ペプチドを含むナノ粒子 - Google Patents

Abstract

弱酸性ｐＨ環境中で目的物質を放出し得るナノ粒子及び細胞導入剤を提供する。ペプチドと粒子形成成分を含むナノ粒子であって、前記粒子形成成分がリポソーム又はミセルを形成し、前記ペプチドにおいてその配列中にＨｉｓ（ヒスチジン）で始まり酸性アミノ酸で終わるユニットを２〜８個有し（各ユニットは同一であっても異なっていてもよい）、ナノ粒子。

Description

本発明は、弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むナノ粒子に関する。また、本発明は、前記ナノ粒子を含む物質導入剤に関する。

癌の化学療法において、特異性の向上を目的としたＤＤＳの開発が試みられているが、腫瘍環境に着目したものはほとんどない。即ち、腫瘍組織は生理的条件下（ｐＨ７．４付近）に比べ低ｐＨ（ｐＨ６．５付近）という特殊な環境であるが、このような微弱なｐＨの変化に応答するように腫瘍組織特異的に作用する薬物送達キャリアは未だ開発途上にある。これまでにも、血液中での血漿タンパク質の結合を回避し、血中滞留性を向上させるために親水性高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がリポソームなどの表面に修飾され、抗がん剤などのキャリアとして用いられている（例えば、特許文献１）。しかし、ＰＥＧといえども抗原性があることが明らかになっている。また、ＰＥＧが表面に提示されているキャリアは、細胞への親和性が低いため、細胞に取り込まれ難く、薬物をがん細胞内部まで送り込むことは困難である。特許文献２に記載のペプチド−リポソーム複合体は、Ｎ末端領域に塩基性アミノ酸（リジンもしくはアルギニン）が存在することで正電荷を有しており、ｐＨに依存して電荷が変化することはなく、十分な血中滞留性は期待できない。

非特許文献１は、ｐＨ応答性領域としてＨｉｓセグメントを用いており、外部環境ｐＨが７．４から５．０にまで大幅に低下することによって中性であったＨｉｓがプラスに荷電し、その静電的反発力の増大によってミセルを崩壊させる技術であるが、Ｈｉｓ単独ではｐＨ６．５という微弱酸性ではプロトン化されないため、ｐＨ６．５において電荷反転を生じさせることは困難である。

非特許文献２は、ブロックポリマー末端リジンセグメントに化学的に結合させたジメチルマレイン酸が、ｐＨ低下によって脱離し、それによって表面荷電がマイナスからプラスに転換するｐＨ応答性のミセルである。非特許文献２のペプチドは、いったんジメチルマレイン酸が脱離したら、プラス電荷のリジン残基が露出した状態になり、ｐＨが上昇したとしても元に戻ることはない。血液循環によって炎症部位のようなｐＨが低い組織を通過する場合においてもジメチルマレイン酸が解離し、リジンが露出してしまい、血液成分と相互作用してしまうため、目的とする腫瘍まで到達するのは困難である。

特開２００４−１０４８１号公報 特表２００４−５２３５３１号公報

ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．５６， Ｎｏ．７， ２０１０， ｐｐ．１９２２−１９３１ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３７６ （２００９） １３４−１４０

本発明は、癌組織のような弱酸性ｐＨ環境中で目的物質を放出し得る薬物送達キャリアを提供することを目的とする。

本発明は、下記（１）〜（１６）のナノ粒子及び物質導入剤を提供する。
（１）ペプチドと粒子形成成分を含むナノ粒子であって、前記粒子形成成分がリポソーム又はミセルを形成し、前記ペプチドにおいてその配列中にＨｉｓ（ヒスチジン）で始まり酸性アミノ酸で終わるユニットを２〜８個有し（各ユニットは同一であっても異なっていてもよい）、ナノ粒子。
（２）前記ユニットにおいて、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に２〜５個のアミノ酸を有する、（１）に記載のナノ粒子。
（３）前記ユニットにおいて、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に３個のアミノ酸を有する、（１）又は（２）に記載のナノ粒子。
（４）前記Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に配列されるアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎから選択される任意のアミノ酸である（２）又は（３）に記載のナノ粒子。
（５）前記Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に配列されるアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ又はＳｅｒから選択される任意のアミノ酸である（４）に記載のナノ粒子。
（６）前記ペプチドが、下記式（Ｉ）
Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ （Ｉ）
（式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、同一又は異なって、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。）
で表されるユニットを２〜８個含み、各ユニットのアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい、（１）〜（５）のいずれかに記載のナノ粒子。
（７）前記ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のペプチド配列を有することを特徴とする、（６）記載のナノ粒子。
（８）前記ペプチドが、リポソーム又はミセルに保持されるための疎水性基を末端に有する、（１）〜（７）のいずれかに記載のナノ粒子。
（９）前記疎水性基が、炭素数１２〜２４の炭化水素基又はアシル基である、（８）に記載のナノ粒子。
（１０）前記粒子形成成分がリン脂質を含む、（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ粒子。
（１１）前記粒子形成成分がリポソームを形成してなる、（１）〜（１０）のいずれかに記載のナノ粒子。
（１２）前記ナノ粒子に保持される目的物質が、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体よりなる群から選ばれる一種以上である、（１）〜（１１）のいずれかに記載のナノ粒子。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載のナノ粒子を含む物質導入剤。
（１４）下記一般式（II）
Ｒ^１−（Ｚ^１）_ｌ−［Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ］_ｎ−（Ｚ^２）_ｍ−Ｒ^２ （II）
（式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、同一又は異なって、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。ｎは２〜８の整数を示す。ｌ、ｍは同一又は異なって０または１を示す。Ｒ^１は炭素数１２〜２４の炭化水素基又はアシル基を示す。Ｒ^２はＯＨまたはＣ末端保護基を示す。Ｚ^１又はＺ^２はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎのいずれかのアミノ酸から構成され、アミノ酸の数が１〜８個であるリンカーを示す。）
で表され、アミノ酸の総数が１０〜６０個である、ペプチド化合物。
（１５）一般式（II）で表されるペプチド化合物におけるペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のペプチド配列を有することを特徴とする、（１４）記載のペプチド化合物。
（１６）Ｒ^１が、炭素数１２〜２４のアシル基である、（１４）または（１５）に記載のペプチド化合物。

本発明によれば、ｐＨ６．５付近の弱酸性の細胞環境で内部に封入された目的物質を放出可能なナノ粒子又は物質導入剤を提供することができる。

本発明のナノ粒子は、このような弱い酸性領域で目的物質を放出して作用させることができるため、優れた薬物送達システムを提供することができる。

本発明のナノ粒子は、ｐＨ７．４の生理的条件では酸性アミノ酸のマイナス電荷によって血漿成分等との相互作用を回避し、血中滞留性を有するとともに、酸性アミノ酸を隣接させることによってＨｉｓのｐＨ応答性を制御することで微弱酸性でもｐＨに敏感に応答できるため、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeation and Retention Effect）によって腫瘍に到達した後に、腫瘍環境の微弱酸性条件下でプロトン化され電荷が反転することで癌細胞に取り込まれるようになるという高い有用性を有している。

製造例１で得たステアロイル化ペプチド（配列番号１，Ｃ末端はＣＯＮＨ_２）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す。 製造例２で得たステアロイル化ペプチド（配列番号２，Ｃ末端はＣＯＮＨ_２）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す。 製造例３で得たステアロイル化ペプチド（配列番号３，Ｃ末端はＣＯＮＨ_２）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す。 製造例４で得たステアロイル化ペプチド（配列番号４，Ｃ末端はＣＯＮＨ_２）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す。 細胞中の蛍光色素量をフローサイトメーターによって測定した結果を示す。 細胞を共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）を用いて観察した結果を示す。 核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で青色に、エンドソーム／ライソソームをＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ で緑色に染色し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）により観察した結果を示す。 実施例４の担ガンマウスにおける腫瘍内動態評価結果を示す。 ペプチド単体およびペプチド修飾ナノ粒子のＣＤスペクトルと２次構造の組成を予測した結果を示す。 製造例４で得られたスクランブル配列ペプチド修飾リポソームの細胞への取り込みをＦＡＣＳにより評価した結果を示す。 製造例２で得られたペプチド修飾リポソームの細胞への取り込みをＦＡＣＳにより評価した結果を示す。

本発明のナノ粒子は、粒子形成成分とペプチドを構成要素とする。

本発明のペプチドの総アミノ酸数としては、１０〜６０個、好ましくは１２〜４０個、より好ましくは１４〜３０個である。

本発明のペプチドは、Ｈｉｓ（ヒスチジン、Ｈ）と酸性アミノ酸（グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）またはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ））を必須の構成要素として含み、配列中にＨｉｓで始まり酸性アミノ酸で終わるユニットを有する。当該ユニットにおいて、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に２〜５個のアミノ酸、好ましくは３個のアミノ酸を有する。なお、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間のアミノ酸数は、全てのユニットにおいて同数であり、例えば、最初のユニットが３個の場合、以降のユニットにおいても３個となる。当該アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎから選択されるアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ又はＳｅｒである。ペプチドが有する当該ユニットの総数は２〜８個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個であり、隣接するユニットは直接結合する。従って、ユニットとユニットが結合する部分は、酸性アミノ酸とＨｉｓが隣接することとなる。

更に、好ましい１つの実施形態において、本発明のペプチドは、下記式（Ｉ）
Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ （Ｉ）
（式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。）で表されるユニットを２〜８個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個含むものである。

ＡＡ_１、ＡＡ_２又はＡＡ_３の好ましいものとしては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓであり、より好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓである。ペプチド配列におけるＨｉｓの総数は、酸性アミノ酸の総数よりも数が多く、例えば酸性アミノ酸が２個の場合には、Ｈｉｓは３〜７個；酸性アミノ酸が３個の場合には、Ｈｉｓは４〜１０個；酸性アミノ酸が４個の場合には、Ｈｉｓは５〜１３個；酸性アミノ酸が５個の場合には、Ｈｉｓは６〜１６個；酸性アミノ酸が６個の場合には、Ｈｉｓは７〜１９個；酸性アミノ酸が８個の場合には、Ｈｉｓは９〜２５個である。本発明ペプチドは酸性アミノ酸を２〜８個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個有する。Ｈｉｓは３〜２５個、好ましくは３〜１９個、より好ましくは３〜１３個有する。

本発明の特に好ましいユニットは、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕである。本発明のペプチドは、上記のようなユニットの他に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓなどからなるアミノ酸配列（Ｚ^１又はＺ^２；リンカー）をＮ末端又はＣ末端に有していてもよい。このようなリンカー（Ｚ^１又はＺ^２）を構成するアミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎが挙げられ、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓであり、より好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓである。このようなリンカー（Ｚ^１又はＺ^２）のアミノ酸の総数は、各々１〜８個であり、好ましくは２〜６個である。

また、本発明ペプチドのＣ末端にはＣ末端保護基を有していてもよい。Ｃ末端保護基としては、Ｃ末端カルボキシルの炭素原子でアミドを形成する基、又はカルボキシルの酸素原子でエステルを形成する基が含まれる。エステルを形成する基としてはアルキル基、特に炭素数１〜５の直鎖又は分枝鎖アルキル基（Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル基）、例えば、メチル基、エチル基及びプロピル基などが含まれ、アミドを形成する基としてはアミノ基のようなアミン官能基、又はアルキルアミノ官能基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のモノＣ_１〜Ｃ_５アルキルアミノ基及びジＣ_１〜Ｃ_５アルキルアミノ基が含まれ、好ましくはアミドを形成する基であり、より好ましくはアミノ基である。

また、本発明ペプチドは、疎水性基で修飾されている。疎水性基はペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入され、好ましくはＮ末端に導入される。疎水性基は炭素数１２以上、好ましくは炭素数１２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２、より好ましくは炭素数１６〜２０の基であり、炭化水素基、アシル基が挙げられ、アシル基が特に好ましい。疎水性基は直鎖であっても分岐を有していても良い。炭化水素基としては、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクダデシル、エイコシルなどの直鎖又は分岐を有する炭素数１２以上のアルキル基が挙げられ、好ましくはステアリル基である。アシル基としては、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、ベヘノイル基、イソステアロイル基、エイコセノイル基、リグノセロイル基、イソパルミトイル基、オレオイル基、リノロイル基などが好適に例示でき、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イソステアロイル基及びオレオイル基から選択されるものがより好ましい。

本発明の好ましいペプチドとしては、配列番号１〜３のアミノ酸配列のものが挙げられる。好ましい実施形態では該ペプチドのＮ末端にはリポソーム又はミセルに保持されるための疎水性基が結合されている。更に、好ましい１つの実施形態としては、下記一般式（II）で表されるペプチド化合物である。
Ｒ^１−（Ｚ^１）_ｌ−［Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ］_ｎ−（Ｚ^２）_ｍ−Ｒ^２ （II）
［（式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、同一又は異なって、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。ｎは２〜８の整数を示す。ｌ、ｍは同一又は異なって０または１を示す。Ｒ^１は炭素数１２〜２４の炭化水素基又はアシル基を示す。Ｒ^２はＯＨまたはＣ末端保護基を示す。Ｚ^１又はＺ^２はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎのいずれかのアミノ酸から構成され、アミノ酸の数が１〜８個であるリンカーを示す。）で表され、アミノ酸の総数が１０〜６０個である。］
上記式（II）において示される炭化水素基、アシル基、Ｃ末端保護基としては、上述のものが挙げられる。

本発明のペプチドは、公知のペプチド合成法、特に液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入し、発現させる方法によっても合成することができる。例えば、固相合成法では、Ｃ末端に対応するアミノ酸のアミノ基を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などのウレタン型保護基で保護したＮ−保護アミノ酸のカルボキシル基を、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、アミノ基の保護基を除去し、Ｎ末端方向に順次保護アミノ酸を縮合させ、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱保護させて、本発明のペプチドを得ることができる。前記のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、特に限定されないが、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノエチル）フェノキシリンカー樹脂）が好ましく、開裂によって直接目的物を与えることができる。本発明のペプチドの合成に用いる保護アミノ酸は、官能基を公知の方法により公知の保護基で保護することにより得ることができ、市販の保護アミノ酸を使用することもできる。保護基としては公知のものが使用でき、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等を使用できる。保護アミノ酸を調製する場合には、例えば、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法等のような公知の方法を用いることができる。本縮合反応は公知の溶媒中で行うことができ、例えば、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒が例示される。アミノ基の保護基の脱離試薬としては限定されず、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等の公知の試薬によって、Ｆｍｏｃ基等の保護基を切断することができる。ウレタン型保護基の脱保護は、接触還元、トリフルオロ酢酸などを用いて行うことができる。他の保護基も公知の方法により脱保護できる。合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、例えばニンヒドリン反応法のような公知の方法によって確認することができる。上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチドを得ることができる。不溶性樹脂としてＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂を用いた場合、ＴＭＳＢｒ（トリメチルシリルブロミド）やＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）等で処理することにより、樹脂及び保護基を同時に脱離させることができる。なお、ペプチドのＣ末端は使用する樹脂の種類により、ＣＯＯＨ（Ｒ^２＝ＯＨ）またはＣＯＮＨ_２（Ｒ^２＝ＮＨ_２）として得ることができる。

Ｒ^２がＯＨとして定義される場合、本発明ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボン酸は無置換である。同様に、Ｒ^２がＮＨ_２等として定義される場合、本発明ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボン酸はアミド（ＣＯＮＨ_２）である。

また、本発明ペプチドへの疎水性基の導入については、公知慣用の方法を使用することができる。例えば、アシル基の導入については、Ｎ末端がフリーであるペプチドと導入するアシル基に対応するカルボン酸を縮合剤（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ等）、反応促進剤（ＤＩＥＡ等）とともに反応させることにより所望のアシル基を導入することができる。また、炭化水素基の導入については、塩基存在下、導入する炭化水素基に対応するハロゲン化炭化水素との反応によって導入することができる。

このようにして得られた本発明のペプチドは、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着)、電気泳動、向流分配等、公知の手段により単離精製することができ、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が好ましい。

本発明のナノ粒子のゼータ電位は、中性付近のｐＨ（例えばｐＨ７もしくは７．４）で−１００〜５０ｍＶ程度、好ましくは−５０〜３０ｍＶ程度、より好ましくは−３０〜１０ｍＶ程度、特に−３０〜０ｍＶ程度である。ゼータ電位は、ゼータサイザーを用いて測定することができる。

本発明のナノ粒子の平均粒径は、特に限定されるものではないが、例えば、粒子径３０〜１０００ｎｍであり、好ましくは、５０〜５００ｎｍ、より好ましくは６０〜４００ｎｍ、特に７０〜３００ｎｍである。平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法、原子間力顕微鏡観察法等により測定することができる。

本発明の物質導入剤は、目的物質を低ｐＨ部位に送達するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも使用することができる。

低ｐＨ部位としては、炎症部位、腫瘍部位、感染部位などが挙げられ、特に腫瘍部位が好ましく例示される。

ナノ粒子に保持される目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）、タンパク質（酵素、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子、抗体等）、糖又はこれらの複合体よりなる群から選ばれる一種以上が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。

目的物質が薬物の場合、例えば制がん剤、血管拡張薬、抗菌剤などが挙げられる。具体的には、制がん剤として、テガフール、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、イリノテカン、ＳＮ−３８、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、シクロホスファミド、カペシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ビノレルビン、トラスツズマブ、エトポシド、エストラムスチン、プレドニゾン、インターフェロンα、インターロイキン−２、ブレオマイシン、イホスファミド、メスナ、アルトレタミン、トポテカン、シタラビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ゲムツズマブ、イダルビシン、ミトキサントロン、トレチノイン、アレムツズマブ、クロランブシル、クラドリビン、イマチニブ、エピルビシン、ダカルバジン、プロカルバジン、メクロレタミン、リツキシマブ、デニロイキンジフチトクス、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アロプリノール、カルムスチン、タモキシフェン、フィルグラスチム、テモゾロマイド、メルファラン、ビノレルビン、アザシチジン、サリドマイド、およびマイトマイシンなどが挙げられ、血管拡張薬として、ボセンタン、アンブリセンタン、ベラプロストナトリウムなどが挙げられ、抗菌剤として、アムホテリシンＢ、ペニシリンＧ、アンピシリン、セファゾリン、イミペネム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキタマイシン、テリスロマイシン、キヌプリスチン、ホスミドシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、スパルフロキサシン、リネゾリドなどが挙げられる。

目的物質が核酸の場合、例えば部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が好ましく例示される。目的物質は単独で或いは２種以上を混合して用いることができる。例えば２種以上のｓｉＲＮＡを併用することも可能である。

置換および修飾（化学修飾を含む）の１つの実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えばチミジン、アデニン）を含むオーバーハング等、二重鎖ＲＮＡの３’末端の一端または両端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。二重鎖ＲＮＡは、一端または両端に平滑末端を有し得る。一部の実施形態において、第１および第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の普遍的な塩基リボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、５’リン酸塩（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１１０：５６３‐５７４，２００２；およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．１０：５３７‐５６８，２００２を参照）または５’，３’二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含むことができる。

二重鎖ＲＮＡは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、ハロゲン、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アリル、またはこれらの任意の組み合わせ等の２’糖置換をさらに含み得る。さらなる実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、第１の鎖または１つ以上の第２の鎖の一端または両端上に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基をさらに含む。

さらに他の実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、独立してホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホネート、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸塩、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせ等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含み得る。

二重鎖ＲＮＡは、５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；６−メチル、２−プロピル、またはアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体；８−置換されたアデニンおよびグアニン（８−アザ、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル等）；７−メチル、７−デアザ、および３−デアザアデニンならびにグアニン；２−チオウラシル；２−チオチミン；２−チオシトシン；５−メチル、５−プロピニル、５−ハロ（５−ブロモまたは５−フルオロ等）、５−トリフルオロメチル、または他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；ならびに６−アゾウラシルなどの核酸アナログを使用することで、置換ないし修飾（化学修飾を含む）することができる。

二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などのＲＮＡは化学的に修飾され得る。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび／または逆方向デオキシ無塩基残基の導入が挙げられる。これらの化学修飾は、細胞内におけるＲＮＡｉ活性を維持することができる。

リポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。

本発明のリポソームにおいて、脂質二重層を構成する脂質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。これらの脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。

脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成する総脂質量に対して５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましい。

脂質二重層には、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；ステアリルアミン、オレイルアミン等の正荷電を付与する荷電物質；ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質；膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。

本発明のナノ粒子は、１０〜６０アミノ酸から構成されるペプチドを表面に有する。本発明ペプチドを用いてナノ粒子表面を修飾する際、ナノ粒子を構成する脂質を１００モル％とした場合に１〜１０モル％程度の割合で修飾するのが好ましい。なお、一枚膜リポソームについては脂質二重層の外表面がリポソームの表面であり、多重膜リポソームについては最外層の脂質二重層の外表面がリポソームの表面である。また、本発明のナノ粒子は、表面以外の部分（例えば、脂質二重層の内表面）に上記ペプチドを有していてもよい。

本発明のナノ粒子は、好ましくは、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ ｌｉｐｉｄ）が含まれる。補助脂質としては、例えば、ＥＰＣ（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＬＰＣ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ），ＳＯＰＥ（ｓｔｅａｒｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらのうち、ＥＰＣ，ＤＯＰＣ，ＤＯＰＥ，ＳＯＰＥが好ましい。

水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。

脂質二重層の構成成分である脂質と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、上記ペプチドを表面に有するナノ粒子を製造することができる。

ミセルは、ステアロイル基などの疎水性基（好ましくはアシル基）を有する本発明のペプチドのみでも形成することができ、この場合、ペプチドは粒子形成成分を兼ねることになる。或いは、ミセルはリン脂質、界面活性剤などのミセルを形成可能な他の成分と組み合わせて使用することができる。

リン脂質としては、リポソームを形成する上記のリン脂質或いは補助脂質を用いることができる。界面活性剤（アニオン、ノニオン、カチオン）としては、以下のものを用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、スルホネート類、例えばアルカンスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、スルホサクシネート及びスルホサクシネートエステル（例えば、ジオクチルナトリウム及びジナトリウムラウレススルホサクシネート）、イセチオネート、アシルイセチオネート（例えば、２−ラウロイルオキシエタンスルホン酸ナトリウム）及び詣肪酸のスルフアルキルアミド、特にＮ−アシルメチルタウリド；サルフェート類、例えばアルキルサルフェート、エトキシル化アルキルサルフェート、硫酸化モノグリセリド、硫酸化アルカノールアミド及び硫酸化油脂；カルボキシレート類、例えば炭素数１２以上の炭素鎖長を有するアルキルカルボキシレート、アシルサルコシネート、サルコシネート（例えば、ナトリウムラウリルサルコシネート）、エトキシル化カルボン酸ナトリウム塩、カルボン酸及び塩（例えば、オレイン酸カリウム及びラウリン酸カリウム）、エーテルカルボン酸；エトキシル化カルボン酸及び塩、例えば、ナトリウムカルボキシメチルアルキルエトキシレート；リン酸エステル及び塩（例えば、レシチン）；アシルグルタメート（例えば、ジナトリウムｎ−ラウロイルグルタメート）とそれらの混合物である。

ノニオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレン類、例えばエトキシル化脂肪アルコール、エトキシル化アルコール（例えば、オクタオキシエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、Ｃ１６Ｅ８及びＣ１２Ｅ８）、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化脂肪アミン、エトキシル化脂肪アミド、エトキシル化アルカノールアミド及びエトキシル化アルキルフェノール；リン酸のトリエステル（例えば、ナトリウムジオレイルホスフェート）；アルキルアミドジエチルアミン；アルキルアミドプロピルベタイン（例えば、ココアミドプロピルベタイン）；アミンオキシド誘導体、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルジヒドロキシエチルアミンオキシド、アルキルアミドジメチルアミンオキシド及びアルキルアミドジヒドロキシエチルアミンオキシド；ポリヒドロキシ誘導体、例えば多価アルコールエステル及びエーテル（例えば、スクロースモノオレエート、セトステアリルグルコシド、β−オクチルグルコフラノシドエステル、Ｃ_１０〜Ｃ_１６の炭素鎖長を有するアルキルグルコシド）、モノ、ジ及びポリグリセロールエーテル及びポリグリセロールエステル（例えば、テトラグリセロールモノラウレート及びモノグリセリド、トリグリセロールモノオレエート［例えば、グリンステッド（Ｇｒｉｎｓｔｅｄ）供給のＴＳ‐Ｔ１２２］、ジグリセロールモノオレエート（例えば、グリンステッド供給のＴＳＴ‐Ｔ１０１）、エトキシル化グリセリド；モノグリセリド、例えばモノオレイン及びモノリノレイン；ジグリセリド脂肪酸、例えばジグリセロールモノイソステアレートが挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、脂肪族‐芳香族四級アンモニウムハライド；四級アンモニウムアルキルアミド誘導体；アルキルアミドプロピルジメチルアンモニウムラクテート；アルキルアミドプロピルジヒドロキシエチルアンモニウムラクテート；アルキルアミドプロピルモルホリニウムラクテートなどが挙げられる。

本発明のナノ粒子がリポソームの形態である場合、以下のように製造することもできる。

脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することによりナノ粒子を製造する。次いで、このナノ粒子の外液に、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドを添加することにより、ナノ粒子の表面に上記ペプチドを導入することができる。

ナノ粒子の調製にあたり、カチオン性脂質（ＥｔＯＨ溶液）／補助脂質（ＥｔＯＨ溶液）／Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）の割合は、適宜変更することができる。ＰＥＧを修飾する場合には、ＰＥＧの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量に対して、例えば、０．１〜１５ｍｏｌ％が挙げられる。

本発明のナノ粒子の内部には、細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。

目的物質が水溶性である場合には、ナノ粒子の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、ナノ粒子内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、ナノ粒子の製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、ナノ粒子の脂質二重層に目的物質を封入することができる。本明細書において「封入」とは、ナノ粒子のような中空粒子の内部に目的物質を含む場合と、脂質二重膜のようなベクターを構成する表面部分に保持される場合の両方を含む。 目的物質を送達すべき生物種は、脊椎動物であれば特に限定されるものではないが、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。

本発明のナノ粒子は、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。

本発明のナノ粒子は、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたナノ粒子は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。

各ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても使用することができる。各ナノ粒子をｉｎ ｖｉｖｏにおいて用いる場合には、投与経路として、例えば、静脈注射、点滴等が挙げられ、投与量及び投与頻度は、本発明に係るナノ粒子に封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調整することができる。

本発明のナノ粒子は、また、体重減少、肝障害のいずれも見られず、安全に投与することができる。

以下、本発明を製造例、実施例によりより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。

製造例１（ステアロイル化ペプチド（化合物１）の合成）
化合物１：C₁₇H₃₅-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEHHAHE-NH₂
Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（０．６７ｍＭｏｌ／ｇ）をスタートとし、０．１ｍＭもしくは０．０３ｍＭスケールで、アミノ酸、縮合剤（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、反応促進剤（ＤＩＥＡ）をそれぞれレジンに対して４当量使用してＦｍｏｃ固相合成法にて配列番号１のペプチド（Ｃ末端はＣＯＮＨ_２）の合成を実施した。ステアリン酸（Ｍ．Ｗ．２８４．４８）、縮合剤（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、反応促進剤（ＤＩＥＡ）をレジンの４倍当量加えて活性化をし、アミノ酸の伸長が終了しＮ末端のみがフリーになった状態のレジンに加え、室温、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた（ＨＢＴＵ：Ｍ．Ｗ．３７９．２、ＨＯＢｔ，Ａｎｈｙｄｒｏｕｓ：Ｍ．Ｗ．１３５．１、ＤＩＥＡ：Ｍ．Ｗ．１２９．２）。反応後にレジンにＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）カクテル溶液（１２５ｍｌ ＴＦＡ， ０．２５ｍｌ Ｈ_２Ｏ， ０．３７５ｇフェノール，０．１２５ｍｌエタンジチオール及び０．２５ｍｌチオアニソール）を加えて氷冷下１５分、室温２時間反応させてクルードペプチドを得た。ＨＰＬＣにて精製作業を実施し、凍結乾燥した。純度の検定はＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて実施した。下記ＨＰＬＣ条件で分析を実施し、単一ピークとして目的物を得た（保持時間１５．１分）。Ａ Ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ、Ｂ Ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル Ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ， ５μｍ， ４．６ｘ１５０ｍｍ Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２２０ｎｍ。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。分子量の計算値：２６５１．８、実測値：２６５１．７３。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を図１に示す。
合成スケール：０．１ｍＭスケール（分子量 ２６５１．８）使用したレジン量 １５９．８ｍｇ。このレジンを使用してできるペプチドの理論値 ２８３．９ｍｇ。実際に取れたクルード量１８３．１ｍｇ（収率６４．５％）。

製造例２（４ＡＡ減ペプチド（化合物２）の合成）
化合物２：C₁₇H₃₅-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEH-NH₂
製造例１と同様の手法により合成し、目的ペプチドを得た。目的ペプチドは、Ｎ末端にステアロイル基（ステアリン酸アミド）を有し、Ｃ末端はＣＯＮＨ_２であり、アミノ酸配列は配列番号２で表されるペプチドである。目的のステアロイル化ペプチドの分子量の計算値：２１７７．３、実測値：２１７７．９。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を図２に示す。
合成スケール： ０．０３ｍＭスケール（分子量 ２１７７．３）、使用したレジンの量 ６１．２ｍｇ。このレジンを使用してできるペプチドの理論値 ８９．３ｍｇ、実際に取れたクルード量 ２８．３ｍｇ（収率３１．７％）。

製造例３（８ＡＡ減ペプチド（化合物３）の合成）
化合物３：C₁₇H₃₅-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHA-NH₂
製造例１と同様の手法により合成し、目的ペプチドを得た。目的ペプチドは、Ｎ末端にステアロイル基（ステアリン酸アミド）を有し、Ｃ末端はＣＯＮＨ_２であり、アミノ酸配列は配列番号３で表されるペプチドである。目的のステアロイル化ペプチドの分子量の計算値：１７８２．９、実測値：１７８２．４。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を図３に示す。
合成スケール：０．０３ｍＭスケール（分子量１７８２．９）、使用したレジンの量６７．０ｍｇ。このレジンを使用してできるペプチドの理論値８０．０ｍｇ、実際に取れたクルード量５１．４ｍｇ（収率６４．３％）。

製造例４（スクランブルペプチド（比較化合物）の合成）
化合物４：C₁₇H₃₅-C(O)-GGGGHGEAHHAEGHHAEAHHGEAH-NH₂
製造例１と同様の手法により合成し、目的ペプチドを得た。目的ペプチドは、Ｎ末端にステアロイル基（ステアリン酸アミド）を有し、Ｃ末端はＣＯＮＨ_２であり、アミノ酸配列は配列番号４で表されるペプチドである。目的のステアロイル化ペプチドの分子量の計算値：２６５１．８、実測値：２６５１．０。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を図４に示す。
合成スケール：０．０３ｍＭスケール（分子量 ２６５１．８）、使用したレジンの量 ４５．３ｍｇ。このレジンを使用してできるペプチドの理論値 ８０．５ｍｇ、実際に取れたクルード量 ３１．０ｍｇ（収率３８．５％）。

実施例１ 異なるｐＨ条件における粒子径および表面電位（ゼータ電位）測定結果（ｐＨ応答性の提示）
（１）リポソームの調製は、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：ジオレオイルテトラアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）＝８：１（ｍｏｌ比）の割合で混合した脂質エタノール溶液を試験管に分注し、さらにクロロフォルムを等量混合したものに、窒素ガスを吹き付けて蒸発乾固させることで脂質薄膜を調製した。ｐＨ７．４の緩衝液を添加し、１０分間室温条件で十分に水和させた。水和後、水槽型超音波装置を用いて試験管を超音波処理することでリポソームを調製した（脂質濃度１０ｍＭ）。得られたリポソーム懸濁液に、製造例１で得られたペプチド（化合物１）を総脂質量の５ｍｏｌ％量を添加し、インキュベートすることで、静電的相互作用によって脂質膜表面に結合し、当該ペプチドのステアリル基が膜脂質の疎水領域に移行する（刺さりこむ）ことで当該ペプチドによりリポソーム表面が修飾されたリポソーム１を調製した。

（２）異なるｐＨの緩衝液で希釈懸濁したリポソーム１の粒子径（ｓｉｚｅ）と表面電位（ζｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をマルバーン社製ゼータサイザーナノにより測定した。結果を表１に示す。

ｐＨ７．４における粒子径は２００ｎｍ弱であり、ｐＨが低下しても大きな変動は認められなかった。しかし表面電位は、ｐＨ７．４において−１５ｍＶ程度であったものが、ｐＨ６．５において７ｍＶへと変化した。すなわち、微小なｐＨ変化によって表面の電荷がマイナスからプラスへと転換することが示された。

実施例２ 異なるｐＨ条件における細胞への取込測定結果（ｐＨ応答性の提示）
蛍光色素で標識化された脂質（ローダミン標識化ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を脂質溶液に脂質量の１ｍｏｌ％添加しておき、実施例１における調製方法で当該リポソームを調製した。調製した当該リポソームを、異なるｐＨ（５．５、６．０、６．５、７．４）の培養液を満たした培養したマウス黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１株）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、培養上清を除去した細胞をトリプシン処理することで剥がしとり、細胞中の蛍光色素量（取り込まれたリポソーム量）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）によって測定した。結果を図５に示す。
ｐＨ７．４の場合、未処理細胞（リポソーム非添加）と細胞へのリポソーム取り込み量にほとんど差は認められなかった。一方、ｐＨ６．５〜ｐＨ５．５の場合、当該リポソームは非常に多く取り込まれた。すなわち、ｐＨの微小な変化（ｐＨ７．４→ｐＨ６．５）によって、当該リポソームの取り込みが著しく上昇した。

このときの、細胞を共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）を用いて観察した。結果を図６に示す。ｐＨ７．４では、ほとんど細胞内にリポソームの蛍光（赤色）が認められなかったのに対して、ｐＨ６．５〜ｐＨ５．５ では、細胞質に多くのリポソームの蛍光が確認された（青色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した核を示す）。このことからも、微小なｐＨ変化（ｐＨ７．４→ｐＨ６．５）によって当該リポソームの細胞取り込みが著しく増大したことが確認された。

実施例３ 培養細胞系における細胞内動態観察結果（エンドソーム内ｐＨ応答性の提示）
実施例２と同様に、蛍光標識化した当該リポソーム（赤色）を、異なるｐＨ（５．５、６．０、６．５、７．４）の培養液を満たした培養したマウス黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１株）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で青色に、エンドソーム／ライソソームをＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎで緑色に染色し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ）により観察した。結果を図７に示す。

その結果、実施例２と同様に、ｐＨ７．４では、細胞内にほとんど赤色が観察されず、当該リポソームが取り込まれていないことが確認された。一方、ｐＨ６．５〜ｐＨ５．５では、細胞内に赤色が多数認められ、当該リポソームが多く取り込まれたことがわかる。この赤色は緑色と重なっておらず、ほとんどが赤単独で認められた。このことは、当該リポソームがエンドソーム／ライソソームに留まらず、細胞質に脱出していることを意味している。エンドソーム／ライソソーム内は低ｐＨ環境であるため、当該リポソームが変化することでエンドソーム／ライソソーム膜と融合するなどして、エンドソーム／ライソソームから抜け出た可能性が示唆される。このことから、当該リポソームはエンドソーム／ライソソーム内のｐＨ変化に応答して脱出能を発揮できることが確認された。

実施例４ 担ガンマウスにおける腫瘍内動態（腫瘍内ｐＨ応答性の提示）
Ｂ１６Ｆ１細胞を皮下に移植して形成した腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３にまで成長した担ガンヘアレスマウスに、蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ−ＤｉＩ（赤色）を脂質量の０．５％含有させた当該リポソーム（脂質濃度１０ｍＭ）、あるいはコントロールとして、同様にＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ−ＤｉＩを脂質量の０．５％含有させたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソーム（脂質組成は、ＥＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン＝１．８５：１：０．１５、脂質濃度１０ｍＭ）を０．２ｍｌ尾静脈投与した後、腫瘍を摘出し、凍結切片を作成した。得られた凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで処理することで組織固定した後、抗ＣＤ３１抗体（血管内皮細胞のマーカータンパク質に対する抗体）を一次抗体として処理し、その後に、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（緑色）標識化抗体を二次抗体として追加処理することで、固定組織の免疫染色を行った。さらに、同じ固定組織を核染色色素ＤＡＰＩを含有したＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤで包埋した。得られた包埋固定組織を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。結果を図８に示す。

両リポソーム（赤色）ともに、腫瘍組織内に同程度認められた。このことは、当該リポソームはＰＥＧでコートされていないにもかかわらず、ＰＥＧと同程度の血中滞留性を有することが示唆される。また、多くのＰＥＧリポソーム（赤色）が緑色と一緒に認められた（黄色）ことから、ＰＥＧリポソームは血管内およびその周辺に位置していることが示唆された。これよりＰＥＧリポソームは腫瘍組織から漏れやすいと考えられた。一方、当該リポソームは赤色単独で、緑色から離れたところに認められたことから、血管から離れたところ（腫瘍組織内深部）に位置していることが示唆された。このことは、当該リポソームが腫瘍内に留まりやすい（ターゲティング効果に優れている）ことを示唆している。

実施例５ 異なるｐＨ条件におけるペプチド単体およびペプチド修飾ナノ粒子のＣＤｓｐｅｃｔｒｕｍ（ｐＨ応答性および膜構造基盤の必要性の提示）
製造例１で得られたペプチド単独および実施例１に準じて得られたリポソーム１（それぞれペプチド濃度にして２０μＭ）を異なるｐＨのＰＢＳ（−）に懸濁し、Ｊ−７２０ＷＩ（日本分光（株）社製）を用いてＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定した。さらに、解析ソフト（ＪＷＳＳＥ−４８０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ Ａｕｇｕｓｔ ２００７；２４（４）：２８２〜２９３参照）を用いて、スペクトルにおける２次構造の組成を予測した。結果を図９に示す。

以下の図９において、「α−ｈｅｌｉｘ」はαへリックス構造を意味し、「ｃｏｉｌ」はランダムコイル構造（明確な二次構造を取っていない状態）を意味し、「ｔｕｒｎ」は折れ曲がり構造を意味する。

その結果、ペプチド単独では、ｐＨ７．４とｐＨ６．５におけるＣＤスペクトルはほとんど一致しており、ｐＨ６．０になって大きくスペクトルが変化したことが分かる。このことから、ペプチド単独では、ｐＨ６．０までｐＨが低下しなければ構造変化が起こらないことが確認された。

一方、リポソーム１のＣＤスペクトルは、ｐＨ７．４におけるスペクトルがペプチド単独のスペクトルと異なっており、脂質膜上に配置されていることで、２次構造が異なる状態であることが示唆された。さらに、ｐＨ７．４からｐＨ６．５になることでＣＤスペクトルが大きく変化しており、そのスペクトルはｐＨ６．０およびｐＨ５．５でもほぼ同じであったことから、リポソーム１上に配置されたペプチドは、微小なｐＨ変化によって大きく構造変化が誘起されることが明らかとなり、ペプチドの微小ｐＨ変化への感応性にはリポソーム、ミセルなどの粒子構造ないし膜構造が不可欠であることが確かめられた。

実施例６ ペプチド配列を入れ替えたペプチド、長さを変えたペプチドにおけるｐＨ応答性（粒子径、ゼータ電位、細胞内取込等）の評価結果
（１）実施例１と同様の調製方法で、ＥＰＣ：ＤＯＴＡＰ＝８：１（ｍｏｌ比）リポソーム懸濁液に、製造例２〜４のいずれかのステアリル化ペプチドを添加し、インキュベートすることで、各種ペプチドによりリポソーム表面が修飾された各種ペプチド修飾リポソーム２〜４を調製した。
（２）異なるｐＨの緩衝液で希釈懸濁した各種ペプチド修飾リポソームの粒子径（ｓｉｚｅ）と表面電位（ζｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をマルバーン社製ゼータサイザーナノにより測定した。

製造例４で得られたペプチドの修飾リポソーム４の結果を表２に示す。

Ｈｉｓで始まり酸性アミノ酸で終わるユニットの繰り返しを有さないリポソーム４では、すべてのｐＨにおいてプラスの表面電位を示しており、本発明リポソームとは全く異なる性質のものであった。

さらに、リポソーム４の細胞への取り込みをＦＡＣＳにより評価したところ、ｐＨ７．４において高い取込が見られ、ｐＨ６．５にｐＨが変化しても、その取り込み量には大きな差は認められなかった（図１０）。この結果は、上記表面電位の結果と一致しており、Ｈｉｓで始まり酸性アミノ酸で終わるユニットの繰り返しを有さないリポソーム４では、構成アミノ酸が同じであっても、微弱ｐＨ変化への応答性は認められないことが明らかになった。
（３）実施例１と同様の方法により、製造例１のペプチドより４残基短い製造例２のペプチドを脂質量の５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％修飾したリポソーム２ａ、２ｂ、２ｃを調製し、表面電位を測定した。結果、いずれのリポソームもリポソーム１と同様の傾向を示した(表３)。

また、細胞への取込量をＦＡＣＳにより評価した。結果、いずれのリポソームにおいてもｐＨ７．４では未処理細胞と同程度で、細胞にほとんどリポソームが取り込まれていなかったが、ｐＨ６．５では取込量が増大していた。

このことから、４残基短いペプチドを修飾したリポソームであっても、微弱ｐＨ変化に応答し、それに応じて細胞への親和性が著しく増大することが確かめられた。
（４）さらに、実施例１と同様の方法により、製造例１のペプチドより８残基短くした製造例３のペプチドを脂質量の５ｍｏｌ％、７．５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％修飾したリポソーム３ａ、３ｂ、３ｃを調製し、表面電位を評価した（表４）。

結果、いずれのリポソームにおいてもｐＨ７．４とｐＨ６．５の表面電位に大きな差があり、特に１０ｍｏｌ％修飾したリポソーム３ｃにおいて大きな値を示した。

Claims (15)

1. ペプチドと粒子形成成分を含むナノ粒子であって、前記粒子形成成分がリポソーム又はミセルを形成し、前記ペプチドにおいてその配列中にＨｉｓ（ヒスチジン）で始まり酸性アミノ酸で終わるユニットを２〜８個有し（各ユニットは同一であっても異なっていてもよい）、ナノ粒子。
2. 前記ユニットにおいて、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に２〜５個のアミノ酸を有する、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 前記ユニットにおいて、Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に３個のアミノ酸を有する、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
4. 前記Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に配列されるアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎから選択される任意のアミノ酸である請求項２又は３に記載のナノ粒子。
5. 前記Ｈｉｓと酸性アミノ酸の間に配列されるアミノ酸がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ又はＳｅｒから選択される任意のアミノ酸である請求項４に記載のナノ粒子。
6. 前記ペプチドが、下記式（Ｉ）
   Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ （Ｉ）
   （式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、同一又は異なって、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。）
   で表されるユニットを２〜８個含み、各ユニットのアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子。
7. 前記ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のペプチド配列を有することを特徴とする、請求項６記載のナノ粒子。
8. 前記ペプチドが、リポソーム又はミセルに保持されるための疎水性基を末端に有する、請求項１〜７のいずれかに記載のナノ粒子。
9. 前記疎水性基が、炭素数１２〜２４の炭化水素基又はアシル基である、請求項８に記載のナノ粒子。
10. 前記粒子形成成分がリン脂質を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のナノ粒子。
11. 前記粒子形成成分がリポソームを形成してなる、請求項１〜１０のいずれかに記載のナノ粒子。
12. 請求項１〜１１のいずれかに記載のナノ粒子を含む物質導入剤。
13. 下記一般式（II）
    Ｒ^１−（Ｚ^１）_ｌ−［Ｈｉｓ−（ＡＡ_１）（ＡＡ_２）（ＡＡ_３）−Ｇｌｕ／Ａｓｐ］_ｎ−（Ｚ^２）_ｍ−Ｒ^２ （II）
    （式中、Ｈｉｓはヒスチジンを表し、Ｇｌｕ／Ａｓｐはグルタミン酸又はアスパラギン酸を示す。ＡＡ_１、ＡＡ_２及びＡＡ_３は、同一又は異なって、それぞれＧｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを示す。ｎは２〜８の整数を示す。ｌ、ｍは同一又は異なって０または１を示す。Ｒ^１は炭素数１２〜２４の炭化水素基又はアシル基を示す。Ｒ^２はＯＨまたはＣ末端保護基を示す。Ｚ^１又はＺ^２はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎのいずれかのアミノ酸から構成され、アミノ酸の数が１〜８個であるリンカーを示す。）
    で表され、アミノ酸の総数が１０〜６０個である、ペプチド化合物。
14. 一般式（II）で表されるペプチド化合物におけるペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のペプチド配列を有することを特徴とする、請求項１３記載のペプチド化合物。
15. Ｒ^１が、炭素数１２〜２４のアシル基である、請求項１３または１４に記載のペプチド化合物。

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