KR20140026501A - ｐＨ 응답성 펩티드를 포함하는 나노 입자 - Google Patents

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Abstract

약산성 pH환경 중에서 목적 물질을 방출할 수 있는 나노 입자 및 세포 도입제를 제공한다. 펩티드와 입자 형성 성분을 포함하는 나노 입자이며, 상기 입자 형성 성분이 리포솜 또는 미셀을 형성하고, 상기 펩티드에 있어서 그의 서열 중에 His(히스티딘)로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛을 2 내지 8개 갖는(각 유닛은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다), 나노 입자.

Description

ｐＨ 응답성 펩티드를 포함하는 나노 입자{NANOPARTICLES CONTAINING pH-RESPONSIVE PEPTIDE}
본 발명은, 약산성 pH 응답성 펩티드 및 상기 펩티드를 포함하는 나노 입자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 나노 입자를 포함하는 물질 도입제에 관한 것이다.
암의 화학 요법에 있어서, 특이성의 향상을 목적으로 한 DDS의 개발이 시도되고 있지만, 종양 환경에 착안한 것은 거의 없다. 즉, 종양 조직은 생리적 조건 하(pH7.4 부근)에 비하여 저pH(pH6.5 부근)라는 특수한 환경이지만, 이러한 미약한 pH의 변화에 응답하도록 종양 조직 특이적으로 작용하는 약물 송달 캐리어는 아직 개발 도중에 있다. 지금까지도, 혈액 중에서의 혈장 단백질의 결합을 피하여, 혈중 체류성을 향상시키기 위하여 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 리포솜 등의 표면에 수식되어, 항암제 등의 캐리어로서 사용되고 있다(예를 들어, 특허문헌 1). 그러나, PEG라고 해도 항원성이 있는 것이 밝혀져 있다. 또한, PEG가 표면에 제시되어 있는 캐리어는, 세포에 대한 친화성이 낮기 때문에, 세포에 도입되기 어려워, 약물을 암 세포 내부까지 보내오는 것은 곤란하다. 특허문헌 2에 기재된 펩티드-리포솜 복합체는, N 말단 영역에 염기성 아미노산(리신 또는 아르기닌)이 존재함으로써 양전하를 갖고 있으며, pH에 의존하여 전하가 변화되지 않아, 충분한 혈중 체류성은 기대할 수 없다.
비특허문헌 1은, pH 응답성 영역으로서 His 세그먼트를 사용하고 있으며, 외부 환경 pH가 7.4부터 5.0까지 대폭 저하됨으로써 중성이었던 His가 플러스로 하전되어, 그 정전적 반발력의 증대에 의해 미셀을 붕괴시키는 기술이나, His 단독으로는 pH6.5라는 미약산성에서는 프로톤화되지 않기 때문에, pH6.5에 있어서 전하 반전을 발생시키는 것은 곤란하다.
비특허문헌 2는, 블록 중합체 말단 리신 세그먼트에 화학적으로 결합시킨 디메틸말레산이, pH 저하에 의해 탈리되어, 그것에 의하여 표면 하전이 마이너스로부터 플러스로 전환하는 pH 응답성의 미셀이다. 비특허문헌 2의 펩티드는, 일단 디메틸말레산이 탈리되면, 플러스 전하의 리신 잔기가 노출된 상태가 되어, pH가 상승되었다고 해도 원래대로 돌아가지는 않는다. 혈액 순환에 의해 염증 부위와 같은 pH가 낮은 조직을 통과하는 경우에 있어서도 디메틸말레산이 해리되고, 리신이 노출되어 버려, 혈액 성분과 상호 작용해 버리기 때문에, 목적으로 하는 종양까지 도달하는 것은 곤란하다.
일본 특허 공개 제2004-10481호 공보 일본 특허 공표 제2004-523531호 공보
AIChE Journal Vol.56, No.7, 2010, pp.1922-1931 International Journal of Pharmaceutics 376(2009) 134-140
본 발명은, 암 조직과 같은 약산성 pH 환경 중에서 목적 물질을 방출할 수 있는 약물 송달 캐리어를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 하기 (1) 내지 (16)의 나노 입자 및 물질 도입제를 제공한다.
(1) 펩티드와 입자 형성 성분을 포함하는 나노 입자이며, 상기 입자 형성 성분이 리포솜 또는 미셀을 형성하고, 상기 펩티드에 있어서 그의 서열 중에 His(히스티딘)로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛을 2 내지 8개 갖는(각 유닛은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다), 나노 입자.
(2) 상기 유닛에 있어서, His와 산성 아미노산 사이에 2 내지 5개의 아미노산을 갖는 (1)에 기재된 나노 입자.
(3) 상기 유닛에 있어서, His와 산성 아미노산 사이에 3개의 아미노산을 갖는 (1) 또는 (2)에 기재된 나노 입자.
(4) 상기 His와 산성 아미노산 사이에 배열되는 아미노산이 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn으로부터 선택되는 임의의 아미노산인 (2) 또는 (3)에 기재된 나노 입자.
(5) 상기 His와 산성 아미노산 사이에 배열되는 아미노산이 Gly, Ala, His, Cys 또는 Ser로부터 선택되는 임의의 아미노산인 (4)에 기재된 나노 입자.
(6) 상기 펩티드가, 하기 화학식 (I)로 표시되는 유닛을 2 내지 8개 포함하고, 각 유닛의 아미노산 서열은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자.
Figure pct00001
(화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다)
(7) 상기 펩티드가, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 펩티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, (6)에 기재된 나노 입자.
(8) 상기 펩티드가, 리포솜 또는 미셀로 유지되기 위한 소수성기를 말단에 갖는 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자.
(9) 상기 소수성기가, 탄소수 12 내지 24의 탄화수소기 또는 아실기인, (8)에 기재된 나노 입자.
(10) 상기 입자 형성 성분이 인지질을 포함하는, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자.
(11) 상기 입자 형성 성분이 리포솜을 형성하여 이루어지는, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자.
(12) 상기 나노 입자로 유지되는 목적 물질이, 약물, 핵산, 펩티드, 단백질, 당 또는 이들의 복합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인, (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자.
(13) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 나노 입자를 포함하는 물질 도입제.
(14) 하기 화학식 (II)로 표시되고, 아미노산의 총 수가 10 내지 60개인, 펩티드 화합물.
Figure pct00002
(화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다. n은 2 내지 8의 정수를 나타낸다. l, m은 동일하거나 또는 상이하며 0 또는 1을 나타낸다. R1은 탄소수 12 내지 24의 탄화수소기 또는 아실기를 나타낸다. R2는 OH 또는 C 말단 보호기를 나타낸다. Z1 또는 Z2는 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln, Asn 중 어느 하나의 아미노산으로 구성되고, 아미노산의 수가 1 내지 8개인 링커를 나타낸다)
(15) 화학식 (II)로 표시되는 펩티드 화합물에 있어서의 펩티드가, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 펩티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, (14)에 기재된 펩티드 화합물.
(16) R1이 탄소수 12 내지 24의 아실기인, (14) 또는 (15)에 기재된 펩티드 화합물.
본 발명에 따르면, pH6.5 부근의 약산성의 세포 환경에서 내부에 봉입된 목적 물질을 방출 가능한 나노 입자 또는 물질 도입제를 제공할 수 있다.
본 발명의 나노 입자는, 이러한 약한 산성 영역에서 목적 물질을 방출하여 작용시킬 수 있기 때문에, 우수한 약물 송달 시스템을 제공할 수 있다.
본 발명의 나노 입자는, pH7.4의 생리적 조건에서는 산성 아미노산의 마이너스 전하에 의해 혈장 성분 등과의 상호 작용을 피하여, 혈중 체류성을 가짐과 함께, 산성 아미노산을 인접시킴으로써 His의 pH 응답성을 제어함으로써 미약산성으로도 pH에 민감하게 응답할 수 있기 때문에, EPR 효과(Enhanced Permeation and Retention Effect; 향상된 투과 및 체류 효과)에 의해 종양에 도달한 후에, 종양 환경의 미약산성 조건 하에서 프로톤화되어 전하가 반전됨으로써 암 세포에 도입되게 된다는 높은 유용성을 갖고 있다.
도 1은 제조예 1에 의해 얻은 스테아로일화펩티드(서열 번호 1, C 말단은 CONH2)의 HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 나타낸다.
도 2는 제조예 2에 의해 얻은 스테아로일화펩티드(서열 번호 2, C 말단은 CONH2)의 HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 나타낸다.
도 3은 제조예 3에 의해 얻은 스테아로일화펩티드(서열 번호 3, C 말단은 CONH2)의 HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 나타낸다.
도 4는 제조예 4에 의해 얻은 스테아로일화펩티드(서열 번호 4, C 말단은 CONH2)의 HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 나타낸다.
도 5는 세포 중의 형광 색소량을 유세포 분석기에 의해 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 세포를 공초점 레이저 현미경(Zeiss LSM 510 META)을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 핵을 회히스트(Hoechst)33342에 의해 청색으로, 엔도좀/라이소좀을 리소트래커그린(LysotrackerGreen)에 의해 녹색으로 염색하고, 공초점 레이저 현미경(Zeiss LSM 510 META)에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 4의 종양 마우스에 있어서의 종양 내 동태 평가 결과를 나타낸다.
도 9는 펩티드 단체 및 펩티드 수식 나노 입자의 CD 스펙트럼과 2차 구조의 조성을 예측한 결과를 나타낸다.
도 10은 제조예 4에 의해 얻어진 스크램블 서열 펩티드 수식 리포솜의 세포에 대한 도입을 FACS에 의해 평가한 결과를 나타낸다.
도 11은 제조예 2에 의해 얻어진 펩티드 수식 리포솜의 세포에 대한 도입을 FACS에 의해 평가한 결과를 나타낸다.
본 발명의 나노 입자는, 입자 형성 성분과 펩티드를 구성 요소로 한다.
본 발명의 펩티드의 총 아미노산 수로서는, 10 내지 60개, 바람직하게는 12 내지 40개, 보다 바람직하게는 14 내지 30개이다.
본 발명의 펩티드는, His(히스티딘, H)와 산성 아미노산(글루탐산(Glu, E) 또는 아스파라긴산(Asp, D))을 필수적인 구성 요소로서 포함하고, 서열 중에 His로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛을 갖는다. 당해 유닛에 있어서, His와 산성 아미노산 사이에 2 내지 5개의 아미노산, 바람직하게는 3개의 아미노산을 갖는다. 또한, His와 산성 아미노산 사이의 아미노산 수는, 모든 유닛에 있어서 동일수이며, 예를 들어 최초의 유닛이 3개인 경우, 이후의 유닛에 있어서도 3개가 된다. 당해 아미노산으로서는, Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn으로부터 선택되는 아미노산이며, 바람직하게는 Gly, Ala, His, Cys 또는 Ser이다. 펩티드가 갖는 당해 유닛의 총 수는 2 내지 8개, 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개이며, 인접하는 유닛은 직접 결합된다. 따라서, 유닛과 유닛이 결합되는 부분은, 산성 아미노산과 His가 인접 하게 된다.
또한, 바람직한 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 하기 화학식 (I)
Figure pct00003
(화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다)로 표시되는 유닛을 2 내지 8개, 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개 포함하는 것이다.
AA1, AA2 또는 AA3의 바람직한 것으로서는, Gly, Ala, Ser, Cys, His이며, 보다 바람직하게는 Gly, Ala, His이다. 펩티드 서열에 있어서의 His의 총 수는, 산성 아미노산의 총 수보다 수가 많고, 예를 들어 산성 아미노산이 2개인 경우에는, His는 3 내지 7개; 산성 아미노산이 3개인 경우에는, His는 4 내지 10개; 산성 아미노산이 4개인 경우에는, His는 5 내지 13개; 산성 아미노산이 5개인 경우에는, His는 6 내지 16개; 산성 아미노산이 6개인 경우에는, His는 7 내지 19개; 산성 아미노산이 8개인 경우에는, His는 9 내지 25개이다. 본 발명 펩티드는 산성 아미노산을 2 내지 8개, 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개 갖는다. His는 3 내지 25개, 바람직하게는 3 내지 19개, 보다 바람직하게는 3 내지 13개 갖는다.
본 발명의 특히 바람직한 유닛은, His-Gly-Ala-His-Glu, His-Ala-Gly-His-Glu, His-Ala-Ala-Gly-Glu, His-His-Ala-His-Glu이다. 본 발명의 펩티드는, 상기와 같은 유닛 이외에, Gly, Ala, His 등을 포함하는 아미노산 서열(Z1 또는 Z2; 링커)을 N 말단 또는 C 말단에 가질 수도 있다. 이러한 링커(Z1 또는 Z2)를 구성하는 아미노산으로서는, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln, Asn을 들 수 있고, 바람직하게는 Gly, Ala, Ser, Cys이며, 보다 바람직하게는Gly, Ala, His이다. 이러한 링커(Z1 또는 Z2)의 아미노산의 총 수는, 각각 1 내지 8개이며, 바람직하게는 2 내지 6개이다.
또한, 본 발명 펩티드의 C 말단에는 C 말단 보호기를 가질 수도 있다. C 말단 보호기로서는, C 말단 카르복실의 탄소 원자에 의해 아미드를 형성하는 기, 또는 카르복실의 산소 원자에 의해 에스테르를 형성하는 기가 포함된다. 에스테르를 형성하는 기로서는 알킬기, 특히 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기(C1 내지 C5 알킬기), 예를 들어 메틸기, 에틸기 및 프로필기 등이 포함되고, 아미드를 형성하는 기로서는 아미노기와 같은 아민 관능기, 또는 알킬아미노 관능기, 예를 들어 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노 등의 모노 C1 내지 C5 알킬아미노기 및 디C1 내지 C5 알킬아미노기가 포함되고, 바람직하게는 아미드를 형성하는 기이며, 보다 바람직하게는 아미노기이다.
또한, 본 발명 펩티드는, 소수성기에 의해 수식되어 있다. 소수성기는 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 도입되고, 바람직하게는 N 말단에 도입된다. 소수성기는 탄소수 12 이상, 바람직하게는 탄소수 12 내지 24, 바람직하게는 탄소수 14 내지 22, 보다 바람직하게는 탄소수 16 내지 20의 기이며, 탄화수소기, 아실기를 들 수 있고, 아실기가 특히 바람직하다. 소수성기는 직쇄일 수도 있고 분지를 갖고 있을 수도 있다. 탄화수소기로서는, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 에이코실 등의 직쇄 또는 분지를 갖는 탄소수 12 이상의 알킬기를 들 수 있고, 바람직하게는 스테아릴기이다. 아실기로서는, 라우로일기, 미리스토일기, 팔미토일기, 스테아로일기, 베헤노일기, 이소스테아로일기, 에이코세노일기, 리그노세로일기, 이소팔미토일기, 올레오일기, 리노로일기 등을 적절하게 예시할 수 있고, 라우로일기, 미리스토일기, 팔미토일기, 스테아로일기, 이소스테아로일기 및 올레오일기로부터 선택되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 바람직한 펩티드로서는, 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열의 것을 들 수 있다. 바람직한 실시 형태에서는 상기 펩티드의 N 말단에는 리포솜 또는 미셀로 유지되기 위한 소수성기가 결합되어 있다. 또한, 바람직한 하나의 실시 형태로서는, 하기 화학식 (II)로 표시되는 펩티드 화합물이다.
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[(화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다. n은 2 내지 8의 정수를 나타낸다. l, m은 동일하거나 또는 상이하며 0 또는 1을 나타낸다. R1은 탄소수 12 내지 24의 탄화수소기 또는 아실기를 나타낸다. R2는 OH 또는 C 말단 보호기를 나타낸다. Z1 또는 Z2는 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln, Asn 중 어느 하나의 아미노산으로 구성되며, 아미노산의 수가 1 내지 8개인 링커를 나타낸다)로 표시되고, 아미노산의 총 수가 10 내지 60개이다]
상기 화학식 (II)에 있어서 표시되는 탄화수소기, 아실기, C 말단 보호기로서는, 상술한 것을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드는, 공지된 펩티드 합성법, 특히 액상 합성법 또는 고상 합성법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA를 유전자 재조합 기술에 의해 숙주 세포에 도입하고, 발현시키는 방법에 의해서도 합성할 수 있다. 예를 들어, 고상 합성법에서는, C 말단에 대응하는 아미노산의 아미노기를 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기 등의 우레탄형 보호기로 보호한 N-보호 아미노산의 카르복실기를, 아미노기를 갖는 불용성 수지에 결합시킨 후, 아미노기의 보호기를 제거하고, N 말단 방향으로 순차 보호 아미노산을 축합시키고, 계속하여 불용성 수지 및 아미노산의 보호기를 탈보호시켜, 본 발명의 펩티드를 얻을 수 있다. 상기한 아미노기를 갖는 불용성 수지로서는, 특별히 한정되지 않지만, Fmoc-NH-SAL 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노에틸)페녹시 링커 수지)가 바람직하고, 개열에 의해 직접 목적물을 부여할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 합성에 사용하는 보호 아미노산은, 관능기를 공지된 방법에 의해 공지된 보호기로 보호함으로써 얻을 수 있고, 시판되고 있는 보호 아미노산을 사용할 수도 있다. 보호기로서는 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, tert-부톡시카르보닐기, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, 4-메톡시벤질옥시카르보닐기, 2,2,2-트리클로로에틸옥시카르보닐기, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기 등을 사용할 수 있다. 보호 아미노산을 제조하는 경우에는, 예를 들어 DIPCDI(디이소프로필카르보디이미드)-HOBt(1-히드록시벤조트리아졸)법 등과 같은 공지된 방법을 사용할 수 있다. 본 축합 반응은 공지된 용매 중에서 행할 수 있고, 예를 들어 디메틸포름아미드 등의 유기 용매가 예시된다. 아미노기의 보호기의 탈리 시약으로서는 한정되지 않고, 피페리딘/디메틸포름아미드 등의 공지된 시약에 의해, Fmoc기 등의 보호기를 절단할 수 있다. 우레탄형 보호기의 탈보호는, 접촉 환원, 트리플루오로아세트산 등을 사용하여 행할 수 있다. 다른 보호기도 공지된 방법에 의해 탈보호할 수 있다. 합성의 각 단계에 있어서의 축합 반응의 진행의 정도는, 예를 들어 닌히드린 반응법과 같은 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다. 상기와 같이 하여, 원하는 아미노산 서열을 갖는 보호 펩티드를 얻을 수 있다. 불용성 수지로서 Fmoc-NH-SAL 수지를 사용한 경우, TMSBr(트리메틸실릴브로마이드)이나 TFA(트리플루오로아세트산) 등에 의해 처리함으로써, 수지 및 보호기를 동시에 탈리시킬 수 있다. 또한, 펩티드의 C 말단은 사용하는 수지의 종류에 따라, COOH(R2=OH) 또는 CONH2(R2=NH2)로서 얻을 수 있다.
R2가 OH로서 정의되는 경우, 본 발명 펩티드의 C 말단 아미노산의 카르복실산은 비치환이다. 마찬가지로, R2가 NH2 등으로서 정의되는 경우, 본 발명 펩티드의 C 말단 아미노산의 카르복실산은 아미드(CONH2)이다.
또한, 본 발명 펩티드에 대한 소수성기의 도입에 대해서는, 공지 관용의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 아실기의 도입에 대해서는, N 말단이 자유로운 펩티드와 도입하는 아실기에 대응하는 카르복실산을 축합제(HBTU/HOBt 등), 반응 촉진제(DIEA 등)와 함께 반응시킴으로써 원하는 아실기를 도입할 수 있다. 또한, 탄화수소기의 도입에 대해서는, 염기 존재 하에서, 도입하는 탄화수소기에 대응하는 할로겐화 탄화수소와의 반응에 의해 도입할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 펩티드는, 예를 들어 추출, 재결정, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환, 분배, 흡착), 전기 영동, 향류 분배 등, 공지된 수단에 의해 단리 정제할 수 있고, 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의한 방법이 바람직하다.
본 발명의 나노 입자의 제타 전위는, 중성 부근의 pH(예를 들어 pH7 또는 7.4)에서 -100 내지 50mV 정도, 바람직하게는 -50 내지 30mV 정도, 보다 바람직하게는 -30 내지 10mV 정도, 특히 -30 내지 0mV 정도이다. 제타 전위는 제타사이저를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 나노 입자의 평균 입경은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 입자 직경 30 내지 1000nm이며, 바람직하게는 50 내지 500nm, 보다 바람직하게는 60 내지 400nm, 특히 70 내지 300nm이다. 평균 입경은, 예를 들어 동적 광산란법, 정적 광산란법, 전자 현미경 관찰법, 원자간력 현미경 관찰법 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 물질 도입제는, 목적 물질을 저pH 부위에 송달하기 위하여 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모두 사용할 수 있다.
저pH 부위로서는, 염증 부위, 종양 부위, 감염 부위 등을 들 수 있고, 특히 종양 부위가 바람직하게 예시된다.
나노 입자로 유지되는 목적 물질의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 약물, 핵산, 펩티드(옥시토신, 브라디키닌, 티로트로핀 방출 인자, 엔케팔린 등의 생리 활성 펩티드, 펩티드 호르몬 등), 단백질(효소, 인타로이킨 등의 각종 사이토카인, 세포 전달 인자, 세포 성장 인자, 항체 등), 당 또는 이들의 복합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 들 수 있고, 진단, 치료 등의 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 「핵산」에는, DNA 또는 RNA 외에, 이들의 유사체 또는 유도체(예를 들어, siRNA, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트DNA 등)가 포함된다. 또한, 핵산은 단일쇄 또는 이중쇄 중 어느 하나일 수도 있고, 선상 또는 환상 중 어느 하나일 수도 있다.
목적 물질이 약물인 경우, 예를 들어 제암제, 혈관 확장약, 항균제 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 제암제로서, 테가푸르, 독소루비신, 다우노루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 이리노테칸, SN-38, 악티노마이신 D, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 플루오로우라실, 마이토마이신 C, 도세탁셀, 시클로포스파미드, 카페시타빈, 에피루비신, 겜시타빈, 미톡산트론, 류코보린, 비노렐빈, 트라스투주맙, 에토포시드, 에스트라무스틴, 프레드니손, 인터페론 α, 인타로이킨-2, 블레오마이신, 이포스파미드, 메스나, 알트레타민, 토포테칸, 시타라빈, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 머캅토푸린, 티오구아닌, 플루다라빈, 겜투주맙, 이다루비신, 미톡산트론, 트레티노인, 알렘투주맙, 클로람부실, 클라드리빈, 이마티닙, 에피루비신, 다카르바진, 프로카르바진, 메클로레타민, 리툭시맙, 데니루킨디프티톡스, 트리메토프림/술파메톡사졸, 알로푸리놀, 카르무스틴, 타목시펜, 필그라스팀, 테모졸로마이드, 멜팔란, 비노렐빈, 아자시티딘, 탈리도마이드 및 마이토마이신 등을 들 수 있고, 혈관 확장약으로서, 보센탄, 암브리센탄, 베라프로스트나트륨 등을 들 수 있고, 항균제로서, 암포테리신 B, 페니실린 G, 암피실린, 세파졸린, 이미페넴, 아즈트레오남, 겐타마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 아지트로마이신, 로키타마이신, 텔리트로마이신, 퀴누프리스틴, 포스마이신, 날리딕스산, 노르플록사신, 스파르플록사신, 리네졸리드 등을 들 수 있다.
목적 물질이 핵산인 경우, 예를 들어 부분 이중쇄 RNA(mdRNA), 닉이 들어간 dsRNA(ndsRNA), 갭이 있는 dsRNA(gdsRNA), 단간섭 핵산(siNA), siRNA, 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 단간섭 올리고뉴클레오티드, 치환된 단간섭 올리고뉴클레오티드, 수식된 단간섭 올리고뉴클레오티드, 화학 수식된 dsRNA, 전사 후 유전자 사일런싱 RNA(ptgsRNA)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 이중쇄 RNA(dsRNA)가 바람직하게 예시된다. 목적 물질은 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 2종 이상의 siRNA를 병용하는 것도 가능하다.
치환 및 수식(화학 수식을 포함한다)의 하나의 실시 형태에 있어서, 이중쇄 RNA는, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 2개의 데옥시리보뉴클레오티드(예를 들어 티미딘, 아데닌)를 포함하는 오버행 등, 이중쇄 RNA의 3' 말단의 일단 또는 양단에 1 내지 4 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있다. 이중쇄 RNA는, 일단 또는 양단에 평활 말단을 가질 수 있다. 일부의 실시 형태에 있어서, 제1 및 제2 쇄의 5' 말단은 인산화되어 있다. 이중쇄 RNA의 실시 형태의 어떤 경우든, 3' 말단의 뉴클레오티드 오버행은, 핵산의 당, 염기 또는 골격에 있어서 화학적으로 수식된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중쇄 RNA의 실시 형태의 어떤 경우든, 3' 말단의 뉴클레오티드 오버행은, 1개 이상의 보편적인 염기 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중쇄 RNA의 실시 형태의 어떤 경우든, 3' 말단의 뉴클레오티드 오버행은, 1개 이상의 비환식 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중쇄 RNA의 실시 형태의 어떤 경우든, dsRNA는, 5'인산염(Martinez et al., Cell. 110: 563-574, 2002; 및 Schwarz et al., Molec. Cell. 10:537-568, 2002를 참조) 또는 5',3' 이인산염 등의 말단 인산기를 더 포함할 수 있다.
이중쇄 RNA는, 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-2-메톡시에틸, 할로겐, 2'-플루오로, 2'-O-알릴 또는 이들의 임의의 조합 등의 2'당 치환을 더 포함할 수 있다. 또한 실시 형태에 있어서, 이중쇄 RNA는, 제1 쇄 또는 1개 이상의 제2 쇄의 일단 또는 양단 상에 알킬, 탈염기, 데옥시 탈염기, 글리세릴, 디뉴클레오티드, 비환식 뉴클레오티드, 반전된 데옥시뉴클레오티드 부분 또는 이들의 임의의 조합 등의 말단 캡 치환기를 더 포함한다.
또한 다른 실시 형태에 있어서, 이중쇄 RNA는, 독립적으로 포스포로티오에이트, 키랄포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 인산트리에스테르, 아미노알킬인산트리에스테르, 메틸포스폰산염, 알킬포스폰산염, 3'-알킬렌포스폰산염, 5'-알킬렌포스폰산염, 키랄포스포네이트, 포스포노아세트산염, 티오포스포노아세트산염, 포스핀산염, 포스포로아미드산염, 3'-아미노포스포로아미드산염, 아미노알킬포스포로아미드산염, 티오노포스포로아미드산염, 티오노알킬포스폰산염, 티오노알킬인산트리에스테르, 셀레노인산염, 보라노인산 결합 또는 이들의 임의의 조합 등의, 적어도 1개의 수식된 뉴클레오티드간 결합을 더 포함할 수 있다.
이중쇄 RNA는, 5-메틸시토신; 5-히드록시메틸시토신; 크산틴; 히폭시산틴; 2-아미노아데닌; 6-메틸, 2-프로필 또는 아데닌 및 구아닌의 그 밖의 알킬 유도체; 8-치환된 아데닌 및 구아닌(8-아자, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 등); 7-메틸, 7-디아자 및 3-디아자아데닌 및 구아닌; 2-티오우라실; 2-티오티민; 2-티오시토신; 5-메틸, 5-프로피닐, 5-할로(5-브로모 또는 5-플루오로 등), 5-트리플루오로메틸 또는 다른 5-치환된 우라실 및 시토신; 및 6-아조우라실 등의 핵산 아날로그를 사용함으로써, 치환 또는 수식(화학 수식을 포함한다)할 수 있다.
이중쇄 RNA(dsRNA) 등의 RNA는 화학적으로 수식될 수 있다. 이러한 화학 수식의 비한정적인 예에는, 뉴클레오티드간의 포스포로티오에이트 결합, 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로리보뉴클레오티드, 「비환상」 뉴클레오티드, 5'-C-메틸뉴클레오티드 및 말단에 대한 글리세릴 및/또는 역방향 데옥시 무염기 잔기의 도입을 들 수 있다. 이들 화학 수식은, 세포 내에 있어서의 RNAi 활성을 유지할 수 있다.
리포솜은, 지질 이중층 구조를 갖는 폐쇄 소포인 한, 다중막 리포솜(MLV)일 수도 있고, SUV(small unilamellar vesicle; 소 유니라멜라 베지클), LUV(large unilamellar vesicle; 대 유니라멜라 베지클), GUV(giant unilamellar vesicle; 거대 유니라멜라 베지클) 등의 1매막 리포솜일 수도 있다.
본 발명의 리포솜에 있어서, 지질 이중층을 구성하는 지질의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니며, 그 구체예로서는, 포스파티딜콜린(예를 들어, 디올레오일포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 등), 포스파티딜글리세롤(예를 들어, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티디글리세롤), 포스파티딜에탄올아민(예를 들어, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 카르디오리핀 등의 인지질 또는 이들의 수소 첨가물; 스핑고미엘린, 강글리오시드 등의 당지질을 들 수 있고, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 인지질은, 난황, 대두 그 밖의 동식물에서 유래하는 천연 지질(예를 들어, 난황 레시틴, 대두 레시틴 등), 합성 지질 또는 반합성 지질 중 어느 하나일 수도 있다. 이들 지질은 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
지질 이중층에는, 지질 이중층을 물리적 또는 화학적으로 안정시키거나, 막의 유동성을 조절하거나 하기 위하여, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤 숙신산, 라노스테롤, 디히드로라노스테롤, 데스모스테롤, 디히드로콜레스테롤 등의 동물 유래의 스테롤; 스티그마스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 브라시카스테롤 등의 식물 유래의 스테롤(피토스테롤); 티모스테롤, 엘고스테롤 등의 미생물 유래의 스테롤; 글리세롤, 수크로오스 등의 당류; 트리올레인, 트리옥타노인 등의 글리세린 지방산에스테르 중 1종 또는 2종 이상을 함유시킬 수 있다. 그의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 지질 이중층을 구성하는 총 지질량에 대하여 5 내지 40％(몰비)인 것이 바람직하고, 10 내지 30％(몰비)인 것이 더욱 바람직하다.
지질 이중층에는, 토코페롤, 갈산프로필, 팔미트산아스코르빌, 부틸화히드록시톨루엔 등의 항산화제; 스테아릴아민, 올레일아민 등의 양하전을 부여하는 하전 물질; 디세틸포스페이트 등의 음전하를 부여하는 하전 물질; 막 표재성 단백질, 막 내재성 단백질 등의 막 단백질을 함유시킬 수 있고, 그의 함유량은 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 나노 입자는, 10 내지 60아미노산으로 구성되는 펩티드를 표면에 갖는다. 본 발명 펩티드를 사용하여 나노 입자 표면을 수식할 때, 나노 입자를 구성하는 지질을 100몰％로 한 경우에 1 내지 10몰％ 정도의 비율로 수식하는 것이 바람직하다. 또한, 1매막 리포솜에 대해서는 지질 이중층의 외표면이 리포솜의 표면이며, 다중막 리포솜에 대해서는 최외층의 지질 이중층의 외표면이 리포솜의 표면이다. 또한, 본 발명의 나노 입자는, 표면 이외의 부분(예를 들어, 지질 이중층의 내표면)에 상기 펩티드를 가질 수도 있다.
본 발명의 나노 입자는, 바람직하게는 보조 지질(Helper lipid)이 포함된다. 보조 지질로서는, 예를 들어 EPC(egg phosphatidylcholine; 난황 포스파티딜콜린), DLPC(dilinoleoylphosphatidylcholine; 디리놀레오일포스파티딜콜린), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine; 디미리스토일포스파티딜콜린), DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine; 디팔미토일포스파티딜콜린), DSPC(distearoylphosphatidylcholine; 디스테아로일포스파티딜콜린), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine; 팔미토일올레오일포스파티딜콜린), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine; 디올레오일포스파티딜콜린), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine; 디올레오일포스파티딜에탄올아민), SOPE(stearyloleoylphosphatidylcholine; 스테아릴올레오일포스파티딜콜린) 등을 들 수 있다. 이들 중, EPC, DOPC, DOPE, SOPE가 바람직하다.
수화법에 의한 리포솜의 제조예를 이하에 나타낸다.
지질 이중층의 구성 성분인 지질과, 소수성기 또는 소수성 화합물로 수식된 상기 펩티드를 유기 용제에 용해한 후, 유기 용제를 증발 제거함으로써 지질막을 얻는다. 이때, 유기 용제로서는, 예를 들어 펜탄, 헥산, 헵탄, 시클로헥산 등의 탄화수소류; 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소류; 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류; 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올류; 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류; 아세톤 등의 케톤류 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 계속해서, 지질막을 수화시켜, 교반 또는 초음파 처리함으로써, 상기 펩티드를 표면에 갖는 나노 입자를 제조할 수 있다.
미셀은, 스테아로일기 등의 소수성기(바람직하게는 아실기)를 갖는 본 발명의 펩티드만으로도 형성할 수 있고, 이 경우, 펩티드는 입자 형성 성분을 겸하게 된다. 또는, 미셀은 인지질, 계면 활성제 등의 미셀을 형성 가능한 다른 성분과 조합하여 사용할 수 있다.
인지질로서는, 리포솜을 형성하는 상기한 인지질 또는 보조 지질을 사용할 수 있다. 계면 활성제(음이온, 비이온, 양이온)로서는, 이하의 것을 사용할 수 있다.
음이온계 계면 활성제로서는, 술포네이트류, 예를 들어 알칸술포네이트, 파라핀술포네이트, 알킬벤젠술포네이트, α-올레핀술포네이트, 술포숙시네이트 및 술포숙시네이트에스테르(예를 들어, 디옥틸나트륨 및 디나트륨라우레스술포숙시네이트), 이세티오네이트, 아실이세티오네이트(예를 들어, 2-라우로일옥시에탄술폰산나트륨) 및 지방산의 술프알킬아미드, 특히 N-아실메틸타우리드; 술페이트류, 예를 들어 알킬술페이트, 에톡실화알킬술페이트, 황산화모노글리세라이드, 황산화알칸올아미드 및 황산화 유지; 카르복실레이트류, 예를 들어 탄소수 12 이상의 탄소쇄 길이를 갖는 알킬카르복실레이트, 아실사르코시네이트, 사르코시네이트(예를 들어, 나트륨라우릴사르코시네이트), 에톡실화카르복실산나트륨염, 카르복실산 및 염(예를 들어, 올레산칼륨 및 라우르산칼륨), 에테르카르복실산; 에톡실화카르복실산 및 염, 예를 들어 나트륨카르복시메틸알킬에톡실레이트; 인산에스테르 및 염(예를 들어, 레시틴); 아실글루타메이트(예를 들어, 디나트륨n-라우로일글루타메이트)와 그들의 혼합물이다.
비이온계 계면 활성제로서는, 폴리옥시에틸렌류, 예를 들어 에톡실화 지방 알코올, 에톡실화알코올(예를 들어, 옥타옥시에틸렌글리콜모노헥사데실에테르, C16E8 및 C12E8), 에톡실화 지방산, 에톡실화 지방 아민, 에톡실화 지방 아미드, 에톡실화알칸올아미드 및 에톡실화알킬페놀; 인산의 트리에스테르(예를 들어, 나트륨디올레일포스페이트); 알킬아미드디에틸아민; 알킬아미드프로필베타인(예를 들어, 코코아미드프로필베타인); 아민옥시드 유도체, 예를 들어 알킬디메틸아민옥시드, 알킬디히드록시에틸아민옥시드, 알킬아미드디메틸아민옥시드 및 알킬아미드디히드록시에틸아민옥시드; 폴리히드록시 유도체, 예를 들어 다가 알코올 에스테르 및 에테르(예를 들어, 수크로오스모노올레에이트, 세토스테아릴글루코시드, β-옥틸글루코푸라노시드에스테르, C10 내지 C16의 탄소쇄 길이를 갖는 알킬글루코시드), 모노, 디 및 폴리글리세롤에테르 및 폴리글리세롤에스테르(예를 들어, 테트라글리세롤모노라우레이트 및 모노글리세라이드, 트리글리세롤모노올레에이트[예를 들어, 그린스테드(Grinsted) 공급의 TS-T122], 디글리세롤모노올레에이트(예를 들어, 그린스테드 공급의 TST-T101), 에톡실화글리세라이드; 모노글리세라이드, 예를 들어 모노올레인 및 모노리놀레인; 디글리세라이드 지방산, 예를 들어 디글리세롤모노이소스테아레이트를 들 수 있다.
양이온계 계면 활성제로서는, 지방족-방향족 4급 암모늄할라이드; 4급 암모늄알킬아미드 유도체; 알킬아미드프로필디메틸암모늄락테이트; 알킬아미드프로필디히드록시에틸암모늄락테이트; 알킬아미드프로필모르폴리늄락테이트 등을 들 수 있다.
본 발명의 나노 입자가 리포솜의 형태인 경우, 이하와 같이 제조할 수도 있다.
지질 이중층의 구성 성분인 지질을 유기 용제에 용해한 후, 유기 용제를 증발 제거함으로써 지질막을 얻고, 이 지질막을 수화시켜, 교반 또는 초음파 처리함으로써 나노 입자를 제조한다. 계속해서, 이 나노 입자의 외액에, 소수성기 또는 소수성 화합물로 수식된 상기 펩티드를 첨가함으로써, 나노 입자의 표면에 상기 펩티드를 도입할 수 있다.
나노 입자의 제조에 있어서, 양이온성 지질(EtOH 용액)/보조 지질(EtOH 용액)/Chol(EtOH 용액)의 비율은, 적절히 변경할 수 있다. PEG를 수식하는 경우에는, PEG의 첨가 비율은 적절히 변경할 수 있고, 총 지질량에 대하여, 예를 들어 0.1 내지 15mol％를 들 수 있다.
본 발명의 나노 입자의 내부에는, 세포 내에 송달하고자 하는 목적 물질을 봉입할 수 있다.
목적 물질이 수용성인 경우에는, 나노 입자의 제조에 있어서 지질막을 수화 할 때에 사용되는 수성 용매에 목적 물질을 첨가함으로써, 나노 입자 내부의 수상으로 목적 물질을 봉입할 수 있다. 또한, 목적 물질이 지용성인 경우에는, 나노 입자의 제조에 있어서 사용되는 유기 용제에 목적 물질을 첨가함으로써, 나노 입자의 지질 이중층에 목적 물질을 봉입할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「봉입」이란, 나노 입자와 같은 중공 입자의 내부에 목적 물질을 포함하는 경우와, 지질 이중막과 같은 벡터를 구성하는 표면 부분에 유지되는 경우 모두 포함한다. 목적 물질을 송달해야 할 생물종은, 척추 동물이면 특별히 한정되는 것은 아니나, 포유 동물인 것이 바람직하다. 포유 동물로서는, 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 말, 돼지, 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스, 모르모트 등을 들 수 있다.
본 발명의 나노 입자는, 예를 들어 분산액의 상태에서 사용할 수 있다. 분산 용매로서는, 예를 들어 생리 식염수, 인산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액 등의 완충액을 사용할 수 있다. 분산액에는, 예를 들어 당류, 다가 알코올, 수용성 고분자, 비이온 계면 활성제, 항산화제, pH 조절제, 수화 촉진제 등의 첨가제를 첨가하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 나노 입자는, 분산액을 건조(예를 들어, 동결 건조, 분무 건조 등)시킨 상태에서 사용할 수도 있다. 건조시킨 나노 입자는, 생리 식염수, 인산 완충액, 시트르산 완충액, 아세트산 완충액 등의 완충액을 첨가하여 분산액으로 할 수 있다.
각 나노 입자는, 시험관내 및 생체내의 어떤 경우든 사용할 수 있다. 각 나노 입자를 생체내에 있어서 사용하는 경우에는, 투여 경로로서, 예를 들어 정맥 주사, 점적 등을 들 수 있고, 투여량 및 투여 빈도는, 본 발명에 따른 나노 입자에 봉입된 목적 물질의 종류나 양 등에 따라 적절히 조정할 수 있다.
본 발명의 나노 입자는, 또한 체중 감소, 간 장해 모두 보이지 않아, 안전하게 투여할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 제조예, 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.
제조예 1 (스테아로일화펩티드(화합물 1)의 합성)
화합물 1:
Figure pct00005
링크 아미드 레진(Rink amide resin)(0.67mMol/g)을 출발 물질로 하여, 0.1mM 또는 0.03mM 스케일로, 아미노산, 축합제(HBTU/HOBt), 반응 촉진제(DIEA)를 각각 레진에 대하여 4당량 사용하여 Fmoc 고상 합성법으로 서열 번호 1의 펩티드(C 말단은 CONH2)의 합성을 실시했다. 스테아르산(M.W.284.48), 축합제(HBTU/HOBt), 반응 촉진제(DIEA)를 레진의 4배 당량 첨가하여 활성화를 하고, 아미노산의 신장이 종료되어 N 말단만이 자유로워진 상태의 레진에 첨가하고, 실온에서 밤새 반응시켰다(HBTU: M.W.379.2, HOBt, 무수: M.W.135.1, DIEA: M.W.129.2). 반응 후에 레진에 TFA(트리플루오로아세트산) 칵테일 용액(125ml TFA, 0.25ml H2O, 0.375g 페놀, 0.125ml 에탄디티올 및 0.25ml 티오아니솔)을 첨가하여 빙냉 하에서 15분, 실온 2시간 반응시켜 크루드 펩티드를 얻었다. HPLC에 의해 정제 작업을 실시하고, 동결 건조했다. 순도의 검정은 HPLC 및 MALDI-TOF-MS에 의해 실시했다. 하기 HPLC 조건에서 분석을 실시하여, 단일 피크로서 목적물을 얻었다(유지 시간 15.1분). A 완충액: 0.1％ TFA/H2O, B 완충액: 0.1％ TFA/아세토니트릴 칼럼: 선파이어(SunFire) C18 칼럼, 5㎛, 4.6×150mm 유속: 1ml/min 파장: 220nm. MALDI-TOF-MS는, 어플라이드 바이오시스템즈 보이저 시스템(Applied Biosystems Voyager System)을 사용했다. 분자량의 계산값: 2651.8, 실측값: 2651.73. HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 도 1에 도시한다.
합성 스케일: 0.1mM 스케일(분자량 2651.8) 사용한 레진량 159.8mg. 이 레진을 사용하여 발생하는 펩티드의 이론값 283.9mg. 실제로 취해진 크루드량 183.1mg(수율 64.5％).
제조예 2(4AA 감소 펩티드(화합물 2)의 합성)
화합물 2:
Figure pct00006
제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 합성하여, 목적 펩티드를 얻었다. 목적 펩티드는, N 말단에 스테아로일기(스테아르산아미드)를 갖고, C 말단은 CONH2이며, 아미노산 서열은 서열 번호 2로 표시되는 펩티드이다. 원하는 스테아로일화펩티드의 분자량의 계산값: 2177.3, 실측값: 2177.9. HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 도 2에 도시한다.
합성 스케일: 0.03mM 스케일(분자량 2177.3), 사용한 레진의 양 61.2mg. 이 레진을 사용하여 발생하는 펩티드의 이론값 89.3mg, 실제로 취해진 크루드량 28.3mg(수율 31.7％).
제조예 3(8AA 감소 펩티드(화합물 3)의 합성)
화합물 3:
Figure pct00007
제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 합성하여, 목적 펩티드를 얻었다. 목적 펩티드는, N 말단에 스테아로일기(스테아르산아미드)를 갖고, C 말단은 CONH2이며, 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 표시되는 펩티드이다. 원하는 스테아로일화펩티드의 분자량의 계산값: 1782.9, 실측값: 1782.4. HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 도 3에 도시한다.
합성 스케일: 0.03mM 스케일(분자량 1782.9), 사용한 레진의 양 67.0mg. 이 레진을 사용하여 발생하는 펩티드의 이론값 80.0mg, 실제로 취해진 크루드량 51.4mg(수율 64.3％).
제조예 4(스크램블 펩티드(비교 화합물)의 합성)
화합물 4:
Figure pct00008
제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 합성하여, 목적 펩티드를 얻었다. 목적 펩티드는, N 말단에 스테아로일기(스테아르산아미드)를 갖고, C 말단은 CONH2이며, 아미노산 서열은 서열 번호 4로 표시되는 펩티드이다. 원하는 스테아로일화펩티드의 분자량의 계산값: 2651.8, 실측값: 2651.0. HPLC 및 MALDI-TOF-MS의 결과를 도 4에 도시한다.
합성 스케일: 0.03mM 스케일(분자량 2651.8), 사용한 레진의 양 45.3mg. 이 레진을 사용하여 발생하는 펩티드의 이론값 80.5mg, 실제로 취해진 크루드량 31.0mg(수율 38.5％).
실시예 1 상이한 pH 조건에 있어서의 입자 직경 및 표면 전위(제타 전위) 측정 결과(pH 응답성의 제시)
(1) 리포솜의 제조는, 난황 포스파티딜콜린(EPC):디올레오일테트라암모늄프로판(DOTAP)=8:1(mol비)의 비율로 혼합한 지질 에탄올 용액을 시험관에 분주하고, 또한 클로로포름을 등량 혼합한 것에, 질소 가스를 분사하여 증발 건고시킴으로써 지질 박막을 제조했다. PH7.4의 완충액을 첨가하고, 10분간 실온 조건에서 충분히 수화시켰다. 수화 후, 수조형 초음파 장치를 사용하여 시험관을 초음파 처리함으로써 리포솜을 제조했다(지질 농도 10mM). 얻어진 리포솜 현탁액에, 제조예 1에 의해 얻어진 펩티드(화합물 1)를 총 지질량의 5mol％양을 첨가하고, 인큐베이트함으로써, 정전적 상호 작용에 의해 지질막 표면에 결합되어, 당해 펩티드의 스테아릴기가 막지질의 소수 영역으로 이행됨으로써(꽂혀짐으로써) 당해 펩티드에 의해 리포솜 표면이 수식된 리포솜 1을 제조했다.
(2) 상이한 pH의 완충액으로 희석 현탁한 리포솜 1의 입자 직경(크기)과 표면 전위(ζ 전위)를 말번사제 제타사이저나노에 의해 측정했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00009
pH7.4에 있어서의 입자 직경은 200nm가 조금 안되며, pH가 저하되어도 큰 변동은 확인되지 않았다. 그러나 표면 전위는, pH7.4에 있어서 -15mV 정도이었던 것이, pH6.5에 있어서 7mV로 변화되었다. 즉, 미소한 pH 변화에 의해 표면의 전하가 마이너스로부터 플러스로 전환되는 것이 나타났다.
실시예 2 상이한 pH 조건에 있어서의 세포에 대한 도입 측정 결과(pH 응답성의 제시)
형광 색소에 의해 표식화된 지질(로다민 표식화 디올레오일포스파티딜에탄올아민)을 지질 용액에 지질량의 1mol％ 첨가해 두고, 실시예 1에 있어서의 제조 방법으로 당해 리포솜을 제조했다. 제조한 당해 리포솜을, 상이한 pH(5.5, 6.0, 6.5, 7.4)의 배양액을 채운 배양된 마우스 흑색종 세포(B16F1주)에 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 배양 상청을 제거한 세포를 트립신 처리함으로써 제거하고, 세포 중의 형광 색소량(도입된 리포솜량)을 유세포 분석기(FACS caliber flow cytometer)에 의해 측정했다. 그 결과를 도 5에 도시한다.
pH7.4의 경우, 미처리 세포(리포솜 비첨가)와 세포에 대한 리포솜 도입량에 거의 차는 확인되지 않았다. 한편, pH6.5 내지 pH5.5의 경우, 당해 리포솜은 매우 많이 도입되었다. 즉, pH의 미소한 변화(pH7.4→pH6.5)에 의해, 당해 리포솜의 도입이 현저하게 상승되었다.
이때의 세포를 공초점 레이저 현미경(Zeiss LSM 510 META)을 사용하여 관찰했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. PH 7.4에서는, 거의 세포 내에 리포솜의 형광(적색)이 확인되지 않은 것에 반하여, pH6.5 내지 pH5.5에서는, 세포질에 많은 리포솜의 형광이 확인되었다(청색은, 회히스트33342로 염색한 핵을 나타낸다). 이러한 점에서도, 미소한 pH 변화(pH7.4→pH6.5)에 의해 당해 리포솜의 세포 도입이 현저하게 증대된 것이 확인되었다.
실시예 3 배양 세포계에 있어서의 세포 내 동태 관찰 결과(엔도좀 내 pH 응답성의 제시)
실시예 2와 마찬가지로, 형광 표식화된 당해 리포솜(적색)을, 상이한 pH(5.5, 6.0, 6.5, 7.4)의 배양액을 채운 배양된 마우스 흑색종 세포(B16F1주)에 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 핵을 회히스트33342에 의해 청색으로, 엔도좀/라이소좀을 리소트래커그린에 의해 녹색으로 염색하고, 공초점 레이저 현미경(Zeiss LSM 510 META)에 의해 관찰했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
그 결과, 실시예 2와 마찬가지로, pH7.4에서는, 세포 내에 거의 적색이 관찰되지 않아, 당해 리포솜이 도입되지 않은 것이 확인되었다. 한편, pH6.5 내지 pH5.5에서는, 세포 내에 적색이 다수 확인되어, 당해 리포솜이 많이 도입된 것을 알 수 있다. 이 적색은 녹색과 겹쳐 있지 않아, 대부분이 적색 단독으로 확인되었다. 이것은, 당해 리포솜이 엔도좀/라이소좀에 머물지 않고, 세포질에서 탈출하고 있는 것을 의미하고 있다. 엔도좀/라이소좀 내는 저pH 환경이기 때문에, 당해 리포솜이 변화됨으로써 엔도좀/라이소좀막과 융합되거나 하여, 엔도좀/라이소좀으로부터 빠져나온 가능성이 시사된다. 이러한 점에서, 당해 리포솜은 엔도좀/라이소좀 내의 pH 변화에 응답하여 탈출능을 발휘할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 4 종양 마우스에 있어서의 종양 내 동태(종양 내 pH 응답성의 제시)
B16F1 세포를 피하에 이식하여 형성된 종양의 크기가 100㎣까지 성장한 종양 무모 마우스에, 형광 색소 셀트래커(CellTracker) CM-DiI(적색)를 지질량의 0.5％ 함유시킨 당해 리포솜(지질 농도 10mM), 또는 컨트롤로서, 마찬가지로 셀트래커 CM-DiI를 지질량의 0.5％ 함유시킨 폴리에틸렌글리콜(PEG) 수식 리포솜(지질 조성은, EPC: 콜레스테롤: PEG2000 수식 디스테아로일포스파티딜에탄올아민=1.85:1:0.15, 지질 농도 10mM)을 0.2ml 꼬리정맥에 투여한 후, 종양을 적출하여, 동결 절편을 제작했다. 얻어진 동결 절편을 4％ 파라포름알데히드에 의해 처리함으로써 조직 고정한 후, 항CD31 항체(혈관 내피 세포의 마커 단백질에 대한 항체)를 1차 항체로서 처리하고, 그 후에, 형광 색소 알렉사(Alexa)488(녹색) 표식화 항체를 2차 항체로서 추가 처리함으로써, 고정 조직의 면역 염색을 행했다. 또한, 동일한 고정 조직을 핵 염색 색소 DAPI를 함유한 벡타쉴드(VECTASHILD)에 의해 포매했다. 얻어진 포매 고정 조직을 공초점 레이저 현미경으로 관찰했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
양쪽 리포솜(적색) 모두, 종양 조직 내에 동일 정도 확인되었다. 이것은, 당해 리포솜은 PEG에 의해 코트되어 있지 않음에도 불구하고, PEG와 동일 정도의 혈중 체류성을 갖는 것이 시사된다. 또한, 많은 PEG 리포솜(적색)이 녹색과 함께 확인된(황색) 점에서, PEG 리포솜은 혈관 내 및 그의 주변에 위치하고 있는 것이 시사되었다. 이것으로부터 PEG 리포솜은 종양 조직으로부터 누설되기 쉽다고 생각되었다. 한편, 당해 리포솜은 적색 단독으로, 녹색으로부터 이격된 곳에서 확인된 점에서, 혈관으로부터 이격된 곳(종양 조직 내 심부)에 위치하고 있는 것이 시사되었다. 이것은, 당해 리포솜이 종양 내에 머물기 쉬운(타겟팅 효과가 우수한) 것을 시사하고 있다.
실시예 5 상이한 pH 조건에 있어서의 펩티드 단체 및 펩티드 수식 나노 입자의 CD 스펙트럼(pH 응답성 및 막 구조 기반의 필요성 제시)
제조예 1에 의해 얻어진 펩티드 단독 및 실시예 1에 준하여 얻어진 리포솜 1(각각 펩티드 농도로서 20㎛)을 상이한 pH의 PBS(-)에 현탁하고, J-720WI(닛본 분꼬우(주)사제)를 사용하여 CD(원편광 이색성) 스펙트럼을 측정했다. 또한, 해석 소프트웨어(JWSSE-480; Molecular Membrane Biology, July August 2007; 24(4): 282 내지 293 참조)를 사용하여, 스펙트럼에 있어서의 2차 구조의 조성을 예측했다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
이하의 도 9에 있어서, 「α-helix」는 α 헬릭스 구조를 의미하고, 「coil」은 랜덤 코일 구조(명확한 2차 구조를 취하지 않은 상태)를 의미하고, 「turn」은 절곡 구조를 의미한다.
그 결과, 펩티드 단독으로는, pH7.4와 pH6.5에 있어서의 CD 스펙트럼은 대부분 일치하고 있으며, pH6.0가 되어 크게 스펙트럼이 변화된 것을 알 수 있다. 이러한 점에서, 펩티드 단독으로는, pH6.0까지 pH가 저하되지 않으면 구조 변화가 일어나지 않는 것이 확인되었다.
한편, 리포솜 1의 CD 스펙트럼은, pH7.4에 있어서의 스펙트럼이 펩티드 단독의 스펙트럼과 달리, 지질막 위에 배치되어 있음으로써, 2차 구조가 상이한 상태인 것이 시사되었다. 또한, pH7.4로부터 pH6.5로 됨으로써 CD 스펙트럼이 크게 변화하고 있으며, 그 스펙트럼은 pH6.0 및 pH5.5에서도 거의 동일한 점에서, 리포솜 1 위에 배치된 펩티드는, 미소한 pH 변화에 의해 크게 구조 변화가 유기되는 것이 명확해지고, 펩티드의 미소 pH 변화에 대한 감응성에는 리포솜, 미셀 등의 입자 구조 또는 막 구조가 불가결한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6 펩티드 서열을 교체한 펩티드, 길이를 바꾼 펩티드에 있어서의 pH 응답성(입자 직경, 제타 전위, 세포 내 도입 등)의 평가 결과
(1) 실시예 1과 마찬가지의 제조 방법으로, EPC:DOTAP=8:1(mol비) 리포솜 현탁액에, 제조예 2 내지 4 중 어느 하나의 스테아릴화펩티드를 첨가하고, 인큐베이트함으로써, 각종 펩티드에 의해 리포솜 표면이 수식된 각종 펩티드 수식 리포솜 2 내지 4를 제조했다.
(2) 상이한 pH의 완충액으로 희석 현탁한 각종 펩티드 수식 리포솜의 입자 직경(크기)과 표면 전위(ζ 전위)를 말번사제 제타사이저나노에 의해 측정했다.
제조예 4에 의해 얻어진 펩티드의 수식 리포솜 4의 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00010
His로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛의 반복을 갖지 않는 리포솜 4에서는, 모든 pH에 있어서 플러스의 표면 전위를 나타내고 있으며, 본 발명 리포솜과는 완전히 상이한 성질의 것이었다.
또한, 리포솜 4의 세포에 대한 도입을 FACS에 의해 평가한 바, pH7.4에 있어서 높은 도입이 보여, pH6.5로 pH가 변화되어도, 그 도입량에는 큰 차는 확인되지 않았다(도 10). 이 결과는, 상기 표면 전위의 결과와 일치하고 있으며, His로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛의 반복을 갖지 않는 리포솜 4에서는, 구성 아미노산이 동일해도, 미약 pH 변화에 대한 응답성은 확인되지 않는 것이 밝혀졌다.
(3) 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 제조예 1의 펩티드보다 4잔기 짧은 제조예 2의 펩티드를 지질량의 5mol％, 6mol％, 7mol％ 수식한 리포솜 2a, 2b, 2c를 제조하고, 표면 전위를 측정했다. 그 결과, 어느 리포솜에서도 리포솜 1과 마찬가지의 경향을 나타냈다(표 3).
Figure pct00011
또한, 세포에 대한 도입량을 FACS에 의해 평가했다. 그 결과, 어느 리포솜에 있어서도 pH7.4에서는 미처리 세포와 동일 정도이며, 세포에 거의 리포솜이 도입되지 않았지만, pH6.5에서는 도입량이 증대되고 있었다.
이러한 점에서, 4잔기 짧은 펩티드를 수식한 리포솜이어도, 미약 pH 변화에 응답하여, 그에 따라 세포에 대한 친화성이 현저하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 또한, 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 제조예 1의 펩티드보다 8잔기 짧게 한 제조예 3의 펩티드를 지질량의 5mol％, 7.5mol％, 10mol％ 수식한 리포솜 3a, 3b, 3c를 제조하고, 표면 전위를 평가했다(표 4).
Figure pct00012
그 결과, 어느 리포솜에 있어서나 pH7.4와 pH6.5의 표면 전위에 큰 차가 있고, 특히 10mol％ 수식한 리포솜 3c에 있어서 큰 값을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Nano particle containing pH responsive peptide <130> P12-042 <150> JP 2011-097694 <151> 2011-04-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly His Gly Ala His Glu His Ala Gly His Glu His Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu His His Ala His Glu 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly His Gly Ala His Glu His Ala Gly His Glu His Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu His 20 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly His Gly Ala His Glu His Ala Gly His Glu His Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly His Gly Glu Ala His His Ala Glu Gly His His Ala 1 5 10 15 Glu Ala His His Gly Glu Ala His 20

Claims (15)

  1. 펩티드와 입자 형성 성분을 포함하는 나노 입자이며, 상기 입자 형성 성분이 리포솜 또는 미셀을 형성하고, 상기 펩티드에 있어서 그의 서열 중에 His(히스티딘)로 시작되어 산성 아미노산으로 끝나는 유닛을 2 내지 8개 갖는(각 유닛은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다), 나노 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유닛에 있어서, His와 산성 아미노산 사이에 2 내지 5개의 아미노산을 갖는, 나노 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유닛에 있어서, His와 산성 아미노산 사이에 3개의 아미노산을 갖는, 나노 입자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 His와 산성 아미노산 사이에 배열되는 아미노산이 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn으로부터 선택되는 임의의 아미노산인, 나노 입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 His와 산성 아미노산 사이에 배열되는 아미노산이 Gly, Ala, His, Cys 또는 Ser로부터 선택되는 임의의 아미노산인, 나노 입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가, 하기 화학식 (I)로 표시되는 유닛을 2 내지 8개 포함하고, 각 유닛의 아미노산 서열은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있는, 나노 입자.
    Figure pct00013

    (화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다)
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩티드가, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 펩티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노 입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가, 리포솜 또는 미셀로 유지되기 위한 소수성기를 말단에 갖는, 나노 입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소수성기가, 탄소수 12 내지 24의 탄화수소기 또는 아실기인, 나노 입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자 형성 성분이 인지질을 포함하는, 나노 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자 형성 성분이 리포솜을 형성하여 이루어지는, 나노 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 나노 입자를 포함하는, 물질 도입제.
  13. 하기 화학식 (II)로 표시되고, 아미노산의 총 수가 10 내지 60개인, 펩티드 화합물.
    Figure pct00014

    (화학식 중 His는 히스티딘을 나타내고, Glu/Asp는 글루탐산 또는 아스파라긴산을 나타낸다. AA1, AA2 및 AA3은, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 Gly, Ala, His, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다. n은 2 내지 8의 정수를 나타낸다. l, m은 동일하거나 또는 상이하며 0 또는 1을 나타낸다. R1은 탄소수 12 내지 24의 탄화수소기 또는 아실기를 나타낸다. R2는 OH 또는 C 말단 보호기를 나타낸다. Z1 또는 Z2는 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Cys, Met, Ser, Thr, Gln, Asn 중 어느 하나의 아미노산으로 구성되고, 아미노산의 수가 1 내지 8개인 링커를 나타낸다)
  14. 제13항에 있어서, 화학식 (II)로 표시되는 펩티드 화합물에 있어서의 펩티드가, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 펩티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 펩티드 화합물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, R1이 탄소수 12 내지 24의 아실기인, 펩티드 화합물.
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