TWI564020B - Containing pH-responsive peptides - Google Patents

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Description

含有pH回應性胜肽之奈米粒子 技術領域
本發明有關於一種弱酸性pH回應性胜肽及含有該胜肽之奈米粒子。此外，本發明亦關於一種含有前述奈米粒子之物質導入劑。
背景技術
於癌症之化學療法中，雖然現今正嘗試著開發以提高專一性為目的之DDS，但幾乎未有著眼於腫瘤環境者。亦即，腫瘤組織雖是處在與生理條件(pH7.4左右)相較下低pH(pH6.5附近)之特殊環境，但可回應此種微弱之pH變化而對腫瘤組織發揮專一性作用之藥物輸送載體則尚在開發之中。迄今，為了避免在血液中與血漿蛋白質結合並提高血中滯留性，而使親水性高分子之聚乙二醇(PEG)在脂質體等之表面受到修飾而用作抗癌劑等之載體(例如專利文獻1)。但已明確得知，即使是PEG仍具有抗原性。此外，由於表面提示有PEG之載體對細胞之親和性較低，不易被細胞攝入，而難以將藥物送至癌細胞內部。專利文獻2所記載之胜肽-脂質體複合物則因N末端區域存在有鹼性胺基酸(離胺酸或精胺酸)而具有正電荷，且電荷不會隨著pH而變化，無法期待充分之血中滯留性。
非專利文獻1係一種使用His片段作為pH回應性區域，透過使外部環境從7.4大幅降低至5.0而使原本為中性之His 帶正電，並利用靜電互斥力增大而使微膠粒崩解的技術，然而，單以His無法在pH6.5之微弱酸性下質子化，因此難以在pH6.5下發生電荷反轉。
非專利文獻2係一種pH回應性之微膠粒，其係使已化學結合至嵌段共聚物末端離胺酸片段之二甲基順丁烯二酸因pH降低而脫離，藉此使表面荷電由負轉正。在非專利文獻2之胜肽中，二甲基順丁烯二酸一旦脫離，正電荷之離胺酸殘基就成為露出狀態，即使pH上昇亦不會回復原狀。即使是在因血液循環而通過炎症部位般之低pH組織的情況下，二甲基順丁烯二酸亦會解離，離胺酸露出而與血液成分相互作用，故而難以到達目的腫瘤。
先行技術文獻 專利文獻
【專利文獻1】日本特開2004-10481號公報
【專利文獻2】日本特表2004-523531號公報
非專利文獻
【非專利文獻1】AIChE Journal Vol.56,No.7,2010,pp.1922-1931
【非專利文獻2】International Journal of Pharmaceutics 376(2009)134-140
發明概要
本發明之目的在於提供一種可在諸如癌組織之弱酸性 pH環境中釋放目的物質之藥物輸送載體。
本發明提供如下述(1)~(16)之奈米粒子及物質導入劑。
(1)一種奈米粒子，含有胜肽與粒子形成成分，前述粒子形成成分係形成脂質體或微膠粒，且前述胜肽中，其序列中具有2~8個以His(組胺酸)為始且以酸性胺基酸結束之單元(各單元可相同亦可不同)。
(2)如(1)之奈米粒子，其前述單元中，His與酸性胺基酸之間具有2~5個胺基酸。
(3)如(1)或(2)之奈米粒子，其前述單元中，His與酸性胺基酸之間具有3個胺基酸。
(4)如(2)或(3)之奈米粒子，其中排列在前述His與酸性胺基酸之間的胺基酸係選自Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn之任意胺基酸。
(5)如(4)之奈米粒子，其中排列在前述His與酸性胺基酸之間的胺基酸係選自Gly、Ala、His、Cys或Ser之任意胺基酸。
(6)如(1)至(5)中之任一奈米粒子，其中前述胜肽含有2~8個如下述式(I)所示之單元，且各單元之胺基酸序列可相同亦可不同；His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp (I)(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸；AA1、AA2及AA3互為相同或不同，各自表示Gly、Ala、His、 Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn)。
(7)如(6)之奈米粒子，其中前述胜肽具有如序列編號1~3中任一者所載之胜肽序列。
(8)如(1)至(7)中之任一奈米粒子，其中前述胜肽係於末端具有用以被脂質體或微膠粒保持之疎水性基。
(9)如(8)之奈米粒子，其中前述疎水性基係碳數12~24之烴基或醯基。
(10)如(1)至(9)中之任一奈米粒子，其中前述粒子形成成分包含磷脂質。
(11)如(1)至(10)中之任一奈米粒子，其中前述粒子形成成分係形成脂質體。
(12)如(1)至(11)中之任一奈米粒子，其中前述奈米粒子所保持之目的物質係選自於由藥物、核酸、胜肽、蛋白質、糖類及其等之複合物所構成群組中之一種以上物質。
(13)一種物質導入劑，含有如(1)至(12)中之任一奈米粒子。
(14)一種如下述通式(II)所示之胜肽化合物：R1-(Z1)1-[His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp]n-(Z2)m-R2 (II)(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸；AA1、AA2及AA3互為相同或不同，各自表示Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn；n表示2~8之整數；l、m互為相同或不同，表示0或1；R1表示碳數12~24之烴基或醯基；R2表示OH或C末端保護 基；Z1或Z2係由Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln及Asn中之任一胺基酸所構成，表示胺基酸數為1~8個之連接子)；且，其胺基酸之總數為10~60個。
(15)如(14)之胜肽化合物，其中通式(II)所示胜肽化合物中之胜肽具有如序列編號1~3中任一者所載之胜肽序列。
(16)如(14)或(15)之胜肽化合物，其中R1為碳數12~24之醯基。
若按本發明，則可提供一種奈米粒子或物質導入劑，其在pH6.5左右之弱酸性細胞環境下可釋放出封入於內部之目的物質。
由於本發明之奈米粒子可在此種弱酸性領域下釋放目的物質並使其作用，因此可提供一種優異之藥物輸送系統。
本發明之奈米粒子在pH7.4之生理條件下，可透過酸性胺基酸之負電荷而避免與血漿成分等相互作用，在具有血中滯留性之同時，亦透過鄰接酸性胺基酸來控制His之pH回應性，藉此，即使在微弱酸性下亦可敏感地回應pH，因此而具有如下述般之高度有用性：利用EPR效果(Enhanced Permeation and Retention Effect)而到達腫瘤後，在腫瘤環境之微弱酸性條件下質子化而反轉電荷，進而被癌細胞所攝入。
圖式簡單說明
第1圖顯示製造例1所得硬脂醯基化胜肽(序列編號1，C 末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第2圖顯示製造例2所得硬脂醯基化胜肽(序列編號2，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第3圖顯示製造例3所得硬脂醯基化胜肽(序列編號3，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第4圖顯示製造例4所得硬脂醯基化胜肽(序列編號4，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第5圖顯示以流式細胞儀測定細胞中之螢光色素量的結果。
第6圖顯示以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)觀察細胞之結果。
第7圖顯示：以Hoechst33342將細胞核染色成藍色，並以LysotrackerGreen將內體(endosome)/溶體(lysosome)染色成綠色，再以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)進行觀察之結果。
第8圖顯示實施例4之罹癌小鼠之腫瘤內動態評估結果。
第9圖顯示預測胜肽單體及胜肽修飾奈米粒子之圓二色光譜(CD spectrum)與2次結構組成的結果。
第10圖顯示以FACS評估製造例4所得擾亂序列(scrambled sequence)胜肽修飾脂質體對於細胞之攝入結果。
第11圖顯示以FACS評估製造例2所得胜肽修飾脂質體對於細胞之攝入結果。
本發明之實施形態
本發明之奈米粒子係以粒子形成成分與胜肽作為構成要素。
本發明之胜肽的總胺基酸數為10~60個，且宜為12~40個，更宜為14~30個。
本發明之胜肽含有His(組胺酸；H)與酸性胺基酸[麩胺酸(Glu；E)或天冬胺酸(Asp；D)]作為必須構成要素，且在序列中具有以His為始並以酸性胺基酸結束之單元。於該單元中，His與酸性胺基酸之間具有2~5個胺基酸，且較宜具有3個胺基酸。此外，His與酸性胺基酸間之胺基酸數在全部單元中均為同數，舉例來說，最初之單元有3個時，在其後的單元中亦會是3個。該胺基酸係選自Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn之胺基酸，且較宜為Gly、Ala、His、Cys或Ser。胜肽所具有之該單元的總數為2~8個(較宜為2~6個，更宜為2~4個)，且鄰接之單元係直接結合。因此，單元與單元結合之部分會是酸性胺基酸與His隣接。
再者，於較佳之1個實施形態中，本發明之胜肽含有2~8個(宜2~6個，更宜2~4個)下述式(I)所示單元：His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp (I)
(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸。AA1、AA2及AA3分別表示Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn)。
AA1、AA2或AA3宜為Gly、Ala、Ser、Cys、His，且更宜為Gly、Ala、His。胜肽序列中之His總數較酸性胺基酸總數之數量更多，例如，酸性胺基酸有2個時，His有3~7個；酸性胺基酸有3個時，His有4~10個；酸性胺基酸有4個時，His有5~13個；酸性胺基酸有5個時，His有6~16個；酸性胺基酸有6個時，His有7~19個；酸性胺基酸有8個時，His有9~25個。本發明之胜肽具有2~8個酸性胺基酸，且宜有2~6個，更宜有2~4個。His則有3~25個，且宜有3~19個，更宜有3~13個。
本發明中尤為理想之單元係His-Gly-Ala-His-Glu、His-Ala-Gly-His-Glu、His-Ala-Ala-Gly-Glu及His-His-Ala-His-Glu。本發明之胜肽除了上述單元之外，亦可在N末端或C末端具有由Gly、Ala、His等構成之胺基酸序列(Z1或Z2；連接子)。構成此種連接子(Z1或Z2)之胺基酸可列舉如Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln、Asn，且宜為Gly、Ala、Ser、Cys，更宜為Gly、Ala、His。此種連接子(Z1或Z2)之胺基酸總數分別為1~8個，且宜為2~6個。
此外，本發明胜肽之C末端亦可具有C末端保護基。C末端保護基包含：以C末端羧基之碳原子形成醯胺之基；或，以羧基之氧原子形成酯之基。形成酯之基包含烷基，特別是碳數1~5之直鏈或枝鏈狀基(C1~C5烷基)，例如甲基、乙基及丙基等；形成醯胺之基則包含諸如胺基之胺官能基或烷胺基官能基，例如甲胺基、乙胺基、二甲胺基、二乙 胺基、甲基乙基胺基等之單C1~C5烷胺基及二C1~C5烷胺基。以形成醯胺之基為宜，更宜為胺基。
此外，本發明胜肽係經疎水性基修飾。疎水性基係導入至胜肽之N末端或C末端，且宜導入至N末端。疎水性基係碳數12以上(宜碳數12~24，較宜碳數14~22，更宜碳數16~20)之基，可列舉如烴基、醯基，且以醯基尤佳。疎水性基可為直鏈狀，亦可具有支鏈。烴基可列舉如十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等直鏈狀或具有支鏈之碳數12以上的烷基，且宜為硬脂基。適宜之醯基可例示如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、山萸醯基、異硬脂醯基、二十烯醯基、二十四醯基、異棕櫚醯基、油醯基、亞油醯基(linoloyl)等，且選自月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、異硬脂醯基及油醯基者更佳。
本發明之較佳胜肽可列舉如具有序列編號1~3之胺基酸序列者。於較佳實施形態中，該胜肽之N末端結合有用以保持脂質體或微膠粒之疎水性基。再者，較佳實施態樣之一則是下述通式(II)所示之胜肽化合物。
R1-(Z1)1-[His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp]n-(Z2)m-R2 (II)
[(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸。AA1、AA2及AA3互為相同或不同，各自表示Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn。n表示2~8之整數。l、m互為相同或不同，表示0或1。R1表示碳數12~24之烴基或醯基。R2表示OH或C末端 保護基。Z1或Z2表示連接子，其係由Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln、Asn中之任一胺基酸所構成，且胺基酸之數量為1~8個)；該胜肽化合物之胺基酸總數為10~60個。]
示於上述式(II)中之烴基、醯基、C末端保護基可列舉如上述者。
本發明之胜肽可利用習知之胜肽合成法來製造，特別是液相合成法或固相合成法。此外，亦可利用以基因重組技術而將編碼本發明胜肽之DNA導入宿主細胞並使其表現的方法來進行合成。例如，在固相合成法中，係使對應C末端之胺基酸的胺基業經9-茀甲氧羰基(Fmoc)等胺甲酸酯型保護基保護，並使此N-保護胺基酸之羧基結合至具有胺基之不溶性樹脂後，去除胺基之保護基，朝N末端方向依序使保護胺基酸縮合，接著使不溶性樹脂及胺基酸之保護基脫保護，即可製得本發明之胜肽。前述具有胺基之不溶性樹脂並未特別受限，但以Fmoc-NH-SAL樹脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基乙基)苯氧基連接子樹脂)為佳，可透過開裂而直接賦予目的物。可利用習知方法以習知保護基將官能基予以保護，即可製得用於合成本發明胜肽之保護胺基酸，亦可使用市售之保護胺基酸。保護基可使用習知物，例如甲氧羰基、乙氧羰基、第三丁氧羰基、9-茀甲氧羰基、苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基等。調製保護胺基酸時，舉例來說可使用諸如DIPCDI(二異丙基碳二醯亞 胺)-HOBt(1-羥基苯并三唑)法等之習知方法。本縮合反應可於習知溶劑中進行，可例示如二甲基甲醯胺等之有機溶劑。胺基之保護基脫離試劑並未受限，可利用哌啶/二甲基甲醯胺等之習知試劑將Fmoc基等之保護基切斷。胺甲酸酯型保護基之脫保護可使用接觸還原、三氟乙酸等來進行。其他保護基亦可以習知方法進行脫保護。於合成之各階段中，縮合反應之進行程度可透過諸如寧海準反應法(ninhydrin reaction)之習知方法來確認。如上述進行即可製得具有所欲胺基酸序列之保護胜肽。不溶性樹脂使用Fmoc-NH-SAL樹脂時，藉由以TMSBr(三甲基矽基溴)或TFA(三氟乙酸)等進行處理，可使樹脂及保護基同時脫離。另，胜肽之C末端依所使用之樹脂種類而定，可獲得COOH(R2=OH)或CONH2(R2=NH2)。
R2定義為OH時，本發明胜肽之C末端胺基酸的羧酸並無取代。同樣地，R2定義為NH2等時，本發明胜肽之C末端胺基酸之羧酸為醯胺(CONH2)。
此外，對本發明胜肽導入疎水性基，可使用習知慣用之方法。例如，就醯基之導入而言，可使N末端呈自由(free)之胜肽以及對應所導入之醯基的羧酸與縮合劑(HBTU/HOBt等)、反應促進劑(DIEA等)共同反應，而導入所欲之醯基。此外，就烴基之導入而言，則可於鹼存在下，藉由與對應所導入之烴基的鹵化烴反應來進行導入。
如此製得之本發明胜肽可藉由諸如抽提、再結晶、各種層析法(凝膠過濾、離子交換、分配、吸附)、電泳、相流 分配等習知手法進行單離純化，且以利用逆相高速液體層析之方法為宜。
本發明之奈米粒子的ξ電位在中性附近之pH(例如pH7或7.4)下為-100~50mV程度，且宜為-50~30mV程度，更宜為-30~10mV程度，尤宜為-30~0mV程度。ξ電位可使用粒徑/電位分布測定儀(Zetasizer)來測定。
本發明之奈米粒子的平均粒徑並未特別受限，但舉例來說，粒徑為30~1000nm，且宜為50~500nm，更宜為60~400nm，且尤宜為70~300nm。舉例來說，平均粒徑可以動態光散射法、靜態光散射法、電子顯微鏡觀察法、原子力顯微鏡觀察法等來測定。
為了將目的物質送達低pH部位，本發明之物質導入劑可用於活體外(in vitro)及活體內(in vivo)中之任一者。
低pH部位可列舉如炎症部位、腫瘤部位、感染部位等，尤佳者可例示如腫瘤部位。
奈米粒子所保持之目的物質的種類並未特別受限，可列舉如選自於由藥物、核酸、胜肽(催產素、舒緩肽、甲狀腺促素釋放因子、腦啡肽等之生理活性胜肽、胜肽激素等)、蛋白質(酵素、介白素等之各種細胞激素、細胞傳達因子、細胞成長因子、抗體等)、糖類以及其等之複合物所構成群組中之一種以上物質，且可因應診斷及治療等之目的來適當選擇。另外，「核酸」除了DNA或RNA以外，還包含其等之類似物或衍生物(例如siRNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA(phosphorothioate DNA)等)。此外，核酸可為單 股或雙股，且可呈線狀或環狀。
目的物質為藥物時，可列舉如抗癌劑、血管擴張藥及抗菌劑等。具體來說，抗癌劑可列舉如替加氟、杜薩魯比辛(doxorubicin)、道諾魯比辛(Daunorubicin)、順鉑、益樂鉑(oxaliplatin)、卡鉑定(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、SN-38、放線菌素D、長春新鹼、長春鹼、胺甲葉酸(methotrexate)、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、絲裂黴素C、克癌易(docetaxel)、環磷醯胺、截瘤達(capecitabine)、依必魯比辛(epirubicin)、吉西他濱(gemcitabine)、邁杜蔥酮(mitoxantrone)、菊白葉酸(Leucovorin)、溫諾平(vinorelbine)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、依妥普賽(Etoposide)、雌二醇氮芥(estramustine)、培尼皮質酮(prednisone)、干擾素α、介白素-2、博來黴素(bleomycin)、依弗醯胺(ifosfamide)、美司鈉(Mesna)、六甲蜜胺(altretamine)、癌康定(topotecan)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、迪皮質醇(dexamethasone)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤、氟達拉濱(fludarabine)、吉妥單抗(Gemutuzumab)、艾達魯比辛(idarubicin)、邁杜蔥酮、視網酸、阿來組單抗(alemtuzumab)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、克拉曲濱(cladribine)、依麥替尼布(imatinib)、依必魯比辛、達卡巴仁(Dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲氮芥(Mechlorethamine)、利妥昔單抗(rituximab)、地尼白介素(denileukin diftitox)、曲美普林 (trimethoprim)/美坐磺胺(sulfamethoxazole)、異嘌呤醇(allopurinol)、卡莫司汀(carmustine)、它莫西芬(Tamoxifen)、惠爾血添(filgrastim)、替莫唑胺(temozolomide)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、溫諾平、氮雜胞嘧啶核苷(azacytidine)、沙利竇邁(thalidomide)及絲裂黴素等；血管擴張藥可列舉如波生坦(bosentan)、安倍生坦(ambrisentan)及貝前列素鈉(Beraprost sodium)等；抗菌劑則可列舉如兩性黴素B(amphotericin B)、青黴素G、胺苄青黴素(ampicillin)、頭孢若林(cefazolin)、亞胺盤尼(imipenem)、氯烯內胺(Aztreonam)、紫菌素(gentamicin)、四環黴素、氯黴素、紅黴素、亞茲索黴素(azithromycin)、洛其他黴素、泰利黴素(telithromycin)、喹努普汀(quinupristin)、Phosmidosine、萘利啶酸(Nalidixic acid)、諾弗洒欣(norfloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)及利奈唑胺(linezolid)等。
目的物質為核酸時，宜例示如：選自於由部分雙股RNA(mdRNA)、有缺口(nick)之dsRNA(ndsRNA)、有間隙(gap)之dsRNA(gdsRNA)、短干擾核酸(siNA)、siRNA、微RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、短干擾寡核苷酸、經取代之短干擾寡核苷酸、經修飾之短干擾寡核苷酸、經化學修飾之dsRNA、轉錄後基因靜默RNA(ptgsRNA)所構成群組中之任一雙股RNA(dsRNA)。目的物質可使用單種或混合2種以上作使用。例如，亦可併用2種以上之siRNA。
在取代及修飾(含化學修飾)中之1個實施形態中，雙股 RNA可包含：去氧核糖核苷酸或含有2個去氧核糖核苷酸(例如胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤)之突出(overhang)等在雙股RNA之3’末端的一端或兩端有1~4個核苷酸的突出。雙股RNA可在一端或兩端上具有平滑末端。在一部分之實施形態中，第1及第2股之5’末端受到磷酸化。在雙股RNA之任一實施形態中，3’末端之核苷酸突出均可包含核酸之糖、鹼基或者骨架中經化學修飾的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。雙股RNA之任一實施形態中，3’末端之核苷酸突出均可包含1個以上普遍的鹼基核糖核苷酸。在雙股RNA之任一實施形態中，3’末端之核苷酸突出均可包含1個以上之非環核苷酸。在雙股RNA之任一實施形態中，dsRNA均可更含有5’磷酸鹽(參照Martinez et al.,Cell.110：563-574,2002；及Schwarz et al.,Molec.Cell.10：537-568,2002)或5’,3’二磷酸鹽等之末端磷酸基。
雙股RNA可更包含2’糖取代，諸如2’-去氧基、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、鹵素、2’-氟基、2’-O-烯丙基或其等之任意組合等。於進一步的實施形態中，雙股RNA在第1股或1個以上之第2股的一端或兩端上更含有封端取代基，諸如烷基、脫鹼基、去氧脫鹼基、甘油基、二核苷酸、非環核苷酸、經反轉之去氧核苷酸部分或是其等之任意組合等。
於其他之實施形態中，雙股RNA可更包含至少1個經修飾之核苷酸間鍵結，諸如獨立之硫代磷酸酯、掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲 基膦酸鹽、烷基膦酸鹽、3’-伸烷基膦酸鹽、5’-伸烷基膦酸鹽、掌性磷酸酯、膦醯基乙酸鹽、硫代膦醯基乙酸鹽、膦酸鹽、磷醯胺酸鹽、3’-胺基磷醯胺酸鹽、胺基烷基磷醯胺酸鹽、硫酮基磷醯胺酸鹽、硫酮基烷基膦酸鹽、硫酮基烷基磷酸三酯、砷基磷酸鹽、硼基磷酸鍵結或是其等之任意組合等。
雙股RNA可藉由使用下述者來進行取代或修飾(包含化學修飾)：5-甲基胞嘧啶；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；6-甲基、2-丙基或腺嘌呤及鳥嘌呤之其他烷基衍生物；在8位上經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤(8-氮雜、8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基等)；7-甲基、7-去氮及3-去氮腺嘌呤及鳥嘌呤；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；2-硫胞嘧啶；5-甲基、5-丙炔基、5-鹵代(5-溴基或5-氟基等)、5-三氟甲基或在5位上經其他取代之尿嘧啶及胞嘧啶；以及6-偶氮尿嘧啶等之核酸類似物。
雙股RNA(dsRNA)等之RNA可作化學修飾。就此種化學修飾之非限定性例示，可列舉如核苷酸間之硫代磷酸酯鍵結、2’-去氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-去氧-2’-氟核糖核苷酸、「非環狀」核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及朝末端導入甘油基及/或反方向去氧無鹼基殘基。此等化學修飾可維持細胞內之RNAi活性。
在脂質體係具有脂質雙層結構之閉鎖小胞的前提下，其可為多層膜脂質體(MLV)，亦可為SUV(small unilamellar vesicle)、LUV(large unilamellar vesicle)及GUV(giant unilamellar vesicle)等之單片膜脂質體。
在本發明之脂質體中，構成脂質雙層之脂質種類並未特別受限，其具體例可列舉如磷脂醯膽鹼(例如二油醯基磷脂醯膽鹼、二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼等)、磷脂醯甘油(例如二油醯基磷脂醯甘油、二月桂醯基磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油、二棕櫚醯基磷脂醯甘油、二硬脂醯基磷脂醯二甘油)、磷脂醯乙醇胺(例如二油醯基磷脂醯乙醇胺、二月桂醯基磷脂醯乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯基磷脂醯二乙醇胺)、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、心磷脂等之磷脂質或其等之加氫物；神經髓磷脂、神經節苷酯等之糖脂質。可使用其等中之1種或2種以上。磷脂質可為源自卵黃、大豆及其他動植物之天然脂質(例如卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)、合成脂質或半合成脂質中之任一者。該等脂質可單獨使用或混合2種以上使用。
為了使脂質雙層之物理或化學性質安定，或是為了調節膜之流動性，舉例來說，可使脂質雙層中含有下述物質中之1種或2種以上：膽固醇、膽固醇琥珀酸、羊毛固醇、二氫羊毛固醇、鏈甾醇(Desmosterol)、二氫膽固醇等源自動物之膽固醇；豆固醇、麥固醇(sitosterol)、油菜籽固醇(campesterol)、菜籽固醇(brassicasterol)等源自植物之膽固醇(植物固醇)；酵母固醇、麥角固醇等源自微生物之膽固醇；甘油、蔗糖等之糖類；三油酸酯、三辛酸甘油酯等之 甘油脂肪酸酯。其含量並未特別受限，但相對於構成脂質雙層之總脂質量，宜為5~40%(莫耳比)，更宜為10~30%(莫耳比)。
可使脂質雙層含有下述物質，並可適當調節其含量：生育酚、五倍子酸丙酯、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基甲苯等之抗氧化劑；硬脂醯胺(stearylamine)、油胺(oleylamine)等賦予正電荷之帶電物質；雙十六基磷酸酯等賦予負電荷之帶電物質；膜表面性蛋白質、膜內在性蛋白質等之膜蛋白質。
本發明之奈米粒子係於表面具有由10~60個胺基酸所構成之胜肽。使用本發明胜肽來修飾奈米粒子表面時，令構成奈米粒子之脂質為100莫耳%的情況下，宜以1~10莫耳%程度之比率進行修飾。此外，就單片膜脂質體而言，脂質雙層之外表面為脂質體之表面；就多重膜脂質體而言，最外層之脂質雙層的外表面為脂質體表面。又，本發明之奈米粒子亦可在表面以外之部分(例如脂質雙層之內表面)具有上述胜肽。
本發明之奈米粒子宜含有輔助脂質(Helper lipid)。輔助脂質可列舉如EPC(egg phosphatidylcholine)、DLPC(dilinoleoylphosphatidylcholine)、DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine)、DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)、DSPC(distearoylphosphatidylcholine)、POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)、 DOPC(dioleoylphosphatidylcholine)、DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)及SOPE(stearyloleoylphosphatidylcholine)等。於該等之中，以EPC、DOPC、DOPE及SOPE為佳。
茲將利用水合法之脂質體製造例顯示如下。
使脂質(脂質雙層之構成成分)與經疎水性基或疎水性化合物修飾之上述胜肽溶解於有機溶劑後，使有機溶劑蒸發去除，而獲得脂質膜。此時，有機溶劑可列舉如：戊烷、己烷、庚烷、環己烷等之烴類；二氯甲烷、氯仿等之鹵化烴類；苯、甲苯等之芳香族烴類；甲醇、乙醇等之低級醇類；乙酸甲酯、乙酸乙酯等之酯類；丙酮等之酮類等；且，該等可單獨使用或組合2種以上使用。接著，使脂質膜進行水合，藉由攪拌或超音波處理即可製得表面具有上述胜肽之奈米粒子。
微膠粒可僅以具有硬脂醯基等疎水性基(以醯基為佳)之本發明胜肽來形成，此時，胜肽會兼為粒子形成成分。或者，微膠粒可與磷脂質及界面活性劑等可形成微膠粒之其他成分組合使用。
磷脂質可使用形成脂質體之上述磷脂質或輔助脂質。界面活性劑(陰離子、非離子、陽離子)則可使用下述者。
陰離子系界面活性劑可列舉如：磺酸鹽(sulfonate)類，例如烷磺酸鹽、石蠟磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、α-烯烴苯磺酸鹽、磺基琥珀酸鹽及磺基琥珀酸酯[例如二辛基鈉及月桂醇聚醚磺基琥珀酸酯二鈉(Disodium laureth sulfosuccinate)]、2-羥乙磺酸鹽(isethionate)、醯基羥乙磺酸鹽(例如2-月桂醯基氧乙磺酸鈉)及脂肪酸之磺烷醯胺，特別是N-醯基甲基牛磺酸鹽；硫酸鹽(sulfate)類，例如烷基硫酸鹽、乙氧基化烷基硫酸鹽、硫酸化單甘油酯、硫酸化烷醇醯胺及硫酸化油脂；羧酸鹽(carboxylate)類，例如具有碳數12以上之碳鏈長的烷基羧酸鹽、醯基肌胺酸鹽、肌胺酸鹽(例如肌胺酸月桂基鈉)、乙氧基化羧酸鈉鹽、羧酸及鹽(例如油酸鉀及月桂酸鉀)、醚羧酸；乙氧基化羧酸及鹽，例如羧甲基乙氧基化鈉(sodium carboxymethyl alkyl ethoxylate)；磷酸酯及鹽(例如卵磷脂)；醯基麩胺酸鹽(例如正月桂醯基麩胺酸二鈉)與其等之混合物。
非離子系界面活性劑可列舉如：聚氧乙烯類，例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化醇(例如八氧基乙二醇單十六基醚、C16E8及C12E8)、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化脂肪胺、乙氧基化脂肪醯胺、乙氧基化烷醇醯胺及乙氧基化烷基酚；磷酸三酯(例如二油醯基磷酸鈉)；烷基醯胺二乙基胺；烷基醯胺丙基甜菜鹼(例如椰油醯胺丙基甜菜鹼)；氧化胺衍生物，例如烷基二甲基胺氧化物、烷基二羥乙基胺氧化物、烷基醯胺二甲基胺氧化物及烷基醯胺二羥基乙基胺氧化物；多羥基衍生物，例如多元醇酯及醚(例如，蔗糖單油酸酯、十八十六基糖苷(cetostearyl glucoside)、β-辛基呋喃葡糖苷酯(β-octyl glucofuranoside ester)、具有C10~C16碳鏈長之烷基糖苷)、單、二及聚甘油醚及聚甘油酯(例如四甘油單月桂酸酯及單甘油酯、三甘油單油酸酯[例如Grinsted所供 給之TS-T122]、二甘油單油酸酯(例如Grinsted所供給之TST-T101)、乙氧基化甘油酯；單甘油酯，例如單油酸甘油酯(mono-olein)及單亞麻油酯；二甘油酯脂肪酸，例如二甘油單異硬脂酸酯。
陽離子系界面活性劑可列舉如：脂肪族-芳香族四級銨鹵化物；四級銨烷基醯胺衍生物；烷基醯胺丙基二甲基銨乳酸鹽；烷基醯胺丙基二羥基乙基銨乳酸鹽；烷基醯胺丙基嗎林鎓乳酸鹽(alkylamidepropylmorpholium lactate)等。
本發明之奈米粒子為脂質體形態時，亦可如下述般進行製造。
將脂質(脂質雙層之構成成分)溶解於有機溶劑後，蒸發去除有機溶劑而獲得脂質膜，使該脂質膜進行水合，並進行攪拌或超音波處理，製得奈米粒子。接著，於該奈米粒子之外液中添加經疎水性基或疎水性化合物修飾之上述胜，可藉此於奈米粒子表面導入上述胜肽。
於調製奈米粒子時，可適當變更陽離子性脂質(EtOH溶液)/輔助脂質(EtOH溶液)/Chol(EtOH溶液)之比例。修飾PEG時，可適當變更PEG之添加比例，舉例來說，相對於總脂質量為0.1~15mol%。
本發明之奈米粒子內部可封入欲送達細胞內部之目的物質。
目的物質呈水溶性時，可於奈米粒子之製造過程中，將目的物質添加至脂質膜進行水合時所用的水性溶劑，進而將目的物質封入奈米粒子內部之水相中。此外，目的物 質呈脂溶性時，可將目的物質添加到製造奈米粒子時所使用之有機溶劑，藉此將目的物質封入奈米粒子之脂質雙層中。於本說明書中，「封入」一詞包含下述兩種情況，即：奈米粒子般之中空粒子內部含有目的物質；及，保持在如同脂質雙層膜般之構成載體的表面部分。應送達目的物質之生物種只要是脊椎動物即不受特別限制，但以哺乳動物為宜。哺乳動物可列舉如人類、猿猴、牛、綿羊、山羊、馬、豬、兔、狗、貓、大鼠、小鼠、天竺鼠等。
舉例而言，本發明之奈米粒子可在分散液之狀態下使用。分散溶劑可使用如生理食鹽水、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液及乙酸緩衝液等之緩衝液。亦可於分散液中添加諸如糖類、多元醇、水溶性高分子、非離子界面活性剤、抗氧化劑、pH調節劑、水合促進劑等之添加劑後再使用。
本發明之奈米粒子亦可在使分散液乾燥(例如冷凍乾燥、噴霧乾燥等)之狀態下使用。經乾燥之奈米粒子可添加生理食塩水、磷酸緩衝液，檸檬酸緩衝液，乙酸緩衝液等之緩衝液而製成分散液。
各奈米粒子無論是在活體外(in vitro)或活體內(in vivo)均可使用。將各奈米粒子使用於活體內(in vivo)時，投藥路徑可列舉如靜脈注射、點滴等，投藥量及投藥頻率可因應封入本發明奈米粒子之目的物質種類及量等來適當調整。
此外，本發明之奈米粒子未發現有導致體重減少及肝損傷中之任一現象，而可安全地進行投藥。
實施例
以下，藉由製造例及實施例來更詳盡地說明本發明，但本發明不受此等實施例所侷限一事，當已無需贅言。
製造例1(硬脂醯基化胜肽(化合物1)之合成) 化合物1：C17H35-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEHHAHE-NH2
以Rink amide resin(0.67mMol/g)作為起始劑，並以0.1mM或0.03mM之規模(scale)使用胺基酸、縮合劑(HBTU/HOBt)及反應促進劑(DIEA)相對於樹脂各4當量，以Fmoc固相合成法實施序列編號1之胜肽(C末端為CONH2)的合成。加入樹脂4倍當量之硬脂酸(M.W.284.48)、縮合劑(HBTU/HOBt)及反應促進劑(DIEA)而使其活性化，再加入胺基酸結束伸長且僅有N末端呈自由狀態之樹脂，於室溫下使其隔夜反應(HBTU：M.W.379.2；HOBt,Anhydrous：M.W.135.1；DIEA：M.W.129.2)。反應後對樹脂加入TFA(三氟乙酸)雞尾酒溶液(125ml TFA,0.25ml H2O,0.375g苯酚，0.125ml乙烷二硫醇及0.25ml大茴香硫醚)，使其於冰冷下反應15分鐘且於室溫下反應2小時，獲得粗肽(crude peptide)。以HPLC實施純化作業後進行冷凍乾燥。純度之檢測係以HPLC及MALDI-TOF-MS實施。於下述HPLC條件下實施分析，而以單一尖峰形式獲得目的物(保持時間15.1分)。A Buffer：0.1%TFA/H2O；B Buffer：0.1%TFA/乙腈；Column：SunFire C18 Column,5μm,4.6x150mm；Flow rate：1ml/min；Wavelength：220nm。MALDI-TOF-MS使用Applied Biosystems Voyager System。分子量計算值：2651.8，實測值：2651.73。茲將HPLC及MALDI-TOF-MS之結果示於第1 圖。
合成規模：0.1mM規模(分子量2651.8)、使用樹脂量159.8mg。使用該樹脂可獲得之胜肽理論值283.9mg。實際取得之粗量183.1mg(收率64.5%)。
製造例2(4AA減胜肽(化合物2)之合成) 化合物2：C17H35-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHAAGEH-NH2
利用與製造例1同樣之手法進行合成，獲得目的胜肽。目的胜肽係一N末端具有硬脂醯基(硬脂酸醯胺基)、C末端為CONH2且胺基酸序列係以序列編號2表示的胜肽。目的之硬脂醯基化胜肽的分子量計算值：2177.3，實測值：2177.9。茲將HPLC及MALDI-TOF-MS之結果示於第2圖。
合成規模：0.03mM規模(分子量2177.3)、使用樹脂量61.2mg。使用該樹脂可獲得之胜肽理論值89.3mg、實際取得之粗量28.3mg(收率31.7%)。
製造例3(8AA減胜肽(化合物3)之合成) 化合物3：C17H35-C(O)-GGGGHGAHEHAGHEHA-NH2
利用與製造例1同樣之手法進行合成，獲得目的胜肽。目的胜肽係一N末端具有硬脂醯基(硬脂酸醯胺基)、C末端為CONH2且胺基酸序列係以序列編號3表示的胜肽。目的之硬脂醯化胜肽的分子量計算值：1782.9，實測值：1782.4。茲將HPLC及MALDI-TOF-MS之結果示於第3圖。
合成規模：0.03mM規模(分子量1782.9)、使用樹脂量67.0mg。使用該樹脂可獲得之胜肽理論值80.0mg、實際取得之粗量51.4mg(收率64.3%)。
製造例4(擾亂胜肽(比較化合物)之合成) 化合物4：C17H35-C(O)-GGGGHGEAHHAEGHHAEAHHGEAH-NH2
利用與製造例1同樣之手法進行合成，獲得目的胜肽。目的胜肽係一於N末端具有硬脂醯基(硬脂酸醯胺基)、C末端為CONH2且胺基酸序列係以序列編號4表示之胜肽。目的之硬脂醯基化胜肽的分子量計算值：2651.8、實測值：2651.0。茲將HPLC及MALDI-TOF-MS之結果示於第4圖。
合成規模：0.03mM規模(分子量2651.8)、使用樹脂量45.3mg。使用該樹脂可獲得之胜肽理論值80.5mg、實際取得之粗量31.0mg(收率38.5%)。
實施例1 不同pH條件下之粒徑及表面電位(ξ電位)測定結 果(pH回應性之提示)
(1)脂質體之調製係如下進行：將卵黄磷脂醯膽鹼(EPC)：二油醯基四銨丙烷(DOTAP)=8：1(mol比)之比例混合而成的脂質乙醇溶液分注到試管，再進一步等量混合氯仿，對所得之物吹噴氮氣使其蒸發乾涸，藉此調製出脂質薄膜。添加pH7.4之緩衝液，於10分鐘室溫條件下使其充分水合。水和後，使用水槽型超音波裝置使試管進行超音波處理，藉此調製出脂質體(脂質濃度10mM)。對所得脂質體懸濁液添加總脂質量之5mol%量的製造例1所得胜肽(化合物1)並予以培養，利用靜電相互作用而結合到脂質膜表面，該胜肽之硬脂基會移動到膜脂質之疎水區域(插入)，藉此調製出脂質體表面業經該胜肽修飾之脂質體1。
(2)利用Malvern社製Zetasizer Nano，測定業經不同pH 之緩衝液稀釋懸濁之脂質體1的粒子径(size)與表面電位(ζpotential)。茲將結果示於表1。
在pH7.4下之粒徑為200nm弱，即使pH降低亦未看出大幅變動。然而，表面電位在pH7.4下為-15mV程度，在pH6.5下卻變為7mV。亦即，顯示出表面電荷因微小之pH變化而由負轉正。
實施例2 不同pH條件下之細胞攝入測定結果(pH回應性之提示)
預先以脂質量之1mol%，將業經螢光色素標識化之脂質(玫紅(rhodamine)標識化二油醯基磷脂醯乙醇胺)添加至脂質溶液，再以實施例1之調製方法調製出該脂質體。將調製出之該脂質體添加到滿足不同pH(5.5、6.0、6.5、7.4)之培養液所培養出的小鼠黑色素瘤細胞(B16F1株)，於37℃下培養1小時後，使已去除培養上清液之細胞藉由胰蛋白酶處理而剥離取出，再以流式細胞儀(FACS caliber flow cytometer)測定細胞中之螢光色素量(已攝入之脂質體量)。茲將結果示於第5圖。
在pH7.4之情況下，未處理細胞(無添加脂質體)與細胞之脂質體攝入量幾無差異。另一方面，在pH6.5~pH5.5之情況下，該脂質體被攝入極多。亦即，該脂質體之攝入因pH 之微小變化(pH7.4→pH6.5)而顯著上昇。
使用共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)觀察此時之細胞。茲將結果示於第6圖。相對於pH7.4下細胞內幾乎未有脂質體之螢光(紅色)，已確認在pH6.5~pH5.5下，細胞質有許多脂質體之螢光(藍色顯示經Hoechst33342染色之細胞核)。由此亦可確認，該脂質體對細胞之攝入因微小之pH變化(pH7.4→pH6.5)而顯著增加。
實施例3 培養細胞系中之細胞內動態觀察結果(內體內之pH回應性的提示)
與實施例2同樣地，將經螢光標識化之該脂質體(紅色)添加到滿足不同pH(5.5、6.0、6.5、7.4)之培養液所培養出的小鼠黑色素瘤細胞(B16F1株)，於37℃下培養1小時後，以Hoechst 33342將細胞核染為藍色，並以Lysotracker Green將內體/溶體染為綠色，再以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)觀察之。茲將結果示於第7圖。
其結果與實施例2相同，在pH7.4下細胞內幾乎未觀察到有紅色，而確認該脂質體未被攝入。另一方面，在pH6.5~pH5.5下，辨識出細胞內有多數紅色處，得知該脂質體已被多量攝入。該紅色並未與綠色重疊，幾乎均以單獨紅色的形式被辨識。此現象意味著，該脂質體未留在內體/溶體中而脫離細胞質。由於內體/溶體內為低pH環境，暗示了該脂質體藉由發生變化而與內體/溶體膜融合等，進而從內體/溶體脫離的可能性。由此，確認該脂質體可回應內體/溶體內之pH變化而發揮脫離能力。
實施例4 罹癌小鼠之腫瘤內動態(腫瘤內pH回應性之提示)
對於將B16F1細胞移植到皮下而形成之腫瘤已成長到100mm3大小的罹癌無毛小鼠，將含有0.5%脂質量之螢光色素CellTracker CM-DiI(紅色)的該脂質體(脂質濃度10mM)、或作為控制組而同樣含有0.5%脂質量之CellTracker CM-DiI的聚乙二醇(PEG)修飾脂質體(脂質組成為EPC：膽固醇：PEG2000修飾二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺=1.85：1：0.15；脂質濃度10mM)作尾部靜脈投藥0.2ml後，摘出腫瘤並製成冷凍切片。將所得冷凍切片以4%聚甲醛(paraformaldehyde)處理而組織固定後，將抗CD31抗體(對抗血管內皮細胞之標誌蛋白質的抗體)作為一次抗體來處理，之後將螢光色素Alexa 488(綠色)標識化抗體作為二次抗體來進行追加處理，進行固定組織之免疫染色。更以含有核染色色素DAPI之VECTASHILD包埋同一固定組織。以共焦點雷射顯微鏡觀察所得包埋固定組織。茲將結果示於第8圖。
兩種脂質體(紅色)均在腫瘤組織內被同程度辨識。此現象暗示該脂質體無論有無被PEG包覆，具有與PEG同程度之血中滯留性。此外，由於有許多PEG脂質體(紅色)與綠色一起被辨識(黃色)，而暗示了PEG脂質體位在血管內及其周邊。由此可想見，PEG脂質體容易從腫瘤組織漏出。另一方面，由於該脂質體係以單獨紅色之形式在遠離綠色處被辨識出，暗示了其位在遠離血管處(腫瘍組織內部深處)。此事暗示了該脂質體容易留在腫瘍內部(標靶效果優異)。
實施例5 在不同pH條件下之胜肽單體及胜肽修飾奈米粒子的CD spectrum(pH回應性及膜結構基礎之必要性的提示)
將製造例1所得胜肽單獨及以實施例1為準製得之脂質體1(以胜肽濃度計分別20μM)懸濁於不同pH之PBS(-)，並使用J-720WI(日本分光(股)社製)測定CD(圓偏光二色性)光譜。更使用解析軟體(JWSSE-480；Molecular Membrane Biology,July August 2007；24(4)：282~293参照)，預測光譜中之2次結構的組成。茲將結果顯示於第9圖。
於第9圖中，「α-helix」意指α螺旋結構，「coil」意指無規線圈結構(未形成明確二次結構之狀態)，「turn」係指彎折結構。
其結果得知，胜肽單獨在pH7.4與pH6.5下之CD光譜幾乎一致，在pH6.0時光譜發生了很大的變化。由此現象確認，在胜肽單獨時，只要pH未降低到pH6.0就不會引起結構變化。
另一方面，脂質體1之CD光譜中，其pH7.4下之光譜與胜肽單獨之光譜不同，暗示了2次結構因配置於脂質膜上而呈不同的狀態。再者，由於CD光譜因pH7.4轉變為pH6.5而大為變化，且其光譜在pH6.0及pH5.5下大致相同，而可明確得知，配置在脂質體1上之胜肽會因微小之pH變化而引發很大的結構變化，進而得以確認：就胜肽對於微小pH變化之感應性而言，脂質體、微膠粒等之粒子結構或膜結構是不可欠缺的。
實施例6 已替代胜肽序列之胜肽及已改變長度之胜肽的pH 回應性(粒徑、ξ電位、細胞內攝入等)的評估結果
(1)利用與實施例1同樣之調製方法，對EPC：DOTAP=8：1(mol比)之脂質體懸濁液添加製造例2~4中任一的硬脂基化胜肽並予以培養，藉此調製出經各種胜肽修飾脂質體表面的各種胜肽修飾脂質體2~4。
(2)利用Malvern社製Zetasizer Nano，測定業經不同pH之緩衝液稀釋懸濁之各種胜肽修飾脂質體的粒徑(size)與表面電位(ζpotential)。
茲將製造例4所得胜肽之修飾脂質體4的結果顯示於表2。
不具有以His為始且以酸性胺基酸結束之重複單元的脂質體4在所有pH下均顯示正值的表面電位，其性質與本發明脂質體完全不同。
再者，以FACS評估脂質體4對細胞之攝入，結果，在pH7.4下可見高量之攝入，即便pH值變化為pH6.5，仍無法承認其攝入量有很大差異(第10圖)。此一結果與上述表面電位之結果一致，而明確得知，不具有以His為始且以酸性胺基酸結束之反覆單元的脂質體4即使構成胺基酸相同，仍無法承認其對於微弱pH變化之回應性。
(3)藉由與實施例1同樣之方法調製出脂質體2a、2b、2c 並測定表面電位，該等脂質體係將較製造例1之胜肽短4個殘基之製造例2的胜肽予以修飾脂質量之5mol%、6mol%、7mol%者。結果，任一脂質體均顯示出與脂質體1同樣之傾向(表3)。
此外，以FACS評估對細胞之攝入量。結果，無論是任一脂質體，在pH7.4下均與未處理細胞同程度，脂質體幾乎未被攝入細胞中，但在pH6.5下則攝入量增大。
由此現象可確知，即使是修飾短4個殘基之胜肽而成的脂質體，仍會回應微弱pH變化，並因應此性質而使對細胞之親和性顯著增加。
(4)利用與實施例1同樣的方法進一步調製出脂質體3a、3b、3c並評估表面電位(表4)，該等脂質體係將較製造例1之胜肽短8個殘基之製造例3的胜肽修飾脂質量之 5mol%、7.5mol%、10mol%者。
結果，任一脂質體均在pH7.4與pH6.5之表面電位上顯示出很大差異，特別是經10mol%修飾之脂質體3c顯示出很大的值。
第1圖顯示製造例1所得硬脂醯基化胜肽(序列編號1，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第2圖顯示製造例2所得硬脂醯基化胜肽(序列編號2，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第3圖顯示製造例3所得硬脂醯基化胜肽(序列編號3，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第4圖顯示製造例4所得硬脂醯基化胜肽(序列編號4，C末端為CONH2)之HPLC及MALDI-TOF-MS結果。
第5圖顯示以流式細胞儀測定細胞中之螢光色素量的結果。
第6圖顯示以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)觀察細胞之結果。
第7圖顯示：以Hoechst33342將細胞核染色成藍色，並以LysotrackerGreen將內體(endosome)/溶體(lysosome)染色成綠色，再以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss LSM 510 META)進行觀察之結果。
第8圖顯示實施例4之罹癌小鼠之腫瘤內動態評估結果。
第9圖顯示預測胜肽單體及胜肽修飾奈米粒子之圓二色光譜(CD spectrum)與2次結構組成的結果。
第10圖顯示以FACS評估製造例4所得擾亂序列(scrambled sequence)胜肽修飾脂質體對於細胞之攝入結果。
第11圖顯示以FACS評估製造例2所得胜肽修飾脂質體對於細胞之攝入結果。
<110> 大鵬藥品工業股份有限公司
<120> 含有pH回應性胜肽之奈米粒子
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Claims (11)

  1. 一種奈米粒子，含有胜肽與粒子形成成分，前述粒子形成成分係形成脂質體或微膠粒，前述胜肽含有2~8個如下述式(I)所示之單元，且各單元之胺基酸序列可相同亦可不同；His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp (I)(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸；AA1、AA2及AA3互為相同或不同，各自表示Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn)。
  2. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中前述AA1、AA2及AA3可相同亦可不同，係分別選自Gly、Ala、His、Cys或Ser之任意胺基酸。
  3. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中前述胜肽具有如序列編號1~3中任一者所載之胜肽序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中前述胜肽係於末端具有用以被脂質體或微膠粒保持之疎水性基。
  5. 如申請專利範圍第4項之奈米粒子，其中前述疎水性基係碳數12~24之烴基或醯基。
  6. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中前述粒子形成成分包含磷脂質。
  7. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中前述粒子形成成分係形成脂質體。
  8. 一種物質導入劑，含有如申請專利範圍第1至7項中任一 項之奈米粒子。
  9. 一種如下述通式(II)所示之胜肽化合物：R1-(Z1)1-[His-(AA1)(AA2)(AA3)-Glu/Asp]n-(Z2)m-R2 (II)(式中，His表示組胺酸，Glu/Asp表示麩胺酸或天冬胺酸；AA1、AA2及AA3互為相同或不同，各自表示Gly、Ala、His、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln或Asn；n表示2~8之整數；l、m互為相同或不同，表示0或1；R1表示碳數12~24之烴基或醯基；R2表示OH或C末端保護基；Z1或Z2係由Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Gln及Asn中之任一胺基酸所構成，表示胺基酸數為1~8個之連接子)；且，其胺基酸之總數為10~60個。
  10. 如申請專利範圍第9項之胜肽化合物，其中通式(II)所示胜肽化合物中之胜肽具有如序列編號1~3中任一者所載之胜肽序列。
  11. 如申請專利範圍第9或10項之胜肽化合物，其中R1為碳數12~24之醯基。
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