CN101356258B - 通过与甘油的酶促反应浓缩脂肪酸烷基酯 - Google Patents

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Abstract

公开了一种在没有有机溶剂存在的条件下动力学分离烷基酯的酶促方法。使从例如鱼油获得的烷基酯在有水存在的条件下，以不同速率在真空室中与甘油反应。该反应在达到平衡之前被终止，并通过短程蒸馏从反应混合物中分离出富含烷基酯的部分。

Description

通过与甘油的酶促反应浓缩脂肪酸烷基酯
本申请要求2005年5月23日提交的美国临时专利申请系列号60/683,749的权益，将其整体引入此处作为参考。
技术领域
公开的发明属于用于浓缩脂肪酸烷基酯的酶促方法的领域。
背景技术
从天然来源获得的甘油三酯由许多不同的脂肪酸组成，该脂肪酸在碳原子数、取代模式、不饱和程度以及立体化学方面可能不同。例如在鱼油中，已经发现了超过50种不同的脂肪酸，包括商业上重要的且具有生物学活性的ω-3脂肪酸：二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。ω-3脂肪酸与对人和动物有益的健康作用相关，特别是在心血管疾病、炎症及认知功能和发育方面[1-3]。因此，需要从如鱼油、海藻油和海豹油的来源中纯化ω-3脂肪酸。
在植物油中，也可发现许多不同的脂肪酸，如反-11油酸(异油酸)和顺-6，9，12十八碳三烯酸(γ-亚麻酸(GLA))。脱水氢化蓖麻油是异油酸的良好来源，而琉璃苣油和月见草油是GLA的良好来源。GLA是一种也与积极的健康作用，如免疫系统调节、特应性湿疹、类风湿性关节炎、糖尿病性神经病和肝硬化的治疗有关的脂肪酸[4]。乳脂代表生物活性脂肪酸象反-异油酸和共轭脂肪酸的另一来源。
由于若干脂肪酸的强阳性生物学效应，脂肪酸可被用作食品增补剂、食物/饲料成分以及药物。然而，天然来源中的例如ω-3脂肪酸的浓度较低，因此需要一种可增加所需脂肪酸浓度的方法。先前，已经使用过短程蒸馏、低温溶剂结晶、溶剂冬化法和尿素配位。
这些方法昂贵且耗时，由此导致浓缩脂肪酸的高加工成本。近来，酶促反应(水解、酯化等)已经受到关注并探究将其作为以游离脂肪酸[5]、乙酯[6]或己酯[7]形式富集DHA/EPA的方式。此外，该技术已经用于以游离脂肪酸形式富集GLA[8]和以烷基酯形式富集共轭亚油酸(CLA)的异构体[9]。那些方法的限制或者是终产品的低产率，或者是加工步骤的个数，两者均对产品的成本具有直接影响。
因此，需要一种更简单、由更少的加工步骤构成、产生更高产率更高纯度的产品的方法。较大体积的EPA/DHA以乙酯形式供应给全球市场。因此，以乙酯形式富集EPA/DHA可节省加工步骤并由此节约时间和成本。
发明内容
第一方面，本发明提供一种通过使烷基酯在一步法中与甘油反应而分离脂肪酸烷基酯的方法。该反应由酶催化，在真空室中，在有水存在的条件下进行，水被允许从第二容器进入。选择反应条件以使底物与甘油以不同速率反应。在达到平衡前终止反应，以便使脂肪酸烷基酯部分的组成与最初组成相比发生改变。由于脂肪酸烷基酯与反应产物(甘油单-、二-和三-酯)之间挥发性的较大差异，可使用短程蒸馏以高产率获得纯化的烷基酯组合物。用作起始物质的脂肪酸烷基酯可从海产来源如鱼油和海藻油、从植物来源如蓖麻油、月见草油和琉璃苣油或从动物来源如海豹油和鲸油制备。根据来源不同，所述方法可用于制备烷基酯的浓缩物。这类烷基酯的非限制性实例为EPA乙酯、DHA乙酯、DPA乙酯、GLA乙酯和异油酸乙酯。
本发明的另一方面是由上述方法产生的脂肪酸烷基酯组合物。此外，是进一步包含由上述方法产生的所述组合物的食物/饲料产品、食品增补剂和药物。
本发明的另一个实施方案是一种新的脂质组合物，它包含脂肪酸烷基酯、甘油酯和游离脂肪酸。所述脂肪酸烷基酯具有高于或大于所述甘油酯1.1倍的碘值。所述组合物中所述游离脂肪酸的量少于50％(w/w)。所述组合物可被动物或人安全地食用。
附图说明
图1是通过脂肪酸烷基酯与甘油(以不同速率)在真空室(B)中的酶促反应而分离脂肪酸烷基酯的方法的示意图。
定义
此处所用术语“食品”是指适于人食用的任何食物或饭食。“食物”可以是预制和包装食品(例如，蛋黄酱、色拉调料、面包、干酪产品)或动物饲料(例如，压榨和颗粒动物饲料或粗混合饲料)。
此处所用术语“动物饲料”是指适于由动物食用的任何饲料。
此处所用术语“婴儿食品”是指为婴儿配制的食品如婴儿配制食品。
此处所用术语“食品增补剂”是指被配制成膳食或营养补充剂，用作膳食的一部分的食品。
此处所用术语“ω-3脂肪酸”是指多不饱和脂肪酸，其在从分子甲基末端起第三和第四个碳原子之间的烃链中具有最后的双键。ω-3脂肪酸的非限制性实例包括5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(DPA)、9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)和6，9，12，15-十八碳四烯酸(SDA)。
此处所用术语“ω-6脂肪酸”是指多不饱和脂肪酸，其在从分子甲基末端起第6和第7个碳原子之间的烃链中具有最后的双键。ω-6脂肪酸的非限制性实例包括顺-6，9，12-十八碳三烯酸(GLA)。
此处所用术语“鱼油”是指从海产来源获得的任何油，例如金枪鱼油、海豹油和海藻油。
此处所用术语“脂酶”是指能够水解脂肪酸酯的任何酶。
此处所用术语“挥发性反应产物”是指水和具有1-12个碳的醇。
此处所用术语“脂肪酸烷基酯”是指脂肪酸的衍生物。该脂肪酸具有1-24个碳的链长和0-6个双键。该衍生物可以是具有1-12个碳的烷基。预期了任何适合的烷基如支链、不饱和及取代的烷基链。
此处所用术语“催化有效量”是指获得催化反应所需的催化剂的最小量。
发明描述
本发明公开了一种通过脂肪酸烷基酯与甘油(以不同速率)在真空室(B)中进行酶促反应而分离脂肪酸烷基酯的方法。将减压施加于容器B并使水蒸汽(水分)通过管子由第二容器(A)进入到反应混合物中(见图1的实验装置示意图)。本发明不限于从单独的容器中加水。以缓慢和可控方式增加水蒸汽/湿度的其它方式也落在本发明范围之内。
在达到平衡之前终止反应并使用短程蒸馏从甘油酯中分离出富含脂肪酸烷基酯的馏分。甘油的用量、酶的用量和类型以及反应时间和温度需要针对每次应用进行优化。这些参数设定取决于初始组合物的化学性质、可利用的时间以及试图制备的最终组合物。本发明不限于使用任何特定的酶。事实上，预期了多种酶的使用，包括，但不限于Thermomyces Lanuginosus脂酶、Rhizomucor miehei脂酶、CandidaAntarctica脂酶、荧光假单胞菌脂酶和爪哇毛霉脂酶。根据酶和/或酶载体极性的不同，将固定化酶(例如TL-IM)分散到非极性反应混合物中可能较为困难。为了使乳液稳定，加入卵磷脂。
本发明不限于任何特定的脂肪酸烷基酯。预期了使用所公开的方法，以不同速率与甘油反应的任何脂肪酸烷基酯。这包括，但不限于：癸酸(10:0)、十一酸(11:0)、10-十一酸(11:1)、十二酸(12:0)、顺-5-十二酸(12:1)、十三酸(13:0)、十四酸(14:0)、肉豆蔻脑酸(顺-9-十四烯酸，14:1)、十五酸(15:0)、十六酸(16:0)、棕榈烯酸(顺-9-十六烯酸，16:1)、十七酸(17:1)、十八酸(18:0)、反油酸(反-9-十八烯酸，18:1)、油酸(顺-9-十八烯酸，18:1)、十九酸(19:0)、二十酸(20:0)、顺-11-二十碳烯酸(20:1)、11，14-二十碳二烯酸(20:2)、二十一酸(21:0)、二十二酸(22:0)、芥酸(顺-13-二十二烯酸，22:1)、二十三酸(23:0)、二十四酸(24:0)、二十四碳烯酸(24:1)、二十五酸(25:0)、二十六酸(26:0)、二十七酸(27:0)、二十八酸(28:0)、二十九酸(29:0)、三十酸(30:0)、异油酸(t-11-十八碳烯酸，18:1)、塔日酸(十八碳-6-炔酸，18:1)和蓖麻酸(12-羟基十八碳-顺-9-烯酸，18:1)和ω3、ω6、和ω9脂肪酰基如9，12，15-十八碳三烯酸(α-亚麻酸)[18:3，ω3]；6，9，12，15-十八碳四烯酸(十八碳四烯酸)[18:4，ω3]；11，14，17-二十碳三烯酸(二高-α-亚麻酸)[20:3，ω3]；8，11，14，17-二十碳四烯酸[20:4，ω3]；5，8，11，14，17-二十碳五烯酸[20:5，ω3]；7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸[22:5，ω3]；4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸[22:6，ω3]；9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)[18:2，ω6]；6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亚麻酸)[18:3，ω6]；8，11，14-二十碳三烯酸(二高-γ-亚麻酸)[20:3，ω6]；5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)[20:4，ω6]；7，10，13，16-二十二碳四烯酸[22:4，ω6]；4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸[22:5，ω6]；6，9-十八碳二烯酸[18:2，ω9]；8，11-二十碳二烯酸[20:2，ω9]；5，8，11-二十碳三烯酸蜂蜜酒(Mead)酸)[20:3，ω9]；t10，c12十八碳二烯酸、c10，t12十八碳二烯酸；c9，t11十八碳二烯酸和t9，c11十八碳二烯酸。此外，酰基残基可以是共轭、羟基化、环氧化或羟基环氧化酰基残基。
在从由10％EPA和50％DHA组成的组合物中富集DHA乙酯的情况下，使用了下列条件：反应时间(24小时)，甘油(13％)，Rhizomucor Miehei脂酶(RM-IM)(13％)，乙酯(74％)，反应温度(40℃)和压力(0.1-1毫巴)。在达到平衡前终止反应，然后使用短程蒸馏分离产物，其由脂肪酸烷基酯(83％)、甘油酯(14％)和游离脂肪酸(3％)组成。24小时后，乙酯馏分中DHA的含量从50％升高至74％。通过降低反应温度至25℃，其选择性进一步增加，且37小时后，达到了84％的DHA浓度。41小时后，ω-6脂肪酸花生四烯酸(AA)的水平也从0.6％降低至0.27％。在一些实施方案中，降低产物中AA的浓度可能是有用的，因为AA是一种促炎前体。慢性炎症与若干病症如心血管疾病、代谢综合征和2型糖尿病有关[10-12]。
在一个实施方案中，该方法可用于从包含这种脂肪酸烷基酯如乙基化鱼油、海藻油和/或海豹油的混合物中富集DHA烷基酯、EPA烷基酯和/或DPA烷基酯。鱼油的非限制性实例可以是从冷榨金枪鱼、沙丁鱼获得的油或它可以是鳕鱼鱼肝油。
在另一实施方案中，该方法可用于从富含GLA的来源如乙基化琉璃苣油或乙基化月见草油中富集GLA烷基酯。本发明公开了通过使乙基化琉璃苣油与甘油反应而将GLA浓度从20％增加至66.7％。
在另一实施方案中，该方法可用于从脱水氢化蓖麻油乙酯或部分氢化的共轭亚油酸乙酯的混合物中以及从其它来源中富集异油酸。
在另一实施方案中，CLA乙酯异构体如顺-9、反-11可从CLA乙酯异构体如顺-9、顺-11；顺-9、反-11；反-9、顺-11；反-9、反-11；顺-10、顺-12；顺-10、反-12；反-10、顺-12和反10、反-12的混合物中富集。
本发明不限于任何特定的机理。事实上，机理的理解无需实践本发明。尽管如此，根据我们的观察和其它报道[5]，烷基酯与甘油之间的反应较慢。加入少量水可增加反应速度，然而分子水平的机理还不清楚。由于反应过程中酸值没有增加(酸值从2.8-3.4)这一事实，有理由相信反应在脂肪酸烷基酯与甘油之间直接进行。预期水可提高酶的活性且游离脂肪酸不是该方法中的中间体。
本发明与现有技术相比在以下方面提供了改进，即可在不转化成游离脂肪酸的情况下，直接富集脂肪酸烷基酯。大体积的浓缩的脂肪酸烷基酯可在世界范围的市场上商购。使用本发明，可节省1-3个方法步骤，由此可减少富集过程的时间和成本。此外，可以增加产率，这是因为例如DHA乙酯与甘油酯之间的挥发性大于游离脂肪酸形式的DHA与甘油酯之间的挥发性。甘油酯是当脂肪酸烷基酯与甘油反应时形成的反应产物。
具体实施方式
实施例1
将100g乙酯(10％EPA和50％DHA(相对峰面积))、13g甘油和13g来自于Novozymes(Bagsvaerd，Denmark)的固定化rhizomucormiehei脂酶(RM-IM)混合于反应容器中并搅拌。反应在40℃(压力0.1-1毫巴)下进行，水/蒸汽从第二个单独的容器中进入(见图1的图解)。8、16和24小时后从反应混合物中收集样品并通过GC-FID分析。结果表明乙酯部分中DHA的含量在8、16和24小时后分别为61％、70％和74％。24小时后，乙酯的量降低至约40％且游离脂肪酸的水平增加至约2％。相对于乙酯的初始量，从第二容器中食用的水量为约40％。接着，过滤除去酶并使混合物脱气且使用短程蒸馏法蒸馏，以便从甘油酯中分离出乙酯馏分。GC分析表明最终的蒸馏液含有83％乙酯、14％甘油单酯和2-3％游离脂肪酸。残余物主要由甘油酯(甘油单-、二-和三-酯)组成，但还有5％乙酯和0.5-1％游离脂肪酸。
实施例2
在与实施例1相同的条件下进行实验，区别之处在于使4.3g甘油、4.3g RM-IM和33g乙酯(10％EPA和50％DHA)在25℃的温度下反应。29小时、37小时和41小时后，乙酯部分分别含有81％DHA、84％DHA和80％DHA。AA的水平从第0小时的0.7％降低至41小时后的0.26％。反应食用了9g水。酸值在5-8的范围内。
实施例3
在与实施例1相同的条件下进行实验，区别之处在于使100g脂肪酸乙酯(富含GLA的乙基化琉璃苣油)、13g甘油、0.34g卵磷脂和13.7g来自Novozymes(Bagsvaerd，Denmark)的固定化ThermomycesLanoginusus(TL-BVI)在50℃的温度下反应。开始时，GLA乙酯的浓度为20％，18:1，18:2和18:3峰之间的比值为1∶2∶1。2小时后，GLA的浓度增加至34.8％且18:1，18:2和18:3的比值变为1∶3∶3。5小时后，GLA的浓度增加至42.4％且18:1，18:2和18:3的比值为1∶3∶4。23小时后，GLA的浓度增加至67％且18:1，18:2和18:3的比值为1∶3∶11。反应过程中食用的水量为547g。
实施例4
进行与实施例3相同的实验，区别之处在于没有加入卵磷脂。40小时后终止实验，结果表明反应没有发生。
实施例5
在与实施例1相同的条件下进行实验，区别之处在于使300g脂肪酸乙酯(乙基化海豹油)、40g甘油、1g卵磷脂和45g TL-IM在50℃的温度下反应。海豹油是富含ω-3脂肪酸EPA、DHA和DPA的海产来源。25小时后，终止实验。DHA浓度从8％增加至11.9％，DPA浓度从3.2增加至3.7％且EPA浓度从7.1增加至8.2％。反应过程中食用了50g水。酸值从开始时的0.5增加至25小时后的7.9。
从上面可以清楚看出，本发明提供了一种新的富集脂肪酸烷基酯的方法。上面说明书中提及的所有出版物和专利引入此处作为参考。在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。虽然已经根据具体的优选实施方案描述了本发明，但应理解所要求保护的本发明不应不适当地限制到这类具体的实施方案。事实上，用于实施本发明的所述模式的各种改进，其对于药物、生物化学或相关领域的技术人员而言是显而易见的，意欲落在下列权利要求的范围之内。
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Claims (22)

1.一种用于富集脂肪酸烷基酯的方法，包括：
a)形成至少两种脂肪酸烷基酯、甘油和催化有效量的酶的混合物；
b)在有水存在的情况下减压处理该混合物，其条件是使得至少两种脂肪酸烷基酯和甘油以不同速率酯化而产生甘油酯，以便获得与其在初始组合物中的浓度相比富含脂肪酸烷基酯的脂肪酸烷基酯馏分；和
c)从甘油酯中分离出富含脂肪酸烷基酯的馏分；
其中所述方法不是富集某脂肪酸烷基酯的一种异构体。
2.权利要求1的方法，其中水以蒸汽形式提供。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的条件包括在25或40℃的温度下搅拌该混合物。
4.权利要求1-3任一项所要求的方法，进一步包括在所有脂肪酸烷基酯被酯化前终止酯化反应的步骤。
5.权利要求1-3任一项所要求的方法，进一步包括使产物混合物经历短程蒸馏步骤，以便获得脂肪酸烷基酯馏分。
6.权利要求1-3任一项所要求的方法，其中脂肪酸烷基酯从选自鱼油、海藻油、海豹油、鲸油、琉璃苣油、月见草油、脱水氢化蓖麻油和部分氢化的共轭亚油酸的甘油三酯制备。
7.权利要求1-3任一项所要求的方法，其中所述脂肪酸烷基酯是鱼油乙酯或甲酯。
8.一种配制食品的方法，包括将权利要求1-7任一项的方法的步骤(c)所获得的分离出来的富含脂肪酸烷基酯的馏分配制成食品的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述食品为婴儿配制食品。
10.组合物，包含按照权利要求1-7任一项的方法的步骤(c)所制备的分离出来的富含脂肪酸烷基酯的馏分。
11.权利要求10的组合物，进一步包含至少一种其它可食用物质。
12.一种用于富集脂肪酸烷基酯的方法，包括使包含至少两种脂肪酸烷基酯、甘油、水和催化有效量的酶的混合物在可有效引起甘油以不同速率开始酯化脂肪酸烷基酯的温度下反应，同时从反应混合物中除去醇和水，并从甘油酯中分离出富含脂肪酸烷基酯的馏分；其中所述方法不是富集某脂肪酸烷基酯的一种异构体。
13.一种用于富集脂肪酸烷基酯的方法，包括使包含至少两种脂肪酸烷基酯、甘油和催化有效量的酶的混合物酯化，如此甘油以不同速率酯化脂肪酸烷基酯并在所有脂肪酸烷基酯被酯化前终止该酯化反应，并从甘油酯中分离出富含脂肪酸烷基酯的馏分；其中所述方法不是富集某脂肪酸烷基酯的一种异构体。
14.一种酶促游离脂肪酸富集方法，包括在可有效引起甘油以不同速率开始酯化脂肪酸烷基酯的温度下搅拌包含至少两种脂肪酸烷基酯、甘油和催化有效量的酶的混合物，并分离出脂肪酸，同时除去反应混合物中的挥发性反应产物的步骤，其中所述挥发性反应产物是指水或具有1-12个碳的醇。
15.权利要求1-3或12-14任一项所要求的方法，其中反应混合物进一步包含卵磷脂。
16.权利要求8的方法，其中所述的食品是为人制备的。
17.一种配制动物饲料的方法，包括将权利要求10或11的组合物配制成动物饲料的步骤。
18.按照权利要求8的方法制备的食品。
19.按照权利要求9的方法制备的婴儿配制食品。
20.按照权利要求17的方法制备的动物饲料。
21.权利要求1-3或12-14任一项所要求的方法，其中在达到平衡之前反应被终止。
22.权利要求1-3或12-14任一项所要求的方法，其中在达到一种或多种选择的脂肪酸烷基酯的所需浓度后反应被终止。
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