CN101284956A - 一种海洋微生物防污涂料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋微生物发酵产物用于制备海洋微生物防污涂料的方法，实现利用生物原料制备防止海洋生物附着的防污涂料，属于生物污损防护技术领域，包括防污微生物制备、防污蛋白酶制备和微生物防污涂料的制备三个工艺步骤，先将藤壶、贻贝匀浆处理，取匀浆放入液体培养基琼脂板上划线分离培养得防污微生物；再将微生物由斜面培养基接入到液体种子培养基中和发酵培养基中培养，经处理后减压冷冻干燥得目标活性物防污蛋白酶；最后依次向氯化橡胶溶液中加入松香搅拌均匀后加入膨润土，然后用电动搅拌均匀后加入活性物防污蛋白酶，混合均匀得微生物防污涂料，其工艺过程简便，生产成本低，防污损效果好，且没有环境污染。

Description

一种海洋微生物防污涂料的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种新型的海洋微生物发酵产物应用于海洋防污领域，制备海洋微生物防污涂料的方法。该方法可实现利用生物原料制备防止海洋生物附着的防污涂料，属于生物污损防护技术领域。

背景技术：

海水中存在大量污损生物如贻贝、藤壶、海藻等，这些海生物会附着在船舶的船体、海水冷却管系、甚至声纳等部位，这种现象统称为海生物污损。海生物污损会使船舶航行阻力增大，海水冷却系统换热效率降低，声纳性能失灵等，严重影响着船舶的机动性、安全性。因此采取措施防除海生物的污损对降低船舶的维护费用，保障船舶的安全性有重要意义。

目前采用的防止海生物污损的手段主要有：电化学方法、电解海水法、涂装海洋防污涂料和水下机械清洗等。涂装海洋防污涂料是目前最有效、最方便、最经济的方法，也是目前采用的主要防污损方法。有机锡自抛光防污涂料(SPC)以其优良的抛光降阻作用及防污效果，一度得到了广泛的应用。但由于有机锡对海洋环境会产生严重的污染，使海生物发生遗传变异，因此国际海事组织通过决议要求到2008年全面禁用有机锡。抛光型氧化亚铜类防污涂料成为现有技术的主流，虽然符合现在的环保要求，但由于铜元素会在海洋中，特别是海港中大量积聚，导致海藻等生物的大量死亡，从而破坏生态平衡，因此最终也将被禁用。由于上述原因，发达国家的研究机构，包括美国、德国、日本等的研究机构都已经开始致力于研究不含重金属防污剂的防污涂层材料，其中从海生物(海洋细菌、大叶藻、珊瑚等)中提取活性物质，添加到防污涂料中对海洋生物进行驱避，从而达到防污效果是目前的主要研究方法和研究对象。

污损生物的胶粘剂在刚分泌出来时，一般是无色、透明液体，不具备粘性，具备被微生物分解的条件。丹麦科学家Ib Schneider和Knud Allermann研制筛选出一种蛋白酶能够水解藤壶从幼虫到成虫演变过程中分泌的蛋白胶。美国Mary等人从纹藤壶的细菌生物膜中分离出16种微生物，其中12种具有抑制网纹藤壶幼虫附着的作用，且大部分防污微生物属于Vibrio种。Holmst rom从被囊动物成体中分离到一中染色后为深绿色的G^-菌，称为D2菌株，D2菌株能够产生两种组分，其中低分子量(＜500Da)的化合物对幼虫附着具有强烈抑制作用，高分子量物质对藤壶幼虫和一些海洋细菌也有一定抑制作用；Kon-ya等人从海绵Halichondria okadai上分离得到一种细菌Alteromonas sp.并从这种细菌的培养基中提取到了具有抑制网纹藤壶活性的泛酶-8；英国学者也已成功应用捕食性细菌制成涂料取得了防污效果；Grant等2003年由海洋生物表面分离出的细菌，即假单孢菌NUDMB50-11，对纹藤壶幼虫的附着有显著的抑制作用。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有海洋环境防污损技术存在的缺点，根据微生物种类的丰富多样性、微生物对其他生物的拮抗性及微生物易实现低成本大规模培养的特点，从海洋中分离纯化有防污功能的微生物成份再加工制备成防污损涂料，通过其分泌生成的蛋白酶降解污损生物附着时分泌的胶粘蛋白及附着在基材表面的蛋白质消耗营养物，达到抑制污损生物的附着而又不杀死生物体本身的目的；由于蛋白酶可被自然降解生成肽段和氨基酸，没有任何污染，其制备的防污损涂料是无毒、无害的新型环保生物防污剂。

为了实现上述目的，本发明方法包括防污微生物制备、防污蛋白酶制备和微生物防污涂料的制备三个工艺步骤。

本发明涉及的防污微生物制备是先将从海洋环境中取得的藤壶、贻贝样品用匀浆器进行匀浆处理，取匀浆10ml放入100ml2216E液体培养基在25℃富集培养24小时，将富集培养的菌液在琼脂板(磷酸二氢钾1.8g，磷酸氢二钠6.5g，氯化钠0.5g，硫酸锌0.1g，氯化钙0.01g，酪素20g，酪素水解氨基酸0.25g，琼脂100g)上进行划线分离培养，24小时后观察培养皿，挑取有水解圈生成的菌落进行进一步分离纯化，直到细胞菌落形态稳定一致、细胞显微观察形态一致即得到防污微生物(纯菌落)。

本发明涉及的防污蛋白酶制备工艺是将微生物纯菌落由斜面培养基接入到液体种子培养基中，其培养基配方为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-15g，氯化钠3-8g，海水1升，pH 7.0-7.2；培养24小时后，将5-10ml种子培养基接入到发酵培养基中进行培养，转速为100-180转/min，发酵培养基配方为：玉米粉20-30g，豆粉30-40g，磷酸氢二钠1-4g，磷酸二氢钾0.3g，海水1升；发酵48小时以后，3000rpm/min离心15-30分钟；上清液用60％硫酸铵饱和溶液盐析，静置24小时，8000rpm/min离心30分钟；离心后的沉淀用sephadex-G75层析，流动相为水，流速为0.6ml/min，每300秒收集一管；层析后将相同组分合并，减压冷冻干燥即制得目标活性物防污蛋白酶。

本发明涉及的微生物防污涂料的制备是按重量百分比依次称取氯化橡胶70-80％，松香12-17％，膨润土1-4％，活性物防污蛋白酶4-10％，向氯化橡胶溶液中加入松香，搅拌均匀后加入膨润土，然后用电动搅拌器高速搅拌均匀，最后加入活性物防污蛋白酶，混合均匀即制得微生物防污涂料产品。

本发明制得微生物防污涂料，其工艺过程简便，生产成本低，防污损效果好，且没有环境污染，其产品对藤壶幼虫附着的抑制率达到76％，对贻贝幼虫的抑制率可达100％，在南海海域实海挂板40天未见海生物附着。

具体实施方式：

实施例1：防污微生物的制备

将保存的防污微生物菌种用接种针挑取一环，接种到种子培养基中(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，海水1L，pH 7.0-7.2)，培养24小时后，按5％的接种比例接种到盛有100ml发酵培养基250ml三角瓶中，150转/min，20℃培养48小时；用纱布粗滤发酵液；过滤母液8000rpm/min离心30分钟，沉淀物为防污微生物。

实施例2：防污蛋白酶的制备

将实施例1制得的防污微生物发酵液，在6000rpm的转速下离心15分钟，取上清液用饱和度为60％的硫酸铵进行盐析，隔夜静置后，8000rpm/min，30分钟离心处理，取沉淀，然后用sephadex G-75层析柱层析，收集相同组分后，进行冷冻干燥。对样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，防污蛋白酶的分子量大约为65Kd。

实施例3：微生物防污涂料的制备

称量实施例1中的防污微生物3.5g，向80g氯化橡胶的二甲苯(40/100，W/W)溶液中添加15g松香并加入1.2g膨润土，用电动搅拌器搅拌10分钟后，加入经过滤、离心的沉淀物(目标活性微生物)3.5g并搅拌均匀，即得微生物防污涂料；将上述制备涂料涂布于A3钢上，待涂层完全干燥后在海域中挂板40天，挂板表面上未见有海生物生成。

实施例4：防污蛋白酶涂料的制备

称取实施例2中的防污蛋白酶16g，氧化锌2g，丙烯酸树脂100g。将防污蛋白酶16g添加到100g丙烯酸树脂中，电动搅拌机混匀，然后加入氧化锌，混匀。

实施例5：目标活性微生物对藤壶的抑制

将有成体藤壶的石块从桶中取出，用自来水冲洗干净，阴干2个小时，放入盛有新鲜海水的海生物培养箱中，并适当加以光照，过大约半个小时后就有大量藤壶幼虫释放出来；当幼虫大量释放时，将容器遮起来使其不透光，用LC-1506光导纤维冷光源照亮容器的一侧，利用幼虫的趋光性，用吸管将其吸出，经镜检为II期无节幼虫，转移到盛有新鲜海水的大烧杯中，在黑暗的环境下培养，每个大烧杯中盛有大约200只幼虫，幼虫密度为1-2个/ml。

实验容器为玻璃培养皿(9cm)，每个培养皿加配制好的目标活性微生物防污剂溶液10ml，选取10只活泼的II期幼虫，先将幼虫转移至一个盛有相应浓度的目标活性微生物防污剂溶液的培养皿中，再转移到实验用的培养皿中，以最大限度的减少从大烧杯中带入的海水量，保持实验培养皿中的实验溶液浓度尽可能不变，加入幼虫时不能使其离水，可用管径略大于幼虫体长的玻璃吸管带水移放，并防止损伤幼虫，每组设3个平行；实验期间不投饵、不充气，实验中目标活性微生物防污剂的重量百分比浓度为20％，在黑暗处培养24小时后，用显微镜观察并记录结果，其中对照组10只藤壶中有8只在游动，有两只沉底；实验组只有两只在游动，目标活性微生物对藤壶幼虫的抑制率为75％。

实施例6：目标活性微生物对贻贝的抑制作用

在六孔板中各加入10ml海水和10ml含目标活性微生物防污剂的海水(防污微生物的重量含量为20％)；在室温下培养24小时后，分别计数贻贝的足丝数目，并列于下表中；

表1：防污微生物的贻贝防污结果

从表1中可以看出，在海水中，贻贝幼体的足丝数目分别达到37和42根，而添加了防污微生物的样本中则没有足丝产生，这说明目标活性微生物防污剂对贻贝释放的形成附着作用的蛋白质足丝起到了非常好的分解作用，抑制了贻贝足丝的形成，对足丝的抑制率达到了100％。

Claims (3)

1. 一种海洋微生物防污涂料的制备方法，包括防污微生物制备、防污蛋白酶制备和微生物防污涂料制备三个工艺步骤，其特征在于防污微生物制备是先将从海洋环境中取得的藤壶、贻贝用匀浆器进行匀浆处理，取匀浆放入液体培养基在25℃富集培养24小时，将富集培养的菌液在琼脂板上进行划线分离培养24小时后观察培养皿，挑取有水解圈生成的菌落进行进一步分离纯化，直到细胞菌落形态稳定一致、细胞显微观察形态一致即得到防污微生物；防污蛋白酶制备是将微生物纯菌落由斜面培养基接入到液体种子培养基中培养24小时后，将种子培养基接入到发酵培养基中进行培养，转速为100-180转/min，发酵48小时以后，3000rpm/min离心15-30分钟；上清液用60％硫酸铵饱和溶液盐析，静置24小时，8000rpm/min离心30分钟；离心后的沉淀层析，流动相为水，流速为0.6ml/min，每300秒收集一管；层析后将相同组分合并，减压冷冻干燥即制得目标活性物防污蛋白酶；微生物防污涂料制备是按重量百分比依次称取氯化橡胶70-80％，松香12-17％，膨润土1-4％，活性物防污蛋白酶4-10％，向氯化橡胶溶液中加入松香，搅拌均匀后加入膨润土，然后用电动搅拌器搅拌均匀，最后加入活性物防污蛋白酶，混合均匀即制得微生物防污涂料。

2. 根据权利要求1所述的海洋微生物防污涂料的制备方法，其特征在于培养基配方为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-15g，氯化钠3-8g，海水1升，pH 7.0-7.2。

3. 根据权利要求1所述的海洋微生物防污涂料的制备方法，其特征在于发酵培养基配方为：玉米粉20-30g，豆粉30-40g，磷酸氢二钠1-4g，磷酸二氢钾0.3g，海水1升。