CN110564618B - 一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:S1.配置缺少氮源、碳源的不完全培养基;S2.培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水混合,调节pH,消毒,将鱿鱼墨‑海水混合液与不完全培养基、灭菌改性硅藻土混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基。本发明工艺简单合理、易操作,以葛仙米糖蛋白和鱿鱼墨作为培养基补充氮源和碳源,制得的鱿鱼墨培养基具筛选抗氧化性良好的适应低浓度营养状态的鱿鱼体内部海洋微生物,本培养基专一性较强,适合与鱿鱼等相似的头足类海洋动物的体内微生物的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法。
背景技术
鱿鱼墨约占鱿鱼体重的1.3%,是鱿鱼加工的主要副产物之一(张井.北太平洋鱿鱼内脏酶解液中重金属镉的脱除研究[D].中国海洋大学硕士学位论文,2009.),黑色素是目前所知的唯一保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体,具有抗氧化、促进免疫功能、促进骨髓造血和防止衰老等功能。头足类海洋生物体内含有类似的墨汁,鱿鱼墨主要成分为黑色素和蛋白多糖复合体,其内的微生物与宿主未共生关系,可为微生物提供碳源和氮源,海洋微生物的筛选一直是微生物实验工作者的一个难点(衣尧.海洋微生物抗肿瘤活性产物的筛选、菌种鉴定及产物的初步研究[D].上海海洋大学硕士学位论文,2013.),海洋的环境具有高盐度、寡营养等特点,而头足类海洋生物的内生微生物的相关研究领域较为薄弱,利用相似的培养条件,模拟共生状态,可使头足类海洋生物的内生微生物具备与环境相适应的次生代谢产物,也同样具备与真黑色素相似的性质,且可扩大规模,降低成本。
发明内容
本发明提供一种鱿鱼墨海洋微生物培养基及其制备方法,其目的在于,提供一种鱿鱼墨海洋微生物培养基,以葛仙米糖蛋白和鱿鱼墨作为培养基补充氮源和碳源,制得的鱿鱼墨培养基具筛选抗氧化性良好的适应低浓度营养状态的鱿鱼体内部海洋微生物,本培养基专一性较强,适合与鱿鱼等相似的头足类海洋动物的体内微生物的筛选。
本发明提供一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:
S1. 配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为0.01-0.04%,加入KH2PO4,使其质量分数为0.11-0.14%,加入牛肉膏,使其质量分数0.05%-0.1%,加入人工海水调配,使其质量分数为3-3.5%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至7.0-7.4,高温灭菌得到灭菌完成的不完全培养基;
S2. 培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:60-90混合,调节pH至7.0-7.4,消毒,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基;
所述改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料。
作为本发明进一步的改进,所述改性硅藻土的制备方法为将葛仙米糖蛋白加入0.5wt%的木醋液溶液中溶解,搅拌后加入硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土。
作为本发明进一步的改进,所述葛仙米糖蛋白与木醋液的质量体积比为1:20-50,所述葛仙米糖蛋白与硅藻土的质量比为1:5-10。
作为本发明进一步的改进,所述搅拌混合为200-500r/min搅拌1h。
作为本发明进一步的改进,所述葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取1-2h,离心,浓缩至相对密度为2-2.5,加入75%的乙醇沉淀,得到黏性蛋白产物后加入混合有机溶剂,搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇沉淀,离心,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白。
作为本发明进一步的改进,所述75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:3-7;所述75%的乙醇与上清液的体积比为1:3-7;所述黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:5-10;所述沉淀温度为0-20℃;所述离心转速为5000-10000r/min,离心时间5min;所述混合有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷和丙酮按照体积比1:1:1混合。
作为本发明进一步的改进,所述高温灭菌为115-125℃加热灭菌40min;所述消毒为72℃下消毒15s。
作为本发明进一步的改进,所述鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:2-7。
本发明进一步保护一种上述制备方法制得的鱿鱼墨海洋微生物培养基。
本发明进一步保护一种上述制备方法制得的鱿鱼墨海洋微生物培养基在培养海洋微生物中的应用。
本发明具有如下有益效果:本发明采用水提醇沉法/有机溶剂提取法/水提醇沉法得到葛仙米中的糖蛋白,糖蛋白上的羟基、氨基、羧基与硅藻土上的羟基、羧基等通过氢键连接,得到改性硅藻土,将碳源、氮源固定在具有多孔结构的硅藻土上,有助于微生物的繁殖和生长;
本发明工艺简单合理、易操作,以葛仙米糖蛋白和鱿鱼墨作为培养基补充氮源和碳源,制得的鱿鱼墨培养基具筛选抗氧化性良好的适应低浓度营养状态的鱿鱼体内部海洋微生物,本培养基专一性较强,适合与鱿鱼等相似的头足类海洋动物的体内微生物的筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中不同培养基对海洋微生物的培养效果对比图;
图2为本发明测试例2中不同培养基对海洋微生物的培养效果对比图;
图3为本发明测试例2中各种菌种在培养基上的生长情况图;
图4为本发明测试例2中各种菌种在培养基上的生长情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:
S1. 配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为0.01%,加入KH2PO4,使其质量分数为0.11%,加入牛肉膏,使其质量分数0.05%,加入人工海水调配,使其质量分数为3%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至7.0,115℃加热灭菌40min得到灭菌完成的不完全培养基;
S2. 培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:60混合,调节pH至7.0,72℃下消毒15s,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土(鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:2)混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基;
改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料,制备方法为将1g葛仙米糖蛋白加入20mL 0.5wt%的木醋液溶液中溶解,200r/min搅拌1h后加入5g硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土,得率为92%。
葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取1h,离心,浓缩至相对密度为2,加入75%的乙醇(75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:3)沉淀,得到黏性蛋白产物后加入混合有机溶剂(黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:5,有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷和丙酮按照体积比1:1:1混合),搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇(75%的乙醇与上清液的体积比为1:3)沉淀,沉淀温度为0℃,离心,离心转速为5000r/min,离心时间5min,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白,得率为90%。
实施例2
一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:
S1. 配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为0.04%,加入KH2PO4,使其质量分数为0.14%,加入牛肉膏,使其质量分数0.05%-0.1%,加入人工海水调配,使其质量分数为3.5%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至7.4,125℃加热灭菌40min得到灭菌完成的不完全培养基;
S2. 培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:90混合,调节pH至7.4,72℃下消毒15s,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土(鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:7)混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基;
改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料,制备方法为将1g葛仙米糖蛋白加入50mL 0.5wt%的木醋液溶液中溶解,500r/min搅拌1h后加入10g硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土,得率为94%。
葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取2h,离心,浓缩至相对密度为2-2.5,加入75%的乙醇(75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:7)沉淀,得到黏性蛋白产物后加入混合有机溶剂(黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:10,有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷和丙酮按照体积比1:1:1混合),搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇(75%的乙醇与上清液的体积比为1:7)沉淀,沉淀温度为0-20℃,离心,离心转速为10000r/min,离心时间5min,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白,得率为92%。
实施例3
一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:
S1. 配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为0.03%,加入KH2PO4,使其质量分数为0.125%,加入牛肉膏,使其质量分数0.07%,加入人工海水调配,使其质量分数为3.2%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至7.2,120℃加热灭菌40min得到灭菌完成的不完全培养基;
S2. 培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:75混合,调节pH至7.2,72℃下消毒15s,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土(鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:5)混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基;
改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料,制备方法为将1g葛仙米糖蛋白加入35mL 0.5wt%的木醋液溶液中溶解,350r/min搅拌1h后加入7g硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土,得率为95%。
葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取1.5h,离心,浓缩至相对密度为2.3,加入75%的乙醇(75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:5)沉淀,得到黏性蛋白产物后加入混合有机溶剂(黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:7,有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷和丙酮按照体积比1:1:1混合),搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇(75%的乙醇与上清液的体积比为1:5)沉淀,沉淀温度为10℃,离心,离心转速为7000r/min,离心时间5min,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白,得率为94%。
对比例1
与实施例3相比,制备工艺参数不同。
一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,包括以下步骤为:
S1. 配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为01%,加入KH2PO4,使其质量分数为1%,加入牛肉膏,使其质量分数1%,加入人工海水调配,使其质量分数为1%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至5,120℃加热灭菌10min得到灭菌完成的不完全培养基;
S2. 培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:20混合,调节pH至6,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土(鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:5)混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基。
改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料,制备方法为将1g葛仙米糖蛋白加入15mL 5wt%的木醋液溶液中溶解,100r/min搅拌1h后加入1g硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土,得率为70%。
葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取1h,离心,浓缩至相对密度为1.2,加入75%的乙醇(75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:5)沉淀,得到黏性蛋白产物后加入正丁醇(黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:1),搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇(75%的乙醇与上清液的体积比为1:1)沉淀,沉淀温度为10℃,离心,离心转速为2000r/min,离心时间5min,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白,得率为62%。
对比例2
与实施例3相比,改性硅藻土用普通硅藻土替代。
对比例3
与实施例3相比,葛仙米糖蛋白用普通乳清蛋白替代。
对比例4
向普通培养基中改性硅藻土。
所述普通培养基原料及制备方法如下:
原料:牛肉膏0.3g,蛋白胨1g,琼脂1.5g,氯化钠0.5g,水1000mL
制备方法:向烧杯中加水100mL,加入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,火上加热,待各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌,调节pH值为7.2-7.6后,高压蒸汽灭菌30min,制得。
对比例5
向普通培养基中加入葛仙米糖蛋白。
测试例1
将本发明实施例1-3和对比例1-3制备的鱿鱼墨海洋微生物培养基和普通培养基对海洋微生物革兰氏阴性杆菌、弧菌、海藻进行培养,结果见图1。注释:**为与普通培养基相比,P<0.01。
由图1可知,实施例1-3对海洋微生物具有良好的培养效果明显优于对比例1-3。
测试例2
将本发明实施例3和对比例4、5制备的培养基和普通培养基对海洋微生物革兰氏阴性杆菌、弧菌、海藻进行培养,结果见图2。注释:**为与普通培养基相比,P<0.01,*为P<0.05。
由图2可知,实施例3对海洋微生物具有良好的培养效果明显优于对比例4、5,可见,向普通培养基中加入硅藻土或者葛仙米糖蛋白并没有明显提高海洋微生物的培养效果,而将其与本发明组合物复配后则具有明显协同增效的作用。
测试例3
1 抑菌试验 根据卫生部颁布的《消毒技术规范》,选择大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌ATCC6538、白色念珠菌ATCC10231和黑曲霉ATCC16404四种代表菌株做抑菌试验,考察本发明实施例1-3产品的抑菌性。试验结果这些菌种在专利产品周围均能正常生长,无抑菌环出现,并且菌落 也可生长。根据《消毒技术规范》,由试验结果可知,专利产品对微生物的生长无抑制作用。 2 微生物唯一碳源生长试验 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌在实施例3制备的培养基上培养2天后,菌落生长良好,白色念珠菌、酿酒酵母、黑曲霉和桔青霉略有生长。5天时白色念珠菌、酿酒酵母、黑曲霉和桔青霉在实施例3制备的培养基均长出较好菌落。结果见图3-4。
与现有技术相比,本发明采用水提醇沉法/有机溶剂提取法/水提醇沉法得到葛仙米中的糖蛋白,糖蛋白上的羟基、氨基、羧基与硅藻土上的羟基、羧基等通过氢键连接,得到改性硅藻土,将碳源、氮源固定在具有多孔结构的硅藻土上,有助于微生物的繁殖和生长;
本发明工艺简单合理、易操作,以葛仙米糖蛋白和鱿鱼墨作为培养基补充氮源和碳源,制得的鱿鱼墨培养基具筛选抗氧化性良好的适应低浓度营养状态的鱿鱼体内部海洋微生物,本培养基专一性较强,适合与鱿鱼等相似的头足类海洋动物的体内微生物的筛选。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:包括以下步骤为:
S1.配置缺少氮源、碳源的不完全培养基:加入MgSO4,使其质量分数为0.01-0.04%,加入KH2PO4,使其质量分数为0.11-0.14%,加入牛肉膏,使其质量分数0.05%-0.1%,加入人工海水调配,使其质量分数为3-3.5%,用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液pH至7.0-7.4,高温灭菌得到灭菌完成的不完全培养基;
S2.培养基的制备:将鱿鱼墨与灭菌人工海水按照质量体积比1:60-90混合,调节pH至7.0-7.4,消毒,于超净工作台中将鱿鱼墨-海水混合液与步骤S1得到的不完全培养基、灭菌改性硅藻土混匀,得到鱿鱼墨海洋微生物培养基;
所述改性硅藻土为葛仙米糖蛋白/硅藻土复合材料;
所述改性硅藻土的制备方法为将葛仙米糖蛋白加入0.5wt%的木醋液溶液中溶解,搅拌后加入硅藻土,继续搅拌混合均匀,40℃烘干研细,得到改性硅藻土;
所述葛仙米糖蛋白的制备方法为将葛仙米干粉加入水中沸水提取1-2h,离心,浓缩至相对密度为2-2.5,加入75%的乙醇沉淀,得到黏性蛋白产物后加入混合有机溶剂,搅拌后静置24h,收集上清液,加入75%的乙醇沉淀,离心,收集沉淀,得到葛仙米糖蛋白。
2.根据权利要求1所述鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:所述葛仙米糖蛋白与木醋液的质量体积比为1:20-50,所述葛仙米糖蛋白与硅藻土的质量比为1:5-10。
3.根据权利要求1所述鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:所述搅拌混合为200-500r/min搅拌1h。
4.根据权利要求1所述鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:所述75%的乙醇与浓缩液的体积比为1:3-7;所述75%的乙醇与上清液的体积比为1:3-7;所述黏性蛋白产物与混合有机溶剂的质量体积比为1:5-10;所述沉淀温度为0-20℃;所述离心转速为5000-10000r/min,离心时间5min;所述混合有机溶剂为正丁醇、二氯甲烷和丙酮按照体积比1:1:1混合。
5.根据权利要求1所述鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:所述高温灭菌为115-125℃加热灭菌40min;所述消毒为72℃下消毒15s。
6.根据权利要求1所述鱿鱼墨海洋微生物培养基的制备方法,其特征在于:所述鱿鱼墨-海水混合液、不完全培养基和灭菌改性硅藻土的质量比为10:10:2-7。
7.一种如权利要求1-6任一所述制备方法制得的鱿鱼墨海洋微生物培养基。
8.一种如权利要求1-6任一所述制备方法制得的鱿鱼墨海洋微生物培养基在培养海洋微生物中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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