CN101283270A - 分析用保持体及其利用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析用保持体及其利用。所述分析用保持体为含有具有非金属制基质的导电性材料的分析对象保持体。该分析用保持体由于含有导电性材料，因而作为需要向保持体施加电压等从而进行分析对象的供给、保持或分析时的保持体是有用的。例如，本发明的分析用保持体可以替代MALDI－TOFMS等质谱分析用的金属制样品板或用作样品板的一部分。

Description

分析用保持体及其利用
技术领域
本发明涉及分析用保持体、保持有分析对象的保持体、质谱分析方法和氨基酸序列的分析方法。
背景技术
在蛋白质、肽、多糖类等高分子化合物、有机化合物的解析中，激光解吸电离(LDI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)及利用该电离的飞行时间质谱分析(TOFMS)等质谱分析法成为有用的手段。在这些电离方法、例如MALDI中，通常在样品载玻片上放置芥子酸等基质与蛋白质的混合物，对该混合物进行激光照射，由此使蛋白质电离。在这样的电离工序中所用的样品板使用导电性的不锈钢等金属制板以便用于其后的质谱分析工序。
此外，利用电泳或者喷墨等印刷方法将二维排列的分子印迹(blot)在透液性的保持体上，用导电性双面胶带等将该保持体贴覆在金属制样品板上或以其它方式置于金属制样品板上(例如，日本特开2005-83784)。
发明内容
质谱分析中，大多对分析对象进行化学修饰等，但金属制板对这样的化学修饰不具有耐受性，需要另外进行化学修饰后将修饰物转移到金属制样品板上。并且，上述现有的保持体其自身均不具有导电性，因此即使将其贴覆在(或以其他方式置于)金属制板上也难以实现良好的电离。进而，由于需要贴在金属制板上，所以不得不使用薄膜状的保持体，导致操作困难。
因此，本发明的一个目的是提供一种分析对象的保持体，其适于LDI和MALDI等中的电离。并且，本发明的另一目的是提供一种质谱分析法，其能简化分析对象的化学修饰等。并且，本发明另一目的是提供一种蛋白质或肽的分析方法，其能简化用于序列分析的化学修饰操作。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过将具有非金属性基质的导电性材料用作电离时所用的固相保持体，可以解决至少一个上述课题，从而完成了本发明。即，根据本发明，提供以下方案。
本发明人研究出以下方案用于解决至少一个上述课题。
(1)一种分析用保持体，其用于保持分析对象，该保持体为具有非金属性基质的导电性材料。
(2)如(1)所述的保持体，其中，所述导电性材料为导电性高分子材料。
(3)如(2)所述的保持体，其中，所述导电性高分子材料为导电性材料分散保持在有机高分子基质中而成的复合导电性高分子材料。
(4)如(1)所述的保持体，其中，所述导电性材料为导电性陶瓷材料。
(5)如(4)所述的保持体，其中，所述导电性陶瓷材料为具有表面处理层的石墨材料，所述表面处理层是利用玻璃态碳或热分解碳形成的。
(6)如(1)～(5)任一项所述的保持体，其中，所述保持体对选自由乙酸、三氟乙酸和乙酸酐组成的组中的酸具有耐蚀性。
(7)如(1)～(6)任一项所述的保持体，其中，所述保持体是透液性的或非透液性的。
(8)如(1)～(7)任一项所述的保持体，其中，所述保持体为膜状、板状和微量滴定板(microtiter plate)状中的任一形状。
(9)如(1)～(8)任一项所述的保持体，其中，所述保持体以选自多核苷酸、寡聚核苷酸、蛋白质、肽、糖蛋白质和多糖类中的1种或2种以上的分子或这些物质的衍生物为分析对象。
(10)如(1)～(9)任一项所述的保持体，其中，该保持体为质谱分析用的样品板或其一部分。
(11)如(10)所述的保持体，其中，该保持体用于基质辅助激光解吸电离质谱分析。
(12)如(11)所述的保持体，其中，该保持体用于飞行时间质谱分析。
(13)如(1)～(12)任一项所述的保持体，其中，该保持体对埃德曼反应具有耐蚀性。
(14)如(13)所述的保持体，其中，该保持体用于保持在保持体上进行的埃德曼反应或者其类似反应的反应产物(product)和反应中间体(intermediate product)。
(15)如(1)～(14)任一项所述的保持体，其中，该保持体用于氨基酸序列分析。
(16)一种保持体，其为用于保持分析对象的分析用保持体，该保持体为具有非金属性基质的导电性材料，并对埃德曼反应具有耐蚀性，同时可以保持埃德曼反应产生的埃德曼反应生成物(by-product)。
(17)一种保持体，其保持有1种或2种以上的分析对象，所述保持体含有分散保持在非金属制基质中的导电性高分子材料。
(18)如(17)所述的保持体，其中，该保持体中排列有2个以上的分析用区域，该分析用区域保持所述1种或2种以上的分析对象。
(19)如(18)所述的保持体，其中，所述分析用区域各自具有固有的位置信息。
(20)如(17)～(19)任一项所述的保持体，其中，所述分析对象选自氨基酸、肽和蛋白质。
(21)如(17)～(20)任一项所述的保持体，其中，在所述分析用区域保持有N末端氨基酸残基不同的蛋白质或肽。
(22)如(17)～(20)任一项所述的保持体，其中，在所述分析用区域保持有埃德曼反应或者其类似反应的反应产物和反应中间体。
(23)如(17)～(22)任一项所述的保持体，其中，通过电泳或液相色谱法将所述分析对象供给至所述保持体进行保持。
(24)一种质谱分析方法，其具有使用分析对象的保持体的激光解吸电离工序，所述分析对象的保持体为具有非金属制基质的导电性材料。
(25)如(24)所述的方法，其中，所述激光解吸电离工序为基质辅助激光电离工序。
(26)如(24)或(25)所述的方法，该方法具有飞行时间质谱分析工序。
(27)如(24)～(26)任一项所述的方法，其中，所述电离工序为使用(17)～(23)任一项所述的分析对象的保持体的工序。
(28)一种方法，其为蛋白质或肽的分析方法，该方法具有如下工序：
(a)将蛋白质或肽供给至保持体上进行保持的工序，该保持体为具有非金属制基质的导电性材料；
(b)对上述保持体上的蛋白质或肽的部分末端氨基酸残基进行化学修饰，同时进行切断的工序；和
(c)对上述保持体上的由上述(b)工序得到的末端氨基酸残基发生欠缺的片断和在上述(b)工序中并未被切断的上述蛋白质或肽进行质谱分析的工序。
(29)如(27)所述的方法，其中，所述(b)工序为利用埃德曼反应或其类似反应来进行的工序。
(30)如(28)或(29)所述的方法，其中，对所述蛋白质或肽的N末端氨基酸残基依次反复实施适当次数的所述(b)工序和所述(c)工序。
(31)如(28)～(30)任一项所述的方法，其中，所述保持工序是将通过电泳分离的或通过液相色谱法洗脱的蛋白质或肽供给至所述保持体进行保持的工序。
具体实施方式
本发明的分析用保持体的特征在于，该保持体由具有非金属制基质的导电性材料形成。根据本发明，由于保持体由这样的导电性材料构成，因而其作为在需要向保持体施加电压以进行样品的供给、保持或分析时的保持体是有用的。例如，本发明的分析用保持体可以替代MALDI-TOFMS等质谱分析用的金属制样品板或者用作其一部分。
此外，由于本发明的分析用保持体由具有非金属制基质的导电性材料形成，因而与金属制的保持体相比，本发明的分析用保持体可以容易地提高耐蚀性。因此，在保持体上可以容易地实施用于对分析对象进行修饰的各种化学反应。因此，本发明可以消除以往在进行质谱分析之前要另外进行将修饰反应的产物涂布在质谱分析用的样品板上的操作之类的麻烦，可以在同一保持体上实施修饰反应和分析工序。
在作为本发明其他实施方式的质谱分析方法和蛋白质或肽的分析方法中，也以具有本发明的分析用保持体或使用本发明的分析用保持体为特征，由此可以提供与该实施方式对应的优点。
下面对本发明的分析用保持体进行说明，同时依次对作为本发明的其他实施方式的质谱分析方法和肽分析方法进行说明。
(分析用保持体)
对于本发明的分析用保持体(以下简称为“保持体”)中所用的导电性高分子材料，其形态并无限定，可以采用与分析目的等相对应的形态。例如可以是珠粒状、基板等板状、膜状、具有形成为1个或2个以上的分析对象区域的孔(well)等的凹部或隔壁的微量滴定板状。例如，在应用于蛋白质测序仪和质谱分析或荧光分析等时，优选板状、膜状、微量滴定板状等。另外，此处所说的板状的保持体是指作为整体具有容易处理的程度的刚性的保持体。作为所谓的基板，优选具有目前使用的程度的刚性。将保持体制为板状时，其可以单独用作样品板。另外，膜状保持体是指其自身具有难以维持恒定的三维形态的程度的挠性或柔软性的保持体。对于这样的膜状保持体，既可以将其与由具有非金属制基质的导电性材料形成的板的表面一体化来使用，也可以将其与不锈钢、铝、钛等具有导电性的金属板的表面一体化来使用。此外，在将其与板进行一体化的情况中，优选利用膜原有的粘合性进行一体化，但也可以使用含有导电性材料的胶带材料(テ一プ材)或粘结剂等。
此外，保持体既可以为具有多孔性等透液性的物体，也可以为通过致密材质或者通过具有防液性等而成为非透液性的物体，优选为非透液性的物体。保持体为透液性时，分析对象被保持在保持体内部，具有电离效率降低且质谱分析的精度降低的倾向。更优选通过使材料为致密材质而成为非透液性的保持体。
对保持体所具有的导电性没有特别限定。例如，用于TOFMS时，可以使用厚度方向的体积电阻率(Ωcm)为2～10000的支持体。该体积电阻率可以基于例如JIS K7194进行测定。
此外，通过使保持体为具有非金属制基质的导电性材料，其自身可以作为质谱分析、特别是LDI-TOFMS或MALDI-TOFMS的样品板。并且，由于该保持体不会阻碍利用MALDI进行的电离工序，因而可以认为导电性材料是适于MALDI的保持体。
此外，保持体优选具有耐蚀性。作为针对具有耐蚀性所优选的酸，可举出硫酸、盐酸、硝酸等无机酸以及乙酸、三氟乙酸等卤化有机酸、有机磺酸等有机酸。其中，考虑到肽和蛋白质的解析，优选对蛋白质和肽的修饰反应中通常使用的有机酸具有耐蚀性。该有机酸的典型例子可举出以埃德曼反应切断N末端氨基酸时所用的乙酸、三氟乙酸等卤化有机酸和乙酸酐等有机酸酐，优选所述保持体对这样的酸具有耐蚀性。另外，保持体优选对甲醇和乙腈等具有耐蚀性。
作为具有非金属制基质的导电性材料，可举出导电性高分子材料。作为导电性高分子材料，例如可举出取代的或未取代的聚乙炔、二乙炔聚合物、取代的或未取代的聚吡咯、取代的或未取代的聚噻吩、聚苯胺等实质上为导电性塑料的材料，此外还可举出在塑料或硅酮等高分子材料中分散复合有金属粉末或纤维、或者炭黑或石墨的粉末或纤维等导电性材料的复合导电性高分子材料。本发明中，从耐蚀性的角度出发，优选使用聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯等。
导电性高分子材料可以具有对保持分析对象有利的官能团。这样的官能团既可以在高分子材料合成时预先在单体等中具有，也可以在合成后通过对保持体的表面进行后修饰而导入这样的官能团。例如，可举出导入氨基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基、碳二亚胺基、活性酯基。例如对于为保持DNA和RNA等核酸而优选的官能团，可举出N-羟基琥珀酰亚胺基、碳二亚胺基、环氧基、甲酰基等，对于为保持肽而优选的官能团，可举出N-羟基琥珀酰亚胺基、碳二亚胺基、环氧基、甲酰基、金属螯合物。
此外，作为其他导电性材料，可举出导电性陶瓷材料。例如，可举出碳化硅(SiC)、石墨等非氧化物系陶瓷。另外，还可以举出在绝缘性陶瓷的基质中混合有金属或导电性陶瓷材料的颗粒而成的复合导电性陶瓷材料等。
优选的导电性陶瓷材料为石墨，更优选为在其表面具有利用玻璃态碳或热分解碳形成的表面处理层的石墨。利用这样的石墨，可以制成如下的样品板来使用，其不仅能够抑制石墨的脱离并同时具有优异的导电性，而且还具有优异的耐溶剂性和反复使用性。其中，具有利用热分解碳形成的表面处理层的石墨可以进一步抑制碳颗粒的脱落，同时具有针对乙腈等溶剂的优异的耐溶剂性、针对酸和碱性等的耐腐蚀性并具有强度、反复使用性等，因而是更优选的。这些具有表面处理层的石墨材料均可以单独构成适于MALDI的样品板，而不用贴覆在金属制板上。
作为具有利用玻璃态碳形成的表面处理层的石墨，可优选使用将玻璃态碳浸渗到石墨表面和内部的材料。浸渗深度例如优选为1mm以上，更优选为10mm以下。作为这样的石墨材料，可以以例如VGI(揖斐电株式会社的石墨制品)的形式得到。另外，作为具有利用热分解碳形成的表面处理层的石墨，可以使用具有通过碳的化学蒸镀形成的覆膜的石墨。优选石墨为各向同性石墨。作为这样的石墨材料，例如可以以Pyrocarb(揖斐电株式会社的石墨制品)的形式获得。
这样的保持体具有必要的耐蚀性，因此可以在保持体上进行以埃德曼反应为首的用于对分析对象进行制备或修饰的反应，同时具有借助非共价键性的结合来对蛋白质、肽和氨基酸或者它们的衍生物进行保持的倾向。因此，本发明的保持体可以使蛋白质和氨基酸或者它们的衍生物在其上生成并保持在保持体上直接供于质谱分析等。由以上可知，本发明的保持体可以成为用于LDI或MALDI质谱分析的保持体，此外还可以用作含有利用埃德曼反应或者其类似反应进行氨基酸序列分析的装置中所用的分析对象保持体的蛋白质和肽的化学修饰用保持体。
进而，其结果是，本发明的保持体可以用作在该保持体上实施埃德曼反应等化学反应并将反应产物保持在该保持体上直接用于质谱分析的保持体，特别是在实施对样品板施加电压的方式的质谱分析工序的质谱分析方法中可以用作样品板或者其一部分。即，可以在实施分析对象的合成、提取、或者对分析对象进行修饰等的化学反应后，直接使用同一保持体进行质谱分析，而无需将分析对象转移至质谱分析用的样品板。因此，通过这样使用本发明的保持体，可以不必像以往那样在对质谱分析的分析对象进行了各种反应后将反应产物转移到金属制的样品板上，并且不必像以往那样将保持有反应产物的膜贴覆在金属制样品板上。
(分析对象)
作为保持在保持体上的分析对象，没有特别限制，可举出DNA或RNA、DNA/RNA嵌合体、DNA/RNA杂合体等形态的多核苷酸和寡聚核苷酸、肽、蛋白质、多糖类、糖蛋白质、脂质、PNA(肽核酸)等。为了进行分析，可以对这样的生物高分子实施化学修饰进行衍生物化。并且，作为分析对象，除这样的生物高分子外，还可举出天然或人工的有机化合物。这样的分析对象包含在细胞或菌体提取物、发酵产物、无细胞提取物、PCR产物、人工的合成产物、蛋白质的酶处理物等中。并且，由于本发明的保持体适用于质谱分析，因而本发明中的分析对象优选为可通过质谱分析特别是MALDI进行分析的化合物或适于通过质谱分析特别是MALDI进行分析的化合物。
(分析方法)
本发明的分析方法的特征在于，其使用保持有分析对象的保持体。即，该方法的特征在于，首先制作保持有分析对象的保持体，其后对该保持体实施各种分析方法，从而得到分析结果。以下，首先对保持有分析对象的保持体及其制作工序进行说明。
(保持有分析对象的保持体)
分析对象在保持体上的保持是指至少直至对保持体上的分析对象进行分析时为止都保持在一定位置上。因此，即使处于分析后的分析对象能够通过清洗等容易地从保持体上除去的程度的固定状态，也可以认为该分析对象保持于保持体上。分析对象的保持形态没有特别限定。例如，既可以是通过离子键、氢键、静电相互作用、疏水性相互作用、螯合等非共价键性的结合进行保持，也可以通过共价键进行保持。并且也可以是这些化学键合以外的保持形态，即使是分析对象仅存在于保持体表面上的凹部的情况下，只要是直到进行分析时为止分析对象都被保持在该凹部，就可以认为保持有该分析对象。对于固定形态，根据分析对象的种类和保持体的材料或表面修饰等可以有各种形态，但考虑到质谱分析中的电离，优选为非共价键性的结合。
分析对象可以直接保持于保持体的表面，也可以例如隔着直接保持于保持体表面上的间隔物间接地保持于保持体。例如，可以预先在保持体上保持有抗体或抗原，然后对该保持体供给抗原或抗体进行抗原抗体反应，由此以抗原-抗体配合物的形态在保持体上保持作为分析对象的抗体或抗原。并且，可以通过核苷酸链间的配对碱基间的氢键形成配合物(杂交)来保持作为分析对象的寡聚核苷酸或核酸等可杂交的化合物。此时，预先使保持体保持具有一定核苷酸序列的核酸等。利用这样的抗原-抗体间的特异的相互作用、受体-配体相互作用、杂交等的蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用和其他各种相互作用；预先保持在保持体上的间隔物与分析对象之间的氢键、亲水性相互作用、疏水性相互作用、静电相互作用、以及螯合作用等，将分析对象保持在保持体上。
此外，根据需要可以对分析对象进行化学修饰。化学修饰的种类没有特别限制。如后面详细叙述的那样，例如对于蛋白质，可以将基于埃德曼法的反应产物作为分析对象进行保持。
对于保持有具有某种一致的1种或2种以上的分析对象的保持体上的区域(位点(spot)等)来说，由于含有分析对象，因而可以直接构成用于分析的单元(cell)。即，在保持体上可以具有1个或2个以上保持有1种或2种以上的分析对象的分析用单元。此外，所谓单元是指保持有1种或2种以上的分析对象的区域，其是成为分析方法的测定对象的区域。
具有2种以上的分析用单元的情况下，优选对这些分析用单元进行配置，更优选与各自固有的位置信息具有关联。即，优选各分析用单元在保持体上的位置是特定的。由于分析用的单元与固有的位置信息具有关联且其位置是特定的，因而可以简化分析工序，同时可以简化分析工序后的解析，其结果，可以在保持体上保持有大量分析用单元时进行高速化分析。例如，利用MALDI分析时，依次对排列于保持体上的分析用单元照射激光，使单元中含有的分析对象解吸/电离，由此可以容易且迅速地对大量的分析用单元进行解析。
(保持有分析对象的保持体的制作)
将分析对象直接保持于保持体上时，首先将分析对象供给于保持体上。分析对象既可以在保持体上合成，也可以将预先制备的分析对象供给于保持体上。作为在保持体上直接合成分析对象的情况，可以举出利用无细胞蛋白质合成系合成蛋白质的情况、在保持体上合成寡聚核苷酸的情况。另外，将分析对象供给于保持体上时，可以使用例如喷墨法和别针法(pin method)等。
此外，可以利用电泳或层析法等分离方法将含有分析对象的混合物分离后再供于保持体。特别优选基于以电泳或层析法进行分离所得到的图样(pattern)将分离后的成分供给于保持体。这样，对于通过各种分离手段进行了分离的分析对象，可以对应其分离图样来分别进行解析。具体地说，可以利用印迹法直接将电泳图样转印在保持体上。此时优选保持体为透液性的。另外，可以通过将每恒定量的由液相色谱法得到的洗脱液以点状或气流状滴加在保持体上来将各种洗脱馏分对应于其分离图样进行保持。
此外，分析对象为肽或蛋白质等高分子化合物时，可考虑通过质谱分析能够进行分析的分子量或获得的信息内容，用各种分解酶适当地将分析对象低分子化后供给于保持体上。例如，可利用胰蛋白酶等蛋白酶等对蛋白质进行处理。除了可以对裂解图样(fragmentation pattern)进行解析外，还可以提高质谱分析的精度，简化蛋白质的鉴定或蛋白质的序列确定。并且，优选将这样片断化的蛋白质通过电泳或液相色谱法分离后供给于保持体。
此外，作为电泳，可举出琼脂糖凝胶电泳、改性琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳、SDS聚丙烯酰胺电泳、等电点电泳和二维电泳等。另外，作为液相色谱法，优选采用使用了微毛细管或者纳米毛细管的液相色谱法。
这样将分析对象供给于保持体上后，分析对象被保持于保持体。最简单的是可以通过使供给分析对象时所用的水等介质蒸发并干燥从而将分析对象保持在保持体上。并且，在通过保持体或者保持体表面的官能团与分析对象间的共价键进行保持时，可以通过与分析对象一起或者分别将必要的试剂供给于保持体上进行反应来将分析对象保持在保持体上。此外，可根据保持形态提供必要的条件。
将分析对象供给于保持体上之后或者保持在保持体上之后，在保持体上可以对分析对象实施化学修饰。实施化学修饰前的分析对象也称为分析对象的前体。修饰的种类和方法没有特别限定。例如，分析对象为蛋白质、肽等时，可举出与1-氟-2，4-二硝基苯(FNDB)或5-二甲氨基萘-1-磺酰氯(丹磺酰氯)的反应、利用埃德曼试剂(异硫氰酸苯酯)和酸酐进行的埃德曼法。
作为本发明中的分析对象，可举出埃德曼反应或者其类似反应的反应产物和反应中间体。例如，利用埃德曼法的衍变法，用所谓的阶梯序列法可以确定蛋白质等的N末端氨基酸序列。即，在异硫氰酸苯酯(PITC)中加入百分之几的异氰酸酯(ITC)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)和异硫氰酸甲酯(MITC)等任一物质，进行偶联，来改变针对N末端氨基酸残基的修饰基团，从而抑制其后利用氟乙酸等进行的N末端氨基残基的切断反应，或者通过调整切断反应时间来抑制N末端氨基酸残基的切断反应，从而在保持体的分析区域上主要残存有(1)作为这样的分解反应产物的一方的经切下的N末端氨基酸残基的衍生物、(2)作为这样的分解反应产物的另一方的N末端氨基酸残基被切去了的片断(埃德曼反应生成物)、和(3)虽然发生偶联但未被切断的未切断蛋白质或肽的修饰体(偶联体)。
在此，上述(2)为埃德曼反应或其类似反应的反应生成物(by-product)，上述(3)为埃德曼反应或其类似反应的反应中间体。
这些之中，(2)和(3)仅N末端氨基酸残基部分不同，所以可以通过在质谱分析工序中对这些片断的质量的差进行测量、比较来确定N末端氨基酸残基。进而，可通过反复进行必要次数的这样的反应工序和质谱分析工序来确定N末端氨基酸序列。
基于以上内容，作为将肽或蛋白质保持于保持体上的操作和这样的保持体的典型例，可举出以下例子。即，用胰蛋白酶等蛋白酶将蛋白质分解后，采用微毛细管或纳米毛细管液相色谱法进行分离，将洗脱液以多个位点(spot)的方式排列在保持体上并进行滴加、干燥，利用上述那样的埃德曼法的衍变法对各位点进行反应，其后进行清洗、干燥。由此得到保持体，该保持体以按照对应于经液相色谱法得到的分离图样进行分配的1个或2个以上的洗脱液位点(分析用的单元)的方式具有利用胰蛋白酶对蛋白质进行分解而得到的1种或2种以上的片断。另外，同时通过应用埃德曼法的衍变法，可以得到在各洗脱液位点保持有片断和未切断偶联体的保持体，所述片断为位点中含有的肽或蛋白质的N末端氨基酸残基被切去了的埃德曼反应生成物，对于所述未切断偶联体来说，其虽然发生偶联但N末端未被切断。
此外，将分析对象间接保持于保持体上时，首先，准备保持有用于间接保持分析对象的间隔物的保持体。如上所述，间隔物例如为蛋白质或核酸等。将这样的间隔物供给于保持体上进行保持时，可以适当使用上述那样的方法。另外，在对分析对象进行保持时，向保持有这样的间隔物的保持体供给含有分析对象的试样，产生希望的相互作用，通过间隔物将分析对象保持在保持体上。
(分析工序)
对保持有分析对象的保持体实施分析工序。本分析工序中优选采用质谱分析法。质谱分析工序中的电离方法没有特别的限制，但从将保持体直接用于电离的方面考虑，优选采用不使用基质的激光解吸电离(LDI)、使用基质的基质辅助激光解吸电离(MALDI)。其中，对于肽或蛋白质等优选采用MALDI。
作为用于MALDI的激光，可以使用N2、Nd-YAG、CWCO、TEA-CO2、氩等。另外，作为用于MALDI的基质，没有特别限定，可以使用烟酸、2-吡嗪羧酸、芥子酸、2，5-二羟基苯甲酸、5-甲氧基水杨酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、3-羟基甲基吡啶甲酸、二氨基萘、2-(4-羟基苯偶氮基)苯甲酸、1，8，9-蒽三酚、琥珀酸、5-(三氟甲基)尿嘧啶、甘油等。相对于分析对象，基质的添加量等没有特别限定，可以以现有公知的范围适当设定。
此外，本质谱分析方法中的质谱分析工序可以是利用磁场偏光型、四极型、离子阱型、飞行时间型、傅利叶变换离子回旋型、串联型等各种质谱仪进行的分析。其中，在采用LDI和MALDI进行分析时，优选使用飞行时间型分析器的质谱分析工序。
质谱分析工序中，可以对存在于保持体上的分析用单元中的1种或2种以上的分析对象的质量进行分析。例如，在分析用单元中存在埃德曼法的产物时，也即存在作为埃德曼反应产物的末端氨基酸残基的衍生物(ATZ衍生物或PTH衍生物)、作为埃德曼反应生成物的残余片断、以及异氰酸酯系偶联剂偶联在N末端但并未被切断的未切断的蛋白质或肽的修饰体时，利用LDI法或MALDI法可以容易地测定作为埃德曼反应生成物的残余片断和未切断物的分子量，由此可以鉴定整体的分子量以及N末端氨基酸。
此外，对于在分析工序中实施的分析方法，除质谱分析外，还可以使用各种分析方法。并且，在利用荧光试剂或显色试剂等对分析对象进行了标记的情况下，可以采用对保持体上的这样的荧光或显色等进行检测的方法。
实施例
以下举出实施例具体说明本发明，但这些实施例并不对本发明构成限定。
(实施例1)
作为保持体，准备耐蚀性导电性塑料膜和导电性硅酮橡胶(均为三菱树脂株式会社制造)这2种膜(厚度分别为80μm和150μm)。此外，这些膜的物性示于下表。
[表1]
厚度方向电阻：负荷1.89MPa；体积电阻：电阻值×测定电极面积/片材厚度
准备与MALDI-TOF质谱分析装置(ABI Voyager DE Pro MALDI TOF型质谱仪)的金属制样品板相同大小的导电性塑料膜，在该导电性塑料膜上涂布0.5pmol的血管紧张素(angiotensin，MW1293)，然后不使用粘结剂将其贴覆在上述金属制样品板上，设定激光强度为1100、1000、700和600进行质谱分析。此外，基质使用芥子酸。在所设定的任一激光强度下都能检测到分子量为1294的离子。其中，在激光强度为1000时检测出最稳定的离子。
另一方面，同样制备与金属制样品板相同大小的导电性硅酮制膜，在该膜上分别涂布0.5pmol、0.25pmol、50fmol、10fmol、1fmol、0.5fmol的血管紧张素，不使用粘结剂将该膜贴覆在金属制样品板上，设定激光强度为1000，使用芥子酸作为基质，用MALDI-TOF质谱分析装置同样地进行质谱分析。结果以任一样品涂布量都能检测出分子量为1294的离子，但在50fmol以上的浓度可以检测出稳定的离子。
(实施例2)
本实施例中，制备与MALDI-TOF质谱装置(ABI Voyager DE ProMALDI TOF型质谱仪)的金属制样品板相同大小的导电性聚氯乙烯板(含有导电性碳)(TAKIRON制，TND CV930)(厚度：1.5mm；厚度方向体积电阻率(Ω·m)(JIS K7194)：104；洛氏硬度(JIS K7112)：88；比重(JISK7202)：1.35)，在其上涂布1pmol、100fmol和10fmol的血管紧张素(angiotensin，MW1293)以及1pmol、100fmol和10fmol的强啡肽(Dynorphin)，然后将其分别用作样品板，设定激光强度为1000进行质谱分析。此外，基质使用芥子酸。除血管紧张素为10fmol的情况外，对于任一蛋白质以任一用量都能检测出具有各自分子量的离子，其中各蛋白质为1pmol时检测出最稳定的离子。
(实施例3)
本实施例中使用碳化硅(SiC)板作为样品板。即，将该陶瓷板制成与MALDI-TOF质谱分析装置(ABI Voyager DE-STR MALDI TOF型质谱仪)的金属制样品板相同的大小，涂布1pmol的血管紧张素(angiotensin，MW1293)，然后将其分别用作样品板并设定激光强度为2142来进行质谱分析。此外，基质使用α-氰基-4-羟基肉桂酸。利用SiC板，背景噪音也可以良好地降低，并可以检测出分子量离子。
(实施例4)
本实施例中，使用VGI石墨和Pyrocarb(均为揖斐电株式会社制造)的板作为样品板。即，将这些石墨板分别制成与MALDI-TOF质谱分析装置(ABI Voyager DE-STR MALDI TOF型质谱仪)的金属制样品板相同的大小，涂布0.5pmol/μL的血管紧张素(angiotensin，MW1293)，涂布量为1μL，然后将其分别用作样品板，针对VGI设定激光强度为2044、针对Pyrocarb设定激光强度为2010，进行质谱分析。此外，基质使用α-氰基-4-羟基肉桂酸。任一板都可检出分子量离子，背景噪音也良好。
(实施例5)
本实施例中，在实施例1中使用的导电性塑料膜上进行埃德曼反应，进行氨基酸序列分析。将200pmol的溶菌酶点样于导电性塑料膜上，用作肽测序仪(ABI 491 CLC肽测序仪)的样品保持膜。分析4残基时可以充分进行分析。由上可知，实施例1中使用的导电性塑料膜对于埃德曼法中所用的埃德曼试剂和三氟乙酸酐等酸酐等具有充分的耐蚀性，同时具有能够对抗清洗等的程度的保持蛋白质的能力。
此外，将10pmol血管紧张素在相同的导电性塑料膜上进行点样，与上述同样地对5残基进行分析，可以充分进行分析。由此可知，实施例1中使用的导电性塑料膜即使对于较低分子量的肽也具有充分的保持能力。
本申请以2005年10月13日提出的日本专利申请第2005-299195号为优先权基础，将其全部内容以引用的方式包含在本说明书中。
工业实用性
本发明可在分析化学领域例如蛋白质测序仪和质谱或荧光分析等中应用。

Claims (31)

1.一种分析用保持体，其用于保持分析对象，该保持体为具有非金属性基质的导电性材料。
2.如权利要求1所述的保持体，其中，所述导电性材料为导电性高分子材料。
3.如权利要求2所述的保持体，其中，所述导电性高分子材料为导电性材料分散保持在有机高分子基质中而成的复合导电性高分子材料。
4.如权利要求1所述的保持体，其中，所述导电性材料为导电性陶瓷材料。
5.如权利要求4所述的保持体，其中，所述导电性陶瓷材料为具有表面处理层的石墨材料，所述表面处理层是利用玻璃态碳或热分解碳形成的。
6.如权利要求1～5任一项所述的保持体，其中，所述保持体对选自由乙酸、三氟乙酸和乙酸酐组成的组中的酸具有耐蚀性。
7.如权利要求1～6任一项所述的保持体，其中，所述保持体是透液性的或非透液性的。
8.如权利要求1～7任一项所述的保持体，其中，所述保持体为膜状、板状和微量滴定板状中的任一形状。
9.如权利要求1～8任一项所述的保持体，其中，所述保持体以选自多核苷酸、寡聚核苷酸、蛋白质、肽、糖蛋白质和多糖类中的1种或2种以上的分子或这些物质的衍生物为分析对象。
10.如权利要求1～9任一项所述的保持体，其中，该保持体为质谱分析用的样品板或其一部分。
11.如权利要求10所述的保持体，其中，该保持体用于基质辅助激光解吸电离质谱分析。
12.如权利要求11所述的保持体，其中，该保持体用于飞行时间质谱分析。
13.如权利要求1～12任一项所述的保持体，其中，该保持体对埃德曼反应具有耐蚀性。
14.如权利要求13所述的保持体，其中，该保持体用于保持在保持体上进行的埃德曼反应或者其类似反应的反应产物和反应中间体。
15.如权利要求1～14任一项所述的保持体，其中，该保持体用于氨基酸序列分析。
16.一种保持体，其为用于保持分析对象的分析用保持体，该保持体为具有非金属性基质的导电性材料，并对埃德曼反应具有耐蚀性，同时能够保持埃德曼反应产生的埃德曼反应生成物。
17.一种保持体，其保持有1种或2种以上的分析对象，所述保持体含有分散保持在非金属制基质中的导电性高分子材料。
18.如权利要求17所述的保持体，其中，该保持体中排列有2个以上的分析用区域，该分析用区域保持所述1种或2种以上的分析对象。
19.如权利要求18所述的保持体，其中，所述分析用区域各自具有固有的位置信息。
20.如权利要求17～19任一项所述的保持体，其中，所述分析对象选自氨基酸、肽和蛋白质。
21.如权利要求17～20任一项所述的保持体，其中，在所述分析用区域保持有N末端氨基酸残基不同的蛋白质或肽。
22.如权利要求17～21任一项所述的保持体，其中，在所述分析用区域保持有埃德曼反应或者其类似反应的反应产物和反应中间体。
23.如权利要求17～22任一项所述的保持体，其中，通过电泳或液相色谱法将所述分析对象供给至所述保持体进行保持。
24.一种质谱分析方法，其具有使用分析对象的保持体的激光解吸电离工序，所述分析对象的保持体为具有非金属制基质的导电性材料。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述激光解吸电离工序为基质辅助激光电离工序。
26.如权利要求24或25所述的方法，该方法具有飞行时间质谱分析工序。
27.如权利要求24～26任一项所述的方法，其中，所述电离工序为使用权利要求17～23任一项所述的分析对象的保持体的工序。
28.一种方法，其为蛋白质或肽的分析方法，该方法具有如下工序：
(a)将蛋白质或肽供给至保持体进行保持的工序，该保持体为具有非金属制基质的导电性材料；
(b)对上述保持体上的蛋白质或肽的部分末端氨基酸残基进行化学修饰，同时进行切断的工序；和
(c)对上述保持体上的由上述(b)工序得到的末端氨基酸残基发生欠缺的片断和在上述(b)工序中进行了修饰但并未切断的上述蛋白质或肽进行质谱分析的工序。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述(b)工序为利用埃德曼反应或其类似反应来进行的工序。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中，对所述蛋白质或肽的N末端氨基酸残基依次反复实施适当次数的所述(b)工序和所述(c)工序。
31.如权利要求28～30任一项所述的方法，其中，所述保持工序是将通过电泳分离的或通过液相色谱法洗脱的蛋白质或肽供给至所述保持体进行保持的工序。
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