CN101255103B

CN101255103B - 海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101255103B
Application number: CN2008100706762A
Authority: CN
Inventors: 张连茹; 阎雪芬; 鲁春华; 郑忠辉; 宋思扬; 黄耀坚; 沈月毛
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: CN101255103A

Abstract

海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用，涉及一种化合物。提供一种分离自海洋的海洋青霉菌代谢产生的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物及其制备方法和用于制备抗肿瘤药物，作为抗氧化等生物活性的先导化合物。海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的分子式为C₁₄H₁₆O₃。取斜面菌种接种到培养基中培养，固体发酵产物浸提，过滤，减压浓缩至干得褐色浸膏；褐色浸膏以水溶解，浸提，反相硅胶柱分离，洗脱，收集70％甲醇洗脱的组分，浓缩后分离，洗脱，将收集的组分浓缩后以反相硅胶柱分离，收集50％丙酮+50％水的洗脱组分，浓缩后分离，梯度洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1时，即得。

Description

海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种化合物，尤其是涉及一种源于帚状海洋青霉菌(Penicillium sp.)产生的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用。

海洋青霉菌(Penicillium sp.)分离于西太平洋近赤道区深海沉积物中，当采用马铃薯(PDA)培养基发酵时，其菌株生长良好，菌丝较长，呈深绿色，培养基内可见黑色素，产绿色孢子。在40倍荧光显微镜可见菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如青霉的帚状体。采用rDNA基因间隔区(ITS regions)的测定方法，利用通用引物ITS4和ITS5对菌株ZhengRr-1的总DNA进行PCR扩增，测序，得到553bp的DNA片段，测序结果与genebank中登记的基因序列进行比较，找到与之具有最高相似度的是Penicillium sp.两者的基因序列有13个碱基的差别，相似度为97％，因此菌株ZhengRr-1鉴定为Penicillium sp。

本发明的目的在于提供一种结构新颖，尚未见报道的分离自海洋的青霉114 ZhengRr-1(Penicillium sp.114 ZhengRr-1)代谢产生的化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮(简称为海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物)及其制备方法。

本发明的另一目的在于将化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮用于制备抗肿瘤药物，作为抗氧化等生物活性的先导化合物。

本发明所述的青霉114 ZhengRr-1(Penicillium sp.114 ZhengRr-1)已于2007年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学内)，保藏号为CCTCC NO：M 207142。

本发明所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物为(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮，其分子式为C₁₄H₁₆O₃，结构式为：

其中，1～12，3a，5a为碳原子的编号，海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物为白色粉末状固体，易溶于甲醇、丙酮等有机溶剂中。

本发明所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法包括以下步骤：

1)固体培养及发酵产物的处理：取斜面菌种，接种到装有PDA培养基中进行固体培养，发酵结束后的固体发酵产物用浸提液乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5等体积浸提至少1次，将浸提液过滤，减压浓缩至干，得到褐色浸膏；

2)化合物分离：将上述褐色浸膏以水溶解，等体积乙酸乙酯浸提，反相硅胶柱分离，以甲醇和水洗脱，收集70％甲醇洗脱的组分，浓缩后用SephadexLH-20柱分离，甲醇洗脱，将收集的组分浓缩后以反相硅胶柱分离，收集50％丙酮+50％水的洗脱组分，浓缩后用硅胶分离，用石油醚∶乙酸乙酯进行梯度洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1时，得到海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物，即化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮。

检测时，荧光显暗红色，碘显色，硫酸显黄色，碘化铋钾显墨绿色，用石油醚∶乙酸乙酯溶剂系统2∶1展开时Rf值为0.58。

在步骤1)中，取斜面菌种，接种到装有PDA的培养基中进行固体培养，固体培养的温度最好为25～28℃，培养时间最好为10～14d。所述的浸提液可为乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，每次浸提的时间可为12～24h，合并浸提液，减压浓缩可采用真空浓缩，真空浓缩的温度最好为40～45℃。

在步骤2)中，等体积乙酸乙酯浸提，反相硅胶柱分离可采用RP-18反相硅胶柱分离，以甲醇与水洗脱，按体积百分比，甲醇占甲醇与水总体积的30％～100％，洗脱的每个梯度为2000mL。将收集的组分浓缩后以RP-18反相硅胶柱分离，以50％丙酮+50％水和70％丙酮+30％水，各400ml洗脱。

本发明所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物是一种新颖的化合物，可在制备抗肿瘤药物，抗氧化或其它生物活性的先导化合物中应用。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1

A.培养基配方：斜面培养基配方：每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取200g放入1L 50％海水中，煮30min，过滤，滤液用100％海水中添加葡萄糖20g，琼脂2.0g。种子培养基配方：每升马铃薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。发酵培养基配方：同种子培养基。

B.发酵工艺：斜面培养：按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min 后制斜面。将保存的青霉114 ZhengRr-1(Penicillium sp.ZhengRr-1)菌种转接至斜面培养基上，28℃下培养4d。待菌体长出后，再挑取菌丝块接种于全海水PDA培养基斜面，28℃下培养4d。

将约0.2cm³活化的真菌琼脂块接种到装有20ml固体培养基的平板上，在28℃培养箱内恒温培养14d。

C.(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮的提取：发酵结束后，将琼脂块切成0.1cm³的小块，用乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5的溶液体系浸提三次，每次24h，将浸提液用棉花过滤，真空浓缩得到浸膏。

D.(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮的精制：上述褐色浸膏以水溶解，等体积乙酸乙酯浸提，RP-18反相硅胶柱分离，以甲醇和水洗脱，收集70％甲醇洗脱的组分，浓缩后用SephadexLH-20柱分离，甲醇洗脱，收集的组分，浓缩后以RP-18反相柱分离，收集50％丙酮+50％水的洗脱组分，浓缩后用硅胶柱分离，石油醚∶乙酸乙酯进行梯度洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1时，得到化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二苯甲基)-己-2，4-二烯-1-酮。

实施例2

采用化学发光法测定(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二苯甲基)-己-2，4-二烯-1-酮对过氧化氢的抑制活性：在96孔发光板中依次加入pH7.4的PBS缓冲液90uL，浓度为0.025、0.25和2.5ug/ml的(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二苯甲基)-己-2，4-二烯-1-酮样品各50μL(阳性对照用相应浓度的Vc，阴性对照用相应稀释度的甲醇)，30mmol/L的H₂O₂20μl，混匀，25℃放置5min，冰浴3min，加入25μmol/L Luminol 40μL，启动化学发光反应，记录30min内发光强度的值(CL)，每个样品三个平行。发光抑制率按下式计算，并通过IC₅₀计算软件，得出抑制率达到50％时对应的(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二苯甲基)-己-2，4-二烯-1-酮的浓度即IC₅₀为3.4ug/ml，相同条件下Vc的IC₅₀为0.6ug/ml。

海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物进行NMR(核磁)、MS(质谱)及生物活性等测试。

根据NMR数据(见表1)和ESI-MS数据进行化合物结构鉴定，确定化合物的结构为(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮。

表1

ESI-MS显示分子离子峰在231.4[M-H⁺]^-由此可以推断化合物的分子量为232，与NMR解析的结果一致。

抗肿瘤活性检测实验

(1)肿瘤细胞株：

人肠癌细胞、人成骨肉瘤MG-63细胞、人肺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞。

(2)材料

a MTT(噻唑蓝)：

用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到终浓度5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光保存。

b SDS裂解液：

100g十二烷基磺酸钠(SDS)，1N HCl10ml，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml。

c细胞培养基(全培)：

一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)细胞培养基溶于1L双蒸水中；加入2gNaHCO₃搅匀溶解后封口，置于4℃过夜，以自然沉淀除去杂质；次日加入10-15％已灭活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。

(3)上述化合物的配置

取一定量的上述化合物，用甲醇溶解并调整浓度为5mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(4)肿瘤细胞的培养

a细胞活化：

取一干净烧杯，装入干净温水，水温调至37～40℃；将冻存管从液氮中取出迅速投入温水解冻，并将冻存细胞接入预装有细胞培养基的培养瓶内，在37℃、5％ CO₂、100％湿度的条件下培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液、分瓶。

b细胞计数：

选对数生成期细胞，胰酶消化，移入离心管中，加全培至10ml，取一滴滴入计数板一侧凹槽中，倒置显微镜下计数。调整细胞数至1×10⁵/ml。

c活性检测：

①96孔板在超净工作台内紫外光下照射1h；

②在各孔中加入细胞悬液80μl，37℃、5％ CO₂、100％湿度的条件下培养24h；

③加入20μl用全培梯度稀释成一系列浓度的A、B、C和D溶液，继续培养48h；

④每孔加入MTT溶液10μl，轻轻震摇使颗粒溶解，37℃放置3h；

⑤取出培养板，每孔加入10％SDS溶液100L，37℃溶解过夜；

⑥用酶标仪测定570nm处各孔吸光值(参比波长为655nm)，按下列公式计算抑制率：

抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％

⑦以抑制率为纵坐标，受试样品浓度的对数为横坐标作图，求出抑制率为50％时的浓度即为IC₅₀。

d试验结果：

化合物对人宫颈癌Hela细胞的IC₅₀分别是2.64μg/ml。浓度为10ug/ml时对人肠癌细胞的抑制率接近90％.

化合物清除过氧化氢的IC₅₀是3.4μg/ml。

Claims

1.海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于所述的海洋青霉菌为青霉114ZhengRr-1(Penicillium sp.114 ZhengRr-1)，已于2007年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 207142；所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物为(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮，其分子式为C₁₄H₁₆O₃，其结构式为：

其中，1～12，3a，5a为碳原子的编号，海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物为白色粉末状固体，易溶于甲醇、丙酮有机溶剂中；

所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法包括以下步骤：

1)固体培养及发酵产物的处理：取斜面菌种，接种到装有PDA培养基中进行固体培养，发酵结束后的固体发酵产物用浸提液乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5等体积浸提至少1次，将浸提液过滤，减压浓缩至干，得到褐色浸膏，每次浸提的时间为12～24h；减压浓缩采用真空浓缩，真空浓缩的温度为40～45℃；

2)化合物分离：将步骤1)所得褐色浸膏以水溶解，等体积乙酸乙酯浸提，反相硅胶柱分离，以甲醇和水洗脱，按体积百分比，甲醇占甲醇与水总体积的30％～100％，洗脱的每个梯度为2000mL，收集70％甲醇洗脱的组分，浓缩后用SephadexLH-20柱分离，甲醇洗脱，将收集的组分浓缩后以反相硅胶柱分离，收集50％丙酮+50％水的洗脱组分，浓缩后用硅胶分离，用石油醚∶乙酸乙酯进行梯度洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1时，得到海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物，即化合物(2E，4E)-1-(2，6-二羟基-3，5-二甲基苯)-己-2，4-二烯-1-酮。

2.如权利要求1所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，固体培养的温度为25～28℃，培养时间为10～14d。

3.如权利要求1所述的海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述收集的组分浓缩后以反相硅胶柱分离，是将收集的组分浓缩后以RP-18反相硅胶柱分离，以50％丙酮+50％水和70％丙酮+30％水，各400ml洗脱。