CN102268395B - 一种海洋青霉菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋青霉菌菌株及其应用，该菌株命名为灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)zju87，分离自浙江东海海泥，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2011年5月19日，保藏号为CGMCC No.4888。本发明的海洋青霉菌菌株具有很好的抑制真菌的作用，尤其对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，对黑曲霉，白色假丝酵母，大肠杆菌等也具有很好的抑制效果，对于真菌病的治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种海洋青霉菌菌株及其应用。
背景技术
海洋青霉是一类广泛存在于海洋的好氧性真菌，长期以来青霉一直用作柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸、抗生素的工业生产菌。海洋微生物所处的特殊环境，使其很大程度上演变成新的种群或具有新的特殊生理功能的亚种，形成了陆生微生物所不具有的特性。微生物是开发研制抗生素及其他生理活性物质的重要资源。近几年来，深部真菌病发生率有明显的上升趋势。
随着从海洋真菌发现新化合物速率不断增加，人们希望通过对海洋真菌的研究开发，获得更多的新型生物活性物质。在对海洋真菌的分离鉴定中目前沿用了传统的分离鉴定方法，即通过表型特征和细胞形态学的观察，对真菌生理生化反应和细胞组成成分结构进行比较分析来实现分类鉴定。随着生物化学、遗传学以及分子生物学、生物信息学等相关学科的发展，同时，也是海洋真菌分类学自身发展的客观要求，分子生物学鉴定方法被引入海洋真菌的菌种鉴定中，使菌种的鉴定在以形态特征和生理生化特征为基础的鉴定上更加准确、可靠。
真菌的核糖体DNA内转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）位于18S和5.8S rDNA（ITS1）以及5.8S和28S rDNA（ITS2）之间，是中度保守区域，长度大约在550~750bp。由于ITS区不加入成熟核糖体，因此在进化过程中承受的自然选择压力非常小，能容忍更多的变异，表现为种内菌株间相对保守，但在种间的差异非常明显，这种特点使其非常适用于对真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，即使是亲缘关系非常接近的两个种都能在ITS序列上表现出差异，显示其最近的进化特征。研究表明，ITS片段的进化速率是18s rDNA的10倍，这就是ITS序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础。
发明内容
本发明提供了一种海洋青霉菌菌株，具有很好的抑制真菌的作用，尤其对金黄色葡萄球菌具有强烈的抑菌作用，对黑曲霉，白色假丝酵母，大肠杆菌等也具有很好的抑制效果，对于真菌病的治疗具有重要意义。
一种海洋青霉菌菌株，命名为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）zju87，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2011年5月19日，保藏号为CGMCC No.4888。
所述的灰黄青霉zju87的ITS的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的灰黄青霉zju87分离自浙江东海海泥，在常温和筛选培养基上生长良好，菌落表面呈灰绿色，反面呈浅黄色，菌落在培养第二天开始产孢子，并在第三天完全成熟。
本发明还提供了上述灰黄青霉zju87在抑制金黄色葡萄球菌生长中的应用。
通过对灰黄青霉zju87进行抑菌试验，发现该菌株对金黄色葡萄球菌(Staphylcococcus aureus)具有强烈的抑菌作用，同时还对黑曲霉(Aspergillusniger)，白色假丝酵母（Candida albicans），大肠杆菌(Escherichia coli)等也具有很好的抑制效果；通过对灰黄青霉zju87的形态观察、培养特征及ITS序列分析，灰黄青霉zju87具备典型的青霉属形态特征，ITS碱基序列与灰黄青霉(Penicillium griseofulvum strain 091402)的同源性为99%。
附图说明
图1是本发明海洋青霉菌菌株的形态学结构特征图；
图2是本发明海洋青霉菌菌株的ITS序列PCR产物的电泳检测图。
(其中M:DL3000 Marker;1:海洋青霉菌菌株的ITS序列)
具体实施方式
筛选/种子培养基(g/L)：葡萄糖10、可溶性淀粉10、蛋白胨2、酵母膏1、FeSO4 0.01、海水/蒸馏水(3/2)、pH7.2~7.5；
发酵培养基（g/L）：可溶性淀粉20、黄豆饼粉2、酵母膏1、K2HPO41、FeSO4 0.01、MgSO4 0.5、海水/蒸馏水(3/2)、pH7.2~7.5；
金黄色葡萄球菌培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏3、琼脂粉20、NaCl 5、pH 7.4；
LB培养基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 5、调pH7.4~7.6。
供试菌株：
金黄色葡萄球菌(Staphylcococcus aureus)ATCC29213；黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC20611；大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC8739；白色假丝酵母（Candida albicans）ATCC10231，上述菌株均为试验菌株，无特异性要求。
实施例1菌株分离纯化
海泥样品在浙江东海划定的区域内进行五点交叉采样，每点采取海泥样10g，放入锥形瓶内，混匀后取海泥样品10g，加到一个装有90mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床上振荡30min，使海泥样中的菌体充分分散于水中，即为10-1菌液。接种环火焰灭菌冷却后蘸取一环稀释度为10-1菌液，在筛选培养基平板上作四区划线接种，28℃培养48h，然后挑取单菌落划线，进一步纯化。
将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用打孔器取出，移入无培养基平皿，28℃培养4d后移入涂布金黄色葡萄球菌的平板，琼脂块中心间隔距离为4cm，培养过夜，根据抑制圈大小选择单菌落进行复筛。
取初筛得到50株菌株，接入到种子培养基中，250mL锥形瓶中装25mL培养基，初始pH 7.2~7.5，28℃下200r/min培养24h。再将种子液以8%(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，250mL三角瓶中装40mL培养基，28℃、pH 7.2~7.5下200r/min培养4d，比较50株菌种发酵液抑制金黄色葡萄球菌的程度，最终获得1株最高效抑制金黄色葡萄球菌的菌株，编号为zju87。斜面保藏（筛选培养基）菌株于4℃冰箱中，长期保藏采用甘油管保藏法于-20℃冻存。
实施例2菌种鉴定
(1)形态观察
在常温和筛选培养基上生长良好，菌落表面呈绿色，反面呈浅黄色，菌落形态较圆整。在培养第二天开始产孢子，并在第三天完全成熟。在平板上培养三天后，挑取单菌落，在光学显微镜下观察，结果如图1所示，根据形态观察和光学显微镜下孢子及菌丝体的观察，可初步鉴定为青霉菌。
(2)ITS序列分析
取1环经活化的海洋霉菌zju87菌种，接入到锥形瓶中，250mL锥形瓶中装100mL筛选培养基，初始pH值7.2~7.5，28℃下200r/min培养3d后，用纱布过滤，60℃烘干后用液氮进行破壁，置于-20℃冰箱中。利用下述改良CTAB法进行菌种基因组DNA提取,在-20℃下保存。
改良CTAB法：
（a）取1.5mL EP管，挑取覆盖管底1mm破壁后的菌体，加入545μL TE缓冲液（10mmol/L Tris.HCl，pH 8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0），加入20μL溶菌酶（20mg/mL），用枪头反复吹打使之重悬，然后加入30μL 10%SDS和6μL 10mg/mL的蛋白酶K，37℃温浴3h；
（b）加5μL 10mg/mL RNase A，37℃温浴1h；
（c）加100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加80μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温浴10min；
（d）加入与上述总体积等体积的氯仿/异戊醇（v/v 24:1），混匀后16000×g，离心5min，重复三次后转移上清液。
（e）加入与上清液等体积的酚：氯仿：异戊醇（v/v/v 25:24:1）混合溶液，混匀后，16000×g离心10min，转移上清液。
（f）加入上一步上清液0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合到DNA沉淀，16000×g离心10min，弃上清。
（g）向沉淀中加70%乙醇进行清洗，6000×g离心10min，弃上清，待乙醇挥发干净后，加入50μL双蒸水进行溶解。在-20℃下保存。
根据真菌ITS序列设计下列引物，并由上海生工生物工程公司合成：
上游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
下游引物：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
利用上述引物对该菌株的ITS序列进行PCR扩增，PCR体系为：
PCR扩增反应体系20μL
PCR反应条件为：PCR循环条件：95℃预变性5min，循环参数95℃变性1min，52℃复性45s，72℃延伸1.5min，重复28个循环后，72℃再延伸10min，最后4℃保温。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物进行纯化。
扩增产物经凝胶电泳回收，并将回收产物连接到pMD19-T载体上，连接体系（10μL）为：
Buffer 5.0μL
载体pMD19-T 1.0μL
PCR产物 4.0μL
连接体系于16℃反应30min，在4℃下连接过夜。
将连接产物10μL加入到大肠杆菌感受态细胞中进行转化，加LB培养基1mL于37℃水平摇床中，180rpm摇动45min。取100μL菌液，涂布在含Amp的LB平板上，37℃培养16h，即可长出白色菌落。挑取阳性克隆子，在含Amp的LB平板上进行划线转接，37℃培养16h。取少量待测菌进行菌落PCR。
菌落PCR体系20μL：
用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；选用条带清晰的菌适量在加Amp的LB培养基中培养过夜；取2mL在LB培养基中培养过夜的阳性克隆子菌液，12000×g，离心1min，弃上清，利用试剂盒进行质粒DNA提取，并进行质粒PCR。
质粒PCR体系20μL：
质粒PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，处于500~700bp之间的条带为目的条带，说明ITS片段成功连接到pMD19-T载体上，经转化的大肠杆菌质粒中有待测菌种的ITS片段，可用于测序。
将质粒中的ITS片段进行测序，获得了该菌株ITS片段一级结构的555bp特征序列(SEQ ID NO.1)。通过在Genebank数据库中进行相似性搜索（blast），搜索结果发现其与灰黄青霉（Penicillium griseofulvum strain091402）的同源性为99%（灰黄青霉的Genebank的登记号为lcl|11669）。
根据上述特征命名该菌株为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）zju87，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号3号院中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号为CGMCCNo.4888，保藏时间2011年5月19日。
实施例3抑菌活性的测定
采用管碟法测试灰黄青霉zju87对上述供试菌株的抑菌活性，并设置霉菌素阳性对照和生理盐水空白对照。
取1环经活化的上述菌种，接入到种子瓶中，250mL锥形瓶中装25mL种子培养基，初始pH值7.2~7.5，28℃下200r/min培养24h，制得种子液；将种子液接种到发酵培养基中，于pH值7.2~7.5，28℃下200r/min下培养4d，于5000rpm下离心15min，留上清液，以管碟法测定发酵液有无抑菌作用。
以金黄色葡萄球菌为指示菌，管碟法测量摇瓶发酵液的抑菌圈大小。具体方法如下：取在上述金黄色葡萄球菌培养基上28℃恒温培养3d的金黄色葡萄球菌，溶于30mL无菌生理盐水制成菌悬液，取2mL菌悬液与50℃的金黄色培养基混合均匀后吸取20mL至直径9cm的培养皿中，冷却后放置牛津杯于金黄色培养基表面，取150μL发酵上清液加入牛津杯中，37℃培养24h，发现具有非常强烈的抑菌效果，抑菌圈达到22.5mm。经同样试验发现，该海洋青霉同样对黑曲霉，白色假丝酵母，大肠杆菌等也具有很好的抑制效果。
Claims (1)
1.一种海洋青霉菌菌株，其特征在于：命名为灰黄青霉（Penicilliumgriseofulvum）zju87，保藏号为CGMCC No.4888。
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