CN108531403A - 一种内生真菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株内生真菌Penicillium sp.EF10及其在抑菌方面的用途，属于微生物及微生物药物领域。一株内生真菌EF10，经形态学特征观察及其rDNA ITS序列分析鉴定为青霉菌Penicilliumsp.，微生物保藏编号为：CGMCC No.14995，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年12月07日。本发明所述内生真菌菌株EF10具有显著的抑制多重耐药菌的活性。体外实验表明，该菌株的代谢产物提取物对多株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及携带Bla _NDM‑1 基因的肺炎克雷伯菌均具有显著的抑制活性。

Description

一种内生真菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及一株内生真菌及其在抑菌方面的用途，属于微生物及微生物药物领域。

背景技术

细菌耐药性问题在世界范围内日趋严重，尤其是高度多重耐药性肠球菌Enterococcus faecium、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia、鲍曼氏不动杆菌Acinetobacter baumannii、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和肠杆菌属Enterobacter的一些病原菌。国外学者根据这些病原菌拉丁名的首字母缩写将其归为“ESKAPE”病原菌（英文单词“ESCAPE”有“逃生”之意，而“ESKAPE”在发音上与其相同，意在强调这些病原菌能够有效地“逃离”现有抗生素药物的作用）。近年来，“ESKAPE”病原菌的流行性持续上升，其耐药性也越来越严重。

携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌是“ESKAPE”病原菌中的重要成员。Bla _NDM-1 基因编码的NDM-1酶是一种新型金属β-内酰胺酶，该酶能够水解除氨曲南外所有的β-内酰胺类抗生素。Bla _NDM-1 基因绝大多数由细菌质粒携带，而这些质粒又常常连锁携带其它耐药基因，如耐受大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等抗生素的基因，因而使其携带菌表现出泛耐药性，可导致被感染患者面临无药可用的危险境地。特别值得注意的是，该类质粒可在异种细菌间进行传递，从而使其快速传播和蔓延，目前已在全球流行和局部地区爆发。研究资料显示，肺炎克雷伯菌是Bla _NDM-1 基因最主要的携带菌之一，美国疾病预防与控制中心已将其列为“紧迫的威胁”（耐药性威胁中的最高等级）。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant S. aureus, 简写为MRSA）是“ESKAPE”病原菌中的另一个重要成员。该类细菌早在上世纪六十年代已被发现，但至今尚未被控制，且其耐药性及危害愈来愈严重，已发展成为全球性致病菌，是院内感染最常见的病原菌之一，并逐渐向社区扩散。MRSA对绝大多数临床常用抗生素均有耐受性，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类等药物。糖肽类抗生素万古霉素治疗MRSA感染的效果较好，但近年来出现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌菌株（Vancomycin-resistant S. aureus, 简写为VRSA）。2013年，美国疾病预防与控制中心已将其列为“严重的威胁”（耐药性威胁中的次高等级）。

高度多重耐药菌的出现和传播迫使人必须加紧研发新型抗生素。目前上市的或正处于临床试验阶段的新抗生素基本都是对现有抗生素进行化学修饰。由于这些新药的母核与原有抗生素相同或相似，对其产生耐药性的病原菌往往会很快出现。为避开耐药菌对现有抗生素的耐药机制，研发全新结构的抗生素是当前控制耐药菌的必由之路。目前开发新结构抗生素主要有两条途径。一是化学合成全新结构的抗菌活性化合物，然而近四十年来，尽管采用了最新的基因组学技术和组合化学技术，世界范围内至今尚未见全新结构的广谱抗生素问世。另一条途径是从天然产物中通过高通量筛选获得新型抗菌化合物。微生物由于生长速度快，易于工业化生产而备受青睐，然而经过上世纪的大筛选，现已很难从普通微生物资源如土壤微生物中发现具有抗菌活性的新结构化合物。

我们从一株健康水杉Metasequoiaglyptostroboides的树皮中分离到一株内生真菌EF10，体外实验表明，该菌株的代谢产物提取物对临床分离的携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌和MRSA具有显著的抑制活性。该菌株易于培养，具有开发新抗生素的潜力。

发明内容

本发明为研制新型抗菌药物提供了一株内生真菌EF10。所述内生真菌菌株EF10经形态学特征观察及其rDNA ITS序列分析鉴定为Penicilliumsp.，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14995。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年12月07日。

本发明所述内生真菌菌株EF10分离自一株健康水杉的树皮。该菌株的形态学特征如下：将内生真菌EF10接种到马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar ，简写为PDA）培养基上，25℃下培养8天，培养基上可见多个绿色圆形小菌落（图1），菌落较致密，边缘呈白色，较整齐，菌落背面呈黄色。分生孢子着生于分生孢子梗上。分生孢子梗明显，无色，顶端分枝呈典型的帚状。分生孢子单孢，绿色，球形（图2）。提取该菌株的基因组总DNA，利用真菌通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）对获得的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，获得该菌株的核糖体DNA 内转录间隔区序列（internal transcribed spacer, ITS）数据。进入美国国家生物技术信息中心（NationalCenter forBiotechnology Information，NCBI）网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，对测序数据进行核酸Blast分析，结果表明所测序列与Penicilliumsp.的ITS序列相似度达99%。结合菌株EF10的形态学特征与ITS序列分析，鉴定该菌株为Penicillium属菌种，本菌株定名为Penicilliumsp. EF10。

将内生真菌菌株EF10接种于含有1000ml马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中（三角瓶容量为2000ml），于25℃下静置培养15天，所得培养物过滤后取上清液，将上清液浓缩后用乙酸乙酯萃取，得粗提物。体外抑菌实验表明，所述粗提物具有显著的抑菌作用，被其抑制的细菌包括但不限于：携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌和MRSA。

本发明为研制新型抗菌药物，特别是抗耐药菌药物提供了新菌株，该菌株容易培养，发酵成本低，具有较高的开发价值和应用前景。

本发明工作得到了国家自然科学基金（No. 31300067）、江苏省高校自然科学研究重大项目（No.15KJA180002）和江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题项目（No.2015HS003）的资助。

附图说明

图1 为菌株EF10在PDA平板上的正面菌落形态照片

图2为菌株EF10的产孢结构及孢子形态显微照片（放大倍数：600倍）

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，本发明的保护范围并不限于下述实施例。本领域的普通技术人员很容易根据本文说明对本发明进行复制或做出各种替换、修改或改变，这些复制、替换、修改或改变均在本发明的保护范围内。

实施例1 内生真菌菌株EF10的分离、纯化及保存

实验方法与步骤如下：

1.样本的采集：采集江苏师范大学校园内一株健康水杉的树皮，立即带回实验室用于内生真菌的分离。

2.内生真菌的分离：将采集的树皮于流水下冲洗，去除表面的灰尘，晾干后将其剪切成约0.5×0.5cm大小的小方块，按如下方法对其进行表面灭菌：先用70% 乙醇浸泡样本lmin，之后转入稀释40倍的84消毒液（爱特福基团）中浸泡10min，最后用无菌水冲洗3次（每次1min）。将表面灭菌的小块接至含有PDA培养基的平板上，每一平板均匀放置5个小块，将上述平板置于25℃下培养3 - 7天，每日观察样品小块边缘是否有菌丝长出。

3.内生真菌的纯化：小块边缘长出菌丝后，用无菌接种针切取大小为0.5×0.5cm的菌饼（菌丝及其下方培养基）转至新PDA培养基上，25℃下培养3-7天，观察菌落形态是否为纯菌落。如不是纯菌落，则从菌落边缘切取大小为0.5×0.5cm的菌饼，按上述方法继续纯化，直至获得纯菌落。

4.内生真菌的保藏：用无菌接种针从内生真菌纯菌落中切取5个大小为0.5×0.5cm的菌饼，转至装有灭菌石蜡油的冷冻管中，置于4℃冰箱中保存。

实施例2. 内生真菌菌株EF10的鉴定

1.形态学鉴定：将内生真菌菌株EF10接种至新PDA培养基上，置于25℃下培养7-30天，每日观察菌落正反面特征。待其生成孢子后，取一张载玻片，在其中央滴一滴乳酚油（配方：加热融化的苯酚20 mL；乳酸20 mL；甘油40 mL；水20 mL），挑取少许菌丝，置于乳酚油中，用接种针将菌丝拨散，盖上盖玻片，置于显微镜下观察其孢子及产孢结构形态特征，对照《真菌鉴定手册》（魏景超 1979）及《Illustrated genera of imeprfect fungi》（Barnett HL，Hunter BB 1998）进行形态学鉴定。菌落正面形态见附图1，菌株孢子及产孢结构形态特征见附图2。根据其形态学特征，鉴定为：Penicillium属菌种。

2.ITS序列分析：

a)实验所用的缓冲液的配制方法：

（1）1M Tris-HCl (pH 8.0) 缓冲液

称取12.11 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）放于烧杯中，加入约80 mL的去离子水，充分搅拌使其溶解。用浓盐酸调节pH至8.0，再将溶液定容至100 mL。高温高压灭菌后，于室温保存。

（2）0.1M EDTA缓冲液（pH 8.0）

称取3.72g 乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）放于烧杯中，加入约80ml去离子水中，充分搅拌使其溶解，调节pH至8.0，再将溶液定容至100 mL。高温高压灭菌后，于室温保存。

（3）10×TE 缓冲液配方

Tris-Cl缓冲液（pH 8.0） 100 mM/L

EDTA缓冲液（pH 8.0） 10 mM /L

调节酸碱度至所需pH值，分装后高压蒸汽灭菌20 min，置于冰箱中保存备用，用时将其稀释10倍。

（4）10% SDS溶液

称取10g 十二烷基磺酸钠（SDS），溶于100ml去离子水中，混匀备用。

（5）溴化乙锭（EB）溶液 (10 mg/mL)

在100 mL去离子水中溶解1 gEB。磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解，然后用铝箔纸包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。

b)菌株EF10基因组总DNA的提取：将在PDA培养基上培养7天的内生真菌EF10的菌丝从平板上小心刮取下来，用真菌DNA提取试剂盒提取总DNA。将DNA溶于30μl TE缓冲液（pH7.4）中，于-20℃保存、备用。

c)菌株EF10的ITS序列扩增：采用真菌通用引物ITS1/TIS4及DreamTaq^TMGreen DNA聚合酶进行其ITS序列的PCR扩增，引物序列分别为：

ITS1 (5'to3')：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；

TIS4 (5'to3')：TCCTCCGCTTATTGATATGC

反应体系如下：

PCR的反应程序如下：95 ℃预变性5 min，依次进入：95 ℃变性 20 s，45 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min； 95 ℃变性20 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，然后开始进入循环：95 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35个循环，最后68 ℃延伸10 min。

d)PCR反应产物的确认：配置1%琼脂糖凝胶，取PCR产物和GeneRuler 1kb PlusDNA Ladder各5μl上样，在110v、160mA条件下电泳30min。电泳结束后将凝胶置于EB溶液（0.5μg/ml）中染色30min，然后置于凝胶成像系统中观察条带。如出现500bp-700bp条带，则初步判断扩增成功。

e)PCR反应产物的测序：将PCR产物送生工生物工程上海（股份）有限公司进行测序。

f)数据分析：将菌株EF10的ITS序列在NCBI网页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行在线比对分析（blastn），找到与其最相似的已知序列。结果表明所测序列与Penicilliumsp.的ITS序列相似度达99%。

结合两种鉴定结果，该菌株鉴定为Penicilliumsp.，本株定名为Penicilliumsp.EF10。

实施例3. 内生真菌EF10代谢产物的体外抑菌实验

一、实验方法（微量肉汤二倍稀释法）

1)涉及的细菌菌种：①临床分离的携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌；②临床分离的MRSA

2)菌种的活化：将各菌种从-80 ºC冰箱中取出，分别划线接种于含氨苄青霉素（终浓度为100 μg/ml）的Luria-Bertani（LB）培养基平板上。将平板置于37 ºC培养箱中过夜培养。

3)菌液的配制：从上述各LB平板上分别挑取单菌落至装有LB液体培养基（含终浓度为100 μg/ml的氨苄青霉素）的试管中。将各试管置于摇床上，于37 ºC下振荡培养，每隔一段时间取出少量菌液用酶标仪测定其在波长600 nm处的光密度 (optical density，OD600) 值，当菌液OD600 值为1时取出菌液，用LB培养液稀释5,000倍，备用。

4)提取物的制备：将菌株EF10接种于含1000ml 马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于25℃下静置培养15天，将培养物过滤，得上清液，用旋转蒸发仪将上清液浓缩。将浓缩液用乙酸乙酯萃取，得粗提物。准确称量粗提物，将其溶于LB培养液中，配成200 μg/ml的溶液，然后用LB培养液依次2倍稀释，配成系列梯度溶液，最低浓度至12.5μg/ml。配制溶液的过程中，所用的移液器吸头及塑料小管均在灭菌后使用。

5)抑菌实验：在无菌96-孔板的各孔中分别加入50μL各浓度提取物溶液和50μL稀释后的菌液，混匀。另取3个孔只加入菌液作为对照，将96-孔板置于37 ºC下恒温培养18~20h后测定菌液OD值。根据每个孔菌液OD值的变化计算抑菌率。抑菌率的计算公式如下：

抑制率(%)= [1- (样品A600增加量/对照A600增加量)]×100

以抑菌率等于或超过90%时的提取物浓度为最低抑菌浓度（minimum inhibitoryconcentration，MIC）。上述实验重复3次，根据实验结果确定提取物的MIC。用同样的方法测试氨苄青霉素和美罗培南对上述细菌菌株的MIC。

二、实验结果：

从表1可以看出，临床分离的携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌和MRSA菌株对氨苄青霉素和美罗培南均有耐受性，内生真菌菌株EF10提取物对上述耐药菌均具有显著的抑制作用。

表1内生真菌EF10提取物对临床分离的携带BlaNDM-1基因的肺炎克雷伯菌和MRSA的最低抑菌浓度（ug/ml）

1: 携带BlaNDM-1基因的肺炎克雷伯菌。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种内生真菌菌株及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 内生真菌菌株EF10(Penicilliumsp. EF10)

<400> 1

gggctttcga gtgagggctt tgggtccacc tcccacccgt gtttatttta ccttgttgct 60

tcggcgggcc cgcctttact ggccgccggg gggctcacgc ccccgggtcc gcgcccgccg 120

aagacaccct cgaactctgt ctgaagattg aagtctgagt gaaaatataa attatttaaa 180

actttcaaca acggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac 240

gtaatgtgaa ttgcaaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccccctg 300

gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg gcttgtgtgt 360

tgggccccgt cctccgattc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg 420

gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctccgtaggc ccggccggcg cttgccgatc 480

aacccaaatt tttatccagg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc 540

atatcaataa gcggaggaat t 561

Claims (4)

1.一株内生真菌Penicilliumsp.EF10，其特征是：保藏编号为CGMCC No.14995；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月07日。

2.一种如权利要求1 所述的内生真菌菌株，其代谢产物提取物在抑菌方面中的应用。

3.根据权利要求2 所述的应用，其特征在于：被该菌株的代谢产物提取物抑制的菌株包括携带Bla _NDM-1 基因的肺炎克雷伯菌。

4.根据权利要求2 所述的应用，其特征在于：被该菌株的代谢产物提取物抑制的菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。