CN101228847A - 北五味子诱导不定芽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种农业技术领域的北五味子组培快繁的不定芽诱导方法，取北五味子的嫩枝顶部和中部带腋芽茎段作为组织培养外植体，采用饱和次氯酸钠间二灭菌法对外植体消毒，无菌操作接种于诱导培养基上，诱导培养基成分为：每升液体MS基本培养基中加6－苄氨基嘌呤2.0mg、α－萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、琼脂8g。在温度20℃－25℃，光照12h/d，光照强度800－1200lx条件下培养。经过20天－30天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽，继续培养待腋芽长到2cm后，将不定芽从外植体上切下，接种到新的培养基上培养获得无菌丛生芽，丛生芽经过分株后再接种于培养基上培养可获得大量不定芽。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种农业技术领域的组织培养方法，具体是一种北五味子诱导不定芽的方法。
背景技术
组织培养是加速植物繁殖、创造优良品种的一种行之有效的方法，为农业生产提供许多优良的新品种，也为农业生产工厂化提供了广阔的前景。MS培养基，6-BA，NAA，ZT的选用在诱导不定芽萌发和不定芽增殖中已经得到肯定。
北五味子这一中国传统著名的药材近年来在国外受到相当的关注，其含有大量的精油、酸等液体物质，具有增强视力和听力能力，消除眼部疲劳，加强视力集中，增强机体免疫能力，提高抵抗力等功能。因此北五味子可以成为一些特殊职业的必备良药，诸如长途驾驶司机、飞行员、航海员和运动员等都可以用它来缓解工作过程中的巨大压力。
经对现有技术的文献检索发现，陈雅君等在《植物研究》(1999，7，19(3)：318-322)上发表的《药用植物北五味子的组织培养》该文中提出以带腋芽的北五味子嫩茎为外植体，在附加6-BA2.0+ZT0.1mg/L的MS培养基上，诱导芽的效果最好。其具体方法为：把北五味子嫩茎剪去叶片及叶柄，用自来水冲洗，并加少量市售洗衣粉加以洗涤，用自来水冲洗4～5小时，然后切成约5cm长的茎段移到超净工作台上，先用70％酒精浸泡30秒，再用0.2％溶液消毒8分钟，取出后用无菌水冲洗5次，切成长度约0.5cm左右的小段，每段至少有一个叶腋，按无菌操作要求，接种于培养基上。将培养瓶置于20～26℃，光照强度为2000Lx的培养室，光照时间每天为12小时。其不足在于：升汞溶液有剧毒，对植物材料损伤大，对人体有危害性，处理不当对环境有污染，不适宜实际应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种北五味子诱导不定芽的方法，使其提供北五味子组培快繁的不定芽诱导所需要的最佳培养基和外植体消毒方法，为优良北五味子的快速繁殖提供了技术保证，将对北五味子资源的开发和利用起到积极的推动作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下具体步骤：
①取北五味子的嫩枝顶部和中部带腋芽茎段作为组织培养的外植体材料；
②采用间二灭菌法对外植体材料消毒；
③在诱导培养基上培养获得无菌丛生芽；
④丛生芽经过分株后再接种于诱导培养基上培养获得大量不定芽。
所述采用间二灭菌法对外植体材料消毒，是指：用饱和的次氯酸钠浸泡消毒后接种于诱导培养基上，隔一天后再用次氯酸钠消毒一次。
进一步的，所述采用间二灭菌法对外植体材料消毒，是指：剪取2cm长的带腋芽的嫩茎段，自来水水冲洗2小时后用饱和的次氯酸钠浸泡三分钟，至两端发白，取出用无菌水冲洗三次以上，然后用无菌纱布吸干水分，通过无菌操作接种于诱导芽的培养基上，隔一天将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次，以获得高质量的无菌北五味子外植体材料。
所述在诱导培养基上培养获得无菌丛生芽，其培养室温度20℃-25℃，光照12h/d，光照强度800-12001x。经过20天-30天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽。
所述丛生芽经过分株后再接种于培养基上培养，是指：长出腋芽后继续培养20天左右，待腋芽长到2cm后，将不定芽从外植体上切下，接种到诱导培养基上培养。在剪取不定芽时，尽量选择腋芽茎段，因为该部位在继代培养中是最容易诱导出更多的不定芽。等待不定芽长成芽丛后，再将不定芽切下分株继续扩大繁殖，直至到达所需数量。
所述诱导培养基，其成分为：每升液体MS基本培养基中加6-苄氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、琼脂8g。
本发明对于外植体的消毒采用了间二灭菌法，原因在于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，而接种到培养基上之后两天是孢子体生命力最弱的阶段，此时将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次，接种到培养基上后，污染率小于5％，且外植体腋芽萌发率高，相对于传统的一次灭菌方法，能取得更好的灭菌效果，而且次氯酸钠相对于其他消毒剂更易于去除，不易残留在外植体上对其造成损伤。
本发明中培养基附加了低浓度的NAA，其作为一种生长素，主要作用是重新启动有丝分裂，使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力。在北五味子不定芽诱导的实验中，低浓度的NAA与6-BA组合，效果比不加NAA要好。不定芽平均增殖系数达到3.4，最高4.1，比前人所作有大幅提高。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本实施例所使用的诱导培养基，通过以下方法制成：每升液体MS基本培养基中加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值调为5.8后每升加入8g琼脂121℃灭菌30min制成固体培养基。
实施例1
剪取2cm长的带腋芽的嫩茎段，自来水水冲洗2小时后用饱和的次氯酸钠浸泡三分钟，至两端发白，取出用无菌水冲洗三次以上，然后用无菌纱布吸干水分，通过无菌操作接种于诱导芽的培养基上(每升液体MS基本培养基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值调为5.8后每升加入8g琼脂121℃灭菌30min制成固体培养基)100个，隔一天将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次后重新接种于诱导培养基上，在温度20℃，光照12h/d，光照强度12001x条件下培养。经过20天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽。待腋芽长到2cm后，选取60个腋芽从外植体上切下，接种到上述培养基上继续培养，30天后统计不定芽数量为211个，增殖系数为3.52。
实施例2
剪取2cm长的带腋芽的嫩茎段，自来水水冲洗2小时后用饱和的次氯酸钠浸泡三分钟，至两端发白，取出用无菌水冲洗三次以上，然后用无菌纱布吸干水分，通过无菌操作接种于诱导芽的培养基上(每升液体MS基本培养基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.03mg、ZT(玉米素)0.04mg、蔗糖30g，pH值调为5.8后每升加入8g琼脂121℃灭菌30min制成固体培养基)100个，隔一天将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次后重新接种于诱导培养基上，在温度25℃，光照12h/d，光照强度8001x条件下培养。经过25天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽。待腋芽长到2cm后，选取60个腋芽从外植体上切下，接种到上述培养基上继续培养，30天后统计不定芽数量为166个，增殖系数为2.76。
实施例3
剪取2cm长的带腋芽的嫩茎段，自来水水冲洗2小时后用饱和的次氯酸钠浸泡三分钟，至两端发白，取出用无菌水冲洗三次以上，然后用无菌纱布吸干水分，通过无菌操作接种于诱导芽的培养基上(每升液体MS基本培养基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.07mg、ZT(玉米素)0.08mg、蔗糖30g，pH值调为5.8后每升加入8g琼脂121℃灭菌30min制成固体培养基)100个，隔一天将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次后重新接种于诱导培养基上，在温度22℃，光照12h/d，光照强度10001x条件下培养。经过26天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽。待腋芽长到2cm后，选取60个腋芽从外植体上切下，接种到上述培养基上继续培养，30天后统计不定芽数量为175个，增殖系数为2.92。
Claims (6)
1.一种北五味子诱导不定芽的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
①取北五味子的嫩枝顶部和中部带腋芽茎段作为组织培养的外植体材料；
②采用间二灭菌法对外植体材料消毒；
③在诱导培养基上培养获得无菌丛生芽；
④丛生芽经过分株后再接种于诱导培养基上培养获得大量不定芽；
所述诱导培养基，其成分为：每升液体MS基本培养基中加6-苄氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、琼脂8g。
2.根据权利要求1所述的北五味子诱导不定芽的方法，其特征是，所述诱导培养基，其pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述的北五味子诱导不定芽的方法，其特征是，所述采用间二灭菌法对外植体材料消毒，是指：用饱和的次氯酸钠浸泡消毒后接种于诱导培养基上，隔一天后再用次氯酸钠消毒一次。
4.根据权利要求1或3所述的北五味子诱导不定芽的方法，其特征是，所述采用间二灭菌法对外植体材料消毒，是指：剪取2cm长的带腋芽的嫩茎段，自来水水冲洗2小时后用饱和的次氯酸钠浸泡三分钟，至两端发白，取出用无菌水冲洗三次以上，然后用无菌纱布吸干水分，通过无菌操作接种于诱导芽的培养基上，隔一天将外植体从培养瓶中取出，再用次氯酸钠消毒一次，以获得高质量的无菌北五味子外植体材料。
5.根据权利要求1所述的北五味子诱导不定芽的方法，其特征是，所述在诱导培养基上培养获得无菌丛生芽，其培养室温度20℃-25℃，光照12h/d，光照强度8001x-12001x，经过20天-30天的培养，北五味子茎段会生长出腋芽。
6.根据权利要求1所述的北五味子诱导不定芽的方法，其特征是，所述丛生芽经过分株后再接种于培养基上培养，是指：长出腋芽后继续培养20天，待腋芽长到2cm后，将不定芽从外植体上切下，接种到诱导培养基上培养，在剪取不定芽时，选择腋芽茎段，等待不定芽长成芽丛后，再将不定芽切下分株继续扩大繁殖，直至到达所需数量。
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| CN101803568A (zh) * | 2010-04-28 | 2010-08-18 | 吉林大学 | 一种高产优质北五味子杂交纯合系的快速繁育方法 |
| WO2021077755A1 (zh) * | 2019-10-23 | 2021-04-29 | 中南林业科技大学 | 一种黑老虎带芽茎段的消毒方法及其快速增殖方法 |
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