CN101803568B - 一种北五味子杂交纯合系的快速繁育方法 - Google Patents

Abstract

一种高产优质北五味子杂交纯合系的快速繁育方法属植物细胞工程及作物杂交育种技术领域，本发明包括北五味子花粉单倍体植株的培育、北五味子纯合二倍体的获得和杂交北五味子品种的培育；本发明针对北五味子作为珍稀药用植物，目前尚无优良品种苗木，生产用苗仍以实生苗为主，种质混杂，育种材料严重缺乏、育种周期长、育种效率低、特定地区适种北五味子优质品种严重不足的现状，利用花粉单倍体培养技术快速获得单倍体植株，并利用二倍体化技术诱发产生二倍体植株，为北五味子常规杂交育种提供了纯系二倍体亲本的方法。

Description

一种北五味子杂交纯合系的快速繁育方法

技术领域

本发明属植物细胞工程及作物杂交育种技术领域，具体涉及一种利用花粉雄核培养和二倍体化处理技术，快速获得北五味子杂交纯合系，并以其作为供选母本，与父本进行北五味子杂交育种的方法。

背景技术

北五味子是我国东北地区重要的药用植物资源，果实除药用外还可加工风味独特的果酒和果汁饮料，应用前景十分广阔。近年来，北五味子作为短缺药材和食品原料，在东北三省呈现积极的发展态势。

目前，北五味子的药用原料依赖于野生资源，我国中药材市场、制药和酿酒加工企业年需五味子干品7000-8000吨，而野生资源的年产量只有500-700吨，市场供需矛盾日趋紧张。近年来由于国内外市场对五味子的需求日益增加，野生北五味子被大量采挖，遭到严重破坏。因此，在加强野生资源保护力度的同时，开展大面积人工栽培是解决原料短缺的根本途径。变野生为家植的成功实践正推动着这一新兴栽培产业的发展。自然界分布了很多的野生类型，未经纯化直接种植，导致产生种质混杂。北五味子变异类型很多，因此要规范它的种植，避免产量高的五味子和产量低的五味子混杂，药效物质基础含量高的五味子和含量低的五味子混杂，抗病的五味子和不抗病的混杂等问题。

北五味子人工驯化和栽培只有近30多年的历史，建园所用幼苗以实生苗为主，因而品种极其混杂，个体间表型千差万别，这样不仅不利于果园统一管理，而且会影响药效。北五味子育种与栽培技术的研究，是解决扩大北五味子资源量的措施之一。为了保护野生资源和满足越来越大的生产需要，我国从上世纪90年代开始重视北五味子的人工栽培研究，系统地开展了规范化栽培、资源收藏评价、新品种选育研究；并选育出我国第一个北五味子无性系新品种“红珍珠”。因为没有成熟的无性繁殖体系，这一优良品种得不到推广。目前“红珍珠”只能通过种子繁殖来生产苗木，其后代不可能维持母体的优良特性。总体而言，优良品种依然较少，不利于五味子的规模化生产，而且这些品种还有一个共同的弱点，即来源于天然自交或杂交，优良性状单一，优质和高产不能统一，其中表现最明显的就是抗病性、抗逆性(低温、干旱等)低，因此急需一种有效的北五味子无性繁殖方法来推广这一优良品种。

用组织培养的方法繁殖苗木，可以解决北五味子栽培及优质苗木快速繁殖等问题，为北五味子栽培技术提供新方法。关于北五味子的组织培养研究，陈雅君、周鑫通过以带腋芽的嫩茎为外植体，诱导腋芽分化，并进一步形成完整植株，但由于增殖倍数只有3.2倍和芽生长速度太慢(培养15d，长0.7cm)而不能应用于生产；胡宝忠、李兴亮对五味子组织培养中的外植体和培养基进行了比较和优化，利用体细胞胚胎发生途径也可以获得五味子再生植株，且可大规模获得植株，有助于保存种质资源；李成浩等利用营养器官诱导体细胞胚发生获得再生植株；Smiskova等和Kim等以五味子合子胚作为外植体进行体细胞胚诱导获得再生植株。

根据育种目标选择亲本是育种能否成功的关键，没有符合育种条件的亲本，想育成好的品种是不可能的事。这就需要根据北五味子性状遗传规律判断出最有希望的亲本，确定合适的杂交组合。从目前五味子品种的选育方法分析，已获得的优良品种主要来源于野生和实生植株的自然变异，不仅选种工作方向性差、效率低、育种目标不明确，而且育出品种遗传背景纷繁复杂，因而无法实现品种的进一步改良和系列化。杂交育种是最基本的、贡献最大的一种育种方法，以培育纯系品种或混系品种为目标，因目前尚无优良品种苗木，生产用苗仍以实生苗为主。但在以种子进行有性繁殖过程中优良性状无法控制，有些甚至丢失。

纯合体是杂交育种的最佳材料。北五味子是雌雄同株的单性花植物，遗传机制复杂，采用常规途径获得相对纯合的亲本，周期很长，至少需要经过5-7代亲本自交。植物花粉单倍体培养技术已在数百种植物上获得成功，花粉作为单倍有机个体，可以在1-2年内通过诱导培养获得纯合个体，因此开展北五味子花粉培养，有助于快速获得大量单倍体植株，经过人工诱发加倍，获得纯合二倍体植株，根据育种目标筛选出优质的种质材料作为亲本，通过常规杂交育种培育出北五味子的优良杂交新品种，从而加速北五味子育种进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用花粉单倍体培养技术快速获得单倍体植株，并利用二倍体化技术诱发产生二倍体植株，为北五味子常规杂交育种提供纯系二倍体亲本的方法。

本发明的一种北五味子杂交纯合系的快速繁育方法，包括下列步骤：

一.北五味子花粉单倍体植株的培育

1.将成熟的处于总苞开裂临界期的北五味子雄花序，进行低温、表面消毒和干燥处理；

2.分离出花粉；

3.接种到MS培养基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant.15：473-497，1962)上直接诱导形成愈伤组织；

4.选取新鲜致密的高活性愈伤组织，转接到分化培养基(MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L)中分化形成再生苗；

5.再生苗转接到生根培养基(MS+NAA 0.1mg/L+3％蔗糖、0.8％琼脂)；

6.培育出花粉单倍体植株。

二.北五味子纯合二倍体的获得

1.对由花粉经诱导、分化、生根形成的候选单倍体植株，进行染色体形态观察和核型分析、确认；

2.用0.1％-0.3％秋水仙素溶液，对所选取的生长良好的单倍体植株的茎尖生长点或正在膨大的根尖进行处理，获得候选纯合二倍体植株；

3.对候选纯合二倍体植株进行核型分析、确认；

4.纯合二倍体植株隔离条件自交扩繁后，繁育出可作为母本的二倍体纯合系。

三.杂交北五味子品种的培育

1.以选育的纯合二倍体植株为母本；

2.以配合力强的自交系，或进一步经遗传改良的自交系为父本；

3.对母本和父本实施杂交组合，筛选获得高产、优质、抗冻、抗旱的北五味子新品种。

对母本和父本实施杂交组合中，北五味子母本的原始材料选自各种来源的品种、品系或野生种，北五味子父本是配合力强的自交系或进一步经遗传改良的自交系。

上述北五味子母本的原始材料的品种、品系或者野生种可以为中国吉林省靖宇县农家品种，或适宜种植的优质品种、品系。

以下内容将对本发明中的常用术语进行解释：

“北五味子种质资源”是制作北五味子母本的原始材料，可以是各种来源(国内或者国外)的品种、品系或者野生种，但以适种优质品种、品系或当地中熟农家品种为首选；北五味子父本是配合力强的自交系或者进一步经遗传改良的自交系。

“北佳3号”北五味子纯合二倍体是选取吉林省北佳中药材科技开发有限公司繁育基地种植的具有优良性状的北五味子花粉，获得单倍体再生植株，并诱发其产生的二倍体植株，采用ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)标记技术、色谱指纹图谱和HPLC(HighPerformance Liquid Chromatography)分析遗传多样性和种质资源的优劣。经鉴定，该纯合二倍体植株综合性状优良，其有效成分与栽培的北五味子相差不大，但具有高产、抗冻、抗旱等特性。

本发明的积极效果在于针对北五味子作为珍稀药用植物，目前尚无优良品种苗木，生产用苗仍以实生苗为主，种质混杂，育种材料严重缺乏、育种周期长、育种效率低、特定地区适种北五味子优质品种严重不足的现状，利用花粉单倍体培养技术快速获得单倍体植株，并利用二倍体化技术诱发产生二倍体植株，为北五味子常规杂交育种提供纯系二倍体亲本的方法。

具体实施方式

以下只是作为事例说明发明人实施本发明的过程，并不限制本发明的其它实施范围，也不排除使用者可使用其它更加有效的方案。

1.单倍体植株快速获得技术

以吉林省北佳中药材科技开发有限公司繁育基地种植的具有优良性状的北五味子为原始种质材料，当雄花总苞处于开裂临界期(似开未开)，此时雄花已经成熟；上午8:00-9:00采集单核中晚期的花蕾用冰壶带回实验室，小心摘取雄花序，立即放在黑暗干燥的容器中，并在-15℃冰箱中进行10-30天的低温处理。在超净工作台上，选择完整未破裂的花蕾，先用70％酒精浸泡10s，然后用20％的次氯酸钠溶液消毒5min，并用无菌水冲洗3-4次，放在超净台上风吹30min至干。用镊子夹住花苞基部，用解剖针剥开花苞，然后敲打镊子，使花粉均匀散落在含有MS培养基的培养皿中，并用封口膜封好。整个过程要注意杂菌污染。

花粉在MS培养基中首先置于4℃低温处理24h，然后放在24-26℃、光照时间12h/d、光照强度2500lx的人工气候箱中进行诱导培养，直至形成愈伤组织，选取新鲜致密的高活性愈伤组织，转接到添加了1.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的最优MS培养基中继续培养，直至形成花粉单倍体植株。此过程中，要经常观察污染情况、培养基失水情况等，并及时处理污染，或更换新鲜的培养基。

单倍体植株的核型分析：取花粉植株的根尖，采用染色体常规切片和压片技术，以8-羟基喹啉(或者二氯苯)饱和溶液进行预处理3-5h，然后用卡诺固定液固定2-24h，经50％乙醇浸泡，蒸馏水冲洗，以及1mol/L浓度的盐酸溶液解离7-8min后，洗去盐酸，进行卡宝品红染色3-5min制片，显微镜检查，并以染色体数目确认单倍体。

2.纯合二倍体植株获得方法

选择确认为单倍体的生长良好的植株，然后用0.1-0.3％秋水仙素溶液，处理其茎尖生长点，或用棉球进行全株涂抹，即可获得纯合二倍体植株；秋水仙素优选的浓度为0.2％。处理后进行定期核型分析，以确认二倍体植株。

3.北五味子杂交种的选育

北五味子供试父本：在吉林省北佳中药材科技开发有限公司繁育基地选择具有优良性状的北五味子“红珍珠”(中国农业科学院特产研究所选育)植株

北五味子纯合二倍体母本的繁育：花粉培育并二倍化的纯合北五味子植株，选取优质和多抗的植株为供试母本。

在开花前1-2天，雌蕊表现出较强的生理活性，是授粉的最佳时机；在培育过程中，及时清除地下横走茎，提高母体的营养水平，促进雌花分化。

Claims (1)

1.一种北五味子杂交纯合系的快速繁育方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)北五味子花粉单倍体植株的培育：

1.1将成熟的处于总苞开裂临界期的北五味子雄花序，进行低温、表面消毒和干燥处理；

1.2分离出花粉；

1.3接种到MS培养基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant.15：473-497，1962)上直接诱导形成愈伤组织；

1.4选取新鲜致密的高活性愈伤组织，转接到分化培养基MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L中分化形成再生苗；

1.5再生苗转接到生根培养基MS+NAA 0.1mg/L+3％蔗糖、0.8％琼脂；

1.6培育出花粉单倍体植株；

(2)北五味子纯合二倍体的获得：

2.1对由花粉经诱导、分化、生根形成的候选单倍体植株，进行染色体形态观察和核型分析、确认；

2.2用0.1％-0.3％秋水仙素溶液，对所选取的生长良好的单倍体植株的茎尖生长点或正在膨大的根尖进行处理，获得候选纯合二倍体植株；

2.3对候选纯合二倍体植株进行核型分析、确认；

2.4纯合二倍体植株隔离条件自交扩繁后，繁育出可作为母本的二倍体纯合系；

(3)杂交北五味子品种的培育：

3.1以选育的纯合二倍体植株为母本；

3.2以配合力强的自交系，或进一步经遗传改良的自交系为父本；

3.3对母本和父本实施杂交组合，筛选获得高产、优质、抗冻、抗旱的北五味子新品种。