CN101228180A - 作为丙型肝炎病毒抑制剂的三肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有通式(I)的丙型肝炎病毒抑制剂。还公开了包含本化合物的组合物和使用该化合物抑制HCV的方法。

Description

作为丙型肝炎病毒抑制剂的三肽
本公开一般涉及抗病毒化合物，并且更具体地说，涉及抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(在本文也称为“丝氨酸蛋白酶”)功能的化合物、包含这样的化合物的组合物和抑制NS3蛋白酶功能的方法。
HCV是主要的人类病原体，在全球感染估计1.7亿人-约为感染1型人免疫缺陷病毒人数的五倍。这些HCV感染个体中的相当大部分发展为包括肝硬化和肝细胞性肝癌的严重的进行性肝病。
目前，最有效的HCV疗法使用α-干扰素和利巴韦林的联合，导致40％的患者的持续效应。近期的临床结果证明，作为单一疗法的聚乙二醇化(pegylated)α-干扰素优于未经修饰的α-干扰素。然而，即使采用包括聚乙二醇化α-干扰素和利巴韦林联合的实验性治疗方案，相当大部分的患者并不使病毒载量持续降低。因而，开发用于治疗HCV感染的有效的治疗剂成为明显和未曾满足的需求。
HCV是正链RNA病毒。基于在5’未翻译区域的推论的氨基酸序列和扩展相似性的比较，将HCV分类为黄病毒科(Flaviviridae)家族中的单独的属。所有黄病毒科家族成员均具有含正链RNA基因组的包膜病毒体，所述基因组经由单个的、不间断的、开放阅读框翻译编码所有已知病毒-特异性蛋白质。
在全部HCV基因组的核苷酸和编码的氨基酸序列中发现相当大的异质性。已经鉴定了6个主要的基因型并描述了多于50个亚型。HCV的主要的基因型在全球分布不同，且尽管对基因型在发病机制和治疗的可能作用已经进行了大量的研究，但HCV的基因异质性的临床意义尚不了解。
单股HCV RNA基因组长度约为9500个核苷酸并且具有编码约300个氨基酸的单个大聚合蛋白质的单个开放阅读框(ORF)。在感染细胞中，此聚合蛋白质在多处位点上被细胞性和病毒性蛋白酶裂解，产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白。在HCV病例中，两个病毒蛋白酶影响成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生。第一个在NS2-NS3连接处裂解；第二个是包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶，并在NS3-NS4A裂解位点上以顺式和对于残余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点以反式，均介导NS3的所有后续的裂解下游过程。NS4A蛋白似乎提供多重功能，作为辅因子作用于NS3蛋白酶和可能在NS3和其它病毒复制酶成分的膜定位上有帮助。NS3蛋白质与NS4A复合物的形成对于高效的聚合蛋白质加工、增强在所有位点的蛋白水解的裂解是重要的。NS3蛋白质还表现出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是涉及HCV复制的RNA-依赖性RNA聚合酶。
本公开提供例如在与NS4A蛋白酶联合时可抑制NS3蛋白酶功能的肽化合物。再有，本公开描述了给予患者以治疗HCV感染的联合疗法，其中有效抑制HCV NS3蛋白酶的依据本公开的化合物可与另一个具有抗-HCV活性的化合物联合给予，所述另一个具有抗-HCV活性的化合物为例如有效抑制选自以下目标功能的化合物：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配、HCV外出、HCV NS5A蛋白质和IMPDH。
在本公开的一个实施方案中，提供式(I)化合物
Figure S2006800251234D00021
或其药学上可接受的盐，其中
n为1、2或3；
R1选自羟基和-NHSO2R7；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R4选自氢和羟基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、(NRaRb)羰基和(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRd；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环；
前提是R4为氢时，则R3不是杂环基。
在本公开的另一个实施方案中，提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐，
Figure S2006800251234D00031
其中
n为1、2或3；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、-(NRaRb)羰基和-(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRc；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环。
在本公开的另一个实施方案中，提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐，其中
n为1；
R2为烯基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R5为烷基；
R6为烷氧基羰基；和
R7为环烷基。
在本公开的另一个实施方案中，提供式(III)化合物
Figure S2006800251234D00041
或其药学上可接受的盐，其中
n为1或2；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基和杂环基烷基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、-(NRaRb)羰基和-(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRd；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环。
在本公开的另一个实施方案中，提供式(III)化合物或其药学上可接受的盐，其中
n为1；
R2为烯基；
R3选自烯基、芳基、芳基烷基、环烷基和(环烷基)烷基；
R5为烷基；
R6为烷氧基羰基；和
R7为环烷基。
在本公开的另一个实施方案中，提供选自以下的化合物
Figure S2006800251234D00071
Figure S2006800251234D00081
在本公开的另一个实施方案中，提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，所述组合物还包含干扰素和利巴韦林。
在本公开的另一个实施方案中，提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、第二个具有抗-HCV活性的化合物和药学上可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，所述第二个具有抗-HCV活性的化合物是干扰素。在另一个实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、重组复合(consensus)干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ(tau)。
在本公开的另一个实施方案中，提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、第二个具有抗-HCV活性的化合物和药学上可接受的载体的组合物。其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、促进1型T辅助细胞反应进展的化合物、干扰RNA、抗-反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
在本公开的另一个实施方案中，提供抑制HCV丝氨酸蛋白酶功能的方法，所述方法包括使HCV丝氨酸蛋白酶与式(I)化合物或其药学上可接受的盐接触。
在本公开的另一个实施方案中，提供在患者中治疗HCV感染的方法，所述方法包括给予患者有效治疗量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
在本公开的另一个实施方案中，提供在患者中治疗HCV感染的方法，所述方法包括给予患者有效治疗量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和在给予式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予第二个具有抗-HCV活性的化合物。在另一个实施方案中，所述第二个具有抗-HCV活性的化合物是干扰素。在另一个实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、重组复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
在本公开的另一个实施方案中，提供在患者中治疗HCV感染的方法，所述方法包括给予患者有效治疗量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和在给予式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予第二个具有抗-HCV活性的化合物，其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、促进1型T辅助细胞反应进展的化合物、干扰RNA、抗-反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
除非在本文另有特别指明，以下所列术语将具有如下定义。
如在本文所使用的，除非在上下文另外清除地指明，单数形式“一”、  “一个”和“该”包括所提到的复数。
如在本文所使用的，术语“烯基”指含至少一个碳-碳双键的2-6个碳原子的直链或支链基团。
如在本文所使用的，术语“烷氧基”指通过氧原子连接至母体分子部分的烷基。
如在本文所使用的，术语“烷氧基烷基”指由一个、二个或三个烷氧基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“烷氧基羰基”指通过羰基连接至母体分子部分的烷氧基。
如在本文所使用的，术语“烷氧基羰基烷基”指被一个、二个或三个烷氧基羰基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“烷基”指衍生自含1-10个碳原子的直链或支链饱和的烃的基团。
如在本文所使用的，术语“烷基羰基”指通过羰基连接至母体分子部分的烷基。
如在本文所使用的，术语“烷基磺酰基”指通过磺酰基连接至母体分子部分的烷基。
如在本文所使用的，术语“芳基”指苯基或其中一个或两个环是苯基的双环稠合环系统。双环稠合环系统由稠合至4-6元的芳族环或非芳族碳环的苯基组成。本公开的芳基可通过基团中任何可取代的碳原子连接至母体分子部分。芳基的代表性实例包括，但不限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本公开的芳基可被一个、二个、三个、四个或五个取代基任选取代，所述取代基独立选自烷氧基、烷氧基羰基、烷基、第二个芳基、氰基、卤代、卤代烷氧基、卤代烷基、杂环基、杂环基烷基、羟基、羟基烷基、硝基、-NRxRy、(NRxRy)烷氧基、(NRxRy)烷基、(NRxRy)羰基和氧代；其中所述第二个芳基、杂环基和杂环基烷基的杂环基部分还可被一个、二个、三个、四个或五个独立选自烷氧基、烷基、氰基、卤代、卤代烷氧基、卤代烷基、羟基和硝基的取代基任选取代。
如在本文所使用的，术语“芳基烷基”指被一个、二个或三个芳基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“羰基”指-C(O)-。
如在本文所使用的，术语“羧基”指-CO2H。
如在本文所使用的，术语“羧基烷基”指被一个、二个或三个羧基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“氰基”指-CN。
如在本文所使用的，术语“氰基烷基”指被一个、二个或三个氰基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“环烷基”指具有3-14个碳原子和0个杂原子的饱和的单环、双环或三环烃环系统。环烷基的代表性实例包括，但不限于环丙基、环戊基、双环[3.1.1]庚基和金刚烷基。本公开的环烷基可被一个、二个、三个或四个独立选自烯基、烷氧基、烷基、卤代、卤代烷氧基和卤代烷基的取代基任选取代。
如在本文所使用的，术语“(环烷基)烷基”指被一个、二个或三个环烷基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“卤代”和“卤素”指F、Cl、Br和I。
如在本文所使用的，术语“卤代烷氧基”指通过氧原子连接至母体分子部分的卤代烷基。
如在本文所使用的，术语“卤代烷基”指被一个、二个、三个或四个卤原子取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“杂环基”指含一个、二个或三个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5-、6-或7-元环。5-元环具有0-2个双键和6-元和7-元环具有0-3个双键。术语“杂环基”也包括其中杂环基环稠合至4-元-6-元芳族环或非芳族碳环或另一个单环杂环基的双环基团。本公开的杂环基可通过基团中的碳原子或氮原子连接至母体分子部分。杂环基的实例包括，但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异唑基、吗啉基、唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代吗啉基。本公开的杂环基可被一个、二个、三个、四个或五个取代基任选取代，所述取代基独立选自烷氧基、烷氧基羰基、烷基、芳基、氰基、卤代、卤代烷氧基、卤代烷基、第二个杂环基、杂环基烷基、羟基、羟基烷基、硝基、-NRxRy、(NRxRy)烷氧基、(NRxRy)烷基、(NRxRy)羰基和氧代；其中的芳基、第二个杂环基和杂环基烷基的杂环基部分还可被一个、二个、三个、四个或五个独立选自烷氧基、烷基、氰基、卤代、卤代烷氧基、卤代烷基、羟基和硝基的取代基任选取代。
如在本文所使用的，术语“杂环基烷基”指被一个、二个或三个杂环基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“羟基”指-OH。
如在本文所使用的，术语“羟基烷基”指被一个、二个或三个羟基取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“-NRaRb”指通过氮原子连接母体分子部分的两个基团Ra和Rb。Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基。
如在本文所使用的，术语“(NRaRb)烷基”指被一个、二个或三个-NRaRb基团取代的烷基。
如在本文所使用的，术语“(NRaRb)羰基”指通过羰基连接母体分子部分的-NRaRb基团。
如在本文所使用的，术语“(NRaRb)磺酰基”指通过磺酰基连接母体分子部分的-NRaRb基团。
如在本文所使用的，术语“-NRcRd”指通过氮原子连接母体分子部分的两个基团Rc和Rd。Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环。
如在本文所使用的，术语“-NRxRy”指通过氮原子连接母体分子部分的两个基团Rx和Ry。Rx和Ry独立选自氢和烷基。
如在本文所使用的，术语“(NRxRy)烷氧基”指通过氧原子连接母体分子部分的(NRxRy)烷基。
如在本文所使用的，术语“(NRxRy)烷基”指被一个、二个或三个-NRxRy基团取代的烷基。
如在本文所使用的，术语(NRxRy)羰基”指通过羰基连接母体分子部分的-NRxRy基团。
如在本文所使用的，术语“硝基”指-NO2。
如在本文所使用的，术语“氧代”指＝O。
如在本文所使用的，术语“磺酰基”指-SO2-。
本公开化合物可作为药学上可接受的盐存在。如在本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”表示本公开化合物的盐或两性离子形式，其为水或油可溶性的或可分散的，即在合理的医学判断范围内，适宜用于与患者的组织接触而没有过度的毒性、刺激性和变态反应，或与合理的利益/风险比相称的其它问题或并发症，并且有效用于它们预期的应用。可在化合物的最终分离和纯化期间制备所述盐，或分别通过使适宜的氮原子与适宜的酸反应制备所述盐。典型的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡萄糖酸盐(digluconate)、丙三醇磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、三甲苯基磺酸盐、甲烷磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对-甲苯磺酸盐和十一酸盐。可用于形成药学上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及有机酸诸如草酸、顺丁烯二酸、丁二酸和柠檬酸。
可在化合物的最终分离和纯化期间通过使羧基与适宜的碱诸如氢氧化物、金属阳离子的碳酸盐或碳酸氢盐反应，或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备碱加成盐。药学上可接受的盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝，以及无毒的季胺阳离子诸如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、三丁基胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯乙基胺和N，N′-二苄基乙二胺。用于形成碱加成盐的其它的代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
如在本文所使用的，术语“抗-HCV活性”意指化合物有效抑制选自以下的目标的功能：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV装配、HCV外出、HCV NS5A蛋白质和IMPD，以用于治疗HCV感染。
术语“本公开的化合物”和相同意义的表达，指包括式(I)化合物及其药学上可接受的对映异构体、非对映异构体、盐和溶剂化物，如水合物。同样地，当谈到中间体时，在上下文允许时，指包括它们的盐和溶剂化物。
术语“患者”同时包括人和其它的哺乳动物。
术语“药用组合物”意指包含本公开化合物并混合至少一个额外的药用载体的组合物，所述载体即为佐剂、赋形剂或溶媒，诸如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动性调节剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，依据给药模式和剂型的性质不同而异。例如，可使用列于Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed.Mack PublishingCompany，Easton，PA(1999)中的成分。
本文使用的词组“药学上可接受的”指那些在合理的医学判断范围内的、适宜用于与患者的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应，或与合理的风险/利益比相称的其它问题或并发症的那些化合物、原料、组合物和/或剂型。
术语“有效治疗量”意指足以显示有意义的患者利益(如，病毒载量持续降低)的每个活性成分的总量。当用单一活性成分单独给予个体时，则术语仅指该成分。当联合应用时，该术语指引起治疗效应的各活性成分(不论是合并、连续或同时给药)的合计量。
术语“治疗”指：(i)预防可能易患但尚未被诊断为已患所述疾病、紊乱和/或病症的患者中所出现的疾病、紊乱或病症；(ii)抑制疾病、紊乱或病症，即阻止其发展；和/或(iii)缓解疾病、紊乱或病症，即使疾病、紊乱和/或病症减退。
谈及氨基酸或氨基酸衍生物时，术语“残基”意指衍生自相应的α-氨基酸的、通过消除羧基的羟基和α-氨基酸基团的一个氢的基团。例如，术语Gln、Ala、Gly、Ile、Arg、Asp、Phe、Ser、Leu、Cys、Asn、Sar和Tyr分别表示L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、肌氨酸和L-酪氨酸的“残基”。
谈及氨基酸或氨基酸残基时，术语“侧链”意指连接至α-氨基酸的α-碳原子的基团。例如，甘氨酸的R-基团侧链是氢，丙氨酸的是甲基，缬氨酸的是异丙基。α-氨基酸的具体的R-基团或侧链参考A.L.Lehninger关于Biochemistry的教科书(见第4章)。
但用于命名本公开化合物时，如在本文所使用的指示P1’、P1、P2、P2*、P3和P4，画在图中蛋白酶抑制剂的氨基酸残基结合于相对于天然肽裂解底物结合点相关的位置上。裂解发生在天然底物P1和P1’之间，此处非主要位置指明氨基酸从肽天然裂解位点的C-末端末开始扩展到N-末端；反之，主要位置从裂解位点指示的N-末端起始并扩展到C-末端。例如，P1’指远离裂解位点的C-末端末右手端的最初位置(即N-末端的最初位置)；而P1从C-末端裂解位点的左手侧开始编号，P2：从C-末端第二个位置开始编号，等)。(见Berger A.&Schechter I.Transactions of the Royal Society London series(1970)，B257，249-264]。
下列图显示本公开化合物结构的命名。
Figure S2006800251234D00161
本公开化合物中存在不对称中心。例如，所述化合物可包括下式的P1环丙基成分
其中C1和C2各自表示在环丙基环的1和2位置上的不对称碳原子。在化合物的其它的部分不抗拒其它可能的不对称中心，此两个不对称中心的存在意指化合物可作为非对映异构体的外消旋混合物存在，诸如如下所示的其中R2或者在酰胺的同侧或者在羰基的同侧构成的非对映异构体。
Figure S2006800251234D00171
应该理解，本公开包括所有具有抑制HCV蛋白酶能力的立体化学异构形式或其混合物。从商业上可获得的含手性中心的起始原料合成，或通过制备对映异构体产物的混合物，随后分离诸如转化为非对映异构体的混合物，再经分离或再结晶、层析技术技术或在手性层析柱上直接分离对映异构体，可合成制备化合物的单个立体异构体。具体立体化学起始化合物或者是商业上可获得的或可通过本领域已知的技术制备和拆分。
某些本公开化合物也可以不同的稳定性的、可分离的构象形式存在。扭力不对称由于不对称单键的限制的旋转(例如由于空间位阻或环应变(ring strain)可允许不同的构象异构体分离。本公开包括这些化合物的各构象异构体及其混合物。
某些本公开化合物也可以两性离子形式存在并且本公开包括这些化合物的每个两性离子形式及其混合物。
当可能用于治疗时，可给予有效治疗量的作为原料化学品的式(I)化合物及其药学上可接受的盐，可能作为药用组合物的活性成分存在。因此，本公开还提供包含有效治疗量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物。式(I)化合物及其药学上可接受的盐如上描述。从与制剂的其它成分相容的意义上说，载体、稀释剂或赋形剂必须是可接受的并且对其接受者没有害处。依据本公开的另一个方面，还提供包括将式(I)化合物或其药学上可接受的盐与一个或更多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合而制备药用制剂的方法。
药用制剂可以每单位剂量含预定量的活性成分的单位剂型呈现。在预防和治疗HCV介导的疾病单一疗法中，本公开化合物的剂量水平在每天每公斤体重约0.01和约250毫克(“mg/kg”)之间，优选典型地在约0.05和约100mg/kg体重之间。典型地，将每天给予本公开药用组合物约1至约5次，或者持续输注。这样的给药可用于慢性或急性治疗。可与载体物质联合生产单一剂型的活性成分的量，将根据被治疗的病症、病症的严重程度、所使用化合物给药次数、给药途径、排泄速率、疗程和患者的年龄、性别、体重和病症的不同而异。优选的单位剂型是那些含本文以上陈述的或其适当的部分的活性成分的每天剂量或亚剂量(sub-dose)的剂型。一般，以基本小于化合物的最佳剂量的小剂量开始治疗。之后，以小的增量增加剂量直到在这种情况下达到最佳效应。一般地，最需要以通常提供抗病毒有效的结果而不产生任何有害的或有毒的副作用的浓度水平给予所述化合物。
当本公开组合物包含本公开化合物和一种或多种额外的治疗剂或预防剂的联合时，通常化合物和额外的药物均以单一治疗方案中正常给药剂量的约10至150％之间和更优选约10和80％之间的剂量水平呈现。
可适于以任何适当的途径给予药用制剂，例如通过口服(包括口颊或舌下含服)、直肠、经鼻、局部(包括口颊、舌下或透皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、皮内、肌肉内、关节内、滑膜腔内、胸骨内、椎管内、病灶内(intralesional)、静脉内或皮内注射或输注)途径。可通过制药领域已知的任何方法，例如通过将活性成分与载体或赋形剂混合制备这样的制剂。
适于口服给药的药用制剂可以不连续的单位呈现，所述制剂有诸如胶囊剂或片剂；粉剂或颗粒剂；在水或非水液体中的溶液剂或悬浮剂；可食用的泡沫剂或whips；或水包油液体乳剂或油包水乳剂。
例如，对于口服给药的片剂或胶囊剂形式，可将活性药物成分与口服、无毒性的药学上可接受的惰性载体诸如乙醇、丙三醇、水等混合。通过将化合物粉碎至适宜的细度并与同样粉碎的药用载体诸如可食用的碳水化合物，例如，淀粉或甘露醇混合，制备粉剂。也可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
通过如上描述的制备粉剂混合物并将其填充至成形的明胶壳囊中，制备胶囊剂。在填充操作前，可将助流剂和润滑剂诸如胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加至粉末混合物中。也可加入崩解剂或增溶剂诸如琼脂-琼脂、碳酸钙或碳酸钠以改善胶囊剂摄入后的药物利用度。
而且，当想要或需要时，也可将适宜的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。适宜的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶或藻酸钠、羧基甲基纤维素、聚乙二醇等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括，但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。例如，通过制备粉末混合物，造粒或造小块(slugging)，添加润滑剂和崩解剂并且压制成片剂，配制片剂。通过将适当粉碎的化合物与稀释剂或如上描述的基质混合，并且任选与粘合剂诸如羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮、溶液阻滞剂诸如石蜡、再吸收加速剂诸如季铵盐和/或吸收剂诸如膨润土、高岭土或磷酸氢钙混合，制备粉末混合物。可通过用粘合剂诸如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚粘液(acadia mucilage)或纤维质或聚合物原料的溶液湿润粉末混合物，并且挤压通过筛网造粒。作为造粒的另一种选择，可将粉末混合物通过压片机，结果不完美地形成粉碎成颗粒的小块。可采用添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或植物油的方法使颗粒润滑以防片剂粘附在成形冲模上。然后将润滑的混合物压制成片剂。也可将本公开化合物与自由流动的惰性载体混合，并无需进行造粒或造小块步骤，直接压制成片剂。可提供由虫胶的密封层组成的透明或不透明的保护层、糖或聚合原料的包衣和蜡抛光包衣。可将染料加至这些包衣中以区别不同的单位剂量。
可制备为剂量单位形式的口服液体剂诸如溶液剂、糖浆剂和酏剂，这样，所给的量含预定量的化合物。通过将化合物溶解于适宜的经过矫味处理的水溶液中，可制备糖浆剂，而通过使用无毒性的溶媒，可制备酏剂。也可加入增溶剂和乳化剂诸如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚，防腐剂、矫味添加剂诸如薄荷油或天然甜味剂或糖精或其它的人造甜味剂等。
适当时，口服给药的剂量单位制剂可以是微囊化的。如通过包衣或将微粒原料包埋进聚合物、蜡等中，也可制备成延长或持续释放的制剂。
也可以脂质体传递系统诸如小单层脂质体(vesicles)、小单层脂质体和多层脂质体的形式，给予式(I)化合物及其药学上可接受的盐。从多种磷脂诸如胆固醇、十八烷基胺或磷脂酰胆碱可形成脂质体。
也可通过使用与化合物分子偶联的单克隆抗体作为单个的载体传递式(I)化合物及其药学上可接受的盐。化合物也可与作为的可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或被palitoyl残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，化合物可偶联至一类生物可降解的聚合物，用于实现药物的控制释放，例如，聚乳酸、聚ε-己内酯(polepsilon caprolactone)、聚羟基丁(butyric)酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或两亲的嵌段共聚物。
适于透皮给药的药用制剂可呈现为分散的贴片剂，其意欲以延长的时间保持与接受者的表皮的密切接触。例如，可将活性成分从贴片通过在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中通常描述的离子电渗疗法传递。
可将适于局部给药的药用制剂配制成软膏、乳膏、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
为了治疗盐眼或其它的外部组织，例如口和皮肤，优选应用局部用软膏或乳膏的制剂。在软膏配制中，可将活性成分与或者石蜡或者水-可混溶的软膏基质一起使用。或者，可用水包油乳膏基质或油包水基质将活性成分配制在乳膏中。
适于局部给予眼睛的药用制剂包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮于适宜的载体尤其是水溶剂中。
适于局部给予口腔的药用制剂包括糖锭、锭剂和洗口液。
适于直肠给药的药用制剂可以呈现为栓剂或灌肠剂。
适于经鼻给药的药用制剂，其中的载体是固体，包括用鼻吸入的方法给药的、具有粒子大小例如在范围20-500微米的一种粉末，即通过从紧靠近鼻子的装有粉末的容器通过鼻通道快速吸入。适宜作为鼻喷雾剂或滴鼻剂给药的、其中载体是液体的制剂，包括活性成分的水或油溶液。
适于通过吸入给药的药用制剂包括可通过不同类型有刻度的、剂量压缩的气雾剂、喷雾器或吹药器产生的细粒子粉末或薄雾。
适于阴道给药的药用制剂可呈现为子宫套、阴道塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
适于胃肠外给药的药用制剂包括水和非水灭菌注射溶液，其可含抗-氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与计划中的接受者血液等渗的soutes；以及可包括悬浮剂和增稠剂的水和非水灭菌混悬液。制剂可以单位-剂量或多个-剂量容器例如密封的安培和小瓶存在，并可储存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前临时添加灭菌液体载体，例如用于注射的水。临配型(Extemporaneous)注射溶液剂和混悬剂可由灭菌粉末、颗粒和片制备。
应该理解，除了以上具体提到的成分外，所述制剂可包括具有与提及的制剂类型有关的、本领域的其它常规试剂，例如那些适宜于口服给药的制剂可含矫味剂。
可与本公开化合物一起给予的某些示例性HCV抑制剂化合物包括那些在下列出版物中公开的那些化合物：于2002年1月17日公布的WO 02/04425A2、2003年1月30日公布的WO 03/007945A1、2003年2月6日公布的WO 03/010141A2、2003年2月6日公布的WO03/010142A2、2003年2月6日公布的WO 03/010143A1、2003年1月3日公布的WO 03/000254A1、2001年5月10日公布的WO01/32153A2、2000年2月10日公布的WO 00/06529、2000年4月6日公布的WO 00/18231、2000年3月2日公布的WO 00/10573、2000年3月16日公布的WO 00/13708、2001年11月15日公布的WO01/85172A1、2003年5月8日公布的WO 03/037893A1、2003年5月8日公布的WO 03/037894A1、2003年5月8日公布的WO03/037895A1、2002年12月9日公布的WO 02/100851A2、2002年12月19日公布的WO 02/100846A1、2002年11月13日公布的EP1256628A2、1999年1月14日公布的WO 99/01582、2002年2月24日公布的WO 00/09543。
下表1列出了一些可与本公开化合物一起给予的示例性化合物的实例。在联合疗法中，本公开化合物可与其它的抗-HCV活性化合物或者合在一起或者分开或者通过将各化合物混合在组合物中一起给予。
表1
商品名 抑制剂或靶标的类型 来源公司
Omega IFN IFN-ω BioMedicines Inc.Emeryville，CA
BILN-2061 丝氨酸蛋白酶抑制剂 Boehringer IngelheimPharma KG，Ingelheim，Germany
Summetrel 抗病毒剂 Endo PharmaceuticalsHoldings Inc.Chadds Ford，PA
罗荛愫 重组干扰素IFN-α2a F.Hoffmann-La RocheLTD，Basel，Switzerland
Pegasys 聚乙二醇化IFN-α2a F.Hoffmann-La RocheLTD，Basel，Switzerland
Pegasys和利巴韦林 聚乙二醇化IFN-α2a/利巴韦林 F.Hoffmann-La RocheLTD，Basel，Switzerland
CellCept HCV IgG免疫抑制剂 F.Hoffmann-La RocheLTD，Basel，Switzerland
Wellferon 类淋巴母细胞IFN-onl GlaxoSmithKline plc，Uxbridge，UK
Albuferon-α 白蛋白IFN-α2b Human Genome SciencesInc.Rockville，MD
Levovirin 利巴韦林 ICN Pharmaceuticals，CostaMesa，CA
IDN-6556 半胱天冬酶(caspase)抑制剂 Idun Pharmaceuticals Inc.San Diego，CA
IP-501 抗纤维变性剂 Indevus PharmaceuticalsInc.Lexington，MA
干扰素γ-1b INF-γ InterMune Inc.Brisbane，CA
干复津A IFN alfacon-l(复合干 InterMune Pharmaceuticals
 商品名  抑制剂或靶标的类型  来源公司
 扰素)  Inc.Brisbane，CA
ISIS14803 反义(antisense)  ISIS Pharmaceuticals Inc，Carlsbad，CA/ElanPhamaceuticals Inc.NewYork，NY
JTK-003 RdRp抑制剂  Japan Tobacco Inc.Tokyo，Japan
 Pegasys和二盐酸组胺  聚乙二醇化IFN-α2a/免疫调节剂  Maxim Pharmacermicals Inc.San Diego，CA
二盐酸组胺 免疫调节剂  Maxim Pharmaceuticals Inc.San Diego，CA
Civacir HCV IgG免疫抑制剂  Nabi BiopharmaceuticalsInc.Boca Raton，FL
Intron A和Zadaxin IFN-α2b/α1-胸腺素  Re geneRxBiopharmiceuticals Inc.Bethesda，MD/SciClone PharmaceuticalsInc，San Mateo，CA
Levovirin IMPDH抑制剂  Ribapharm Inc.Costa Mesa，CA
Viramidine IMPDH抑制剂  Ribapharm Inc.Costa Mesa，CA
Heptazyme 核酶(ribozyme)  Ribozyme PharmaceuticalsInc.Boulder，CO
Intron A IFN-α2b  Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ
PEG-Intron 聚乙二醇化IFN-α2b  Schering-PloughCorooration，Kenilworth，NJ
Rebetron IFN-α2b/利巴韦林  Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ
 商品名 抑制剂或靶标的类型 来源公司
利巴韦林 利巴韦林 Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ
 PEG-Intron/利巴韦林 聚乙二醇化IFN-α2b/利巴韦林 Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ
Zadazim 免疫调节剂 SciClone PharmaceuticalsInc.San Mateo，CA
 Rebif IFN-β1a Serono，Geneva，Switzerland
 IFN-β和EMZ701 IFN-β和EMZ701 Transition治疗s Inc.Ontario，Canada
T67 β-微管蛋白抑制剂 Tularik Inc.South SanFrancisco，CA
VX-497 IMPDH抑制剂 Vertex Pharmaceuticals Inc.Cambridge，MA
VX-950/LY-570310 丝氨酸蛋白酶抑制剂 Vertex Pharmaceuticals Inc.Cambridge，MA/Eli Lilly和Co.Inc.Indianapolis，IN
 Omniferon 天然IFN-α Viragen Inc.Plantation，FL
XTL-002 单克隆抗体 XTL BiopharmaceuticalsLtd.Rehovot，Isreal
本公开化合物也可用作实验室试剂。化合物可有助于提供研究设计病毒复制分析、验证动物检验系统和结构生物学研究的工具，以更加深了解HCV疾病的机制。再有，本公开化合物用于例如，通过竞争性抑制确立或测定其它的抗病毒化合物的结合位点。
本公开化合物也可用于治疗或预防材料的病毒污染，并且因此降低实验室或与这些材料接触的医务人员或患者的病毒感染的风险，所述材料有例如血液、组织、手术器械和外表面、实验室器械和外表面以及血液收集或输血仪器和材料。
本公开意欲包括通过合成方法制备或通过包括那些发生在人或动物体(体内)或在体外加工的代谢方法制备的具有式(I)的化合物。
在本申请中所用的缩写，特别包括在以下的说明性流程和实施例中的缩写，为本领域技术人员熟悉。一些缩写应用如下：CDI表示1，1’-羰基二咪唑；THF表示四氢呋喃；DBU表示1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；TFA表示三氟乙酸；HATU表示O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲磷酸盐；PyBOP表示六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基；MeI表示甲基碘；Boc或BOC表示叔-丁氧基羰基；OtBu表示叔-丁氧基；TBME表示叔-丁基甲醚；Et3N表示三乙胺；DMSO表示二甲基亚砜；OAc表示乙酸盐；DPPA表示二苯基磷酰基叠氮化物；Me表示甲基；TBAF表示四丁基氟化铵；DMAP表示4-N，N-二甲基氨基吡啶；tBuLi表示叔-丁基锂；LiHMDS表示六甲基二硅基胺基锂；Tle表示叔-丁基亮氨酸，也称为叔-丁基甘氨酸；4-BiphMgBr表示4-联苯基溴化镁；DCM表示二氯甲烷；MeO表示甲氧基；EDAC或EDC表示1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸；和HOBt表示1-羟基苯并三唑。
用于合成本公开化合物的起始原料为本领域技术人员已知并且可易于制备或是商业上可获得的。
接下来在以下所列的方法，是为了说明的目的而提供的，并不打算限制权利要求的本公开的范围。应该承认，制备这样的化合物可为必须用常规保护基团保护其中的官能团，然后去除保护基团以提供本公开化合物。关于依据本公开的使用保护基团的细节为本领域技术人员所知。
例如，依据如在流程I中说明的通用方法，可合成本公开化合物(其中CPG是羧基保护基团和APG是氨基保护基团)。
流程I
简言之，可通过熟知的肽偶联技术连接P1`、P1、P2、P3和P4。P1`、P1、P2、P3和P4基团可以任何顺序连接在一起，只要最终的化合物与本公开的肽相符。例如，P3可连接至P2-P1；或P1连接至P3-P2。
一般地，使用描述的方法，通过使N-末端残基的α-氨基去保护和通过肽联接使下一个合适的N-保护氨基酸的未保护羧基偶联，使肽延长。重复此去保护和偶联过程直至得到所需的序列。如在流程I所图示的，可采用组成氨基酸逐步实施该偶联。
可采用标准的偶联方法，进行两个氨基酸、氨基酸和肽或两个肽片段之间的偶联，所述方法包括诸如叠氮化物法、混合的碳酸-羧酸酸酐(氯甲酸异丁酯)法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或水-可溶性碳二亚胺)法、活性酯(对-硝基苯基酯、N-羟基丁二酸亚氨基酯)法、伍德沃德试剂K-法、羰基二咪唑法、磷试剂法或氧化-还原法。这些方法中的某些方法(特别是碳二亚胺法)可通过加入1-羟基苯并三唑或4-DMAP增强。可在溶液(液相)中或固相进行这些偶联反应。
更明确地，偶联步骤包括在偶联剂的存在下，一个反应物的游离羧基与其它反应剂的游离氨基的脱水性偶联形成偶联的酰胺键。这样的偶联剂的描述可在有关肽化学的普通教科书，例如，M.Bodanszky，“Peptide Chemistry”，2nd rev ed.Springer-Verlag，Berlin，Germany，(1993)中找到。适宜的偶联剂的实例为在N，N’-二环己基碳二亚胺或N-乙基-N’-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺存在下的N，N’-二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑。实用和有益的偶联剂是商业上可获得的六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)，其或者单独或者在1-羟基苯并三唑或4-DMAP的存在下起作用。另一个实用和有益的偶联剂是商业上可获得的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐。再一个实用和有益的偶联剂是商业上可获得的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐。
偶联反应在惰性溶剂，如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺中进行。加入过量的叔胺，如二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷或4-DMAP以维持反应混合物于约8的pH。反应温度通常在0℃和50℃之间和反应时间通常在15分钟和24小时之间。
在偶联反应期间一般必须保护组成氨基酸的官能团，以避免形成不想要的键。可用的保护基团列于，例如，Greene，“Protective Groupsin Organic Chemistry”，John Wiley & Sons，New York和“The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”，Vol.3，Academic Press，New York(1981)中。
必须保护偶联至成长肽链的每个氨基酸的α-氨基(APG)。可使用本领域已知的任何保护基团。这样的基团实例包括：1)酰基诸如甲酰基、三氟乙酰基、酞酰基和p-甲苯磺酰基；2)芳族的氨基甲酸酯基团诸如苄氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄氧基羰基和9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基团诸如叔-丁氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基和烯丙氧基羰基；4)环烷基氨基甲酸酯基团诸如环戊基氧基羰基和金刚烷基氧基羰基；5)烷基诸如三苯基甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基诸如三甲基甲硅烷基；和7)含硫醇的基团诸如苯基硫代羰基(phenylthiocarbonyl)和二硫代琥珀酰(dithiasuccinoyl)。
在一个实施方案中，α-氨基保护基团或者是Boc或者是Fmoc。用于肽合成的适宜保护的许多氨基酸衍生物为商业上可获得的。
在偶联下一个氨基酸之前，使新加入的氨基酸残基的α-氨基保护基团裂解。当使用Boc基团时，选择的方法是纯净的三氟乙酸或是在二氯甲烷中的三氟乙酸，或在二氧六环或在乙酸乙酯中的HCl。然后将得到的铵盐，或者在偶联之前或者在原位用碱性溶液诸如缓冲水溶液，或于二氯甲烷或乙腈或二甲基甲酰胺中的叔胺中和。当使用Fmoc基团时，选择的试剂是二甲基甲酰胺中的哌啶或取代的哌啶，但是可使用任何仲胺。去保护在0℃和通常20-22℃的室温(rt或RT)之间的温度下进行。
在使用任何以上描述的基团制备肽期间，必须保护任何具有侧链官能团的氨基酸。本领域技术人员将会理解，选择和使用保护这些侧链官能团的适当的保护基团，这取决于氨基酸和肽中其它的保护基团的存在。选择这样的保护基团是重要的，即在α-氨基的去保护和偶联期间不必去除所述基团。
例如，当使用Boc作为α-氨基保护基团时，以下的侧链保护基团是适宜的：对-甲苯磺酰基(tosyl)部分可用于保护氨基酸诸如Lys和Arg的氨基侧链；乙酰氨基甲基、苄基(Bn)或叔-丁基磺酰基部分可用于保护半胱氨酸的含硫化物的侧链；苄基(Bn)醚可用于保护丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的含羟基的侧链；和苄基酯可用于保护天冬氨酸和谷氨酸的含羧基的侧链。
当选择Fmoc用于α-胺保护时，通常以叔-丁基为基础的保护基团是可接受的。例如，Boc可用于保护赖氨酸和精氨酸、叔-丁基醚用于保护丝氨酸、苏氨酸和羟基脯氨酸和叔-丁基酯用于保护天冬氨酸和谷氨酸。三苯基甲基(Trityl)部分可用于保护半胱氨酸的含硫化物的侧链。
一旦完成肽的延长，则去除所有的保护基团。这些方法为本领域技术人员所熟知。
再有，在制备本公开化合物中可遵循以下指导。例如，为了形成R6为烷基羰基或烷基磺酰基的化合物，将保护的P3或全肽或肽片段分别偶联至适当的酰氯或磺酰氯上，所述酰氯或磺酰氯或者为商业上可获得的或者通过本领域熟知的方法合成。
在制备R6为烷氧基羰基的化合物中，将保护的P3或全肽或肽片段偶联至适当的氯甲酸酯上，后者或者为商业上可获得的或者通过本领域熟知的方法合成。对于Boc-衍生物，使用(Boc)2O。
例如：
Figure S2006800251234D00301
用碳酰氯处理环戊醇，得到相应的氯甲酸酯。
在碱诸如三乙胺的存在下，用想要的NH2-三肽处理氯甲酸酯得到氨基甲酸环戊酯。
在制备R6为(NRaRb)羰基的化合物中，如在Syn.Lett.Feb 1995；(2)；142-144中描述的用碳酰氯，随后用胺处理处理保护的P3或全肽或肽片段，或使保护的P3或全肽或肽片段与商业上可获得的异氰酸酯和适宜的碱诸如三乙胺反应。
在制备R6为(NRaRb)磺酰基的化合物中，如在WO 98/32748中描述的用或者新鲜制备的或者商业上可获得的氨磺酰氯、随后用胺处理保护的P3或全肽或肽片段。
C-末端残基的α-羧基通常作为可被裂解以形成羧酸的酯(CPG)被保护。可使用的保护基团包括：1)烷基酯诸如甲基、三甲基甲硅烷基乙基和叔-丁基，2)芳基烷基酯诸如苄基和取代的苄基或3)可被温和的碱处理或温和的还原手段诸如三氯乙基酯和苯甲酰甲基酯裂解的酯。
将得到的α-羧酸(由温和的酸、温和的碱处理或温和的还原手段裂解获得)，在肽偶联剂诸如CDI的存在下，与R7SO2NH2(经R7SO2Cl在氨饱和的四氢呋喃溶液中处理制备)偶联，或在碱诸如4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)和/或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的存在下与EDAC偶联，以结合于P1’部分，有效地装配三肽P1’-P1-P2-P3-APG。典型地，在该过程中，使用1-5个当量的P1’偶联剂。
此外，如果通过以上描述的方法去除P3保护基团APG并用P4部分置换，和得自裂解(得自由温和的酸、温和的碱处理或温和的还原手段裂解)的所得到的α-羧酸，在肽偶联剂诸如CDI的存在下，与R7SO2NH2(由在氨饱和的四氢呋喃溶液的R7SO2Cl处理或者由本文描述方法制备)偶联，或在碱诸如4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)和/或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的存在下与EDAC偶联，以结合于P1’部分，制备三肽P1’-P1-P2-P3-P4。典型地，在该过程中，使用1-5个当量的P1’偶联剂。
流程II还显示其中由三肽羧酸与P1`磺酰胺偶联构成式(I)化合物的通用方法。所述偶联反应需要使用在溶剂诸如THF中的偶联试剂诸如羰基二咪唑，处理羧酸(1)，可加热至回流，随后，在碱诸如DBU存在下，在溶剂诸如THF或二氯甲烷中，加入形成的(1)的衍生物至P1`磺酰胺中。
流程II
Figure S2006800251234D00311
Figure S2006800251234D00321
构成式(I)化合物的备选的方法示于流程III中。采用示于流程I的方法使P1`磺酰胺单元偶联至P1单元。然后得到的P1-P1`部分可在其氨基末端去保护。在此通用的实施例中，使用Boc保护基团，但本领域技术人员将会认识到，一些适宜的氨基保护基团可用于该方法中。可使用酸诸如三氟乙酸在溶剂诸如二氯乙烷中去除Boc保护基团，提供去保护的胺如TFA盐。如流程III中所示，TFA胺盐可直接用在后续的偶联反应中，或作为选择，可将TFA胺盐首先转变成HCl胺盐，并将该HCl胺盐用于所述偶联反应。可使用偶联试剂，诸如HATU，在溶剂诸如二氯甲烷中，实现HCl胺盐(3)与羧基末端P4-P3-P2中间体的偶联，提供式(I)化合物(4)。
流程III
Figure S2006800251234D00322
Figure S2006800251234D00323
构成式(I)化合物的备选方法示于流程IV中。在此用偶联剂诸如PyBOP，在碱诸如二异丙胺的存在下和在溶剂诸如二氯甲烷中，使P1-P1`末端胺(1)的盐酸盐偶联至P2单元的游离羧基上。可将得到的P2-P1-P1`中间体以两步法转化为式(I)化合物，其中第一步是用酸诸如TFA在溶剂诸如二氯甲烷中使P2胺末端去保护。可在碱诸如二异丙胺的存在下，使用标准的偶联剂诸如PyBOP和使用溶剂诸如二氯甲烷，将得到的三氟乙酸盐与P4-P3单元的羧基末端偶联，提供式(I)化合物(4)。
流程IV
方法
Figure S2006800251234D00331
Figure S2006800251234D00332
如前描述的，用示于通用流程V中的进一步描述的该方法，可构成用于以上流程中的P4-P3-P2中间体。在此，可将P4-P3中间体(1)的游离羧基末端偶联至P2单元的氨基末端，以提供P4-P3-P2二肽(2)。通过使酯基团皂化，可使P4-P3-P2中间体的羧基末端去保护，得到作为游离羧酸(3)的P4-P3-P2。采用本文描述的方法可将中间体样(3)转化为式(I)化合物。
流程V
方法
Figure S2006800251234D00341
Figure S2006800251234D00342
如本文描述的式(I)化合物也可转化为其它的式(I)化合物。这样的方法实例示于流程VI中，其中在P4位具有Boc基团的式(I)化合物(1)转化为在P4位具有脲基的式(I)化合物(3)。(1)至(3)的转化可用两步法进行，首先，通过在溶剂诸如二氯甲烷中，用酸诸如TFA处理(1)使(1)转化为胺(2)。可在1个当量的碱的存在下，用异氰酸酯诸如异氰酸叔-丁基酯处理所得到的胺TFA盐，提供其中P3部分被脲封端的式(I)化合物(3)。如之前指出的，本领域技术人员将会认识到，中间体(2)可用作起始原料用于制备其中P3基团被酰胺或磺酰胺或硫脲或磺酰胺封端的式(I)化合物。可采用形成所述P4官能团的标准条件，由胺构成所述式(I)化合物。
流程VI
方法
Figure S2006800251234D00343
Figure S2006800251234D00344
在构成式(I)化合物中，采用以上概述和以下将更详细描述的通用方法将P1`末端结合到分子中。在某些实施例中，P1`单元是环烷基-或烷基-磺酰胺，其为商业上可获得的或可从相应的烷基-或环烷基-磺酰基氯，通过用氨处理所述磺酰氯制备。或者，采用流程VII中概述的通用方法，可合成这些磺酰胺。在此，例如通过用叔-丁基胺处理，使市售可获得的3-氯代-丙基磺酰氯(1)转化为适宜的保护磺酰胺。然后通过用2当量的碱诸如丁基锂，在溶剂诸如THF中，将得到的磺酰胺(2)转化为相应的环烷基磺酰胺。通过用酸处理，可使得到的环烷基磺酰胺去保护，以提供想要的未保护的环烷基磺酰胺。
流程VII
Figure S2006800251234D00351
也可采用以上所述方法的修正法，将取代的环烷基磺酰胺结合到式(I)化合物中。例如，可用2个当量的碱诸如丁基锂处理流程VIII中的中间体2，并可用亲电子试剂诸如甲基碘处理所得到的反应混合物，以提供取代的环烷基磺酰胺(3)。可使该中间体(3)在N-末端去保护，所得到的化合物(4)用作制备式(I)化合物中的中间体。
流程VIII
Figure S2006800251234D00352
在生成式(I)化合物中使用的P1`中间体在某些情况下衍生自磺酰胺衍生物。在这样的情况下，可通过几种合成途径，例如通过在流程IX中概述的通路获得磺酰胺中间体。
流程IX
Figure S2006800251234D00361
可按下法在原位制备氨磺酰氯(2)。向于维持在低温诸如-20℃的溶剂诸如THF中的氯磺酰异氰酸酯1(如1当量)中加入水(如1当量)，并且将得到的溶液使之温热至0℃。向该溶液中加入碱，诸如无水三乙胺(如1当量)，随后加入胺(如1当量)。然后使该反应混合物温热至室温，过滤并浓缩滤液得到想要的磺酰胺(3)。
依照在流程X中阐释的合成路径，可将磺酰胺结合到式(I)化合物中。在那里，用活性剂诸如CDI处理羧酸P1单元(1)。在分开的烧瓶中，将强碱加至以上描述的磺酰胺溶液中并且搅拌所得到的反应混合物数小时，之后，将反应混合物加至含活化的羧酸的烧瓶中，以提供酰基磺酰胺衍生物(2)。如本文描述的中间体样2可转化为式(I)化合物。
流程X
Figure S2006800251234D00362
应该注意的是，如在流程XI中阐释的，也可从三肽羧酸经一步制备酰基磺酰胺衍生物。
流程XI
在生成式(I)化合物中使用的P1单元在某些情况下是商业上可获得的，但可使用对本领域技术人员已知的方法和以本文描述的非限制的含义另外合成，随后使用本文描述的方法结合到式(I)化合物中。可按照流程XII中概述的通用方法合成取代的P1环丙基氨基酸。
在碱产物的存在下，用1，4-二卤代丁烯(2)处理商业上可获得的或易于合成的亚胺(1)，提供产物亚胺(3)。然后使(3)经酸解，提供具有与羧基同侧的烯丙基取代基的(4)作为主要产物。可使用Boc基团保护(4)的胺部分，以提供完全保护的氨基酸(5)。该中间体是可经酶法拆分的外消旋物，其中(5)的酯部分经蛋白酶裂解以提供相应的羧酸。不受限于任何特别的理论，相信该反应是选择性的，其中对映异构体之一以比其镜像经历更高速率的反应，提供对中间体外消旋物的动力学拆分。在本文所引用的实例的实施方案中，整合进式(I)化合物的立体异构体是具有(1R，2S)立体化学的(5a)。在酶的存在下，该对映异构体不经历酯裂解并由此从反应混合物收获对映异构体(5a)。然而，其它的对映异构体，具有(1S，2R)立体化学的(5b)经历酯裂解，即水解，以提供游离酸(6)。至该反应完成时，用常规方法例如，水提取方法或层析，可将酯(5a)从酸产物(6)中分离。提取含水
流程XII
Figure S2006800251234D00381
制备P2中间体和式(I)化合物的非限制性方法在以下的流程中显示。应该注意的是，在许多情况下，仅对中间体的一个位置的反应进行描述。然而，应该理解，这样的反应可用于赋予对该中间体中其它的位置进行修饰。而且，在具体实例中给定的所述中间体、反应条件和方法广泛应用于具有其它取代模式的化合物中。例如，按照阐述的合成路径，可合成在流程XIII中的式(I)化合物中发现的P2单元。此处，用有机金属剂诸如Grignard试剂(或者选择烷基或芳基锂物质或者选择烷基或芳基锌物质)处理商业上可获得的N-Boc-4-氧代-L-脯氨酸，以提供其中脯氨酸的C4位置上具有R3取代基和游离叔羟基的中间体(2)。然后可将中间体(2)偶联至所示的P1-P1`片段和将得到的中间体(3)转化为所示的式(I)化合物。
流程XIII
Figure S2006800251234D00391
如在流程XIII中描述的合成式(I)化合物的备选途径示于流程XIV中。经由Grignard加成至后期的中间体(5)，产生脯氨酸基团的C4位置的官能化，以提供式(I)化合物。从商业上可获得的中间体(1)开始，经由4-步骤程序，可用到中间体(5)，第一步包括使(1)偶联至本领域确定的P1-P1`中间体偶联试剂。对中间体(2)的N-Boc基团进行酸-催化的去保护，提供游离胺中间体(3)，其随后与P3-P4片段偶联以提供中间体(4)。可使用氧化试剂诸如Dess-Martin试剂，使中间体(4)中C4氢基经选择性氧化，以提供中间体(5)。
流程XIV
可从相应的R4是羟基的式(I)化合物合成R4是氢的式(I)化合物。备选地，可从任何用于制备R4是羟基的式(I)化合物的中间体合成R是氢的式(I)化合物。例如可如流程XV中所示，制备合成R4是氢的式(I)化合物。可从相应的羟基类似物(1)制备所述化合物(3)。从类似(1)的化合物形成类似(3)的化合物的方法需要使脯氨酸C4羟基还原或脱氧化。有相当多的本领域确定的技术用于醇类的还原和/或脱氧化，并且特别是叔醇可提供从类似(1)的化合物形成类似(3)的化合物。例如在如下参考文献中已有报告使醇直接还原为相应的链烷(流程XV的方法1)：J. Org.Chem.2001，66，7741。在所述文献中，描述了醇还原为链烷，其中用氯代二苯基硅烷和于溶剂诸如二氯乙烷中的催化量的三氯化铟处理所述醇类，以提供相应的链烷。所述反应可在室温中进行，但在某些情况下可需要加热。从R4是羟基的式(I)化合物形成R4是氢的式(I)化合物的备选方法在流程XV中的过程2显示。在那里，类似(1)的化合物首先转化为活化的醇(2)和这些中间体还原为相应的链烷(例如使用Barton脱氧化方法)。备选地，例如使用还原剂那样，可使示于2中的活化的醇还原为相应的链烷。流程XV中这些用于使1转化为3的方法为本领域技术人员所熟知。
流程XV
方法1：使醇直接还原为链烷
Figure S2006800251234D00411
应该注意的是，将有机金属试剂加至脯氨酸衍生物1的酮部分(流程XVI)在本领域是非常确定的。例如，Hruby和合作者(J.Org.Chem.2001，66，3593)已经描述加入溴化苯基镁至通式结构1的中间体中(流程XVI)。这些结果提供证据，证明在用叔-丁基酯基团作为C2羧基部分的保护基团时，得到想要的1，2加成产物(流程XVI的2)的最佳得率。另外，该工作提供了清楚的的证据，即X-线结晶学的形成是由于该加成反应的立体化学结果。特别地，作为前述的Grignard加成至酮1的结果，得到其中C4羟基和C2羧基呈现关于5元环的顺位相对取向(a syn relative orientation)的单一产物。在流程XVI的结构1的上下文中，从此结构确定，在R3M加至酮1的端面(face)选择性推测为α。即，有机金属选择性地加至1的羰基的潜手性面(re-face)底面(bottomface)，以提供相应的具有立体化学显示的叔醇(2)。
流程XVI
Figure S2006800251234D00421
Hruby的上述工作描述加入特殊的Grignard试剂至1的衍生物(流程XVI)。然而，加入多种Grignard试剂至脯氨酸1是在本公开中的示例。描述将有机金属剂包括Grignard试剂加成至酮的文献的主要部分是重要的并且在本领域的一般概述中作了总结，诸如：
Comprehensive Organic Functional Group Transformations.Volume 2：Synthesis：Carbon with one heteroatom attached by a single bond.Editorin Chief Alan.R.Katritzky，et al.1995.Chapter 2.02，page 37。此类反应也在Comprehensive Organic Synthesis.Editor in Chief Barry M Trost，Volume 1：Additions to C-X pi-键s(part 1).1991中描述。
本领域近期的研究提供进一步使在对酮的加成反应中的Grignard试剂最优化的条件，并且这些著作在本公开中可能是有用的。例如Ishihara和合作者(Org.Lett.2005，Vol.7，No.4，573)最近描述形成和使用镁盐复合物(magnesium ate complexes)。镁盐复合物R3MgLi，衍生自Grignard试剂和烷基锂。如由Ishihara描述的，在对酮的反应中，这些复合物提供极好的1，2加成产物得率。在分开的研究中，Knochel和合作者(Angew.Chem Int.Ed.2006，45，497)已经描述联合使用可溶性镧系盐诸如LnCl3和有机金属镁试剂。这些镧系盐的存在导致改善对羰基化合物的1，2加成反应效率。这些在本文引用的著作和参考文献，确立关于在简单的加成至羰基化合物中优化Grignard反应技术状况并用作本公开重要的信息来源。
还应该注意的是，参与对酮的加成反应中的一系列有机金属试剂。包括在该著作主体的是试剂诸如芳基锂、烷基锂和杂芳基锂试剂，在以1，2方式加至羰基部分方面，它们是熟知的。例如，由Dondoni和合作者(J.Org.Chem.2005，70，9257)近期的研究中，用BuLi使苯并噻唑(benzothioazole)锂化并且将得到的C2-锂物质以1，2方式加至内酯。通过类似的锂化的苯并噻唑将期望以1，2方式加至流程XVI的酮1中，以提供2a类的中间体。
本领域技术人员应该认可，衍生自杂环诸如唑和噻唑以及咪唑的有机金属试剂也可以参与对酮1的1，2加成反应。文献中有相当的篇幅阐释用于这些杂环系统中的每一个的独特条件，并且该信息易于为本领域技术人员所利用。例如，在对酮的加成反应中，应用衍生自苯并唑或唑的有机金属试剂，需要使用锂镁盐。由Bayh和合作者近期的特殊研究在J.Org.Chem.2005，70，5190中描述。流程XVI的苯并唑与酮1的加成将提供获得2b样中间体的途径。
有重要的在先文献，涉及使用一系列宽范围的衍生自杂环的有机金属试剂与酮的加成。例如Behinda和合作者的著作(Tet.Lett.42，2001，647)描述锂化的苯并咪唑的形成和其与简单内酯的加成。类似地，在流程XVI的对酮的加成反应中使用该锂化的苯并咪唑将提供获得2c样中间体的途径。另外，由Kawasaki和合作者(Bioorganic和MedicinalChem.Lett.13，2003，87)的近期研究描述一系列锂化的杂芳族化合物的形成和它们的针对活化的酰胺的加成反应。类似于在流程XVI的对酮的加成反应中使用这些锂化的杂芳族中间体，将提供获得中间体2d-2k的途径。
在对酮1的加成1，2反应中使用衍生自联芳基或杂芳基-芳基系统的有机金属剂，也与本公开有关。将这类有机金属试剂加成至酮1中将提供获得21和2m样中间体的途径。应该注意的是，在本发明的例证中，为了后续的在流程XVI的对酮的加成反应中使用，合成联芳基或杂-芳基有机金属剂可能是必需的。本领域技术人员应该认识到描述制备该类型的有机金属剂及其前体的文献中有意义的主要部分。例如由Chinchilla和合作者近期的综述(Chem.Rev.2004，104，2667)描述了金属化的杂环的制备及其使用。制备联芳或杂芳基-芳基系统的基础化学常常应用Suzuki样偶联反应。由Gregory Fu发表的文献主要部分描述了这样的偶联反应的技术现状以及这些参考文献的次级文献(subset)如下：JACS 2004，126，1340；JACS，2002，124，13662；Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.11，1945；Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.20，3910；JACS 2002，122，4020；JACS 2001，123，10099；Org.Lett.2001，Vol.3，No.26，4295；Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，No.24，3387。除了该著作的主体外，本领域的重要的综述可易于获得，诸如Rossi在Synthesis 2004，No.15，2419中的文献。
实施例
本公开现在将结合某些优选的实施方案加以描述，所述实施方案并不意欲限制本公开的范围。相反，本公开涵盖所有的如可包括在权利要求书范围内的备选方案、修正和等价物。因而，以下的包括具体实施方案的实施例将阐明本发明优选的实践，应该理解，这些实施例是为了阐明某些实施方案的目的，并且呈现出来以提供相信是最有用的并使对方法和概念方面的描述易于理解。
除非另有指明，溶液百分率表示重量对体积的关系，而溶液比率表示体积对体积的关系。或者在Bruker 300、400或500MHz光谱仪上记录核磁共振(NMR)频谱；以每百万分之几报告化学位移(δ)。快速层析依据Still’的快速层析技术(J.Org.Chem.1978，43，2923)在硅胶(SiO2)上进行。
部分A：中间体的制备：
I.P1中间体的制备：
1.外消旋的(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的 制备：(2个方法中的)方法1
Figure S2006800251234D00451
步骤1：
Figure S2006800251234D00452
将甘氨酸乙酯盐酸盐(303.8g，2.16mol)悬浮于叔-丁基甲醚(1.6L)中。加入苯甲醛(231g，2.16mol)和无水硫酸钠(154.6g，1.09mol)且用冰-水浴将该混合物冷却至0℃。于室温下，经30分钟逐滴加入三乙胺(455mL，3.26mol)并搅拌混合物48小时。然后通过加入冰冷的水(1L)猝灭反应，并分离有机层。用叔-丁基甲醚(0.5L)提取水相并用饱和的NaHCO3(1L)水溶液和盐水(1L)的混合物洗涤合并的有机相。溶液经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到392.4g稠厚的黄色油样N-苄基亚胺产物，其可直接用于下一步骤。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.32(t，J＝7.1Hz，3H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，4.41(d，J＝1.1Hz，2H)，7.39-7.47(m，3H)，7.78-7.81(m，2H)，8.31(s，1H)。
步骤2：
向于无水甲苯(1.2L)中的叔-丁醇锂(84.06g，1.05mol)的悬浮液中，用60分钟逐滴加入甘氨酸乙酯(100.4g，0.526mol)的N-苄基亚胺和反式-1，4-二溴代-2-丁烯(107.0g，0.500mol)于无水甲苯(0.6L)中的混合物中。加入完成后，通过加入水(1L)和叔-丁基甲醚(TBME，1L)猝灭该深红色混合物。分离水相并用TBME(1L)第二次提取。合并有机相，加入1N HCl(1L)并于室温下搅拌该混合物2小时。分离有机相并用水(0.8L)提取。然后合并水相，用盐(700g)饱和，加入TBME(1L)和使该混合物冷却至0℃。然后逐滴加入10N NaOH使搅拌的混合物碱化至pH14，分离有机层并用TBME(2×500mL)提取水相。合并的有机提取物经干燥(MgSO4)，过滤并浓缩至1L的体积。向该游离胺的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(131.0g，0.6mol)并于室温下搅拌该混合物4天，将额外的二碳酸二叔丁基酯(50g，0.23mol)加入反应物中，使该混合物回流3小时，然后使之冷却至室温过夜。反应混合物经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到80g的粗原料。该残余物经快速层析(2.5kg的SiO2，用1％至2％甲醇/二氯甲烷洗脱)纯化，得到57g(53％)黄色油样外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，将其置于冰箱中固化：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.46(s，9H)，1.43-1.49(m，1H)，1.76-1.82(br m，1H)，2.14(q，J＝8.6Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，5.12(dd J＝10.3，1.7Hz，1H)，5.25(br s，1H)，5.29(dd，J＝17.6，1.7Hz，1H)，5.77(ddd，J＝17.6，10.3，8.9Hz，1H)；MS m/z 254.16(M-1)。
步骤3：
Figure S2006800251234D00471
将N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(9.39g，36.8mmol)溶解于4N HCl/二氧六环(90mL，360mmol)中并于室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物以提供(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐，定量得率(7g，100％)。1H NMR(甲醇-d4)δ1.32(t，J＝7.1，3H)，1.72(dd，J＝10.2，6.6Hz，1H)，1.81(dd，J＝8.3，6.6Hz，1H)，2.38(q，J＝8.3Hz，1H)，4.26-4.34(m，2H)，5.24(dd，10.3，1.3Hz，1H)5.40(d，J＝17.2，1H)，5.69-5.81(m，1H)。
制备外消旋的N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的 备选途径：(2个方法中的)方法2
Figure S2006800251234D00472
于-78℃，向叔-丁醇钾(11.55g，102.9mmol)于THF(450mL)的溶液中加入商业上可获得的于THF(112mL)中的甘氨酸乙酯(25.0g，93.53mmol)的N，N-二苄基亚胺。使反应混合物温热至0℃，搅拌40分钟，然后冷却回到-78℃。向该溶液中加入反式-1，4-二溴代-2-丁烯(20.0g，93.50mmol)，于0℃搅拌该混合物1小时并冷却回到-78℃。加入叔-丁醇钾(11.55g，102.9mmol)，使该混合物立即温热至0℃和再搅拌1小时，之后真空浓缩。使粗产物溶于乙醚(530mL)中，加入1Naq.HCl溶液(106mL，106mmol)，将得到的两相混合物于室温下搅拌3.5小时。各层分离并用乙醚(2x)洗涤水层并用饱和的aq.NaHCO3溶液碱化之。用乙醚(3x)提取想要的胺，并且用盐水洗涤合并的有机提取物，干燥(MgSO4)并真空浓缩以得到游离胺。用4 N HCl的二氧六环溶液(100mL，400mmol)处理该材料并浓缩，得到棕色半-固体样(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(5.3g，34％得率)，与得自方法A的物质相同，不同的是存在少量未鉴定的芳族杂质(8％)。
2.N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的拆 分
外消旋物：(1R，2S)和
(1S，2R)的1∶1混合物
拆分A
向维持于39℃和于300rpm搅拌的装在12升夹套反应器中的磷酸钠缓冲溶液(0.1M，4.25L，pH8)中，加入511克的碱性蛋白酶(Alcalase)2.4L(约425mL)(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度达到39℃时，通过加入50％NaOH水溶液将pH调节至8.0。然后用40分钟时间加入外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(85g)于850mL的DMSO中的溶液。然后使反应温度维持于40℃计24.5小时，在此期间，于1.5小时和19.5小时的时间点，用50％NaOH水溶液将混合物的pH调节至8.0。24.5小时后，经测定酯的对映体过量为97.2％并将反应冷却至室温(26℃)并搅拌过夜(16小时)，之后经测定酯的对映体过量为100％。然后用50％NaOH将反应混合物的pH调节至8.5，用MTBE(2×2L)提取得到的混合物。然后用5％NaHCO3(3×100mL)、水(3×100mL)洗涤合并的MTBE提取液，真空浓缩得到浅黄色固体样对映异构体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(42.55g；纯度：97％@210nm，不含酸；100％对映异构体过量(“ee”).
然后用50％H2SO4使得自提取过程的水层酸化值pH2并用MTBE(2×2L)提取。用水(3×100mL)洗涤MTBE提取液并浓缩，得到浅黄色固体样酸(42.74g；纯度：99％@210nm，不含酯)。
Figure S2006800251234D00491
酯 酸
高分辨质谱 (+)ESI，C13H22NO4，[M+H]+，计算值256.1549，实测值256.1542 (-)ESI，C11H16NO4，[M-H]-，计算值226.1079，实测值226.1089
NMR观测到的化学位移溶剂：CDCl3(质子δ7.24，C-13δ77.0)Bruker DRX-500C：质子500.032MHz，碳125.746MHz
位置 质子(模式)ppm C-13ppm 质子(模式)ppm C-13ppm
1 ---- 40.9 ---- 40.7
2 2.10(q，J＝9.0Hz) 34.1 2.17(q，J＝9.0Hz) 35.0
3a 1.76(br) 23.2 1.79(br) 23.4
3b 1.46(br) 1.51，(br)
 4  ----  170.8  ----  175.8
 5  5.74(ddd，J＝9.0，10.0，17.0Hz)  133.7  5.75(m)  133.4
 6a  5.25(d，J＝17.0Hz)  117.6  5.28(d，J＝17.0Hz)  118.1
 6b  5.08(dd，J＝10.0，1.5Hz)  5.12(d，J＝10.5Hz)
 7  ----  155.8  ----  156.2
 8  ----  80.0  ----  80.6
 9  1.43(s)  28.3  1.43(s)  28.3
 10  4.16(m)  61.3  ----  ----
 11  1.23(t，J＝7.5Hz)  14.2  ----  ----
拆分B
向于24孔板(容量：10mL/孔)的孔中的0.5mL 100mM Heps·Na缓冲液(pH8.5)中，加入0.1mL的洒维奈斯16.0L(来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的蛋白酶)(Novozymes North America Inc.)和外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)于0.1mL的DMSO中的溶液。密封板并于40℃、250rpm下孵育。18小时后，经如下测定酯的对映体过量为44.3％：去除0.1mL的反应混合物并用1mL乙醇均匀混合；离心后，取10微升(“μL”)的上清液用手性HPLC分析。向剩余的反应混合物中加入0.1mL的DMSO，并于40℃、250rpm下将板再孵育3天，之后将4mL乙醇加至孔中。离心后，取10μL的上清液用手性HPLC分析，经测定酯的对映体过量为100％。
拆分C
向于24孔板(容量：10mL/孔)的孔中的0.5mL 100mM Heps·Na缓冲液(pH8.5)中，加入0.1mL的内肽酶(Esperase)8.0L(来自嗜碱耐高温杆菌(Bacillus halodurans)的蛋白酶)(Novozymes North AmericaInc.)和外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)于0.1mL的DMSO中的溶液。密封板并于40℃、250rpm下孵育。18小时后，如下测定酯的对映体过量为39.6％：去除0.1mL的反应混合物并用1mL乙醇均匀混合；离心后，取10μL的上清液用手性HPLC分析。向剩余的反应混合物中加入0.1mL的DMSO，并于40℃、250rpm下将板再孵育3天，之后将4mL乙醇加至孔中。离心后，取10μL的上清液用手性HPLC分析，经测定酯的对映体过量为100％。
样品分析按照以下方法进行：
1)样品制备：将约0.5mL的反应混合物与10体积的乙醇均匀混合。离心后，将10μL的上清液注射至HPLC柱上样。
2)转化测定：
柱：YMC ODS A，4.6×50mm，S-5μm
溶剂：A，1mM HCl于水中；B，乙腈
梯度：30％B1分钟；30％-45％B超过0.5分钟；45％B1.5分钟；45％-30％B超过0.5分钟。
流速：2mL/min
UV检测：210nm
保留时间：酸，1.2分钟；酯，2.8分钟。
3)酯的对映体过量测定：
柱：CHIRACEL OD-RH，4.6×150mm，S-5μm
流动相：乙腈/50mM HClO4于水(67/33)中
流速：0.75mL/分钟。
UV检测：210nm.
保留时间：
(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸5.2分钟；
外消旋物(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯18.5分钟和20.0分钟；
(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯18.5分钟。
拆分D
在20L夹套反应器中，将5L的0.3M磷酸钠缓冲液(pH8)维持于38℃并于130rpm下搅拌。将4升的碱性蛋白酶(Alcalase)2.4L(Novozymes North America Inc.)和1升的DI水加至反应器中。当混合物的温度接近38℃时，用10N NaOH调节pH至7.8。在超过1小时的时期内，经由加液漏斗将外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(500克)于5升的DMSO的溶液加至反应器中。然后调节反应温度至48℃。21小时后，酯的对映体过量达到99.3％。于24小时时停止加热并使反应缓慢冷却降至室温(约25℃)并搅拌过夜。用10N NaOH调节反应混合物的pH至8.5，并用MTBE(2×4L)提取该混合物。用5％NaHCO3(3×400mL)和水(3×400mL)洗涤合并的MTBE提取液并浓缩，得到浅黄色结晶样对映异构体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(259g；纯度：96.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
拆分E
在20L夹套反应器中，将10L的0.1M磷酸钠缓冲液(pH8)维持于40℃并于360rpm下搅拌。将1.5L的碱性蛋白酶(Alcalase)2.4L(Novozymes North America Inc.)加至反应器中。当混合物的温度接近38℃时，用10N NaOH调节pH至8.0。在超过1小时的时期内，经由加液漏斗将外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)于2L的DMSO的溶液加至反应器中。然后调节反应温度至40℃。3小时后，用10N NaOH调节pH至8.0。21小时后，使反应冷却降至25℃。用10N NaOH调节反应混合物pH至8.5，且用MTBE(2×5L)提取反应混合物。用5％NaHCO3(3×500mL)和水(3×200mL)洗涤合并的MTBE提取液并浓缩，得到110g的黄色油。将油置于室温、低真空(house vacuum)下，得到无色长棒状结晶样对映异构体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(101g；纯度：97.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
用单晶分析(X-线NB#：52795-093，参数编码(refcode)：634592N1)对结晶结构对映异构体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯进行特性描述。由于缺乏已知的手性中心或较重的原子，未确定绝对构型。经由酰胺基与羰基氧原子之间的分子内氢键(N...O 3.159)，形成沿着结晶的a-轴的链结构。
N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：
Figure S2006800251234D00531
结晶数据：                      实验
化学式：C13H21N1O4              结晶
结晶系统：正交晶的              晶源：MTBE
空间基团：P212121               结晶描述：无色棒状
a＝5.2902(1)α＝90°          结晶大小(mm)：0.12X 0.26X 0.30
b＝13.8946(2)β＝90°         数据采集
c＝19.9768(3)γ＝90°         温度(K)：293
V＝1468.40(4)3                θmax(°)：65.2(Cu Kα)
Z＝4  dx＝1.155g cm-3           测量的反射数：7518
晶格参数反射数：6817            独立的反射数：2390(Rint＝0.0776)
晶格参数的θ范围(°)：2.2-65.2  观测到的反射数：(I≥2σ：2284
吸收系数(mm-1)：0.700           吸收校正数(Tmin-Tmax)：0.688-1.000
拆分F
在20L夹套反应器中，将5L的0.2M硼酸钠缓冲液(pH9)维持于45℃并于400rpm下搅拌。将3L的DI水和4L的EX型的洒维奈斯(Savinase)16L(Novozymes North America Inc.)加至反应器中。当混合物的温度接近45℃时，用10N NaOH调节pH至8.5。在超过40分钟的时期内，经由加液漏斗将外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)于2L的DMSO的溶液加至反应器中。然后调节反应温度至48℃。2小时后，用10N NaOH调节pH至9.0。18小时后，酯的对映体过量达到72％，并用10N NaOH调节pH至9.0。在24小时，温度降低至35℃。在42小时，温度升至48℃，并用10N NaOH调节pH至9.0。于48小时时，停止加热，使反应缓慢冷却降至室温(约25℃)并搅拌过夜。在66小时，反应混合物的pH为8.6。用MTBE(2×4L)提取混合物。用5％NaHCO3(6×300mL)和水(3×300mL)洗涤合并的MTBE提取液并浓缩，得到浅黄色结晶对映异构体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(101Ag；纯度：95.9％@210nm，不含酸；98.6％ee)。
3.手性(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
Figure S2006800251234D00541
于N2气氛下将N-BOC-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(8.5g，33.3mmol)与200mL的4N HCl/二氧六环(Aldrich)于室温下一起搅拌3小时。减压下去除溶剂并保持温度低于40℃。这样得到6.57g(～100％)浅棕褐色固体样(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，1.69-1.82(m，2H)，2.38(q，J＝8.8Hz，1H)，4.29(q，J＝7.0Hz，2H)，5.22(d，J＝10.3Hz，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.69-5.81(m，1H)。MS m/z 156(M++1)。
4.N-Boc-(1R.2S)-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯的制备
用乙酸钯(5mg，0.022mmol)处理N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸(255mg，1.0mmol)于乙醚(10mL)的溶液。将该橙色/红色溶液置于N2气氛下。在超过1小时的时间内，逐滴加入过量的重氮甲烷的乙醚溶液。于室温下搅拌得到的溶液18小时。用氮气流去除过量的重氮甲烷。将得到的溶液通过旋转蒸发浓缩得到粗产物。快速层析(10％乙酸乙酯/己烷)提供210mg(78％)无色油样N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯。MS m/e 270(M++1)。
5.1-叔-丁氧基羰基氨基-环丙烷-羧酸是商业上可获得的
Figure S2006800251234D00552
6.1-氨基环丁烷羧酸甲基酯盐酸盐的制备
Figure S2006800251234D00553
将1-氨基环丁烷羧酸(100mg，0.869mmol)(Tocris)溶解于10mL甲醇。鼓泡通入HCl气体2小时。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩，得到144mg的黄色油。用10mL乙醚研磨，提供100mg的白色固体样标题产物。1H NMR(CDCl3)δ2.10-2.25(m，1H)，2.28-2.42(m，1H)，2.64-2.82(m，4H)，3.87(s，3H)，9.21(br s，3H)。
7.外消旋的(1R，2R)/(1S，2S)-氨基-2-乙基环丙烷羧酸叔-丁基酯 的制备
Figure S2006800251234D00554
乙基在羧基的同侧
步骤1：下面所示的2-乙基环丙烷-1，1-二羧酸二-叔-丁基酯的制备
Figure S2006800251234D00561
向苄基三乙基氯化铵(21.0g，92.2mmol)于50％NaOH水溶液(92.4g于185mL H2O中)的悬浮液中加入1，2-二溴代丁烷(30.0g，138.9mmol)和丙二酸二-叔-丁酯(20.0，92.5mmol)。于室温下剧烈搅拌反应混合物18小时，然后加入冰和水的混合物。用二氯甲烷(3x)提取该粗产物并相继用水(3x)、盐水洗涤，合并有机提取液。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩。得到的残余物经快速层析(100gSiO2，3％乙醚于己烷中)得到直接用于下一步反应的标题产物(18.3g，67.8mmol，73％得率)。
步骤2：下面所示的外消旋的2-乙基环丙烷-1，1-二羧酸叔-丁基酯 的制备
Figure S2006800251234D00562
于0℃，将步骤1的产物(18.3g，67.8mmol)加至叔-丁醇钾(33.55g，299.0mmol)于无水乙醚(500mL)的悬浮液中，随后加入H2O(1.35mL，75.0mmol)，并于室温下剧烈搅拌过夜。将反应混合物倾入冰和水的混合物中并用乙醚(3x)洗涤。于0℃，水层用10％aq柠檬酸溶液酸化，用乙酸乙酯(3x)提取。合并的有机层用水(2x)、盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到淡黄色油样标题产物(10g，46.8mmol，69％得率)。
步骤3：下面所示的(1R，2R)/(1S，2S)2-乙基-1-(2-三甲基硅烷基乙 氧基羰基氨基)环丙烷-羧酸叔-丁基酯的制备
Figure S2006800251234D00571
向步骤2的产物(10g，46.8mmol)和3g的新鲜活化的4分子筛于无水苯(160mL)的悬浮液中，加入三乙胺(7.50mL，53.8mmol)和DPPA(11mL，10.21mmol)。使反应混合物回流3.5小时，然后加入2-三甲基甲硅烷基-乙醇(13.5mL，94.2mmol)并使反应混合物回流过夜。反应混合物经过滤，用乙醚稀释，用10％柠檬酸水溶液、水、饱和的NaHCO3水溶液、水(2x)、盐水(2X)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩。用10g的Aldriich聚异氰酸酯清除剂树脂使残余物悬浮于120mL的二氯甲烷中，于室温下搅拌过夜并过滤，得到淡黄色油样标题产物(8g，24.3mmol；52％)：1H NMR(CDCl3)δ0.03(s，9H)，0.97(m，5H)，1.20(br m，1H)，1.45(s，9H)，1.40-1.70(m，4H)，4.16(m，2H)，5.30(br s，1H)。
步骤4：下面所示的外消旋的(1R，2R)/(1S，2S)1-氨基-2-乙基环丙烷 羧酸叔-丁基酯的制备
Figure S2006800251234D00572
乙基在羧基的同侧
向步骤3的产物(3g，9mmol)中加入1.0M TBAF的THF(9.3mL，9.3mmol)溶液并将该混合物加热至回流1.5小时，冷却至室温，然后用500mL乙酸乙酯稀释。该溶液经相继用水(2×100mL)、盐水(2×100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，提供标题中间体。
II.P1’中间体的制备
1.环丙基磺酰胺的制备
(2个方法中的)方法1：
向冷却至0℃的100mL的THF溶液中鼓泡通入氨气直至达到饱和。向该溶液中加入5g(28.45mmol)的环丙基磺酰基氯(购自ArrayBiopharma)的50mL的THF溶液，将该溶液温热至室温过夜并再搅拌一天。浓缩该混合物直至剩余1-2mL的溶剂，将其施用于30g的SiO2塞上(用30％-60％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到3.45g(100％)白色固体样环丙基磺酰胺。1H NMR(甲醇-d4)δ0.94-1.07(m，4H)，2.52-2.60(m，1H)；13C NMR(甲醇-d4)δ5.92，33.01。
(2个方法中的)方法2：
步骤1：N-叔-丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00582
将叔-丁基胺(3.0mol，315.3mL)溶解于THF(2.5L)。将溶液冷却至-20℃。缓慢加入3-氯代丙烷磺酰基氯(1.5mol，182.4mL)。使反应混合物温热至室温并搅拌24小时。过滤该混合物且真空浓缩滤液。将残余物溶解于二氯甲烷(2.0L)。得到的溶液经用1N HCl(1.0L)、水(1.0L)、盐水(1.0L)洗涤和经Na2SO4干燥。过滤并真空浓缩，得到浅黄色固体，使其从己烷结晶得到白色固体样产物(316.0g，99％)。1HNMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，2.30-2.27(m，2H)，3.22(t，J＝7.35Hz，2H)，3.68(t，J＝6.2Hz，2H)，4.35(br，1H)。
步骤2：环丙烷磺酸叔-丁基酰胺的制备
于-78℃，向N-叔-丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(2.14g，10.0mmol)于THF(100mL)的溶液中加入正-丁基锂(2.5M于己烷中，8.0mL，20.0mmol)。用超过1小时的时间使反应混合物温热至室温。真空去除挥发物。使残余物在乙酸乙酯和水(200mL，200mL)之间分配。分离的有机相经用盐水洗涤，经Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。将残余物从己烷中再结晶，得到想要的白色固体样产物(1.0g，56％)。1H NMR(CDCl3)δ0.98-1.00(m，2H)，1.18-1.19(m，2H)，1.39(s，9H)，2.48-2.51(m，1H)，4.19(br，1H)。
步骤3：环丙基磺酰胺的制备
于室温下搅拌环丙烷磺酸叔-丁基酰胺(110.0g，0.62mol)的TFA(500mL)溶液16小时。真空去除挥发物。将残余物从乙酸乙酯/己烷(60mL/240mL)中再结晶，得到想要的白色固体样产物(68.5g，91％)。1HNMR(DMSO-d6)δ0.84-0.88(m，2H)，0.95-0.98(m，2H)，2.41-2.58(m，1H)，6.56(br，2H)。
2.C1-取代的环丙基磺酰胺的制备
2a.N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺的制备
步骤1：N-叔-丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00593
如上描述的制备。
步骤2：N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺的制备
将N-叔-丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(4.3g，20mmol)的溶液溶解于无水THF(100mL)中并冷却至-78℃。向该溶液中缓慢加入正-丁基锂(17.6mL，44mmol，2.5M于己烷中)。去除干冰浴并用超过1.5小时的时间使反应混合物温热至室温。然后使该混合物冷却至-78℃并加入正-丁基锂(20mmol，8mL，2.5M于己烷中)溶液。将反应混合物温热至室温，经2小时的时间再冷却至-78℃，加入净的甲基碘(5.68g，40mmol)溶液。使反应混合物温热至室温过夜，然后于室温下用饱和的NH4Cl(100mL)猝灭。用乙酸乙酯(100mL)提取之。有机相经用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到黄色油，其从己烷结晶，得到浅黄色固体产物(3.1g，81％)：1H NMR(CDCl3)δ0.79(m，2H)，1.36(s，9H)，1.52(m，2H)，1.62(s，3H)，4.10(br s，1H)。
步骤3：1-甲基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00601
将N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺(1.91g，10mmol)溶液溶解于TFA(30mL)并于室温下搅拌反应混合物16小时。真空去除溶剂，得到黄色油，其从乙酸乙酯/己烷(1∶4，40mL)中结晶，得到白色固体样实施例3，1-甲基环丙基磺酰胺(1.25g，96％)：1H NMR(CDCl3)δ0.84(m，2H)，1.41(m，2H)，1.58(s，3H)，4.65(br s，2H)。C4H9NO2S的元素分析，计算值：C，35.54；H，6.71；N，10.36。测定值：C，35.67；H，6.80；N，10.40。
2b.1-苄基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00602
步骤1：N-叔-丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00603
采用所描述的合成N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的方法，但是使用1.05当量的苄基溴，随后用10％乙酸乙酯的己烷溶液研磨，以60％得率得到该化合物：1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，2H)，1.36(m，2H)，1.43(s，9H)，3.25(s，2H)，4.62(br s，1H)，7.29-7.36(m，5H)。
步骤2：1-苄基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00611
采用所描述的合成1-甲基环丙基磺酰胺的方法，从N-叔-丁基(1-苄基)环丙基磺酰胺制备，随后从最小量的10％乙酸乙酯的己烷溶液中再结晶，以66％得率得到该化合物：1H NMR(CDCl3)δ0.90(m，2H)，1.42(m，2H)，3.25(s，2H)，4.05(s，2H)，7.29(m，3H)，7.34(m，2H)；13CNMR(CDCl3)δ11.1，36.8，41.9，127.4，128.8，129.9，136.5。
2c.1-丙基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00612
采用所描述的制备1-甲基环丙基磺酰胺的方法，但在该方法的第二个步骤中使用丙基卤化物替代甲基碘，制备该化合物。
2d.1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00613
步骤1：N-叔-丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00614
依据在合成N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺中所描述的方法，但用1.25当量的烯丙基溴作为亲电子试剂，以97％得率得到该化合物。该化合物无需纯化直接用于进入下一步反应：1H NMR(CDCl3)δ0.83(m，2H)，1.34(s，9H)，1.37(m，2H)，2.64(d，J＝7.3Hz，2H)，4.25(br s，1H)，5.07-5.10(m，2H)，6.70-6.85(m，1H)。
步骤2：1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00615
依据所描述的合成1-甲基环丙基磺酰胺的方法，从N-叔-丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺，以40％得率得到该化合物，1-烯丙基环丙基磺酰胺。该化合物经SiO2的柱层析纯化，使用2％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱液：1H NMR(CDCl3)δ0.88(m，2H)，1.37(m，2H)，2.66(d，J＝7.0Hz，2H)，4.80(s，2H)，5.16(m，2H)，5.82(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.2，35.6，40.7，119.0，133.6.
2e.1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00621
步骤1：N-叔-丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00622
采用所描述的合成N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的方法，但用1.30当量的环己酮，随后从从最小量的20％乙酸乙酯的己烷溶液中再结晶，以84％得率得到该化合物：1H NMR(CDCl3)δ1.05(m，4H)，1.26(m，2H)，1.37(s，9H)，1.57-1.59(m，6H)，1.97(m，2H)，2.87(br s，1H)，4.55(br s，1H)。
步骤2：1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺的制备
采用所描述的合成1-甲基环丙基磺酰胺的方法，从N-叔-丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺制备，随后从最小量的乙酸乙酯和己烷中再结晶，以85％得率得到该化合物，1-(1-环己烯基)-环丙基磺酰胺：1H NMR(DMSO-d6)δ0.82(m，2H)，1.28(m，2H)，1.51(m，2H)，1.55(m，2H)，2.01(s，2H)，2.16(s，2H)，5.89(s，1H)，6.46(s，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ11.6，21.5，22.3，25.0，27.2，46.9，131.6，132.2；LR-MS(ESI)：200(M+-1)。
2f.1-苯甲酰基环-丙基磺酰胺的制备
步骤1：N-叔-丁基-(1-苯甲酰基)环丙基-磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00631
采用所描述的合成N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的方法，但用1.2当量的苯甲酸甲酯作为亲电子试剂，以66％得率得到该化合物。用柱层析经SiO2以30％-100％二氯甲烷的己烷洗脱使化合物纯化：1HNMR(CDCl3)δ1.31(s，9H)，1.52(m，2H)，1.81(m，2H)，4.16(br s，1H)，7.46(m，2H)，7.57(m，1H)，8.05(d，J＝8.5Hz，2H)。
步骤2：1-苯甲酰基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00632
采用所描述的合成1-甲基环丙基磺酰胺的方法，从N-叔-丁基(1-苯甲酰基)环丙基磺酰胺制备，随后从最小量的乙酸乙酯的己烷溶液中再结晶，以87％得率得到该化合物：1H NMR(DMSO-d6)δ1.39(m，2H)，1.61(m，2H)，7.22(s，2H)，7.53(t，J＝7.6Hz，2H)，7.65(t，J＝7.6Hz，1H)，8.06(d，J＝8.2Hz，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ12.3，48.4，128.1，130.0，133.4，135.3，192.0。
2g.N-叔-丁基-(1-苯基氨基羧基)-环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00633
采用所描述的合成N-叔-丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的方法，用1当量的异氰酸苯基酯，随后从最小量的乙酸乙酯的己烷溶液中再结晶，以42％得率得到该化合物：1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，1.67-1.71(m，4H)，4.30(br s，1H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(t，J＝7.5Hz，2H)，7.53(t，J＝7.5Hz，2H)。
3.C1-取代的环丙烷磺酰胺的制备使用N-Boc保护基团
3a.制备C1-取代的环丙基磺酰胺的关键中间体环丙基磺酰氨基 甲酸叔-丁酯的制备，
Figure S2006800251234D00641
步骤1：3-氯丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00642
将3-氯代丙烷磺酰氯(55g，310.7mmol)溶液溶解于THF(200mL)并在超过30分钟内逐滴加入冷却至0℃的NH4OH(200mL)的溶液。使该反应混合物温热至室温，搅拌1小时，用二氯甲烷(4×500mL)使水层分配多次。合并的二氯甲烷层经用1N HCl(150mL)、水(150mL)洗涤，经MgSO4干燥、过滤并真空浓缩。粗固体从最小量的二氯甲烷的己烷溶液中再结晶，得到白色固体样3-氯丙基磺酰胺(45.3g，93％)。1H NMR(CDCl3)δ2.34(m，2H)，3.32(t，J＝7.3Hz，2H)，3.70(t，J＝6.2Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ27.10，42.63，52.57。
步骤2：3-氯丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的制备
Figure S2006800251234D00643
用30分钟向冷却至0℃的3-氯丙基磺酰胺(30.2g，191.5mmol)、三乙胺(30.2mL，217.0mmol)和4-DMAP(2.40g，19.6mmol)于二氯甲烷(350mL)的溶液中，逐滴缓慢加入二碳酸二叔丁酯(47.2g，216.9mmol)的二氯甲烷(250mL)溶液。使该反应混合物温热至室温，再搅拌3小时，并用1N HCl(300mL)、水(300mL)、盐水(300mL)分配，经MgSO4干燥、过滤并真空浓缩得到粗产物。用70mL的5％二氯甲烷的己烷研磨该物质，得到灰白色固体样3-氯丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(47.2g，96％)：1H NMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，2.33(m，2H)，3.60(t，J＝7.3Hz，2H)，3.68(t，J＝6.21Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)δ 26.50，27.95，42.37，50.40，84.76，149.53。
步骤3：环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的制备
Figure S2006800251234D00651
于氩气氛下，将正-丁基锂(74.7mL，119.5mmol，1.6M于己烷中)溶液溶解于无水THF(105mL)并冷却至-78℃。经20-30分钟向该溶液中逐滴加入3-氯丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(14g，54.3mmol)的无水THF(105mL)的溶液。去除干冰浴并用2小时的时间使该反应混合物温热至室温。用冰乙酸(3.4mL)猝灭该反应混合物，真空浓缩并在二氯甲烷(100mL)和水(100mL)之间分配。有机相经用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并真空浓缩，得到蜡样灰-白色固体环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(12.08g，100％)：1H NMR(CDCl3)δ1.10(m，2H)，1.34(m，2H)，1.50(s，9H)，2.88(m，1H)，7.43(s，1H)。13C NMR(CDCl3)δ6.21，28.00，31.13，84.07，149.82。
3b.1-甲氧基-甲基环丙基-磺酰胺的制备
步骤1：1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的制备
Figure S2006800251234D00653
向冷却至-78℃的溶解于THF(30mL)的环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(1.0g，4.5mmol)溶液中，加入正-丁基锂(6.4mL，10.2mmol，1.6M于己烷中)并搅拌该反应混合物1小时。向该溶液中加入纯净的氯代甲基甲醚(0.40mL，5.24mmol)溶液并使该混合物缓慢温热至室温过夜。用1N HCl水溶液调节溶液pH至3，然后用乙酸乙酯(4×50mL分次)提取。合并的提取液经干燥(MgSO4)、过滤并浓缩，得到无需再纯化直接进入下一步反应使用的、蜡样固体的1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(1.20g，100％)：1H NMR(CDCl3)δ1.03(m，2H)，1.52(s，9H)，1.66(m，2H)，3.38(s，3H)，3.68(s，2H)，7.54(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.37，28.29，40.38，58.94，73.43，83.61，149.57。
步骤2：1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00661
将1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯(1.14g，4.30mmol)溶液溶解于50％TFA/二氯甲烷(30mL)溶液中并于室温下搅拌16小时。真空去除溶剂和残余物经80g的SiO2层析(用0％-60％乙酸乙酯/己烷洗脱)得到白色固体样1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺(0.55g，经两步总得率77％)：1H NMR(CDCl3)δ0.95(m，2H)，1.44(m，2H)，3.36(s，3H)，3.65(s，2H)，4.85(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.17，40.87，59.23，74.80；LRMS m/z 183(M++NH4)。
3c.1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00671
步骤1：1-环丙基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的制备
Figure S2006800251234D00672
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的方法，但用1.10当量的环丙基甲基溴作为亲电子试剂，以92％得率得到1-环丙基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯。该化合物无需纯化直接进入下一步反应使用：1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：的制备1-环丙基甲基-环丙基磺酰胺
Figure S2006800251234D00673
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的方法，从1-环丙基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯，以65％得率得到该化合物。该化合物经SiO2用0％-60％乙酸乙酯的己烷作为洗脱液用柱层析纯化：1HNMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193 (M++NH4)。
3d.1-丙基氨甲酰基环丙烷-磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00674
步骤1：1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔-丁酯的制备
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的方法，但用1.10当量的正-丙基异氰酸酯作为亲电子试剂，以100％的粗得率得到该化合物。该化合物无需纯化直接进入下一步反应使用：1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：1-丙基氨甲酰基环丙烷-磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00681
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的方法，从1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔-丁酯，以50％的最佳得率得到该化合物。不同的是不使用层析，原料从最小量的二氯甲烷/己烷再结晶：1H NMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
3e.1-(3，5-二甲基异唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00682
步骤1：1-(3，5-二甲基异唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲 酸叔-丁酯的制备
Figure S2006800251234D00683
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰氨基甲酸叔-丁酯的方法，但用1.20当量的3，5-二甲基异唑-4-异氰酸酯作为亲电子试剂，以100％的粗得率得到该化合物。该化合物无需纯化直接进入下一步反应使用：
步骤2：1-(3，5-二甲基异唑-4yl)氨甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00691
依据所描述的合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的方法，从1.62g(4.52mmol)的1-(3，5-二甲基异唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺氨基甲酸叔-丁酯，使用30mL(120mmol)的4N HCl/二氧六环，搅拌过夜，浓缩并用层析经Biotage 40M柱(用0％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱)，以50％得率得到该化合物(580mg)：1H NMR(甲醇-d4)δ1.57(m，2H)，1.61(m 2H)，2.15(s，3H)，2.30(s，3H)，4.84(s，3H)；13C NMR(甲醇-d4)δ9.65，10.94，15.01，46.11，114.82，159.45，165.55，168.15；LRMS m/z 260(M++H)。
4.从环烷基溴制备环烷基磺酰胺
4a.从环丁基溴制备环丁基磺酰胺
Figure S2006800251234D00692
向冷却至-78℃的、5.0g(37.0mmol)的环丁基溴于30mL的无水乙醚(乙醚)溶液中，加入44mL(74.8mmol)的1.7M叔-丁基锂的戊烷，并用超过1.5小时的时间使该溶液缓慢温热至-35℃。用导管缓慢加入冷却至-40℃的、新鲜蒸馏的5.0g(37.0mmol)磺酰氯于100mL的己烷溶液至该混合物中。用超过1小时的时间温热至0℃和小心真空浓缩。将该混合物再溶解于乙醚，用一些冰冷的水洗涤一次，干燥(MgSO4)、过滤和小心浓缩。将该混合物再溶解于20mL的THF，逐滴加入至500mL的饱和NH3的THF中，并使之搅拌过夜。真空浓缩该混合物至粗黄色固体，并从最小量的二氯甲烷的己烷加上1-2滴甲醇再结晶，得到1.90g(38％)的白色固体样环丁基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.95-2.06(m，2H)，2.30-2.54(m，4H)，3.86(p，J＝8Hz，1H)，4.75(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ16.43，23.93，56.29。HRMS m/z(M-H)-，C4H8NSO2：计算值134.0276，实测值134.0282。
4b.环己基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00701
将18.5mL(37.0mmol)的2M氯化环己基镁的醚溶液，逐滴加入至冷却至-78℃的、新鲜蒸馏的3.0mL(37.0mmol)磺酰氯(得自Aldrich)于100mL的己烷溶液中。用超过1小时的时间使该混合物温热至0℃，然后小心真空浓缩。将该混合物再溶解于乙醚(200mL)中，用一些冰冷的水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO4)、过滤并小心浓缩。将该混合物再溶解于35mL的THF，逐滴加入至500mL的于THF饱和的NH3中，并使之搅拌过夜。真空浓缩该混合物至粗黄色固体，残余物经过50g的硅胶用70％乙酸乙酯-己烷作为洗脱液过滤，然后浓缩溶液。使残余物从最小量的二氯甲烷的己烷加上1-2滴甲醇再结晶，得到2.49g(41％)的白色固体样环己基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ1.58-1.72(m，2H)，1.74-1.88(m，2H)，1.94-2.14(m，4H)，3.48-3.59(m，1H)，4.80(br s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.90，28.33，63.54；MS m/e148(M-H)-。
4c.环己基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00702
将18.5mL(37.0mmol)的2M氯化环己基镁(TCI Americas)的乙醚溶液，逐滴加入至冷却至-78℃的、新鲜蒸馏的3.0mL(37.0mmol)磺酰氯于100mL的己烷溶液中。用超过1小时的时间使该混合物温热至0℃，然后小心真空浓缩。将该混合物再溶解于乙醚(200mL)中，用一些冰冷的水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO4)、过滤并小心浓缩。将该混合物再溶解于35mL的THF，逐滴加入至500mL的于THF饱和的NH3中，并使之搅拌过夜。真空浓缩该混合物至粗黄色固体，残余物经过50g的硅胶用70％乙酸乙酯-己烷作为洗脱液过滤并浓缩。使残余物从最小量的二氯甲烷的己烷加上1-2滴甲醇再结晶，得到1.66g(30％)的白色固体样环己基-磺酰胺：1H NMR(CDCl3)δ1.11-1.37(m，3H)，1.43-1.56(m，2H)，1.67-1.76(m，1H)，1.86-1.96(m，2H)，2.18-2.28(m，2H)，2.91(tt，J＝12，3.5Hz，1H)，4.70(br s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.04，25.04，26.56，62.74；MS m/e 162(M-1)-。
4d.新戊基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00711
按照制备环己基磺酰胺的方法，将49mL(37mmol)的0.75M氯化新戊基镁(Alfa)的乙醚转化为1.52g(27％)的新戊基磺酰胺白色固体样。1H NMR(CDCl3)δ1.17(s，9H)，3.12(s，2H)，4.74(brs，2H)；13CNMR(CDCl3)δ29.46，31.51，67.38；MS m/e 150(M-1)-。
4e.环丁基甲基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00712
将12.3g(83mmol)的环丁基甲基溴(Aldrich)和13.7g(91mmol)碘化钠于150mL的丙酮溶液回流过夜，然后冷却至室温。滤掉无机固体，并分别于室温和150托、80℃下蒸馏掉丙酮和环丙甲基碘(8.41g，46％)。
将冷却至-78℃的4.0g(21.98mmol)的环丁基甲基碘于30mL的无水乙醚(乙醚)溶液，经导管通入17mL(21.98mmol)的1.3M仲-丁基锂于环己烷的溶液中，且搅拌该溶液5分钟。经导管向该混合物中加入冷却至-78℃的、新鲜蒸馏的3.0g(21.98mmol)磺酰氯于110mL的己烷溶液，用超过1小时的时间使该混合物温热至0℃，然后小心真空浓缩。将该混合物再溶解于乙醚中，用一些冰冷的水洗涤一次，干燥(MgSO4)、过滤和小心浓缩。将该混合物再溶解于35mL的THF，逐滴加入至500mL的于THF饱和的NH3中，并使之搅拌过夜。真空浓缩该混合物至粗黄色固体，和从最小量的二氯甲烷的己烷加上1-2滴甲醇再结晶，得到1.39g(42％)的白色固体样环丁基甲基磺酰胺。1HNMR(CDCl3)δ1.81-2.03(m，4H)，2.14-2.28(m，2H)，2.81-2.92(m，1H)，3.22(d，J＝7Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ19.10，28.21，30.64，60.93；MS m/e 148(M-1)-；818(M++H)。
4f.环丙基甲基磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00721
使用应用于制备环丁基甲基磺酰胺的方法，从环丙基甲基溴(Aldrich)(也见JACS 1981，p.442-445)制备环丙基甲基磺酰胺。1H NMR(CDCl3)δ0.39-0.44(m，2H)，0.67-0.76(m，2H)，1.13-1.27(m，1H)，3.03(d，J＝7.3Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.33，5.61，59.93；MS m/e 134(M-1)。
4g.2-噻吩磺酰胺的制备
Figure S2006800251234D00722
使用Justus Liebigs Ann.Chem.501，1933，p.174-182的方法从2-噻吩磺酰基氯(购自Aldrich)制备。
4h.4-溴代苯磺酰胺的制备
通过用于THF中饱和的氨水处理商业上可获得的4-溴代磺酰基氯，制备4-溴代苯基磺酰胺。
5.制备磺酰胺通用方法
Figure S2006800251234D00724
通过将水(1当量)于THF加至冷的(-20℃)、搅拌的氯代磺酰基异氰酸酯(1当量)于THF的溶液中，并使得到的溶液温热至0℃，制备中间体氨磺酰氯。向该溶液中加入无水三乙胺(1当量)，随后加入必需的仲胺(1当量)。使反应混合物温热至室温，然后过滤并浓缩滤液，得到想要的磺酰胺。
III.P1’-P1中间体的制备
1a.环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺盐酸盐 的制备
步骤1：1(R)-叔-丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸的制备
Figure S2006800251234D00732
向1(R)-叔-丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(3.28g，13.2mmol)于THF(7mL)和甲醇(7mL)的溶液中加入LiOH(1.27g，53.0mmol)于水(14mL)的悬浮液。于室温下搅拌该混合物过夜并用1N NaOH(15mL)和水(20mL)猝灭。用乙酸乙酯(20mL)洗涤得到的混合物，且用20mL 0.5N NaOH提取有机相。合并的水相经用1N HCl使酸化直至pH 4，并用乙酸乙酯(3×40mL)提取。合并有机提取物经用盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩，得到白色固体样标题化合物(2.62g，87％)。1H NMR：(DMSO-d6)δ1.22-1.26(m，1H)，1.37(s，9H)，1.50-1.52(m，1H)，2.05(q，J＝9Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，5.22(d，J＝17Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，7.18，7.53(s，NH(旋转异构体)，12.4(br s，1H)；MS m/z 228(M++H)。
步骤2：环丙烷磺酸(1-(R)-叔-丁氧基羰基氨基-2-(S)-乙烯基环丙 烷羰基)-酰胺的制备
于氮气氛下，将步骤1的产物(2.62g，11.5mmol)和CDI(2.43g，15.0mmol)于THF(40mL)的溶液于回流加热50分钟。使溶液冷却至室温并用导管转移入环丙基磺酰胺(1.82g，15.0mmol)于THF(10mL)的溶液中。向得到的溶液中加入DBU(2.40mL，16.1mmol)和持续搅拌20小时。用1N HCl猝灭该混合物至pH1并真空浓缩THF。用乙酸乙酯(2×50mL)提取该悬浮液，且合并的有机提取物经干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。通过从己烷-乙酸乙酯(1∶1)再结晶纯化得到白色固体样标题化合物(2.4g)。母液通过Biotage 40S柱(9％丙酮的二氯甲烷洗脱)纯化，得到第二批标题化合物(1.1g)。两批合并(总得率92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ0.96-1.10(m，4H)，1.22(dd，J＝5.5，9.5Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.70(t，J＝5.5Hz，1H)，2.19-2.24(m，1H)，2.90(m，1H)，5.08(d，J＝10Hz，1H)，5.23(d，J＝17Hz，1H)，5.45(m，1H)，6.85，7.22(s，NH(旋转异构体)；MS m/z 331(M++H)。
步骤3：的制备环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基) 酰胺盐酸盐
Figure S2006800251234D00741
将步骤2的产物(3.5g，10.6mmol)于二氯甲烷(35mL)和TFA(32mL)的溶液于室温下搅拌1.5小时。真空去除挥发物，并将残余物悬浮于1N HCl的乙醚(20mL)中并真空浓缩。重复该过程一次。用戊烷研磨得到的混合物并过滤，得到易吸湿的、灰-白色固体样标题化合物(2.60g，92％)。1H NMR：(DMSO-d6)δ1.01-1.15(m，4H)，1.69-1.73(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.38(q，J＝9Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，5.20(d，J＝11Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.52-5.59(m，1H)，9.17(br s，3H)；MS m/z 231(M++H)。
1b.P1-P1’磺酰胺衍生物的制备
Figure S2006800251234D00751
向(1R，2S)1-叔-丁氧基羰基氨基-2-乙烯基-环丙烷羧酸(217mg，1.194mmol)于THF(5mL)的溶液中加入CDI(290mg，1.791mmol)，并将该反应混合物于回流下加热45分钟。在另一个圆底烧瓶中，将LiHMDS(1.0M的己烷溶液，2.4mL，2.4mmol)加至N-乙基甲基磺酰胺(330mg，2.388mmol)于THF(5mL)的溶液中，并将反应混合物于室温下搅拌1小时。将两个反应混合物加在一起并于室温下搅拌2小时。加水以猝灭反应，用用乙酸乙酯提取该反应溶液。有机层分离并经MgSO4干燥。过滤和蒸发溶剂，得到粗产物，其经制备型HPLC纯化得到想要的N-Boc保护的N-酰基磺酰胺。然后，将化合物溶解于4NHCl于二氧六环(2mL)的溶液，并于室温下搅拌4小时，去除Boc保护基团。蒸发溶液得到棕色样油的盐酸盐。(112mg，33％得率)。1H NMR(400Mz，CD3OD)δ1.16(t，J＝7.21Hz，3H)，1.68(dd，J＝10.03，7.83Hz，1H)，2.15(m，1H)，2.37(m，1H)，2.89(s，3H)，3.30(m，2H)，5.31(d，J＝10.27Hz，1H)，5.42(d，J＝17.12Hz，3H)，5.68(m，1H)。MS m/z 270(M+Na+)。
部分B：本公开化合物的制备
实施例1：化合物1的制备
Figure S2006800251234D00752
化合物1
流程1
Figure S2006800251234D00761
化合物1
步骤1：
向(2S，4S)-Boc-4-苯基吡咯烷-2-羧酸(0.711g 2，44mmol)(购自Chem-Impex International，Inc.)、二异丙基乙胺(0.948g，7.33mmol)和环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺盐酸盐(0.561g，2.44mmol)于二氯甲烷(24mL)的混合物中，加入HATU(1.21g，3.18mmol)。搅拌该反应混合物14小时之后，用5％NaHCO3(50mL)水溶液和5％柠檬酸(50mL)水溶液洗涤。每个水层相继用2×25mL二氯甲烷提取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。得到的棕色粘性油经快速柱层析(SiO2，97∶3、二氯代甲烷∶甲醇)纯化，得到棕色起泡的固体(0.973g，79％得率)。1H NMR(CD3OD，500MHz)δ0.91(br s，1H)，1.03(d，J＝6.4Hz，1H)，1.16-1.23(m，1H)，1.31-1.38(m，1H)，1.44(dd，J＝9.6，5.6Hz，1H)，1.48(s，4H)，1.52(s，5H)，1.89(t，J＝6.4Hz)，2.09(q，J＝8.4Hz，0.4H)，2.19(q，J＝8.6Hz，0.6H)，2.85-2.90(m，0.4H)，2.92-2.97(m，0.6H)，3.44(t，J＝9.6Hz，1H)，3.65(p，J＝8.0Hz，1H)，3.93-4.01(m，1H)，4.29(dd，J＝10.1，6.7Hz，1H)，5.12(d，J＝10.1Hz，1H)，5.30(d，J＝18.0Hz，1H)，5.75-5.82(m，1H)，7.24(t，J＝6.9Hz，1H)，7.29-7.33(m，5H)；MS m/z 504(M+Na)。
步骤2：
向实施例1的步骤1的产物(0.900g，1.79mmol)于二氯甲烷(5mL)的溶液中，加入TFA(5mL)。于室温下搅拌30分钟之后，真空下简短地浓缩和干燥该反应混合物。得到的棕色粘性油经再溶解于二氯甲烷(10mL)中并将之逐滴加入1N HCl的乙醚(10mL)溶液中。通过真空过滤并用乙醚洗涤形成并得到白色固体沉淀(0720mg，91％得率)。MS m/z404(MH+)。
步骤3：
向实施例1的步骤2的产物(0.300g，0.682mmol)于二氯甲烷(7mL)的浆状液中，加入二异丙基乙胺(0.265g，2.05mmol)。使反应混合物变得均匀。向该混合物中加入Boc-L-Tle-OH(也称为叔-丁基甘氨酸)(0.189g，0.818mmol)和HATU(0.389g，1.02mmol)。于室温下搅拌6小时之后，如步骤1进行反应后处理，并经快速柱层析(SiO2，97∶3、二氯代甲烷∶甲醇)纯化，得到白色固体的化合物1(0.382g，91％得率)。1HNMR(CD3OD，500MHz)δ1.04(br s，3H)，1.06(s，9H)，1.21-1.25(m，2H)，1.40(dd，J＝9.5，5.5Hz，2H)，1.45(s，9H)，1.88(dd，J＝7.9，5.5Hz，1H)，2.21(q，J＝8.7Hz，1H)，2.27(t，J＝6.9Hz，2H)，2.91-2.96(m，1H)，3.70(p，J＝6.5Hz，1H)，4.04(dd，J＝10.1，6.7Hz，1H)，4.15(dd，J＝9.9，6.7Hz，1H)4.34(t，J＝7.2Hz，1H)，4.37(d，J＝9.5Hz，1H)，5.12(d，J＝10.4，1H)，5.29(d，J＝16.8Hz)，6.71(d，J＝9.15Hz，1H)，7.23(d，J＝4.6Hz，1H)，7.28-7.34(m，5H)；MS m/z 639(M+Na)。
实施例2：化合物2的制备
化合物2
Figure S2006800251234D00781
步骤1：
向(2S，4R)-Boc-γ-苄基-脯氨酸(0.516g 1.64mmol)、二异丙基乙胺(0.637g，4.92mmol)和环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺盐酸盐(0.788g，2.96mmol)于二氯甲烷(16mL)的混合物中加入HATU(0.935g，2.46mmol)。搅拌反应混合物14小时之后，反应物经用二氯甲烷(50mL)稀释并用1N HCl(10mL)洗涤。用2×25mL二氯甲烷提取水层。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。得到的棕色粘性油经快速柱层析(SiO2，95∶5、二氯代甲烷∶甲醇)纯化，得到黄色粘性油产物(0.651g，77％得率)。MS m/z 517(MH+)。
步骤2：
向实施例2的步骤1的产物(0.744g，1.43mmol)于1∶1二氯甲烷/二氯乙烷(4mL)溶液加入TFA(2mL)。于室温下搅拌15min之后，浓缩反应混合物。将得到的棕色粘性油再-溶解于二氯乙烷(6mL)中并再-浓缩。用1N HCl水溶液研磨油产物和加入乙醚(30mL)产生沉淀。通过真空过滤并用乙醚洗涤得到白色固体产物(0.386g，59％得率)。MSm/z 417(MH+)。
步骤3：
向实施例2的步骤2的产物(0.154g，0.338mmol)、二异丙基乙胺(0.131g，1.01mmol)和Boc-L-Tle-OH(0.117g，0.507mmol)于二氯甲烷(2mL)的溶液中加入HATU(0.193g，0.507mmol)。于室温下搅拌14小时之后，反应物经用二氯甲烷(20mL)稀释，然后用3×2mL 1N水HCl和10％Na2CO3(3mL)水溶液洗涤。混合物中沉淀的产物如白色固体并通过真空过滤得到。产物经反相HPLC纯化，得到白色固体的化合物2(0.151g，70％得率)。1H NMR(CD3OD，500MHz)δ1.02(s，9H)，1.08(dd，J＝7.9，1.9Hz，2H)，1.16(dd，J＝6.3，3.5Hz，1H)，1.21-1.28(m，2H)，1.37(dd，J＝9.5，5.2Hz，1H)，1.49(s，9H)，1.87(dd，J＝8.2，5.5Hz，1H)，1.94-1.99(m，2H)，2.23(q，J＝8.9Hz，1H)，2.66-2.75(m，3Hz)，2.91-2.96(m，1H)，3.66(q，J＝4.43Hz，1H)，3.82(q，J＝6.0Hz，1H)，4.30(d，J＝9.5Hz，1H)，4.34(t，J＝7.3Hz，1H)，4.38(s，2H)，5.15(d，J＝10.1Hz，1H)，5.32(d，J＝17.1Hz，1H)，5.71-5.78(m，1H)，6.61(d，J＝9.2Hz，1H)，7.21-7.25(m，3H)，7.3 1(t，J＝7.5Hz，2H)；MS m/z 631(M+H)。
实施例3：化合物3的制备
化合物3
Figure S2006800251234D00801
实施例3
步骤1：
于-50℃，向(S)-1-(叔-丁氧基羰基)-4-氧代吡咯烷-2-羧酸(460mg，2.0mmol)于THF(10mL)的溶液中逐滴加入4-溴化联苯基镁(0.5MTHF，16.0mL，8.0mmol)。于此温度搅拌4小时之后，混合物经用5％的柠檬酸猝灭，用乙酸乙酯(50mL)提取。有机层经用盐水洗涤、经MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余的固体从乙酸乙酯∶己烷(15mL∶15mL)再结晶，得到白色固体样中间体1(415mg，54％)。1H NMR(CD3OD)δ1.49，1.51(d，9H)，2.48-2.51(m，1H)，2.79-2.82(m，1H)，3.75-3.81(m，2H)，4.48-4.53(m，1H)，7.33-7.36(m，1H)，7.43-7.46(m，2H)，7.58-7.65(m，6H)；MS m/z384(M++H)。
步骤2：
向冰冷的中间体1(383mg，1.0mmol)、环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)酰胺盐酸(293mg，1.1mmol)和HATU(570mg，1.5mmol)于二氯甲烷(10mL)的混合物中加入二异丙基乙胺(560mg，5.0mmol)。使形成的溶液温热至室温4小时并真空去除挥发物。用乙酸乙酯(100mL)研磨残余物并过滤。滤液经用5％柠檬酸(50mL，x2)和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。用甲醇(4mL)研磨残余物，得到314mg(53％)想要的产物，中间体2。MS m/z 596(M++H)。
步骤3：
向冰冷的中间体2(150mg，0.25mmol)于1，4-二氧六环(1mL)的悬浮液中加入HCl(4M二氧六环，5mL)。于室温下搅拌形成的溶液2小时并真空去除挥发物，高真空下干燥过夜。该产物直接用于下一步。MS m/z 496(M++H)。
步骤4：
向冰冷的中间体3(134mg，0.25mmol)于二氯甲烷(2.5mL)的悬浮液中逐滴加入二异丙基乙胺(560mg，5.0mmol)。向该形成的溶液中加入HATU(144mg，0.38mmol)和(S)-2-(叔-丁氧基羰基)-3，3-二甲基丁酸(64mg，0.28mmol)。使最终的混合物温热至室温过夜并真空去除挥发物。用乙酸乙酯(10mL)研磨残余物并过滤。滤液经用5％柠檬酸(10mL，x2)和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化，得到16mg(9％)想要的产物，白色固体样化合物3。1HNMR(CD3OD)δ1.08-1.13(m，11H)，1.27-1.29(m，2H)，1.47-1.53(m，10H)，1.89-1.93(m，1H)，2.26-2.32(m，2H)，2.68-2.71(m，1H)，2.97-2.99(m，1H)，4.05-4.12(m，1H)，4.34-4.37(m，2H)，4.45-4.47(m，1H)，5.15(d，J＝12Hz，1H)，5.33(d，J＝18.5Hz，1H)，5.77-5.82(m，1H)，7.36-7.37(m，1H)，7.44-7.47(m，2H)，7.62-7.67(m，6H)；MS m/z 709(M++H)。
实施例4：化合物4的制备
Figure S2006800251234D00811
化合物4
步骤1：
Figure S2006800251234D00821
采用如在实施例3，步骤1中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用溴化苯基镁。1H NMR(DMSO-d6)δ1.36-1.41(m，9H)，2.25-2.28(m，1H)，2.60-2.64(m，1H)，3.56-3.66(m，2H)，4.27-4.29(m，1H)，5.50(s，1H)，7.25-7.36(m，3H)，7.46-7.48(m，2H)，12.40(br，1H)；MS m/z308(M++H)。
步骤2：
Figure S2006800251234D00822
采用如在实施例3，步骤2中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例4，步骤1的产物。MS m/z520(M++H)。
步骤3：
Figure S2006800251234D00823
采用如在实施例3，步骤3中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例4，步骤2的产物。MS m/z420(M++H)。
步骤4：
采用如在实施例3，步骤4中描述的同样的方法，制备化合物4，不同的是使用实施例4，步骤3的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.08-1.12(m，11H)，1.27-1.28(m，2H)，1.48-1.52(m，10H)，1.89-1.90(m，1H)，2.26-2.32(m，2H)，2.68-2.71(m，1H)，2.97-2.99(m，1H)，4.05-4.09(m，1H)，4.34-4.35(m，2H)，4.45-4.47(m，1H)，5.14(d，J＝12Hz，1H)，5.34(d，J＝18.5Hz，1H)，5.77-5.82(m，1H)，7.31-7.33(m，1H)，7.37-7.40(m，2H)，7.57-7.59(m，2H)；MS m/z 633(M++H)。
实施例5：化合物5的制备
Figure S2006800251234D00831
化合物5
步骤1：
Figure S2006800251234D00832
采用如在实施例3，步骤1中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用溴化2-萘基镁。1H NMR(CD3OD)δ1.50，1.52(d，9H)，2.54-2.56(m，1H)，2.89-2.91(m，1H)，3.84-3.87(m，2H)，4.51-4.53(m，1H)，7.45-7.52(m，2H)，7.62-7.64(m，1H)，7.85-7.94(m，3H)，7.99(s，1H)；MS m/z 358(M++H)。
步骤2：
Figure S2006800251234D00833
采用如在实施例3，步骤2中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例5，步骤1的产物。MS m/z 570(M++H)。
步骤3：
Figure S2006800251234D00841
采用如在实施例3，步骤3中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例5，步骤2的产物。MS m/z470(M++H)。
步骤4：
采用如在实施例3，步骤4中描述的同样的方法，制备化合物5，不同的是使用实施例5，步骤3的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.05-1.12(m，11H)，1.28-1.29(m，2H)，1.48-1.53(m，10H)，1.91-1.92(m，1H)，2.25-2.40(m，2H)，2.75-2.79(m，1H)，2.97-3.00(m，1H)，4.13-4.16(m，1H)，4.38-4.47(m，2H)，5.14(d，J＝12Hz，1H)，5.33(d，J＝18.5Hz，1H)，5.77-5.82(m，1H)，7.49-7.51(m，2H)，7.70-7.73(m，1H)，7.86-7.92(m，3H)，8.04 (s，1H)；MS m/z683(M++H)。
实施例6：的制备化合物6
化合物6
步骤1：
Figure S2006800251234D00843
采用如在实施例3，步骤1中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用溴化4-氟苯基镁。1H NMR(CD3OD)δ1.48，1.50(d，9H)，2.44-2.47(m，1H)，2.74-2.95(m，2H)，3.69-3.76(m，2H)，4.45-4.53(m，1H)，7.08-7.12(m，2H)，7.52-7.54(m，2H)；MS m/z326(M++H)。
步骤2：
Figure S2006800251234D00851
采用如在实施例3，步骤2中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例6，步骤1的产物。MS m/z538(M++H)。
步骤3：
Figure S2006800251234D00852
采用如在实施例3，步骤3中描述的同样的方法，制备该产物，不同的是使用实施例6，步骤2的产物。MS m/z438(M++H)。
步骤4：
采用如在实施例3，步骤4中描述的同样的方法，制备化合物6，不同的是使用实施例6，步骤3的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.02-1.12(m，11H)，1.26-1.28(m，2H)，1.47-1.52(m，10H)，1.89-1.90(m，1H)，2.25-2.28(m，2H)，2.55-2.65(m，1H)，2.92-2.99(m，1H)，4.06-4.08(m，1H)，4.25-4.33(m，2H)，4.41-4.49(m，1H)，5.15(d，J＝12Hz，1H)，5.32(d，J＝18.5Hz，1H)，5.77-5.82(m，1H)，7.09-7.12(m，2H)，7.60-7.63(m，2H)；MS m/z651(M++H)。
实施例7：化合物7的制备
Figure S2006800251234D00861
化合物7
Figure S2006800251234D00862
步骤1：
Figure S2006800251234D00863
于0℃，向(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-2-羧甲酯盐酸盐(5.45g，30.0mmol)、(S)-2-(叔-丁氧基羰基)-3，3-二甲基丁酸(6.93g，30.0mmol)和HATU(17.1g，45.0mmol)于二氯甲烷(100mL)的浆状液中逐滴加入二异丙基乙胺(16.8g，150mmol)。将形成的溶液于室温下搅拌过夜，用冰冷的5％柠檬酸和1M NaOH(aq)洗涤两次，然后用盐水洗涤，经MgSO4干燥并过滤。真空浓缩滤液以提供10.75g(100％)浅棕色样泡沫。1H NMR(CD3OD)δ1.04(s，9H)，1.46(s，9H)，2.01-2.06(m，1H)，2.27-2.29(m，1H)，3.73(s，3H)，3.77-3.87(m，2H)，4.31(s，1H)，4.49(br，1H)，4.56(t，J＝8.5Hz，1H)。
步骤2：
Figure S2006800251234D00871
向实施例7，步骤1的产物(10.75g，30.0mmol)于THF(100mL)和甲醇(100mL)的溶液中加入LiOH一水合物(6.30g，150mmol)的水(100mL)溶液。将最终的溶液于室温下搅拌过夜。真空去除挥发物。残余物经用1M HCl(aq)酸化至pH2。用乙酸乙酯(100mL)提取。有机层经用5％柠檬酸和盐水洗涤，经MgSO4干燥并过滤。滤液真空浓缩以提供8.95g(87％)的灰-白色泡沫样想要的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.05(s，9H)，1.45(s，9H)，2.03-2.06(m，1H)，2.32-2.36(m，1H)，3.79-3.86(m，2H)，4.32(br，1H)，4.49(br，1H)，4.54(t，J＝8.5Hz，1H)。
步骤3：
Figure S2006800251234D00872
于0℃，向实施例7，步骤2的产物(1.95g，5.68mmol)于乙酸乙酯(150mL)的溶液中加入(1R，2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺盐酸盐(1.51g，5.68mmol)。将该混合物于此温度下搅拌5分钟，随后逐滴加入二异丙基乙胺(1.91g，17.0mmol)。形成的清澈溶液于0℃再搅拌5分钟，随后加入EDC(1.41g，7.38mmol)和HOBt(0.77g，5.68mmol)。最后的浆状液于室温下搅拌过夜。分别用冰冷的5％柠檬酸洗涤两次，饱和的柠檬酸钠(aq)和盐水洗涤。经MgSO4干燥并过滤。真空浓缩滤液，经快速柱用1∶1己烷-丙酮洗脱纯化，得到2.50g(79％)的白色泡沫样想要的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.00-1.10(m，11H)，1.24-1.28(m，2H)，1.41-1.46(m，10H)，1.86-1.91(m，1H)，2.00-2.04(m，1H)，2.12-2.28(m，1H)，2.92-2.99(m，1H)，3.80-3.95(m，2H)，4.30-4.40(m，2H)，4.51(br，1H)，5.14(d，J＝12Hz，1H)，5.35(d，J＝18.5Hz，1H)，5.77-5.82(m，1H)；MS m/z557(M++H)。
步骤4：
Figure S2006800251234D00881
向Dess Martin试剂(940mg，2.2mmol)于二氯甲烷(20mL)的溶液中加入实施例7，步骤3的产物(556mg，1.0mmol)。于室温下搅拌该溶液4小时并真空浓缩。残余物经用热研磨乙酸乙酯(10mL)和通过硅藻土(Celite)过滤。真空浓缩滤液。残余物经快速柱用1∶1己烷-丙酮洗脱纯化，得到550mg(99％)的白色泡沫样想要的产物。1H NMR(CD3OD)δ1.09-1.14(m，11H)，1.25-1.28(m，2H)，1.43-1.46(m，10H)，1.88-1.91(m，1H)，2.22-2.28(m，1H)，2.51-2.60(m，1H)，2.92-2.96(m，1H)，4.17-4.34(m，2H)，4.77-4.80(m，1H)，5.16(d，J＝12Hz，1H)，5.33(d，J＝18.5Hz，1H)，5.72-5.82(m，1H)；MS m/z555(M++H)。
步骤5：
于-50℃，向实施例7，步骤4的产物(23mg，0.05mmol)于THF(0.5mL)的溶液中逐滴加入溴化4-甲氧基苯基镁(0.5mL，0.5M于THF中，0.25mmol)。形成的溶液于此温度下搅拌2小时，并用氯化铵(aq)猝灭，然后用乙酸乙酯提取。有机层经用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化，得到4.5mg(14％)的白色固体样化合物7。1H NMR(CD3OD)δ1.09-1.12(m，11H)，1.26-1.28(m，2H)，1.46-1.52(m，10H)，1.89-1.91(m，1H)，2.25-2.28(m，2H)，2.58-2.65(m，1H)，2.92-2.99(m，1H)，3.81(s，3H)，4.04-4.08(m，1H)，4.25-4.35(m，2H)，4.41-4.49(m，1H)，5.15(d，J＝12Hz，1H)，5.32(d，J＝18.5Hz，1H)，5.74-5.82(m，1H)，6.92-6.94(m，2H)，7.48-7.50(m，2H)；MS m/z663(M++H)。
实施例8：化合物8的制备
Figure S2006800251234D00891
化合物8
采用如在实施例7，步骤5中描述的同样的方法，制备化合物8，不同的是使用溴化4’-甲氧基-3-联苯基镁。1H NMR(CD3OD)δ1.02-1.10(m，11H)，1.29-1.31(m，2H)，1.40-1.50(m，10H)，1.90-1.92(m，1H)，2.25-2.27(m，2H)，2.68-2.69(m，1H)，2.92-2.98(m，1H)，3.84(s，3H)，4.10-4.15(m，1H)，435-4.52(m，2H)，5.15(d，J＝12Hz，1H)，5.32(d，J＝18.5Hz，1H)，5.75-5.82(m，1H)，7.00-7.03(m，3H)，7.40-7.60(m，5H)；MS m/z739(M++H)。
实施例9：化合物9的制备
Figure S2006800251234D00892
化合物9
于-78℃，向如在中描述的实施例7中制备的、叔-丁基(S)-1-{(S)-2-{[(1R，2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基]氨甲酰基}-4-氧代吡咯烷-1-基}-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基-氨基甲酸盐(77mg，0.14mmol)于THF(5mL)的溶液中加入溴化烯丙基镁(1.0M于乙醚中，0.7mL，0.7mmol)。将该反应混合物温热至室温并搅拌过夜。用饱和的NH4Cl水溶液猝灭反应。该混合物经用乙酸乙酯提取，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物经硅胶用快速柱层析用2∶1己烷/丙酮洗脱纯化，得到标题产物(50mg，60％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.92-0.96(m，2H)，0.93-1.09(m，10H)，1.19-1.25(m，2H)，1.38-1.48(m，10H)，1.83-1.94(m，2H)，2.18-2.31(m，2H)，2.31-2.46(m，2H)，2.88-2.96(m，1H)，3.70(d，J＝9.82Hz，1H)，3.81(d，J＝10.32Hz，1H)，4.22(d，J＝9.32Hz，1H)，4.32(dd，J＝9.06，4.78Hz，1H)，5.09-5.20(m，3H)，5.30(dd，J＝17.25，1.38Hz，1H)，5.69-5.80(m，1H)，5.87-5.99(m，1H)，6.69(d，J＝9.06Hz，1H)；MS m/z 619(M+Na)+。
制备化合物10-25的通用方法
Figure S2006800251234D00901
于-78℃，向叔-丁基(S)-1-{(S)-2-{[(1R，2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基]氨甲酰基}-4-氧代吡咯烷-1-基}-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基氨基甲酸盐(83mg，0.15mmol)于THF(1-5mL)的溶液中加入Grignard试剂(0.75-0.90mmol)。使该反应混合物温热至室温并搅拌1-3小时。用饱和的NH4Cl(1mL)水溶液猝灭反应。该混合物经用1N HCl中和，用乙酸乙酯(2×20mL)提取，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物经制备型HPLC纯化，得到想要的产物。
实施例10：化合物10的制备
Figure S2006800251234D00911
化合物10
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-氟苯基)镁(1.0M于THF中，0.75mL，0.75mmol)制备化合物10，得到5mg(6％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.98-1.01(m，2H)，1.03-1.11(m，10H)，1.21-1.27(m，2H)，1.37-1.51(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.18-2.28(m，2H)，2.56-2.64(m，1H)，2.90-2.99(m，1H)，4.03(d，J＝10.83Hz，1H)，4.24(d，J＝10.58Hz，1H)，4.28(s，1H)，4.43(dd，J＝9.06，4.03Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.45，1.64Hz，1H)，5.30(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.82(m，1H)，6.99-7.07(m，1H)，7.30-7.41(m，3H)；MS m/z 651(M+H)+。
实施例11：化合物11的制备
Figure S2006800251234D00912
化合物11
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-甲氧基苯基)镁(1.0M于THF中，0.75mL，0.75mmol)制备化合物11，得到7mg(7％)的产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ0.98-1.01(m，2H)，1.03-1.12(m，10H)，1.20-1.27(m，2H)，1.42-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.17-2.29(m，2H)，2.55-2.64(m，1H)，2.90-3.00(m，1H)，3.79(s，3H)，3.98-4.06(m，1H)，4.21-4.33(m，2H)，4.43(dd，J＝9.19，3.90Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.45，1.64Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.69-5.82(m，1H)，6.85(dd，J＝8.06，2.01Hz，1H)，7.08(d，J＝7.81Hz，1H)，7.14(s，1H)，7.23-7.30(m，1H)；MS m/z 663(M+H)+。
实施例12：化合物12的制备
Figure S2006800251234D00921
化合物12
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-氯代苯基)镁(0.5M于THF中，1.8mL，0.90mmol)制备化合物12，得到5mg(5％)的产物。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ0.98-1.01(m，2H)，1.03-1.11(m，10H)，1.22-1.27(m，2H)，1.41-1.50(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.19-2.28(m，2H)，2.56-2.64(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，4.04(d，J＝10.58Hz，1H)，4.22(d，J＝10.83Hz，1H)，4.27(s，1H)，4.44(dd，J＝9.19，3.90Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.51Hz，1H)，5.30(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，7.28-7.37(m，2H)，7.47(t，J＝7.68Hz，1H)，7.61(s，1H))；MS m/z 689(M+Na)+。
实施例13：化合物13的制备
Figure S2006800251234D00922
化合物13
如在通用方法中所描述的，使用溴化间-甲苯基镁(1.0M于THF中，0.90mL，0.90mmol)制备化合物13，得到11mg(11％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.99(s，2H)，1.04-1.09(m，10H)，1.21-1.27(m，2H)，1.42-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.31，5.54Hz，1H)，2.18-2.29(m，2H)，2.35(s，3H)，2.56-2.63(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，4.03(d，J＝11.08Hz，1H)，4.24(d，J＝10.83Hz，1H)，4.28-4.32(m，1H)，4.41(dd，J＝9.06，4.03Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.51Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.25，1.38Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，7.11(d，J＝7.55Hz，1H)，7.23(t，J＝7.55Hz，1H)，7.32(d，J＝7.81Hz，1H)，7.37(s，1H))；MS m/z 669(M+Na)+。
实施例14：化合物14的制备
Figure S2006800251234D00931
化合物14
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-异丙基苯基)镁(0.5M于THF中，1.5mL，0.75mmol)制备化合物14，得到12mg(12％)的产物。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.98-1.01(m，2H)，1.04-1.11(m，10H)，1.22-1.28(m，8H)，1.41-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.18-2.34(m，2H)，2.55-2.63(m，1H)，2.87-2.98(m，2H)，4.00-4.07(m，1H)，4.26(d，J＝10.83Hz，1H)，4.29-4.33(m，1H)，4.42(dd，J＝9.06，4.03Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.45，1.64Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，7.17(d，J＝7.30Hz，1H)，7.24-7.36(m，2H)，7.44(s，1H)。MS m/z 675(M+H)+。
实施例15：化合物15的制备
Figure S2006800251234D00932
化合物15
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-异丙氧基苯基)镁(0.5M于THF中，1.5mL，0.75mmol)制备化合物15，得到12mg(12％)的产物。
1H NMR(400Mz，CD3OD)δ0.98-1.01(m，2H)，1.04-1.11(m，10H)，1.21-1.27(m，2H)，1.29(d，J＝6.04Hz，6H)，1.42-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.18-2.29(m，2H)，2.55-2.63(m，1H)，2.90-2.99(m，1H)，3.98-4.06(m，1H)，4.23(d，J＝10.83Hz，1H)，4.29(s，1H)，4.45(dd，J＝9.32，3.78Hz，1H)，4.57-4.66(m，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.76Hz，1H)，5.30(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，6.83(dd，J＝8.06，1.76Hz，1H)，7.05(d，J＝7.81Hz，1H)，7.12(s，1H)，7.20-7.28(m，1H)；MS m/z 691(M+H)+。
实施例16：化合物16的制备
Figure S2006800251234D00941
化合物16
如在通用方法中所描述的，使用溴化[3-(N，N-二甲基)苯胺]镁(0.5M于THF中，1.5mL，0.75mmol)制备化合物16，得到7mg(7％)的产物。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.00(s，2H)，1.02-1.13(m，9H)，1.20-1.27(m，2H)，1.40-1.47(m，10H)，1.88(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.19-2.29(m，2H)，2.59-2.70(m，1H)，2.90-3.00(m，1H)，3.08-3.19(m，6H)，4.01-4.14(m，2H)，4.24(d，J＝10.83Hz，1H)，4.28(s，1H)，4.50(dd，J＝9.44，3.15Hz，1H)，5.13(dd，J＝10.32，1.76Hz，1H)，5.30(dd，J＝17.25，1.39Hz，1H)，5.70-5.82(m，1H)，7.16-7.23(m，1H)，7.28-7.36(m，1H)，7.42(t，J＝7.43Hz，1H)，7.52(s，1H)；MS m/z 676(M+H)+。
实施例17：化合物17的制备
化合物17
如在通用方法中所描述的，使用溴化[3-(1-吡咯烷基甲基)苯基]镁(0.25M于THF中，3.0mL，0.75mmol)制备化合物17，得到9mg(9％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.98-1.02(m，3H)，1.04-1.09(m，9H)，1.24(d，J＝1.51Hz，3H)，1.39-1.51(m，11H)，1.87(dd，J＝8.31，5.54Hz，1H)，2.18-2.29(m，2H)，2.35(s，3H)，2.56-2.63(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，4.03(d，J＝11.08Hz，1H)，4.24(d，J＝10.83Hz，1H)，4.30(s，1H)，4.41(dd，J＝9.06，4.03Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.51Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.25，1.38Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，7.11(d，J＝7.55Hz，1H)，7.23(t，J＝7.55Hz，1H)，7.32(d，J＝7.81Hz，1H)，7.37(s，1H)；MS m/z 716(M+H)+。
实施例18：化合物18的制备
Figure S2006800251234D00952
化合物18
如在通用方法中所描述的，使用溴化[3-(1-哌啶基甲基)苯基]镁(0.25M于THF中，3.0mL，0.75mmol)制备化合物18，得到15mg(14％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.99-1.04(m，5H)，1.07(s，9H)，1.15-1.26(m，3H)，1.41-1.47(m，13H)，1.77-1.92(m，5H)，2.11-2.40(m，2H)，2.65-2.76(m，1H)，2.86-2.97(m，1H)，4.08-4.19(m，2H)，4.28(s，3H)，4.52(dd，J＝9.82，2.77Hz，1H)，5.05-5.15(m，1H)，5.22-5.34(m，1H)，5.72-5.85(m，1H)，7.44(d，J＝7.20Hz，1H)，7.49(t，J＝7.43Hz，1H)，7.66(d，J＝7.55Hz，1H)，7.81(s，1H)；MS m/z 732(M+H)+。
实施例19：化合物19的制备
Figure S2006800251234D00961
化合物19
如在通用方法中所描述的，使用溴化[3-(4-吗啉基甲基)苯基]镁(0.25M于THF中，3.0mL，0.75mmol)制备化合物19，得到16mg(15％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.98-1.02(m，2H)，1.07(s，9H)，1.19-1.27(m，3H)，1.40-1.50(m，10H)，1.88(dd，J＝7.93，5.67Hz，1H)，2.16-2.38(m，2H)，2.60-3.01(m，6H)，3.71-3.83(m，4H)，4.00-4.16(m，3H)，4.22(d，J＝10.83Hz，1H)，4.26-4.32(m，1H)，4.48(dd，J＝9.32，2.77Hz，1H)，5.12(d，J＝10.58Hz，1H)，5.30(d，J＝16.87Hz，1H)，5.70-5.83(m，1H)，6.79(d，J＝8.81Hz，1H)，7.33-7.45(m，2H)，7.56(d，J＝8.06Hz，1H)，7.66(s，1H)；MS 732 m/z(M+H)+。
实施例20：化合物20的制备
Figure S2006800251234D00962
化合物20
如在通用方法中所描述的，使用溴化[2-(4-吗啉基甲基)苯基]镁(0.25M于THF中，3.0mL，0.75mmol)制备化合物20，得到4mg(4％)的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.94-0.98(m，2H)，1.01-1.11(m，10H)，1.16-1.24(m，2H)，1.41-1.48(m，10H)，1.85(dd，J＝8.06，5.29Hz，1H)，2.12-2.22(m，1H)，2.45(dd，J＝12.59，7.55Hz，1H)，2.55-2.68(m，4H)，2.72-2.85(m，1H)，2.87-2.97(m，1H)，3.59-3.84(m，6H)，4.00-4.07(m，1H)，4.13-4.21(m，1H)，4.34-4.38(m，1H)，4.47(d，J＝10.83Hz，1H)，5.10(dd，J＝10.20，1.64Hz，1H)，5.26(dd，J＝17.12，1.26Hz，1H)，5.68-5.80(m，1H)，6.77(d，J＝9.57Hz，1H)，7.28-7.40(m，3H)，7.44-7.49(m，1H)；MS m/z(M+H)+。
实施例21：化合物21的制备
Figure S2006800251234D00971
化合物21
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3，5-二甲基苯基)镁(0.5M于THF中，1.8mL，0.90mmol)制备化合物21，得到7mg(7％)的产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ0.97-1.11(m，12H)，1.19-1.27(m，2H)，1.37-1.51(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.15-2.25(m，2H)，2.30(s，6H)，2.54-2.62(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，4.02(d，J＝10.58Hz，1H)，4.21(d，J＝10.83Hz，1H)，4.27-4.32(m，1H)，4.41(dd，J＝9.06，3.78Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.51Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，6.94(s，1H)，7.15(s，2H)；MS m/z 683(M+Na)+。
实施例22：化合物22的制备
Figure S2006800251234D00972
化合物22
如在通用方法中所描述的，使用溴化(4-氟-3-甲基苯基)镁(1.0M于THF中，0.9mL，0.90mmol)制备化合物22，得到8mg(8％)的产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ0.97-1.02(m，2H)，1.03-1.11(m，10H)，1.20-1.27(m，2H)，1.41-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.20-2.25(m，1H)，2.27(d，J＝1.51Hz，3H)，2.55-2.63(m，1H)，2.89-2.98(m，1H)，4.03(d，J＝10.83Hz，1H)，4.21(d，J＝10.83Hz，1H)，4.26-4.31(m，1H)，4.41(dd，J＝9.19，3.90Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.76Hz，1H)，5.30(dd，J＝17.12，1.26Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，6.79(d，J＝9.06Hz，1H)，6.96-7.03(m，1H)，7.33-7.40(m，1H)，7.41-7.46(m，1H)；MS m/z687(M+Na)+。
实施例23：化合物23的制备
Figure S2006800251234D00981
化合物23
如在通用方法中所描述的，使用溴化(3-氟-4-甲基苯基)镁(0.5M于THF中，1.8mL，0.90mmol)制备化合物23，得到5mg(5％)的产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ0.99(s，2H)，1.03-1.10(m，10H)，1.21-1.27(m，2H)，1.42-1.47(m，10H)，1.87(dd，J＝8.31，5.54Hz，1H)，2.19-2.22(m，J＝8.06Hz，1H)，2.24(d，J＝1.51Hz，3H)，2.54-2.61(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，4.01(d，J＝10.83Hz，1H)，4.22(d，J＝10.83Hz，1H)，4.26-4.30(m，1H)，4.41(dd，J＝9.06，4.03Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.32，1.76Hz，1H)，5.29(dd，J＝17.25，1.13Hz，1H)，5.70-5.81(m，1H)，7.20-7.27(m，3H)；MS m/z 665(M+H)+。
实施例24：化合物24的制备
Figure S2006800251234D00991
化合物24
如在通用方法中所描述的，使用溴化(2，5-二甲基苯基)镁(0.5M于THF中，1.8mL，0.90mmol)制备化合物24，得到5mg(5％)的产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ0.94-0.97(m，2H)，1.02-1.10(m，10H)，1.20-1.26(m，2H)，1.40-1.49(m，10H)，1.86(dd，J＝8.18，5.41Hz，1H)，2.16(d，J＝4.78Hz，1H)，2.17-225(m，1H)，2.28(s，3H)，2.48(s，3H)，2.72(dd，J＝12.46，8.18Hz，1H)，2.88-2.97(m，1H)，4.09(d，J＝10.83Hz，1H)，4.13-4.21(m，1H)，4.37(d，J＝9.32Hz，1H)，4.44(d，J＝10.83Hz，1H)，5.11(dd，J＝10.32，1.51Hz，1H)，5.28(dd，J＝17.12，1.51Hz，1H)，5.70-5.80(m，1H)，6.82(d，J＝9.57Hz，1H)，6.99(t，J＝7.68Hz，1H)，7.11(d，J＝7.30Hz，1H)，7.17(d，J＝7.81Hz，1H)；MS m/z 683(M+Na)+。
实施例25：化合物25的制备
Figure S2006800251234D00992
化合物25
如在通用方法中所描述的，使用溴化(5-氟-2-甲氧基苯基)镁(0.5M于THF中，1.8mL，0.90mmol)制备化合物25，得到5mg(5％)的产物。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.00-1.10(m，11H)，1.20-1.26(m，2H)，1.40-1.47(m，10H)，1.83-1.89(m，1H)，2.20-2.29(m，1H)，2.34-2.43(m，1H)，2.90-2.98(m，1H)，3.80(s，1H)，3.85(s，3H)，3.93(d，J＝10.83Hz，1H)，4.18-4.28(m，1H)，4.45(d，J＝10.83Hz，1H)，4.56(dd，J＝9.69，2.64Hz，1H)，5.12(dd，J＝10.58，1.51Hz，1H)，5.30(d，J＝17.37Hz，1H)，5.68-5.83(m，1H)，6.75(d，J＝8.81Hz，1H)，6.98-7.04(m，2H)，7.36(d，J＝10.32Hz，1H)；MS m/z 703(M+Na)+。
生物学研究
HCV NS3/4A蛋白酶复合物的酶检测和基于细胞的HCV复制子检测在本公开中应用，并且制备、传导和验证如下：
重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物的产生
衍生自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物如下描述产生。产生这些纯化的重组蛋白质是用于均一性分析(见下述)，以提供本公开化合物将如何有效抑制HCV NS3蛋白水解活性的指示。
取自HCV-感染患者的血清从旧金山医院(San Francisco Hospital)的Dr.T.Wright处获得。HCV基因组(BMS株)的(遗传)工程学的全长cDNA(互补的脱氧核糖核酸)模板，使用基于其它的基因型1a株之间的同源性选择的引物，由通过血清RNA(核糖核酸)的反转录-PCR(RT-PCR)得到的DNA片段构成。从全部基因组序列的测定，依据Simmonds等(见P Simmonds，KA Rose，S Graham，SW Chan，FMcOmish，BC Dow，EA Follett，PL Yap和H Marsden，J.Clin.Microbiol.31(6)，1493-1503(1993))的分类，将基因型1a指定为HCV分离株。非结构区域NS2-5B的氨基酸序列显示与HCV基因型1a(H77)的一致性＞97％和与基因型1b(J4L6S)的一致性为87％。感染性克隆，H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)得自R.Purcell(NIH)并且该序列发表在Genbank(AAB67036，见Yanagi，M.Purcell，R.H.Emerson，S.U.和Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，见Yanagi，M.St Claire，M.Shapiro，M.Emerson，S.U.Purcell，R.H.和Bukh，J，Virology 244(1)，161-172.(1998))。
H77和J4L6S株用于生产重组NS3/4A蛋白酶复合物。DNA编码重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027至1711)，由于这些株被操控(manipulated)，如由P.Gallinari等(见Gallinari P，Paolini C，Brennan D，Nardi C，Steinkuhler C，De Francesco R.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))所描述的。简言之，在NS4A编码区的3′-末端加入三个-赖氨酸增溶尾(solubilizing tail)。NS4A-NS4B裂解位点(氨基酸1711)的P1位置中的半胱氨酸变为甘氨酸以避免赖氨酸标志(tag)的蛋白水解裂解。此外，半胱氨酸至丝氨酸的突变由在氨基酸位置1454的PCR引导，以防止在NS3解旋酶结构域自溶性裂解。按照由P.Gallinari等(见Gallinari P，Brennan D，Nardi C，Brunetti M，Tomei L，Steinkuhler C，De Francesco R.J Virol.72(8)：6758-69(1998))描述的实验程序(protocol)及其修正，变异DNA片段在pET21b细菌表达载体(Novagen)中克隆而NS3/4A复合物在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)株BL21(DE3)(Invitrogen)中表达。简言之于20℃，用0.5毫摩尔(mM)异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导22小时(h)，表达NS3/4A蛋白酶复合物。典型的发酵(1升(L))得到约10克(g)湿细胞糊(cell paste)。将细胞再悬浮于裂解缓冲液(10mL/g)中，所述裂解缓冲液含25mMN-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH7.5，20％丙三醇，500mM氯化钠(NaCl)，0.5％Triton X-100，1微克/毫升(″μg/mL″)溶菌酶，5mM氯化镁(MgCl2)，1μg/ml脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)，5mM β-巯基乙醇(βME)，蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸(EDTA)(Roche)，匀浆并于4℃孵育20分钟(min)。使匀浆经超声处理并于4℃于235000g用超速-离心1小时(h)澄清。将咪唑加至上清液使终浓度为15mM和pH调节至8.0。将粗蛋白质提取液荷载于预装缓冲液B(25mMHEPES，pH8.0，20％丙三醇，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，15mM咪唑，5mM βME)的Nickel-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上。以1mL/min的流速荷载样品。用15倍柱体积的缓冲液C(与缓冲液B相同，除了0.2％Triton X-100)洗涤柱。蛋白质用5倍柱体积的缓冲液D(与缓冲液C相同，除了200mM咪唑)洗脱。
将含NS3/4A蛋白酶复合物的部分汇集并荷载于用缓冲液D(25mM HEPES，pH7.5，20％丙三醇，300mM NaCl，0.2％Triton X-100，10mM βME)预平衡的去盐柱Superdex-S200上。以1mL/min的流速荷载样品。将含NS3/4A蛋白酶复合物的部分汇集并浓缩至约0.5mg/ml。衍生自BMS、H77和J4L6S株的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度，经SDS-PAGE和质谱分析鉴定大于90％。将酶存储于-80℃，用于检测缓冲液之前在冰上解冻并且稀释。
FRET肽检测以监测HCV NS3/4A蛋白水解活性
该体外检测的目的是检测由本公开化合物对如上描述的衍生自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物的抑制作用。该检测提供本公开化合物将如何有效抑制HCV NS3蛋白水解活性的指示。
为了监测HCV NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽底物。所述底物为由Taliani等在Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996)中描述的RET S1(共振能量转移缩酚肽(Depsipeptide)底物；AnaSpec，Inc.cat#22991)(FRET肽)。该肽的序列松散地基于(loosely based on)HCV NS3蛋白酶的NS4A/NS4B天然裂解位点，只是在裂解位点上存在酯联接而不是酰胺键。该肽还在近肽的末端含有荧光供体EDANS以及在近肽的另一末端含有受体DABCYL。通过供体和受体之间的分子内共振能量转移(RET)猝灭肽的荧光性，但是在NS3蛋白酶裂解肽时，产物从RET猝灭中释放并且供体的荧光变得明显。
在缺乏或存在本公开化合物下，将肽底物用三个重组NS3/4A蛋白酶复合物之一孵育。通过用Cytofluor Series 4000监测实时的荧光反应产物的形成，测定化合物的抑制作用。
试剂如下：HEPES和丙三醇(Ultrapure)得自GIBCO-BRL。二甲基亚砜(DMSO)得自Sigma。β-巯基乙醇得自Bio Rad。
检测缓冲液：50mM HEPES，pH7.5；0.15M NaCl；0.1％Triton；15％丙三醇；10mM βME。底物：2μM终浓度(自储存于-20℃的2mM储存液的DMSO)。HCV NS3/4A蛋白酶型1a(1b)，2-3nM终浓度(自5μM储存液于25mM HEPES，pH7.5，20％丙三醇，300mM NaCl，0.2％Triton-X100，10mM βME中)。由于化合物具有接近检测限制的效价强度，通过加入50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma)至检测缓冲液并将蛋白酶终浓度降低至300pM，使检测更加敏感。
该检测在来自Falcon的96-孔聚苯乙烯黑色板上进行。每个孔含25μl NS3/4A蛋白酶复合物的检测缓冲液、50μl的本公开化合物的10％DMSO/检测缓冲液和25μl底物的检测缓冲液。对照组(无化合物)也在同样的检测板上制备。在加入底物开始酶促反应前，将酶复合物与化合物或对照溶液混合1min。立即采用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosistem)读取检测板。设置仪器的发射波长为340nm和激发波长为490nm，于25℃读板。一般跟进反应约15min。
用以下方程式计算抑制百分率：
100-[(δFinh/δFcon)x100]
其中δF是在曲线的线性范围的荧光变化。采用Excel XL拟合软件，并使用y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))方程，将非线性曲线拟合应用于抑制-浓度数据和计算50％有效浓度(IC50)。
发现所有测试化合物抑制NS3/4A蛋白酶复合物的活性，IC50为1.2μM或更小。另外，针对多于一种类型的NS3/4A复合物的测试，发现本公开化合物具有相似的抑制特性，虽然始终证明，与1a株相比，本化合物对1b株具有更大的效价强度。
特异性检测
实施特异性检测以证明本公开化合物在体外抑制HCV NS3/4A蛋白酶复合物中的选择性，与抑制其它丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶比较。
针对多种丝氨酸蛋白酶：人中心粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)和人胰腺胰凝乳蛋白酶和一种半胱氨酸蛋白酶：人肝脏组织蛋白酶B，测定本公开化合物的特异性。在所有情况下，如前(PCT专利申请号WO 00/09543)所描述的，使用特异性对每个酶的比色的对-硝基苯胺(pNA)底物的96-孔板格式协议以及一些修正条款，被应用于丝氨酸蛋白酶检测。所有酶购自Sigma而底物购自Bachem。
每次检测包括于室温下2h的酶-抑制剂的预-孵育，随后加入底物和水解至经Spectramax Pro读微板器上检测的～30％转化。依据化合物的效价强度，它们的浓度在100-0.4μM范围变化。
每次检测的最终条件如下：
50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH8，0.5M硫酸钠(Na2SO4)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，0.01％土温-20和：
133μM succ-AAA-pNA和20nM HNE或8nM PPE；100μMsucc-AAPF-pNA和250pM胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)。
100mM NaHPO4(磷酸氢钠)pH6，0.1mM EDTA，3％DMSO，1mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)，0.01％土温-20，30μMz-FR-pNA和5nM组织蛋白酶B(Cathepsin B)(酶储存液用前在含20mM TCEP的缓冲液中活化)。
用下式计算抑制百分率：
[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))]x100
采用Excel XL拟合软件，将非线性曲线拟合应用于抑制-浓度数据和计算50％有效浓度(IC50)。
HCV复制子的产生
如由Lohmann V，Korner F，Koch J，Herian U，Theilmann L，Bartenschlager R.Science 285(5424)：110-3(1999)描述的，建立HCV复制子全细胞系统。该系统使发明人能够评价HCV蛋白酶化合物对HCV RNA复制的作用。简言之，使用在Lohmann论文(收录号：AJ238799)中描述的HCV株1b序列，通过Operon Technologies，Inc.(Alameda，CA)合成HCV cDNA，然后采用标准的分子生物技术在质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中装配全长复制子。该复制子由以下组成：(i)稠合至壳体蛋白质的最初的12的氨基酸的HCV 5’UTR，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)来自的脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES和(iv)HCV NS3至NS5B基因和HCV 3’UTR。用ScaI使质粒DNAs线性化和使用T7 MegaScript转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)依据制造商的说明书体外合成RNA转录本。在体外将cDNA的转录本转染进入人肝细胞瘤细胞系，HUH-7。在可选择的标记物新霉素(G418)的存在下，实现细胞固有表达HCV复制子的选择。得到的细胞系的特征是随着时间的推移产生正链和负链RNA和产生蛋白质。
HCV复制子FRET检测
开发HCV复制子FRET检测是为了监测本公开描述的化合物对HCV病毒复制的抑制作用。将固有表达HCV复制子的HUH-7细胞生长在含10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco-BRL)中。(实验)前夜将细胞(1.5×104细胞/孔)接种于96-孔组织-培养灭菌板上。以含4％FCS、1∶100青霉素/链霉素(Gibco-BRL)、1∶100 L-谷氨酰胺的DMEM制备化合物和不含化合物的对照品，并且在稀释板中有5％DMSO(检测中的DMSO终浓度为0.5％)。将化合物/DMSO混合物加至细胞并于37℃孵育4天。4天后，首先采用阿尔玛蓝(alamar Blue)(TrekDiagnotstic System)对细胞进行毒性评估，读取CC50。通过加入1/10体积的阿尔玛蓝至培养基中孵育细胞，测定化合物的毒性(CC50)。4h后，采用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystem)，于激发波长530nm和发射波长580nm，读取每孔的荧光信号。然后用磷酸盐-缓冲的盐水(PBS)(3次150μl)彻底漂洗板。用25μl的裂解检测试剂将细胞溶解，所述试剂含HCV蛋白酶底物(5X细胞荧光素酶细胞培养裂解试剂(Promega#E153A)用蒸馏水稀释至1X，NaCl加至终浓度150mM，FRET肽底物(如以上描述酶检测)从2mM储存液的100％DMSO稀释至终浓度10μM。HCV蛋白酶底物。然后将板置于Cytofluor 4000仪器中，设定340nm的激发波长/490nm的发射波长，自动模式进行21个周期和以运动模式(kinetic mode)读板。如用于描述测定IC50的方法测定EC50。
HCV复制子荧光素酶报告检测
作为次级检测，由复制子FRET检测确定的EC50在复制子荧光素酶报告检测中得到证实。复制子荧光素酶报告检测的应用由Krieger等(Krieger N，Lohmann V和Bartenschlager R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))首先描述。用于描述发明者的FRET检测的复制子构成，经过插入编码类人形式(humanized form)的Renilla荧光素酶基因的cDNA和直接稠合至荧光素酶基因的3’-末端的接头(linker)序列改良。使用位于的新霉素标记基因直接上游(directly upstream)的核心的Asc1限制位点，将该插入物导入复制子构成。也诱导在位置1179(丝氨酸至异亮氨酸)的适应性突变(Blight KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，science 290(5498)：1972-1974)。如上描述的，固有表达该HCV复制子构成产生稳定的细胞系。如对于HCV复制子FRET检测所描述的，作如下修正，设立荧光素酶报告检测。在37℃/5％CO2孵育器4天后，采用Promega Dual-Glo荧光素酶检测系统检测细胞Renilla荧光素酶活性。从每个含细胞的孔中去除培养基(100μl)。向剩余的50μl的培养基中，加入50μl的Dual-Glo荧光素酶试剂和使板于室温下振摇10min至2h。然后将Dual-Glo Stop&Glo试剂(50μl)加至每个孔中和再于室温下振摇板10min至2h。使用发光程序在Packard TopCount NXT上读板。使用下式计算百分抑制：
Figure S2006800251234D01061
使用XL拟合将值绘成图表并分析，以得到EC50值。
以HCV酶检测、HCV复制子细胞检测和/或几个概述的特异性检测，评估本公开的典型化合物。例如，在酶检测中，发现化合物3对于NS3/4A BMs株具有4纳摩尔(nM)的IC50。用发表的H77株(IC50为1.6nM)和J4L6S株(IC50为0.9nM)得到类似的效价强度值。在复制子FRET检测中EC50值为28nM和在复制子荧光素酶检测中为14nM。
在特异性检测中，发现相同的化合物具有以下活性：HLE＞100μM；PPE＞100μM；胰凝乳蛋白酶＞100μM；组织蛋白酶B＝2μM。这些结果指出，该类化合物对NS3蛋白酶具高度特异性，并且这些成员的许多成员抑制HCV复制子复制。
经测试本公开化合物并发现具有活性范围如下：
IC50活性范围(NS3/4A BMS株)：A＞1微摩尔(μM)；B为0.1-1μM；C为0.001μM-0.1μM。
EC50活性范围(for化合物tested)：A＞10微摩尔(μM)；B为1-10μM；C为0.01-1μM。
注意，通过使用示于表2的本专利实施例号码和本专利化合物号码，可在本文找到化合物的结构。
依据本公开一个实施方案，化合物具有100μM或更低的生物活性(EC50)，而在另一个实施方案中，生物活性为1μM或更低。
表2
实施例号码 化合物号码 活性范围(IC50) 活性范围(EC50)
    1     1     B     B
    2     2     A     A
    3     3     C     C
    4     4     B     B
    5     5     C     C
    6     6     B     B
    7     7     B     B
    8     8     B     B
    9     9     A     A
    10     10     C     B
    11     11     C     B
    12     12     C     B
实施例号码 化合物号码 活性范围(IC50) 活性范围(EC50)
    13     13     C     B
    14     14     B     B
    15     15     B     B
    16     16     B     A
    17     17     B     A
    18     18     B     A
    19     19     B     A
    20     20     B     B
    21     21     C     B
    22     22     B     B
    23     23     B     B
    24     24     B     B
    25     25     B     B
本领域技术人员显然明白，本公开并不受限于前述的说明性的实施例，而且可用其它的不背离其基本特征的特定形式具体表达。因此，需要的是，参考附属的权利要求书，而不是前述的实施例，在任何意义上来说实施例被认为是说明性的而不是限制性的，因此，在权利要求的等价物的含义和范围内的所有变化，均意欲纳入其中。

Claims (18)

1.一种式(I)化合物
Figure S2006800251234C00011
或其药学上可接受的盐，其中
n为1、2或3；
R1选自羟基和-NHSO2R7；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R4选自氢和羟基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、(NRaRb)羰基和(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRd；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环；
前提是R4为氢时，则R3不是杂环基。
2.一种式(II)化合物
Figure S2006800251234C00021
或其药学上可接受的盐，其中
n为1、2或3；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、-(NRaRb)羰基和-(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRc；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环。
3.权利要求2的化合物，其中
n为1；
R2为烯基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；
R5为烷基；
R6为烷氧基羰基；和
R7为环烷基。
4.一种式(III)的化合物
Figure S2006800251234C00031
或其药学上可接受的盐，其中
n为1或2；
R2选自氢、烯基、烷基、氰基烷基、环烷基和卤代烷基；
R3选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基和杂环基烷基；
R5选自烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、羟基烷基和(NRaRb)烷基；
R6选自烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基、环烷基、杂环基、-(NRaRb)羰基和-(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRcRd；
Ra和Rb独立选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂环基和杂环基烷基；和
Rc和Rd独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或Rc和Rd与它们连接的氮原子一起形成5-元或6-元单环杂环。
5.权利要求4的化合物，其中
n为1；
R2为烯基；
R3选自烯基、芳基、芳基烷基、环烷基和(环烷基)烷基；
R5为烷基；
R6为烷氧基羰基；和
R7为环烷基。
6.一种化合物，所述化合物选自
Figure S2006800251234C00051
Figure S2006800251234C00061
7.一种组合物，它包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
8.权利要求7的组合物，它还包含干扰素和利巴韦林。
9.权利要求7的组合物，它还包含第二个具有抗-HCV活性的化合物。
10.权利要求9的组合物，其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物是干扰素。
11.权利要求10的组合物，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、重组复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
12.权利要求9的组合物，其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、促进1型T辅助细胞反应进展的化合物、干扰RNA、抗-反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
13.一种抑制HCV丝氨酸蛋白酶功能的方法，所述方法包括使HCV丝氨酸蛋白酶与权利要求1的化合物接触。
14.一种在患者中治疗HCV感染的方法，所述方法包括给予所述患者有效治疗量的权利要求1的化合物。
15.权利要求14的方法，所述方法还包括在给予权利要求1的化合物之前、之后或同时给予第二个具有抗-HCV活性的化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物是干扰素。
17.权利要求16的方法，其中所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、重组复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
18.权利要求15的方法，其中所述第二个具有抗-HCV活性的化合物选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、促进1型T辅助细胞反应进展的化合物、干扰RNA、抗-反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
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