CN101225403A - 靶向表皮生长因子受体的小干扰rna重组腺病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的作用。本发明使用腺病毒载体系统构建shuttle vector－穿梭载体和backbone vector－骨架载体在包装细胞293细胞中发生同源重组，得到预期的复制缺陷型重组腺病毒。本发明针对肺癌治疗和基因调节技术的难点，构建小干扰RNA病毒表达载体，不仅可提高小干扰RNA导入效率，还可延长RNA干扰效应的时间。通过动物体内实验验证了小干扰RNA重组腺病毒能产生RNA干扰效应，下调EGFR表达，抑制肿瘤生长。

Description

靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及重组腺病毒，具体涉及靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的作用。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)通过与配体结合形成复合物，引起一系列的生物效应，促进上皮再生、刺激体内多种细胞的分裂。EGFR基因的扩增及产物的过度表达与人体肿瘤的发生密切相关，人类多种肿瘤存在EGFR的过度表达。EGFR过表达与肺癌的恶性程度、转移、放化疗敏感性及预后密切相关，阻滞EGFR通路能有效地抑制肿瘤生长，说明EGFR是一个非常有前途的肺癌靶向治疗的靶点，以此靶点开发有效的药物可望使目前效果不甚理想的肺癌治疗有所突破。

目前以EGFR为靶点的肿瘤生物治疗手段存在有效率低、在延长患者生存期方面无优越性、价格昂贵、转染效率低、表达不稳定等问题，使得调控EGFR的肿瘤治疗研究尚未有突破性进展。

RNA干扰是由双链RNA引发的一种高效基因表达抑制途径，是转录后基因沉默的重要机制。近年来这一技术发展迅速，目前已经在基因组功能研究和疾病的基因治疗研究中取得了巨大进展。RNA干扰技术阻断基因表达具有高效率和高特异的特点，且RNA干扰具有级联放大效应，甚至其效应可传递至子代细胞，是适合肿瘤基因治疗的新手段。目前RNA干扰应用于临床治疗的主要难题就是如何增加小干扰RNA稳定性并提高导入效率，以提高RNA干扰的效率并延长RNA干扰效应时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒。

本发明的进一步目的是提供上述重组腺病毒在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的用途。

本发明针对肺癌治疗和基因调节技术的难点，实现动物体内核酸导入，产生RNA干扰效应，下调EGFR表达，抑制肿瘤生长。

本发明使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公司)，构建shuttle vector-穿梭载体(图1)，其中，修饰的CMV启动子驱动小发夹RNA表达，由修饰的SV40polyA signal作为终止子，和backbone vector-骨架载体在包装细胞293细胞中发生同源重组，得到预期的复制缺陷型重组腺病毒。

本发明的重组腺病毒通过下述方法制备：

根据EGFR基因在GenBank中的序列(NM_005228)设计对应的小干扰RNA。设计原则是：从启动子下游75碱基处寻找到第一个AA二聚体；记录AA下游19个碱基序列为目的序列；计算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比(G/C)。G/C比值接近50％为较理想，标准是大于30％小于70％；如果选择的序列中G/C含量不能达到要求，继续搜寻下一个AA二聚体，直到获得满意结果；在GenBank表达序列标签数据库中用BLAST检索，确认所设计小干扰RNA序列的唯一性。设计的针对EGFR基因的小干扰RNA序列，正义链：5’-GGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3’；反义链：5’-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3’；化学合成小干扰RNA初步验证了其抑制EGFR基因表达的效应；

以此序列为基础，设计靶向EGFR的小干扰RNA DNA表达模板：

5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’

3’-CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’序列进行酶切分析保证其中无Pac I，EcoR I，HindIII酶切位点；

使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公司)，以穿梭载体的多克隆位点中Xho I和Spe I为插入位点，将上述靶向EGFR的小干扰RNA DNA表达模板与穿梭载体连接，即构建了靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭载体，其中，修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40polyA signal作为终止子(图1)；

将上述构建的靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭载体和骨架载体在293细胞中同源重组，得到靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒Adv-shEGFR。

将所得的重组腺病毒扩增、纯化、鉴定后，测定病毒滴度和感染效率，分析重组腺病毒抑制EGFR表达的效率。以插入无关序列表达模板的重组腺病毒Adv-shNEG作为研究对照。

最后通过体内实验验证靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒的抗肿瘤活性。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。

本发明构建的小干扰RNA病毒表达载体，不仅可提高小干扰RNA导入效率，还可延长RNA干扰效应的时间。

附图说明

图1是pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统的穿梭载体结构图。以穿梭载体的多克隆位点中Xho I和Spe I为插入位点，插入DNA表达模版；修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40polyA signal作为终止子。

图2是免疫荧光染色检测感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后细胞EGFR表达变化，

其中，control：未处理组，AShEGFR：感染Adv-shEGFR组。

图3是免疫印迹检测感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后，细胞中EGFR蛋白水平的抑制，

其中，A：A549细胞，B：SPC-A1细胞，control：未处理组，AShNEG：感染Adv-shNEG组，AShEGFR：感染Adv-shEGFR组。

图4是免疫组织化学法检测A549细胞肿瘤组织中EGFR、PCNA表达，

其中，A：EGFR，B：PCNA，control：注射3％蔗糖/PBS对照组，AShNEG：注射Adv-shNEG组，AShEGFR：注射Adv-shEGFR组。

图5是免疫组织化学法检测SPC-A1细胞肿瘤组织中EGFR、PCNA表达，

其中，A：EGFR，B：PCNA，control：注射3％蔗糖/PBS对照组，AShNEG：注射Adv-shNEG组，AShEGFR：注射Adv-shEGFR组。

图6是免疫印迹检测肿瘤组织中EGFR表达，

其中，AShNEG：注射Adv-shNEG组，AShEGFR：注射Adv-shEGFR组。

图7是裸鼠皮下移植瘤内注射重组腺病毒，测量肿瘤体积，

其中，AShNEG：注射Adv-shNEG组，AShEGFR：注射Adv-shEGFR组。

具体实施方式

实施例1靶向EGFR的小干扰RNA穿梭载体的构建和鉴定

设计及合成小干扰RNA DNA表达模板：

5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’

3’-CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’

上述寡核苷酸退火形成双链结构，建立退火反应体系如下：

正义链                2μl

反义链                2μl

1×DNA拟和液          46μl

95℃孵育5分钟，72℃孵育10分钟，缓慢降至37℃孵育1小时；

取上步退火溶液5μl加入45μl去离子水，终浓度8ng/μl；

表达模板与穿梭载体连接反应：

pShEGFR反应体系         加入量

去离子水                11.25μl

EGFR表达模板            1.25μl

10×T4DNA缓冲液         1.5μl

穿梭载体                0.5μl

T4DNA连接酶(5U/μl)     0.5μl

22℃孵育过夜；65℃变性10分钟；

穿梭载体的转化：

A、感受态细菌(JM109)放置于冰水浴，使之解冻；

B、取50μl JM109，加3μl连接液搅匀后冰育30分钟；

C、42℃90秒，冰水中冷却5分钟，使质粒导入细菌；

D、预温SOC培养基400μl加入上述离心管中，250rpm 37℃振摇菌液2小时；

E、1000rpm离心5分钟，弃去上清，取上述转化菌菌液50μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜；

F、根据形成细菌克隆的数量初步判定连接反应是否成功；穿梭载体的测序鉴定：

挑取阳性克隆，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜。次日取1ml菌液，采用下列测序引物进行测序鉴定：

上游引物：5’-ggatttccaagtctccac-3’

下游引物：5’-agcaccttccagatctgc-3’

使用QIAGEN公司质粒抽提试剂盒大量提取穿梭载体，得到靶向EGFR的小干扰RNA穿梭载体。

实施例2腺病毒的重组及鉴定

穿梭载体和骨架载体的线性化：

反应体系          加入量(μl)

穿梭载体          1.0

Pac I             2.0

10×缓冲液        5.0

10×牛血清白蛋白  5.0

去离子水          补足体积至50.0μl

37℃水浴1.5小时；

反应体系          加入量(μl)

Lac Z骨架载体     8.0

Pac I             2.0

10×缓冲液        2.0

10×牛血清白蛋白  2.0

去离子水          补足体积至20.0μl

37℃水浴1.5小时；

采用磷酸钙法将线性化的穿梭载体和骨架载体共转染至293细胞中，并发生同源重组，得到靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒。

重组腺病毒的扩增：

A、10ml 10％胎牛血清/DMEM培养5×10⁶ 293细胞；

B、取0.5μl病毒保存液，加入10％胎牛血清/DMEM至1ml，混匀；

C、移去步骤a的培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次；

D、37℃5％CO2孵箱中培养120分钟，加入9ml 10％胎牛血清/DMEM；

E、再培养72小时，收集细胞，600g离心5分钟沉淀细胞；

F、病毒保存溶液重悬细胞，-20℃和37℃冻融3次；

G、台式离心机上以最大速率离心20分钟去除细胞碎片，收集上清；

H、反复扩增至需要病毒量。

重组腺病毒的纯化：

A、收集细胞，4℃，12500g离心30分钟；

B、弃上清，沉淀充分重悬于5mlCsCl(1.1g/ml)；

C、4℃，8000g离心5分钟，取上清；

D、在超速离心管中缓慢加入2mlCsCl(1.4g/ml)，3mlCsCl(1.3g/ml)；

E、4℃，60000g离心12h，吸出病毒带；

F、10mM Tris pH8.0稀释备用。

50％组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度：

A、收集一瓶293细胞，计数；用2％胎牛血清/DMEM准备20ml、10⁵/ml细胞；

B、在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液；

C、准备稀释病毒液：第1管中加入0.9ml2％胎牛血清/DMEM，其余加入1.8ml；第1管中再加入0.1ml病毒保存液，上下吸打5次混匀；换用新吸头，从第1管中吸取0.2ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度；用同一管病毒保存液进行第2轮稀释；最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照，37℃培养10天；10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现细胞病变效应(CPE)的孔数；

D、Karbers公式计算病毒滴度(T＝10^{1+d(s-0.5)-0.7}pfu/ml，d＝稀释倍数的对数；S＝阳性率之和)。

重组腺病毒的鉴定：

采用Qiagen基因组DNA抽提试剂盒提取重组腺病毒DNA，PCR反应鉴定。

A、PCR反应引物：

上游引物：5’-ggatttccaagtctccac-3’

下游引物：5’-agcaccttccagatctgc-3’

B、PCR反应体系

Adv-shEGFR             2.0μl

上游引物(20pm/μl)     0.5μl

下游引物(20pm/μl)     0.5μl

10×缓冲液             2.0μl

10mM dNTP              0.5μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)  0.5μl

去离子水               补足体积至20μl

C、PCR反应条件：

95℃，3分钟        1个循环

95℃，40秒

58℃，40秒

72℃，60秒         35个循环

72℃，30秒         1个循环。

实施例3重组腺病毒感染效率的测定

1.细胞准备：以5×10⁵/孔的密度将人肺腺癌细胞A549接种至6孔板，次日汇合率达50％左右；

2.使用感染复数(multiplicity of infection，MOI)分别为10、20、30、50、100的重组腺病毒(使用含2％胎牛血清的培养基稀释)和细胞共培养；

3.37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4-8小时，去上清，加入常规培养基继续培养48-72小时；

4.去除培养基，PBS漂洗；

5.去除PBS，0.25％戊二醛室温固定15分钟；

6.去固定液，PBS漂洗3×5分钟；

7.使用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒进行X-gal染色。

a.染色工作液配制

β-半乳糖苷酶染色液A 10.0μl

β-半乳糖苷酶染色液B 10.0μl

β-半乳糖苷酶染色液C 930.0μl

X-gal 50.0μl

b.将上述工作液1ml加入上述固定好的细胞中，37℃孵育20分钟甚至更长时间，直至部分细胞颜色变蓝，孵育时间不超过24小时。

使用腺病毒通过不同MOI值感染细胞，X-gal染色后发现感染A549、SPC-A1，MOI值分别为10，30时，约90％以上细胞呈蓝色，而随着MOI值的增加，细胞蓝染数无明显增加，细胞死亡数增加。

实施例4重组腺病毒阻断EGFR基因表达效率分析

重组腺病毒体外转染人肺腺癌细胞A549和SPC-A1，分别在转染3天、6天进行EGFR mRNA、蛋白水平的检测。

Adv-shEGFR体外感染肺腺癌细胞A549和SPC-A1。定量PCR检测EGFR基因mRNA表达变化：感染Adv-shEGFR 3天后，对A549，SPC-A1细胞中EGFR mRNA水平的抑制率分别达81.2％和79.8％。免疫荧光染色检测感染Adv-shEGFR前后细胞EGFR表达变化(图2)。免疫印迹检测，感染Adv-shEGFR 3天和6天后，与感染Adv-shNEG组相比，A549细胞EGFR蛋白水平抑制率分别为52.3％和80.2％，SPC-A1细胞EGFR蛋白水平抑制率分别为45.5％和85.8％(图3)。

实施例5体内实验验证靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒的抗肿瘤活性

收集对数生长期细胞A549，SPC-A1细胞，PBS调整细胞浓度至1×10⁷/ml。消毒裸小鼠右下肢皮肤，细胞悬液200μl注射入右下肢皮下。待成瘤鼠局部瘤体生长至5mm时，隔日于瘤体内多点注射重组腺病毒10¹⁰pfu/瘤体(病毒使用3％蔗糖/PBS稀释)。隔日测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，按公式求出肿瘤体积V＝ab²/2。根据公式计算抑瘤率＝(1-实验组肿瘤平均体积/对照组肿瘤体积)×100％。实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，部分组织中性甲醛固定，石蜡包埋，制备切片，免疫组织化学法检测A549肿瘤组织(图4)和SPC-A1肿瘤组织(图5)中EGFR、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达；部分组织以免疫印迹检测肿瘤组织中EGFR表达。

免疫印迹测定A549、SPC-A1肿瘤组织EGFR蛋白表达的抑制率分别为51.5％和44.8％(图6)。测量肿瘤体积，计算肿瘤抑制率分别达62.8％和52.4％(图7)。

Claims (6)

1.靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒，其特征是在腺病毒载体中，插入了靶向表皮生长因子受体的下述小干扰RNA表达模板：

5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’

3’CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’。

2.根据权利要求1所述的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒，其特征是所述的腺病毒载体是pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统。

3.根据权利要求1所述的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒的制备方法，其特征是包括下述步骤：

1)构建和鉴定靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA穿梭载体，

包括：设计及合成小干扰RNA DNA表达模板：

5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’

3’CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’

所述寡核苷酸退火形成双链结构；

表达模板与穿梭载体连接；

穿梭载体转化，测序鉴定，提取穿梭载体，得靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA穿梭载体；

2)重组及鉴定腺病毒

包括：穿梭载体和骨架载体线性化；采用磷酸钙法将线性化的穿梭载体和骨架载体共转染293细胞，发生同源重组，得靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤1的测序鉴定引物为：

上游引物：5’ggatttccaagtctccac-3’

下游引物：5’agcaccttccagatctgc-3’。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤1的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA穿梭载体，其中，修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40 polyA signal作为终止子。

6.权利要求1的靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒在制备抑制肿瘤生长药物中的用途。

Images