CN101223448A - 来自自身免疫病受试者的生物学样品的预处理 - Google Patents
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Abstract
本申请记载了用于预处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品以避免干扰的方法,尤其是在该样品将进行基于细胞的生物学活性测定法诸如中和性抗体测定法的情况下。
Description
这是一件非临时申请,依据35USC§119要求2005年5月20日提交的临时申请号60/682,990的优先权,将其完整公开内容收入本文作为参考。
发明领域
本发明关注用于预处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品以避免干扰的方法,尤其是在该样品将进行基于细胞的生物学活性测定法诸如中和性抗体测定法的情况下。
发明背景
淋巴细胞是在造血过程中在骨髓中生成的许多类型白细胞之一。有两种主要的淋巴细胞群:B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文中特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。
B细胞在骨髓内成熟,然后离开骨髓并在其细胞表面上表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异性的抗原时,细胞开始快速分裂且其后代分化成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体,但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
CD20抗原(也称作人B淋巴细胞限制分化抗原,Bp35)是位于前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上、具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白质(Valentineet al.,J.Biol.Chem.264(19):11282-11287(1989);Einfeld et al.,EMBO J.7(3):711-717(1988))。该抗原还在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson et al.,Blood 63(6):1424-1433(1984)),但在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或其它正常组织上没有找到(Tedder et al.,J.Immunol.135(2):973-979(1985))。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤(Tedder et al.,supra),并可能发挥钙离子通道的功能(Tedder et al.,J.Cell.Biochem.14D:195(1990))。
倘若CD20在B细胞淋巴瘤中表达,那么该抗原可充当“靶向”此类淋巴瘤的候选者。本质上,这样的靶向可概括如下:对患者施用对B细胞的CD20表面抗原特异的抗体,这些抗CD20抗体特异性结合正常B细胞和恶性B细胞二者的CD20抗原(在表面上);抗体与CD20表面抗原结合可导致赘生性B细胞的破坏和消减。另外,可以将具有破坏肿瘤潜力的化学药剂或放射性标记物与抗CD20抗体偶联,使得该药剂特异性“投递”至赘生性B细胞。不考虑方法,首要目标是破坏肿瘤;具体方法可根据所利用的具体抗CD20抗体来决定,因此靶向CD20抗原的可用方法可以有相当大的变化。
rituximab即利妥昔单抗(RITUXAN)抗体是针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体。rituximab就是1998年4月7日公告的美国专利No.5,736,137(Anderson et al.)中称作“C2B8”的抗体。rituximab指明用于治疗患有复发性或顽固性低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。在体外证明了rituximab介导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)并诱导凋亡(Reff et al.,Blood 83(2):435-445(1994);Maloneyet al.,Blood 88:637a(1996);Manches et al.,Blood 101:949-954(2003))。在实验中还观察到rituximab与化疗和毒素之间的协同作用。具体而言,rituximab使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素、和蓖麻毒蛋白的细胞毒性作用敏感(Demidem et al.,Cancer Chemotherapy &Radiopharmaceuticals 12(3):177-186(1997))。体内临床前研究显示了rituximab从猕猴的外周血、淋巴结、和骨髓消减B细胞(Reff et al.,Blood 83:435-445(1994))。
还在B细胞和自身抗体似乎在疾病病理生理学中发挥作用的多种非恶性自身免疫性病症中研究了rituximab(Edwards et al.,Biochem Soc.Trans.30:824-828(2002))。有报导说rituximab潜在减轻例如类风湿性关节炎(RA)(Leandro et al.,Ann.Rheum.Dis.61:883-888(2002);Edwards et al.,ArthritisRheum.46(Suppl.9):S46(2002);Stahl et al.,Ann.Rheum.Dis.62(Suppl.1):OP004(2003);Emery et al.,Arthritis Rheum.48(9):S439(2003))、狼疮(Eisenberg,Arthritis.Res.Ther.5:157-159(2003);Leandro et al.,ArthritisRheum.46:2673-2677(2002);Gorman et al.,Lupus 13:312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D’Arena et al.,Leuk.Lymphoma 44:561-562(2003);Stasi etal.,Blood 98:952-957(2001);Saleh et al.,Semin.Oncol.27(Suppl.12):99-103(2000);Zaia et al.,Haematolgica 87:189-195(2002);Ratanatharathorn et al.,Ann.Int.Med.133:275-279(2000))、纯红细胞再生障碍(Auner et al.,Br.J.Haematol.116:725-728(2002))、自身免疫性贫血(Zaja et al.,Haematologica87:189-195(2002)(勘误见Haematologica 87:336(2002))、冷凝集素病(Layioset al.,Leukemia 15:187-8(2001);Berentsen et al.,Blood 103:2925-2928(2004);Berentsen et al.,Br.J.Haematol.115:79-83(2001);Bauduer,Br.J.Haematol.112:1083-1090(2001);Damiani et al.,Br.J.Haematol.114:229-234(2001))、重度胰岛素耐受B型综合征(Coll et al.,N.Engl.J.Med.350:310-311(2004))、混合性冷球蛋白血症(DeVita et al.,Arthritis Rheum.46(Suppl.9):S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja et al.,Neurology 55:1062-63(2000);Wylam et al.,J.Pediatr.143:674-677(2003))、韦格纳氏肉芽肿病(Specks et al.,Arthritis &Rheumatism 44:2836-2840(2001))、顽固性寻常型天疱疮(Dupuy et al.,Arch.Dermatol.140:91-96(2004))、皮肌炎(Levine,Arthritis Rheum.46(Suppl.9):S1299(2002))、斯耶格伦氏综合征(Somer et al.,Arthritis & Rheumatism49:394-398(2003))、活动性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja et al.,Blood101:3827-3834(2003))、寻常型天疱疮(Dupay et al.,Arch.Dermatol.140:91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk et al.,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry74:485-489(2003))、瘤外视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli et al.,Neurology 60(Suppl.1)PO5.128:A395(2003))、及复发-缓和型多发性硬化(RRMS)(Cross et al.,(abstract)“Preliminary results from a phase II trial ofrituximab in MS”,Eighth Annual Meeting of the Americas Committees forResearch and Treatment in Multiple Sclerosis(美国多发性硬化研究与治疗委员会第八次年会),20-21(2003))的征候和症状。
已经在类风湿性关节炎(RA)患者中进行了II期研究(WA16291),提供了有关rituximab的安全性和功效的48周跟踪数据(Emery et al.,Arthritis Rheum.48(9):S439(2003);Szczepanski et al.,Arthritis Rheum.48(9):S121(2003);Edwards et al.,“Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patientswith rheumatoid arthritis”,N.Engl.J.Med.350:2572-82(2004))。将总共161名患者随机平分为四个治疗组:甲氨蝶呤、仅用rituximab、rituximab加甲氨蝶呤、及rituximab加环磷酰胺(CTX)。rituximab的治疗方案为第1天和第15天静脉内施用1克。大多数RA患者对rituximab输注有很好的耐受,有36%的患者在其初次输注期间发生至少一例不良事件(与30%接受安慰剂的患者相比)。总之,认为大多数不良事件在严重程度上是轻度到中度的,而且所有治疗组之间很均衡。在48周中四个组共有19例重度不良事件,其中rituximab/CTX组稍多一些。所有组之间的感染发生率很均衡。该RA患者群中重度感染的平均比率为每100名患者-年有4.66例,低于基于社会的流行病学研究中所报告的RA患者中需要入院治疗的感染比率(每100名患者-年为9.57例)(Doranet al.,Arthritis Rheum.46:2287-2293(2002))。
所报导的rituximab在少数神经学病症患者中的安全谱,包括自身免疫性神经病(Pestronk et al.,supra)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli et al.,supra)、和RRMS(Cross et al.,supra),与在肿瘤学或RA中所报导的类似。在正在RRMS患者中进行的rituximab联合干扰素-β(IFN-β)或醋酸格拉默的研究者发起试验(IST)(Cross et al.,supra)中,10名接受治疗的患者中有1人在初次rituximab输注后发生中度发烧和打寒战,之后入院彻夜观察,而其余9名患者完成了四次输注的方案,没有报告任何不良事件。
关注CD20抗体和CD20结合分子的专利和专利出版物包括美国专利Nos.5,776,456,5,736,137,5,843,439,6,399,061和6,682,734,以及US 2002/0197255,US 2003/0021781,US 2003/0082172,US 2003/0095963,US 2003/0147885(Anderson et al.);美国专利No.6,455,043,US 2003/0026804和WO2000/09160(Grillo-Lopez,A.);WO 2000/27428(Grillo-Lopez and White);WO2000/27433和US 2004/0213784(Grillo-Lopez and Leonard);WO 2000/44788(Braslawsky et al.);WO 2001/10462(Rastetter,W.);WO 01/10461(Rastetterand White);WO 2001/10460(White and Grillo-Lopez);US 2001/0018041,US2003/0180292,WO 2001/34194(Hanna and Hariharan);US 2002/0006404和WO 2002/04021(Hanna and Hariharan);US 2002/0012665和WO 2001/74388(Hanna,N.);US 2002/0058029(Hanna,N.);US 2003/0103971(Hariharan andHanna);US 2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez,A.);WO2001/97858(White,C.);US 2002/0128488和WO 2002/34790(Reff,M.);WO2002/060955(Braslawsky et al.);WO 2002/096948(Braslawsky et al.);WO2002/079255(Reff and Davies);美国专利No.6,171,586和WO 1998/56418(Lam et al.);WO 1998/58964(Raju,S.);WO 1999/22764(Raju,S.);WO1999/51642,美国专利No.6,194,551,美国专利No.6,242,195,美国专利No.6,528,624和美国专利No.6,538,124(Idusogie et al.);WO 2000/42072(Presta,L.);WO 2000/67796(Curd et al.);WO 2001/03734(Grillo-Lopez et al.);US2002/0004587和WO 2001/77342(Miller and Presta);US 2002/0197256(Grewal,I.);US 2003/0157108(Presta,L.);WO 04/056312(Lowman et al.);US2004/0202658和WO 2004/091657(Benyunes,K.);WO 2005/000351(Chan,A.);US 2005/0032130 A1(Beresini et al.);US 2005/0053602 A1(Brunetta,P.);美国专利Nos.6,565,827,6,090,365,6,287,537,6,015,542,5,843,398和5,595,721(Kaminski et al.);美国专利Nos.5,500,362,5,677,180,5,721,108,6,120,767和6,652,852(Robinson et al.);美国专利No.6,410,391(Raubitschek et al.);美国专利No.6,224,866和WO 00/20864(Barbera-Guillem,E.);WO 2001/13945(Barbera-Guillem,E.);US 2005/0079174 A1(Barbera-Guillem et al.);WO2000/67795(Goldenberg);US 2003/0133930和WO 2000/74718(Goldenbergand Hansen);US 2003/0219433和WO 2003/68821(Hansen et al.);WO2004/058298(Goldenberg and Hansen);WO 2000/76542(Golay et al.);WO2001/72333(Wolin and Rosenblatt);美国专利No.6,368,596(Ghetie et al.);美国专利No.6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg,D.);US 2003/0026801(Weiner and Hartmann);WO 2002/102312(Engleman,E.);US 2003/0068664(Albitar et al.)WO 2003/002607(Leung,S.);WO 2003/049694,US2002/0009427和US 2003/0185796(Wolin et al.);WO 2003/061694(Sing andSiegall);US 2003/0219818(Bohen et al.);US 2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen et al.)US 2003/0219818(Bohen et al.);US 2002/0136719(Shenoy etal.);WO 2004/032828(Wahl et al.));及WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。还可参见美国专利No.5,849,898和EP 330,191(Seed et al.);EP 332,865 A2(Meyer and Weiss);美国专利No.4,861,579(Meyer et al.);US 2001/0056066(Bugelski et al.);WO 1995/03770(Bhat et al.);US 2003/0219433 A1(Hansen etal.);WO 2004/035607(Teeling et al.);US 2004/0093621(Shitara et al.);WO2004/103404(Watkins et al.);WO 2005/000901(Tedder et al.);US2005/0025764(Watkins et al.);WO2005/016969和US 2005/0069545 A1(Carr etal.);WO 2005/014618(Chang et al.)。
关注使用rituximab的疗法的出版物包括:Perotta and Abuel,“Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”,Abstract# 3360 Blood10(1)(part 1-2):p.88B(1998);Perotta et al.,“Rituxan in the treatment of chronicidiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)”,Blood 94:49(abstract)(1999);Matthews,R.,“Medical Heretics”,New Scientist(7 April,2001);Leandro et al.,“Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis:early evidence for safety,efficacyand dose response”,Arthritis and Rheumatism 44(9):S370(2001);Leandro et al.,“An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”,Arthritis and Rheumatism 46:2673-2677(2002),其中在2周期间,每名患者接受两次500mg rituximab输注、两次750mg环磷酰胺输注、和高剂量口服皮质类固醇,其中两名接受治疗的患者分别在7个月和8个月时复发且已经用不同方案复治;Weide et al.,“Successful long-term treatment of systemic lupuserythematosus with rituximab maintenance therapy”,Lupus 12:779-782(2003),其中一名患者用rituximab治疗(375mg/m2×4,以一周为间隔重复)并每5-6个月投递更多的rituximab应用,然后每三个月接受rituximab 375mg/m2的维持疗法,第二名患有顽固性SLE的患者得到了rituximab的成功治疗且每三个月接受维持疗法,两名患者对rituximab疗法都有较好的响应;Edwards andCambridge,“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocoldesigned to deplete B lymphocytes”,Rheumatology 40:205-211(2001);Cambridge et al.,“B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis:serial studies of immunological parameters”,Arthritis Rheum.46(Suppl.9):S1350(2002);Edwards et al.,“Efficacy and safety of rituximab,a B-cell targetedchimeric monoclonal antibody:A randomized,placebo controlled trial in patientswith rheumatoid arthritis”,Arthritis and Rheumatism 46(9):S197(2002);Pavelkaet al.,Ann.Rheum.Dis.63(S1):289-90(2004);Emery et al.,Arthritis Rheum.50(S9):S659(2004);Levine and Pestronk,“IgM antibody-relatedpolyneuropathies:B-cell depletion chemotherapy using rituximab”,Neurology52:1701-1704(1999);DeVita et al.,“Efficacy of selective B cell blockade in thetreatment of rheumatoid arthritis”,Artgritis & Rheum 46:2029-2033(2002);Hidashida et al.,“Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis withrituximab”,展示于the Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology(美国风湿病学学会科学年会),Oct 24-29,New Orleans,LA2002;Tuscano,J.,“Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoidarthritis with rituximab”,展示于the Annual Scientific Meeting of the AmericanCollege of Rheumatology,Oct 24-29,New Orleans,LA 2002;Martin and Chan,“Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity;insights from the clinic”,Immunity 20:517-527(2004);Silverman and Weisman,“Rituximab Therapy andAutoimmune Disorders,Prospects for Anti-B Cell Therapy”,Arthritis andRheumatism 48:1484-1492(2003);Kazkaz and Isenberg,“Anti B cell therapy(rituximab)in the treatment of autoimmune diseases”,Current opinion inpharmacology 4:398-402(2004);Virgolini and Vanda,“Rituximab inautoimmune diseases”,Biomedicine & pharmacotherapy 58:299-309(2004);Klemmer et al.,“Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with aAntiCD20 monoclonal antibody Rituximab”,Arthritis And Rheumatism48(9):S624-S624(2003);Kneitz et al.,“Effective B cell depletion with rituximabin the treatment of autoimmune diseases”,Immunobiology 206:519-527(2002);Arzoo et al.,“Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorderswith an anti-CD20 monoclonal antibody(rituximab)”,Annals of the RheumaticDiseases 61(10):922-4(2002);Comment in Ann Rheum Dis.61:863-866(2002);Lake and Dionne,“Future Strategies in Immunotherapy”,于Burger′s MedicinalChemistry and Drug Discovery(2003 by John Wiley & Sons,Inc.)论文在线粘贴日期:2003年1月15日(Chapter 2“Antibody-Directed Immunotherapy”);Liang and Tedder,Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Section:CD20 asan Immunotherapy Target,论文在线粘贴日期:2002年1月15日,题为“CD20”;Appendix 4A题为“Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens”byStockinger et al.,编:Coligan et al.,于Current Protocols in Immunology(2003John Wiley & Sons,Inc)在线粘贴日期:2003年5月;印刷出版日期:2003年2月;Penichet and Morrison,“CD Antibodies/molecules:Definition;AntibodyEngineering”,于Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Section:Chimetic,Humanized and Human Antibodies;在线粘贴日期:2002年1月15日;Specks etal.,“Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonalantibody therapy”,Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840(2001);在线摘要提交和邀请Koegh et al.,“Rituximab for Remission Induction in SevereANCA-Associated Vasculitis:Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in10 Patients”,American College of Rheumatology,Session Number:28-100,Session Title:Vasculitis,Session Type:ACR Concurrent Session,PrimaryCategory:28 Vasculitis,Session 10/18/2004(http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp);Eriksson,“Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitistreated with rituximab”,Kidney and Blood Pressure Resesrch 26:294(2003);Jayne et al.,“B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis”,Kidneyand Blood Pressure Research 26:294(2003);Jayne,poster 88(11th InternationalVasculitis and ANCA workshop),2003 American Society of Nephrology;Stoneand Specks,“Rituximab Therapyfor the Induction of Remission and Tblerance inANCA-associated Vasculitis”,于the Clinical Trial Research Summary of the2002-2003 Immune Tolerance Network,http://www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html。还可参见Leandro et al.,“B cell repopulation occurs mainly fromB cells in patientwith rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus”,Arthritis Rheum.48(Suppl.9):S1160(2003)。
美国专利申请No.2003/0068664(Albitar et al.)记载了用于测定针对rituximab的人抗嵌合抗体(HACA)的ELISA测定法。
美国专利申请No.2005/0032130 A1(Beresini and Song)披露了检测治疗用抗体诸如CD20抗体的中和性抗体的方法。
Mire-Sluis et al.,J.Immunol.Methods 289:1-16(2004)提供了关于用于检测宿主针对生物技术产品的抗体的免疫测定法的检测和优化的建议。
Hong et al.,J Immunol Methods 294:189-197(2004)记载了用于针对细胞表面蛋白CD20的人源化抗体的一种基于活细胞和抗独特型抗体的简单定量ELISA。
Wei et al.,J Immunol Methods 293:115-26(2004)记载了用于在临床研究中检测针对重组人红细胞生成素的中和性抗体的一种基于细胞的生物测定法。
Leon et al.,Clin Exp Med 2(2):59-67(2002)(勘误见Leon et al.,Clin ExpMed 2(3):157(2002))记载了鸽子饲养者中抗鸟类抗体的检测中类风湿因子活性的干扰。Stahl et al.,Vox Sang 74(4):253-255(1998)涉及用于检测IgM冷凝集素滴度高的患者中的IgG同种抗体的血清亲和层析。Koper et al.,Clin ChemLab Med 36(1):23-28(1998)使用亲和层析量化了CA125测量中的IgG和IgM人抗小鼠抗体(HAMA)干扰。Crowley and Walters,J Chromatogr 266:157-162(1983)涉及血清中免疫球蛋白通过高效亲和层析的测定。
还可参见Maeda et al.,Intl.J.Hematology 74(1):70-75(2001);Gordon etal.,Blood 98(11 Part 2):228b(2001);Kaminski et al.,Blood 96(11 Part 1):734a(2000);Shan et al.,Cancer Immunology Immunotherapy 48(12):673-683(2000);Idusogie et al.,Journal of Immunology 166(4):2571-2575(2001);Reff et al.,Blood 83(2):435-445(1994);Zaya et al.,Blood 98(11 Part 2):41b(2001)。
发明概述
本发明涉及,至少部分涉及来自患有自身免疫性疾病诸如RA或SLE的受试者的血清包含干扰基于细胞的生物测定法诸如中和性抗体测定法实施的物质的发现。尝试了多种方法来解决干扰问题,直到免疫球蛋白亲和纯化被鉴定为消除干扰的优选方法,从而可以在生物测定法中获得更可靠的结果。
因此,在第一个方面,本发明提供了处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品的方法,其包括:
(a)使样品脱脂(delipidating);
(b)亲和纯化样品中的免疫球蛋白;
(c)浓缩经纯化的免疫球蛋白;并
(d)将经浓缩的免疫球蛋白进行基于细胞的生物学活性测定法。
本发明进一步提供了治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,其包括:
(a)对受试者施用治疗性抗体或免疫粘附素以治疗自身免疫性疾病;
(b)获取来自受试者的生物学样品;
(c)亲和纯化生物学样品中的免疫球蛋白;并
(d)将经纯化的免疫球蛋白进行中和性抗体测定法。
为用于上述方法,本发明进一步提供了诊断试剂盒,其包含:
(a)脱脂(delipidation)试剂;
(b)用于免疫球蛋白亲和纯化的缓冲液;和
(c)指导诊断试剂盒的使用者实施上述方法之一或二者的使用手册。
附图简述
图1A是比较鼠2H7(SEQ ID NO:1)、人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO:2)和人κ轻链亚类I(SEQ ID NO:3)各自轻链可变域(VL)氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下:CDR1(SEQ ID NO:4)、CDR2(SEQ IDNO:5)和CDR3(SEQ ID NO:6)。
图1B是比较鼠2H7(SEQ ID NO:7)、人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO:8)和人重链亚类III共有序列(SEQ ID NO:9)各自重链可变域(VH)氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下:CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。
在图1A和图1B中,每条链中的CDR1、CDR2和CDR3围在括号内,侧翼是框架区FR1-FR4,如图所示。2H7指鼠2H7抗体。两行序列之间的星号指示两种序列间不同的位置。残基编号方式依照Kabat et al.,Sequences ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991),插入显示为a、b、c、d和e。
图2显示了成熟2H7.v16与2H7.v511轻链(分别为SEQ ID NO:13和15)的比对,标示了Kabat可变域残基编号和Eu恒定域残基编号。
图3显示了成熟2H7.v16与2H7.v511重链(分别为SEQ ID NO:14和16)的比对,标示了Kabat可变域残基编号和Eu恒定域残基编号。
图4描绘了通过中和性抗体(NAb)测定法得到的Rituximab的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
图5描绘了通过NAb测定法得到的关于以下样品的CDC:对照、山羊抗rituximab CDR抗体、和山羊抗人Fc抗体。
图6显示了CDC NAb测定法中的血清耐受,比较了来自正常人受试者的血清(左图)与来自类风湿性关节炎(RA)受试者的血清(右图)的结果。
图7描绘了通过CDC NA测定法得到的关于以下各项的测定读数:CELLTITER-GLO发光细胞生存能力测定法、钙黄绿素、乳糖脱氢酶(LDH)、和ALAMAR BLUETM(刃天青)。
图8对测定读数比较了包含ALAMAR BLUETM(刃天青)(左图)或CELLTITER-GLO(右图)的RA血清干扰。
图9描绘了用于本文中血清预处理的优选规程。
图10显示了血清预处理对未经血清预处理的(左图)和经过血清预处理的(右图)RA血清读数的影响。
图11描绘了改变NAb测定法中所用细胞数目的影响。
图12描绘了rituximab剂量选择,对NAb的灵敏度。
图13显示了NAb测定法中的药物干扰,其中NAb∶Rituxan比率为0∶1(左图)或5∶1(右图)。
发明详述
I.定义
除非另有说明,“生物学样品”在本文中指从人类受试者得到的样品。受试者优选是自身免疫性疾病受试者。样品可包含来自受试者的、结合曾经用于治疗该患者的抗体或药物的免疫球蛋白,诸如人抗鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)。生物学样品可例如包括血清、血浆、溶胞物、乳汁、唾液、玻璃体液、滑液、腹膜腔液、泪液、组织匀浆,但优选血清。样品可来自已经用药物治疗过的受试者(在这种情况中,样品可进一步包含药物,诸如治疗用抗体或免疫粘附素),或者可来自未接受过治疗或未用过药物的受试者。
“自身免疫性疾病”或“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织或器官引起的和针对个体自身组织或器官的疾病或病症,或其共分离(co-segregate)或表现,或者由此产生的疾患。在一个实施方案中,它指因B细胞生成对正常身体组织和抗原有反应性的抗体引起的或因其加重的疾患。在其它实施方案中,自身免疫病指牵涉对自身抗原(例如核抗原)的表位特异性的自身抗体分泌的疾病。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫学关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、和幼发型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、和强直性脊柱炎),炎性过度增殖性皮肤病,银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病,特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征,皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎,x连锁的高IgM综合征,变应性眼内炎性疾病,荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹(包括慢性自身免疫性荨麻疹),肌炎,多肌炎/皮肌炎,青少年型皮肌炎,中毒性表皮坏死松解症,硬皮病(包括系统性硬皮病),硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsingremitting)MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic)硬化,视神经脊髓炎(NMO),炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免疫介导的胃肠病、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、和自身免疫性炎性肠病),肠炎,坏疽性脓皮症,结节性红斑,原发性硬化性胆管炎,呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS),脑膜炎,整个或部分葡萄膜的炎症,虹膜炎,脉络膜炎,自身免疫性血液学病症,类风湿性脊椎炎,类风湿性滑膜炎,遗传性血管性水肿,脑神经损伤像脑膜炎中的,妊娠疱疹,妊娠性类天疱疮,阴囊瘙癣(pruritis scroti),自身免疫性早熟性卵巢衰竭,因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失,IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎,脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎,葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎,具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型和II型)、和急进性GN,增殖性肾炎,自身免疫性多腺体内分泌衰竭,龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎,龟头包皮炎,离心性环状红斑,持久性色素异常性红斑,多形性红斑,环状肉芽肿,光泽苔藓,硬化萎缩性苔藓,慢性单纯苔藓,小棘苔藓,扁平苔藓,片层状鱼鳞癣,表皮松解性角化过度,恶变前角化,坏疽性脓皮症,变应性疾患和应答,变应性反应,湿疹包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema),哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale)和自身免疫性哮喘,涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患,针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应,慢性肺部炎性疾病,自身免疫性心肌炎,白细胞粘附缺陷,狼疮包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、狼疮脱发、系统性红斑狼疮(SLE)(诸如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮,幼发型(I型)糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM),成人期发作的糖尿病(II型糖尿病),自身免疫性糖尿病,特发性尿崩症,糖尿病视网膜病变,糖尿病肾病,糖尿病大动脉病症,与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答,结核病,结节病,肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病,粒细胞缺乏,血管炎病包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、微观多动脉炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎(诸如系统性坏死性血管炎)、和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关小血管血管炎,颞动脉炎,再生障碍性贫血,自身免疫性再生障碍性贫血,库姆斯(Coombs)阳性贫血,戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血,溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA),恶性贫血(anemia pemiciosa),阿狄森氏(Addison)病,单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA),因子VIII缺乏,血友病A,自身免疫性嗜中性粒细胞减少症,全血细胞减少症,白细胞减少症,涉及白细胞渗出的疾病,CNS炎性病症,阿耳茨海默氏(Alzheimer)病,帕金森氏(Parkinson)病,多器官损伤综合征诸如那些脓毒症、外伤或出血继发的,抗原-抗体复合物介导的疾病,抗肾小球基底膜病,抗磷脂抗体综合征,变应性神经炎,贝切特氏(Behcet)病/综合征,卡斯尔曼氏(Castleman)综合征,古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征,雷诺氏(Reynaud)综合征,斯耶格伦氏(Sjgren)综合征,史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征,类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮,天疱疮包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮,自身免疫性多内分泌病,莱特氏(Reiter)病或综合征,热伤,先兆子痫,免疫复合物病症诸如免疫复合物肾炎,抗体介导的肾炎,多神经病,慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病,血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP),巩膜炎诸如特发性角膜-巩膜炎、巩膜外层炎,睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎,原发性甲状腺功能减退症,甲状旁腺功能减退,自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎(诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏(Graves)病,多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺性内分泌病综合征),瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征,僵体或僵人综合征,脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE),重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力,小脑变性,神经性肌强直,视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS),和感觉神经病,多病灶运动神经病,席汉氏(Sheehan)综合征,自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎,淋巴样间质性肺炎(LIP),梗阻性细支气管炎(非移植物)对NSIP,格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征,贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病),特发性IgA肾病,线性IgA皮肤病,急性热性嗜中性白细胞皮肤病,角质层下脓疱皮肤病,一过性棘层松解性皮肤病,硬化诸如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变,自身免疫性肠病综合征,乳糜泻,腹腔或腹部疾病,口炎性腹泻(麸质肠病),顽固性口炎性腹泻,特发性口炎性腹泻,冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病),冠状动脉病,自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失,多软骨炎诸如顽固性或复发的或复发性多软骨炎,肺泡蛋白沉着症,寇甘氏(Cogan)综合征/非梅毒性间质性角膜炎,贝耳氏(Bell)麻痹,斯威特氏(Sweet)病/综合征,自身免疫性酒糟鼻,带状疱疹相关疼痛,淀粉样变,非癌性淋巴细胞增多,原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)),周围神经病,瘤外综合征,通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病,孤独症,炎性肌病,局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS),内分泌性眼病,葡萄膜视网膜炎,脉络膜视网膜炎,自身免疫性肝脏病学病症,纤维肌痛,多发性内分泌衰竭,施密特氏(Schmidt)综合征,肾上腺炎,胃萎缩,早老性痴呆,脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病,德雷斯勒氏(Dressler)综合征,斑秃,全秃,CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张),男性和女性自身免疫性不孕不育例如由于抗精虫抗体的,混合性结缔组织病,恰加斯氏(Chagas)病,风湿热,习惯性流产,农民肺,多形红斑,心脏切开术后综合征,柯兴氏(Cushing)综合征,养鸟者肺,变应性肉芽肿性血管炎,良性淋巴细胞性血管炎,阿尔波特氏(Alport)综合征,肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎,间质性肺病,输血反应,麻风,疟疾,寄生虫病诸如利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病,曲霉病,Sampter氏综合征,卡普兰氏(Caplan)综合征,登革,心内膜炎,心内膜心肌纤维化,弥漫性肺间质纤维化,间质性肺纤维化,肺纤维化,特发性肺纤维化,囊性纤维化,眼内炎,持久隆起性红斑,胎儿成红细胞增多症,嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征,费尔提氏(Felty)综合征,flariasis,睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、或Fuch氏睫状体炎,亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜,人免疫缺陷病毒(HIV)感染,SCID,获得性免疫缺陷综合征(AIDS),艾柯病毒感染,脓毒症,内毒素血症,胰腺炎,甲状腺毒症(thyroxicosis),细小病毒感染,风疹病毒感染,种痘后综合征,先天性风疹感染,爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染,腮腺炎,埃文斯(Evans)综合征,自身免疫性性腺衰竭,西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病,链球菌后肾炎,闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans),甲状腺毒症,脊髓痨,脉络膜炎,巨细胞性多肌痛,慢性超敏感性肺炎,干燥性角膜结膜炎,流行性角膜结膜炎,特发性肾炎综合征,微小病变肾病,良性家族性和缺血-再灌注损伤,移植器官再灌注,视网膜自身免疫,关节炎症,支气管炎,慢性阻塞性气道/肺部疾病,硅沉着病,口疮,口疮性口炎,动脉硬化性病症,无精子发生(aspermiogenese),自身免疫性溶血,伯克氏(Boeck)病,冷球蛋白血症,杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩,晶体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica),变应性小肠炎(enteritis allergica),麻风节结性红斑,特发性面瘫,慢性疲乏综合征,风湿热(febris rheumatica),哈-里二氏(Hamman-Rich)病,感觉神经性听觉丧失,阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica),性腺功能减退,局限性回肠炎(ileitisregionalis),白细胞减少症,传染性单核细胞增多症,横贯性(traverse)脊髓炎,原发性特发性粘液水肿,肾病,交感性眼炎(ophthalmia symphatica),肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa),胰腺炎,急性多神经根炎,坏疽性脓皮症,奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎,获得性脾萎缩,非恶性胸腺瘤,白癜风,中毒性休克综合征,食物中毒,涉及T细胞浸润的疾患,白细胞粘附缺陷,与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答,涉及白细胞渗出的疾病,多器官损伤综合征,抗原-抗体复合物介导的疾病,抗肾小球基底膜病,变应性神经炎,自身免疫性多内分泌病,卵巢炎,原发性粘液水肿,自身免疫性萎缩性胃炎,交感性眼炎,风湿病,混合性结缔组织病,肾病综合征,胰岛炎,多内分泌衰竭,自身免疫性多腺性综合征I型,成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH),心肌病诸如扩张型心肌病,获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita,EBA),血色素沉着,心肌炎,肾病综合征,原发性硬化性胆管炎,化脓性或非化脓性鼻窦炎,急性或慢性鼻窦炎,筛窦炎,额窦炎,上颌窦炎或蝶窦炎,嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿,过敏反应,血清阴性脊椎关节炎病,多内分泌自身免疫病,硬化性胆管炎,巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病,布鲁顿氏(Bruton)综合征,婴儿期一过性低丙种球蛋白血症,威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征,共济失调性毛细管扩张综合征,血管扩张,与以下各项有关的自身免疫性病症:胶原病、风湿病、神经病学疾病、淋巴结炎、血压应答降低(reduction in bloodpressure response)、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管化的疾病,变应性超敏感性病症,肾小球肾炎病,再灌注损伤,缺血再灌注病症,心肌或其它组织的再灌注损伤,淋巴瘤气管支气管炎,炎性皮肤病,具有急性炎性成分的皮肤病,多器官衰竭,大疱病,肾皮质坏死,急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症,眼和眶炎性病症,粒细胞输血相关综合征,细胞因子诱发的中毒,发作性睡病,急性重度炎症,慢性顽固性炎症,肾盂炎,动脉内增生,消化性溃疡,心瓣炎,和子宫内膜异位症。
“受试者”在本文中指人类受试者。
“自身免疫病受试者”在本文中指已经或有风险发生自身免疫病的受试者。
“脱脂”在本文中意指从生物学样品诸如血清中除去脂质。需要除去样品中可能存在的、可能阻塞或填塞纯化柱的脂质时可进行脱脂。脱脂可通过多种方法来实现,包括使用吸收剂(诸如LIPOSORB;山梨聚糖酯类/聚氧乙烯山梨聚糖酯类)、有机萃取、过滤、离心、诸如此类。
“亲和纯化”意指使用选择性或优先结合待纯化的化合物或组合物(例如含Fc区多肽)的吸附剂(优选固定化的)。例子包括蛋白A+G纯化;IgG亲和纯化(例如使用MELON GELTM,Pierce);抗免疫球蛋白抗体(单独使用或联合对一种或多种同种型的特异性;例如为每种同种型的特异性亲和纯化偶联的抗人IgG、IgA、IgM和IgE的组合);具有免疫球蛋白结合特性的任何其它吸附剂(例如PIERCE T-GELTM)。本文中优选的亲和纯化方法牵涉使用蛋白A+G亲和纯化(见下文定义)从生物学样品中纯化出IgG、IgA、IgM和IgE抗体同种型。优选的是,本文中的亲和纯化纯化得到基本上所有同种型的含Fc区多肽。
“含Fc区多肽”在本文中指包含Fc区的多肽。此类多肽的例子包括治疗用抗体、免疫粘附素、和来自受试者的免疫球蛋白(包括受试者的抗药物免疫球蛋白)。
“吸附剂”在本文中指能够在其表面附着其它物质而没有任何共价键合的物质或组合物。优选的是,吸附剂是固定化的。
“固定化的”吸附剂指附于固相的吸附剂。
“固相”意指吸附剂可附着的非水性基质。本文中感兴趣的固相一般包括玻璃、硅土、琼脂糖或聚苯乙烯表面。固相可以包括例如纯化柱或离散颗粒的不连续相。
“蛋白A+G亲和纯化”在本文中指使用蛋白A和蛋白G(包括其变体、片段、和/或融合物,优选固定在固相上的)从样品中除去免疫球蛋白或含Fc区多肽。此类纯化包括基本上同时进行的蛋白A和蛋白G纯化,以及任何次序的序贯纯化(即先蛋白A后蛋白G,反之亦然)。
“浓缩”在本文中意指提高目的化合物或组合物的浓度。例如,可使用浓缩器(诸如Pierce ICON蛋白质浓缩器或CENTRICON-30TM)、离心、过滤等来提高样品中免疫球蛋白的浓度。
表述“生物学活性”指药剂诸如本文中的治疗用抗体或免疫粘附素的可测量功能。设想了多种活性,包括但不限于补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、凋亡、离子通道调控、抑制细胞(例如表达治疗用抗体或免疫粘附素可结合的抗原的细胞)生长等。
“生物学活性测定法”指评估药剂或组合物诸如治疗用抗体或免疫粘附素的生物学活性的测定法。
在本文中,“基于细胞的”测定法指利用细胞(包括细胞系)来评估药剂或组合物(诸如治疗用抗体或免疫粘附素)的生物学活性的生物测定法。优选的是,测定法中所使用的细胞或细胞系表达治疗用抗体或免疫粘附素所结合的抗原。
生物学样品(包括经过预处理的样品或经过纯化的免疫球蛋白制备物)
“阻断”拮抗剂或抗体的生物学活性的能力指部分和完全阻断该活性。
“中和性抗体”在本文中指不仅结合目的抗原(例如治疗用抗体或免疫粘附素)而且还在一定程度上抑制该抗原生物学活性的抗体。
在本文中,“中和性抗体测定法”指评估样品中中和性抗体存在情况的测定法。
“干扰”在本文中指存在干扰基于细胞的生物学活性测定法(诸如中和性抗体测定法)的再现性的化合物或组合物。样品中存在干扰可通过例如测定来自将进行生物测定法的目标人群中未用过药物的自身免疫受试者的血清来验证。若测定法证明这些个体间有高度易变的细胞应答,则可得出结论,一份或多份样品中存在血清干扰。优选的是,干扰不是类风湿性因子(RF)、免疫球蛋白、或曾经用于治疗受试者的药物。
“B细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞,包括幼稚B细胞、记忆B细胞或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。
“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达的、可以用与它结合的拮抗剂或抗体靶向它的抗原。例示性的B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志(描述参见The Leukocyte Antigen Facts Book,第2版,1997,Barclay et al.编,Academic Press,Harcourt Brace & Co.,New York)。其它B细胞表面标志包括RP105、FcRH2、B细胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287。特别感兴趣的B细胞表面标志在B细胞上较之受试者的其它非B细胞组织优先表达,且可以在前体B细胞和成熟B细胞二者上表达。为本发明目的,优选的B细胞表面标志是CD20、CD22和BR3。
“CD20”抗原或“CD20”是在超过90%来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上找到的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上,但在干细胞上不表达。CD20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。CD20抗原记载于例如Clark et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:1766(1985)。
“B细胞表面标志拮抗剂”指在结合B细胞上的B细胞表面标志后破坏或消减受试者中的B细胞和/或干扰一项或多项B细胞功能的分子,例如通过降低或阻止B细胞引发的体液应答。拮抗剂优选能够消减用它治疗的受试者中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这样的消减可通过多种机制来实现,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。本发明范围内所包括的拮抗剂包括与B细胞表面标志诸如CD20结合的抗体、合成的或天然序列的肽、免疫粘附素、和小分子拮抗剂,任选偶联或融合了细胞毒剂。优选的拮抗剂包括抗体。
“CD20抗体拮抗剂”在本文中指在结合B细胞上的CD20后破坏或消减受试者中的B细胞和/或干扰一项或多项B细胞功能的抗体,例如通过降低或阻止B细胞引发的体液应答。抗体拮抗剂优选能够消减用它治疗的受试者中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这样的消减可通过多种机制来实现,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。
在用于本文时,“B细胞消减”指一般在药物或抗体治疗后,与治疗前的水平相比,动物或人体中B细胞水平降低。B细胞消减可以是部分的或完全的。B细胞水平可使用众所周知的技术来测量,诸如那些Reff et al.,Blood83:435-445(1994)或美国专利No.5,736,137(Anderson et al.)中所记载的。举例而言,可以用各种剂量的抗体或免疫粘附素处理哺乳动物(例如正常灵长类动物),并可以测定外周B细胞浓度,例如通过对B细胞进行计数的FACS方法。
CD20抗体的例子包括:“C2B8”,现在称作“rituximab”(RITUXAN)(美国专利No.5,736,137);钇[90]标记的2B8鼠抗体,称作“Y2B8”或“IbritumomabTiuxetan”(ZEVALIN),可以从IDEC Pharmaceuticals公司购买(美国专利No.5,736,137;2B8于1993年6月22日保藏于ATCC,编号HB11388);鼠IgG2a“B1”,也称作“Tositumomab”,任选用131I标记以产生“131I-B1”或“碘131tositumomab”抗体(BEXXARTM),可以从Corixa购买(还可参见美国专利No.5,595,721);鼠单克隆抗体“1F5”(Press et al.,Blood 69(2):584-591(1987))及其变体,包括“框架修补的”或人源化的1F5(WO 2003/002607,Leung,S.;ATCC保藏物HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利No.5,677,180);人源化2H7(WO 2004/056312,Lowman et al.及下文所列);2F2(HuMax-CD20),一种完全人的高亲和力抗体,靶向B细胞细胞膜中的CD20分子(Genmab,Denmark;参见例如Glennie and van de Winkel,Drug Discovery Today8:503-510(2003);Cragg et al.,Blood 101:1045-1052(2003);WO 2004/035607;US 2004/0167319);WO 2004/035607和US 2004/0167319(Teeling et al.)中所列出的人单克隆抗体;US 2004/0093621(Shitara et al.)中所记载的Fc区结合有复杂N-糖苷连接的糖链的抗体;诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的与CD20结合的单克隆抗体和抗原结合片段(WO 2005/000901,Tedder etal.);诸如AME系列抗体的CD20结合分子,例如WO 2004/103404和US2005/0025764(Watkins et al.,Eli Lilly/Applied Molecular Evolution,AME)中所列出的AME 33抗体;诸如US 2005/0025764(Watkins et al.)中所记载的CD20结合分子;A20抗体或其变体,诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20和hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433,Immunomedics);CD20结合抗体,包括表位消减的Leu-16、1H4或2B8,任选偶联有IL-2,如US 2005/0069545 A1和WO 2005/16969(Carr et al.)中的;与CD22和CD20结合的双特异性抗体,例如hLL2xhA20(WO 2005/14618,Chang et al.);单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2,可以从国际白细胞分类研究组(InternationalLeukocyte Typing Workshop)获得(Valentine et al.,于:Leukocyte Typing III,McMichael编,p.440,Oxford University Press(1987);1H4(Haisma et al.,Blood92:184(1998));抗CD20 auristatin E偶联物(Seattle Genetics);抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope);抗CD20单抗疗法(EpiCyte);抗CD20抗体TRU015(Trubion)。本文中优选的CD20抗体是嵌合的、人源化的或人的CD20抗体,更优选rituximab、人源化2H7、2F2(Hu-Max-CD20)人CD20抗体(Genmab)和人源化A20抗体或IMMUN-106抗体(Immunomedics)。
术语“rituximab”(利妥昔单抗)或“RITUXAN”在本文中指针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体,在美国专利No.5,736,137中称作“C2B8”,包括其保持结合CD20能力的片段。
纯粹为了本发明的目的且除非另有说明,“人源化2H7”抗体指鼠2H7抗体的人源化变体,其中所述抗体在体内有效降低循环B细胞。
在一个实施方案中,人源化2H7抗体包含一种、两种、三种、四种、五种或六种以下CDR序列:
CDR L1序列RASSSVSYXH,其中X是M或L(SEQ ID NO.21),例如SEQ IDNO:4(图1A);
CDR L2序列,SEQ ID NO:5的(图1A);
CDR L3序列QQWXFNPPT,其中X是S或A(SEQ ID NO.22),例如SEQ IDNO:6(图1A);
CDR H1序列,SEQ ID NO:10的(图1B);
CDR H2序列AIYPGNGXTSYNQKFKG,其中X是D或A(SEQ ID NO.23),例如SEQ ID NO:11(图1B);及
CDR H3序列VVYYSXXYWYFDV,其中第6位X是N、A、Y、W或D且第7位X是S或R(SEQ ID NO.24),例如SEQ ID NO:12(图1B)。
上述CDR序列一般存在于人轻链和重链可变区框架序列内,诸如基本上为人轻链κ亚组I(VLκI)的人共有FR残基和基本上为人重链亚组III(VHIII)的人共有FR残基。还可参见WO 2004/056312(Lowman et al.)。
可以将重链可变区连接人IgG链恒定区,其中所述区可以是例如IgG1或IgG3,包括天然序列的和变异的恒定区。
在一个优选的实施方案中,此类抗体包含SEQ ID NO:8的重链可变域序列(v16,如图1B所示),任选还包含SEQ ID NO:2的轻链可变域序列(v16,如图1A所示),其任选包含重链可变域中第56、100和/或100a位的一处或多处氨基酸替代,例如D56A、N100A或N100Y、和/或S100aR及轻链可变域中第32和/或92位的一处或多处氨基酸替代,例如M32L和/或S92A。优选的是,所述抗体是完整抗体,其包含SEQ ID NO.13或15的轻链氨基酸序列及SEQID NO.14、16、17或20的重链氨基酸序列。
一种优选的人源化2H7抗体是ocrelizumab(Genentech)。
本文中的抗体还可以在Fc区中包含至少一处改进ADCC活性的氨基酸替代,诸如位于第298、333和334位的氨基酸替代,优选S298A、E333A和K334A,使用EU重链残基编号方式。还可参见美国专利No.6,737,056 B1,Presta。
任何这些抗体可以在Fc区中包含至少一处改进FcRn结合或血清半衰期的替代,例如位于重链第434位的替代,诸如N434W。还可参见美国专利No.6,737,056 B1,Presta。
任何这些抗体还可以在Fc区中包含至少一处提高CDC活性的氨基酸替代,例如至少包含位于第326位的替代,优选K326A或K326W。还可参见美国专利No.6,528,624 B1,Idusogie et al.。
有些优选的人源化2H7变体是那些包含SEQ ID NO:2的轻链可变域及SEQ ID NO:8的重链可变域的抗体,包括那些在Fc区(如果有的话)中具有或没有替代的抗体,和那些包含在SEQ ID NO:8中具有改变N100A;或者D56A和N100A;或者D56A、N100Y和S100aR的重链可变域及在SEQ ID NO:2中具有改变M32L;或者S92A;或者M32L和S92A的轻链可变域的抗体。
2H7.v16重链可变区中的M34已经鉴定为抗体稳定性的潜在来源,且是替代的另一个潜在候选位置。
在本发明的一些各种优选实施方案的总结中,基于2H7.v16的变体的可变区包含v16的氨基酸序列,除了下文表1所示氨基酸替代的位置。除非另有说明,2H7变体将具有与v16相同的轻链。
表1:例示性的人源化2H7抗体变体
2H7型式 | 重链(VH)变化 | 轻链(VL)变化 | Fc变化 |
16,供参照 | - | ||
31 | - | - | S298A,E333A,K334A |
73 | N100A | M32L | |
75 | N100A | M32L | S298A,E333A,K334A |
96 | D56A,N100A | S92A | |
114 | D56A,N100A | M32L,S92A | S298A,E333A,K334A |
115 | D56A,N100A | M32L,S92A | S298A,E333A,K334A,E356D,M358L |
116 | D56A,N100A | M32L,S92A | S298A,K334A,K322A |
138 | D56A,N100A | M32L,S92A | S298A,E333A,K334A,K326A |
477 | D56A,N100A | M32L,S92A | S298A,E333A,K334A,K326A,N434W |
375 | - | - | K334L |
588 | - | - | S298A,E333A,K334A,K326A |
511 | D56A,N100Y,S100aR | M32L,S92A | S298A,E333A,K334A,K326A |
一种优选的人源化2H7包含2H7.v16轻链可变域序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKR(SEQ ID NO:2);
及2H7.v16重链可变域序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。
若人源化2H7.v16抗体是完整抗体,则它可包含轻链氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:13);
及重链氨基酸序列SEQ ID NO.14或:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPG(SEQ ID NO:17)。
另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7.v511轻链可变域序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS
NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK
VEIKR(SEQ ID NO:18);
及2H7.v511重链可变域序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO:19)。
若人源化2H7.v511抗体是完整抗体,则它可包含轻链氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS
NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK
VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15);
及重链氨基酸序列SEQ ID NO.16或:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPG(SEQ ID NO:20)。
为本发明目的,“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法,其中的抗体可以是未偶联的或“裸露的”抗体,或者抗体可以偶联或融合有异源分子或药剂,诸如一种或多种细胞毒剂,由此产生“免疫偶联物”。
在用于本文时,“治疗用抗体”指有效治疗患有或易患某种疾病或病症的哺乳动物中的该疾病或病症(优选自身免疫病)的抗体。例示性的治疗用抗体包括:HER2抗体,包括trastuzumab(HERCEPTIN)(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289(1992);美国专利No.5,725,856)和pertuzumab(OMNITARGTM)(WO 01/00245);CD20抗体(见下文);IL-8抗体(St John et al.,Chest 103:932(1993)和国际公布No.WO 95/23865);VEGF或VEGF受体抗体,包括人源化的和/或亲和力成熟的VEGF抗体,诸如人源化VEGF抗体huA4.6.1 bevacizumab(AVASTIN)和ranibizumab(LUCENTIS)(Kim et al.,Growth Factors 7:53-64(1992);国际公布No.WO 96/30046;WO98/45331,公布于1998年10月15日);PSCA抗体(WO 01/40309);CD11a抗体,包括efalizumab(RAPTIVA)(美国专利No.5,622,700;WO 98/23761;Steppeet al.,Transplant Intl.4:3-7(1991);Hourmant et al.,Transplantation 58:377-380(1994));与IgE结合的抗体,包括omalizumab(XOLAIR)(Presta et al.,J.Immunol.151:2623-2632(1993);国际公布No.WO 95/19181;美国专利No.5,714,338,公告于1998年2月3日;美国专利No.5,091,313,公告于1992年2月25日;WO 93/04173,公布于1993年3月4日;国际申请No.PCT/US98/13410,提交于1998年6月30日;美国专利No.5,714,338);CD18抗体(美国专利No.5,622,700,公告于1997年4月22日;WO 97/26912,公布于1997年7月31日);Apo-2受体抗体抗体(WO 98/51793,公布于1998年11月19日);组织因子(TF)抗体(欧洲专利No.0 420 937 B1,授权于1994年11月9日);α4-α7整联蛋白抗体(WO 98/06248,公布于1998年2月19日);EGFR抗体(例如嵌合化的或人源化的225抗体,cetuximab,ERBUTIX,见WO 96/40210,公布于1996年12月19日);CD3抗体,诸如OKT3(美国专利No.4,515,893,公告于1985年5月7日);CD25或Tac抗体,诸如CHI-621(SIMULECT)和ZENAPAX(见美国专利No.5,693,762,公告于1997年12月2日);CD4抗体,诸如cM-7412抗体(Choyet al.,Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996));CD52抗体,诸如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann et al.,Nature 332:323-337(1988));Fc受体抗体,诸如针对FcγRI的M22抗体(Graziano et al.,J.Immunol.155(10):4996-5002(1995));癌胚抗原(CEA)抗体,诸如hMN-14(Sharkey et al.,Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s(1995));针对乳腺上皮细胞的抗体,包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.,Cancer Res.55(23):5852s-5856s(1995);Richman et al.,Cancer Res.55(23 Supp):5916s-5920s(1995));与结肠癌细胞结合的抗体,诸如C242(Litton et al.,Eur J.Immunol.26(1):1-9(1996));CD38抗体,例如AT 13/5(Ellis et al.,J.Immunol.155(2):925-937(1995));CD33抗体,诸如Hu M195(Jurcic et al.,Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771;EpCAM抗体,诸如17-1A(PANOREX);GpIIb/IIIa抗体,诸如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO);RSV抗体,诸如MEDI-493(SYNAGIS);CMV抗体,诸如PROTOVIR;HIV抗体,诸如PRO542;肝炎抗体,诸如Hep B抗体OSTAVIR;CA125抗体OvaRex;独特型GD3表位抗体BEC2;αvβ3抗体(例如VITAXIN;Medimmune);人肾细胞癌抗体,诸如ch-G250;ING-1;抗人17-1A抗体(3622W94);抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24;抗人鳞状细胞癌(SF-25);人白细胞抗原(HLA)抗体,诸如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1);CD37抗体,诸如TRU 016(Trubion);IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗B细胞抗体(Impheron);B细胞靶向单抗(Immunogen/Aventis);1D09C3(Morphosys/GPC);LymphoRad 131(HGS);Lym-1抗体,诸如Lym-1Y-90(USC)或抗Lym-1 Oncolym(USC/Peregrine);LIF 226(Enhanced Lifesci.);BAFF抗体(例如WO 03/33658);BAFF受体抗体(例如WO 02/24909);BR3抗体;Blys抗体,诸如belimumab;LYMPHOSTAT-BTM;ISF 154(UCSD/Roche/Tragen);gomilixima(Idec 152;Biogen Idec);IL-6受体抗体,诸如atlizumab(ACTEMRATM;Chugai/Roche);IL-15抗体,诸如HuMax-I1-15(Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体,诸如CCR2抗体(例如MLN1202;Millieneum);抗补体抗体,诸如C5抗体(例如eculizumab,5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白口服配制剂(例如IgPO;Protein Therapeutics);IL-12抗体,诸如ABT-874(CAT/Abbott);Teneliximab(BMS-224818;BMS);CD40抗体,包括S2C6及其人源化变体(WO 00/75348)和TNX 100(Chiron/Tanox);TNF-α抗体,包括cA2或infliximab(REMICADE)、CDP571、MAK-195、adalimumab(HUMIRATM)、PEG化TNF-α抗体片段诸如CDP-870(Celltech)、D2E7(Knoll)、抗TNF-α多克隆抗体(例如PassTNF;Verigen);CD22抗体,诸如LL2或epratuzumab(LYMPHOCIDE;Immunomedics),包括epratuzumab Y-90和epratzumab I-131、Abiogen的CD22抗体(Abiogen,Italy)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、combotox(UT Soutwestem)、BL22(NIH)、和LympoScan Tc99(Immunomedics)。优选的是,治疗用抗体在本文中是可用于治疗自身免疫病诸如RA和/或SLE的裸露的、完整的抗体。
在用于本文时,术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的分子。在结构上,免疫粘附素包括氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源的”)、具有期望结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物。例示性的粘附素序列包括包含受体(本文中的“配体结合结构域”)或配体(本文中的“受体结合结构域”)中与目的蛋白质结合的那部分的连续氨基酸序列。粘附素序列还包括与目的蛋白质结合但不是受体或配体序列的序列(例如肽体(peptibody)中的粘附素序列)。此类多肽序列可通过多种方法来选择或鉴定,包括噬菌体展示技术和高通量分拣方法。
术语“配体结合结构域”在用于本文时指任何天然细胞表面受体或其至少保留相应天然受体的定性配体结合能力的任何区域或衍生物。在一个具体的实施方案中,受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族成员同源的胞外结构域的细胞表面多肽。并非免疫球蛋白超基因家族成员但仍然被此定义明确覆盖的其它受体有细胞因子的受体,具体有具有酪氨酸激酶活性(受体酪氨酸激酶)的受体、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员、和细胞粘附分子,例如(E-、L-和P-)选择蛋白。
术语“受体结合结构域”用于指受体的任何天然配体,包括细胞粘附分子,或此类天然配体至少保留相应天然配体的定性受体结合能力的任何区域或衍生物。此定义格外明确包括来自上述受体的配体的结合序列。
“抗体-免疫粘附素嵌合物”包括将至少一个抗体的结合结构域(如本文中所定义的)与至少一个免疫粘附素(如本申请中所定义的)联合在一起的分子。例示性的抗体-免疫粘附素嵌合物有Berg et al.,PNAS(USA)88:4723-4727(1991)和Chamow et al.,J.Immunol.153:4268(1994)中记载的双特异性CD4-IgG嵌合物。
“处理”和“治疗”(treatment)受试者在本文中指治疗性处置和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有疾病的以及那些要预防疾病的。因此,受试者可以已经诊断为患有疾病或者可以有患上疾病的倾向性或易感性。术语“处理”、“处置”或“治疗”在用于本文时包括预防性(例如防范性)、缓解性和治愈性处理。
表述“有效量”指药物(诸如抗体或免疫粘附素)有效预防、改善或治疗疾病的量。这样的有效量一般将导致疾病征候或症状的改善。
术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指起抑制或掩盖在此所治疗受试者的免疫系统作用的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见美国专利No.4,665,077);非类固醇抗炎药类(NSAID);更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素类诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎剂类诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂;嘌呤拮抗剂类,诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil,MMF);烷化剂类,诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)、溴隐亭(bromocryptine)、达那唑(danazol)、氨苯砜(dapsone)、戊二醛(它掩盖MHC抗原,如美国专利No.4,120,649中所记载的);MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢霉素;6-巯基嘌呤;类固醇类,诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物,例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)包括SOLU-MEDROL甲泼尼龙琥珀酸钠、和地塞米松(dexamethasone);二氢叶酸还原酶抑制剂类,诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下);抗疟剂类,诸如氯喹(chloroquine)和羟氯喹(hydroxycloroquine);柳氮磺吡啶(sulfasalazine);来氟米特(leflunomide);细胞因子或细胞因子受体抗体或拮抗剂类,包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体,抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)或阿达木单抗(adalimumab)),抗TNF-α免疫粘附素(依那西普(etanercept)),抗TNF-β抗体,抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体,和抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂;抗LFA-1抗体,包括抗CD11a和抗CD18抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;泛(pan)T抗体,优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;包含LFA-3结合域的可溶性肽(WO 90/08187,发布于90年7月26日);链激酶;转化生长因子-β(TGF-β);链道酶;来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;苯丁酸氮芥(chlorambucil);脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T细胞受体(Cohen et al.,美国专利No.5,114,721);T细胞受体片段(Offner et al.,Science 251:430-432(1991);WO 90/11294;Ianeway,Nature,341:482(1989);WO 91/01133);BAFF拮抗剂,诸如BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay and Mackay,Trends Immunol.23:113-5(2002);还可参见下文定义);干扰T辅助细胞信号的生物制剂,诸如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154),包括CD40-CD40配体的阻断性抗体(例如Durie et al.,Science 261:1328-30(1993);Mohan et al.,J.Immunol.154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck et al.,Science 265:1225-7(1994));及T细胞受体抗体(EP 340,109),诸如T10B9。
在用于本文时,“BAFF拮抗剂”一般指直接抑制BAFF的生物学活性的任何化合物。通过与BAFF多肽、BAFF基因、BAFF转录物或BAFF受体相互作用,分子直接抑制BAFF的生物学活性。BAFF拮抗剂可例如结合BAFF并中和BAFF的活性;降低BAFF的表达水平;影响BAFF的稳定性;影响BAFF的膜结合形式蛋白水解切割成可溶性形式;干扰BAFF与一种或多种受体的结合;或者它可干扰一种或多种BAFF受体的胞内信号传导。BAFF拮抗剂可以是蛋白质性质的(例如抗体、受体融合蛋白、肽、肽体(peptibody)、显性负的BAFF突变体)或非蛋白质性质的(例如有机小分子,小于约500Da)分子,包括siRNA和适体等。用于评估BAFF拮抗剂的中和生物学活性的方法包括那些本领域已知的和已记载的。BAFF拮抗剂的例子包括包含BAFF受体的BAFF结合部分的多肽或其BAFF结合变体(例如WO 01/12812、WO02/24909、WO 00/40716、WO 03/024991)、抗BAFF抗体(例如WO 03/33658)、BAFF结合肽(例如WO 02/092620)、抗BAFF-R抗体(例如WO 02/24909)和BAFF结合肽(例如WO 02/16412)。依照一个实施方案,BAFF拮抗剂选自下组:BCMA-Fc(例如WO 01/12812)、BAFF-R-Fc(例如WO 02/24909)、TACI-Ig(例如WO 00/40716)、抗BAFF抗体(例如WO 03/33658)、抗BAFF-R抗体(例如WO 02/24909)、BAFF结合肽体(例如WO 02/092620)、显性负的BAFF(例如WO 04/081043)。依照另一个实施方案,抗BAFF抗体和抗BAFF受体抗体是人的、人源化的、嵌合的或以其它方式为在人体中的治疗进行了增强的。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);β-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinicacid);喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱);苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL)、脂质体多柔比星TLC D-99(MYOCET)、PEG化脂质体多柔比星(CAELYX)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物类,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物类,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物类,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfomithine;依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoid),例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、帕利他塞的清蛋白改造纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(docetaxel)(TAXOTERE));苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂剂类,诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin);长春药类(vincas),它们阻止微管蛋白聚合形成微管,包括长春碱(vinblastine)(VELBAN)、长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)、长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN)和长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);亚叶酸(leucovorin);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基喋呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids),诸如视黄酸(retinoic acid),包括贝沙罗汀(bexarotene)(TARGRETIN);二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸盐(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL);曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸类,特别是那些抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的,诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗类,诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗,例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗;拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN);rmRH(例如ABARELIX);BAY439006(sorafenib;Bayer);SU-11248(Pfizer);哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如PS341);bortezomib(VELCADE);CCI-779;tipifarnib(R11577);orafenib;ABT510;Bcl-2抑制剂,诸如哈眠那(oblimersen sodium)(GENASENSE);pixantrone;及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合,诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
在本文中,化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素,包括但不限于:具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类,包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene),和选择性雌激素受体调节剂类(SERM),诸如SERM3;没有激动剂特性的纯的抗雌激素类,诸如氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平);芳香酶抑制剂类,包括类固醇芳香酶抑制剂类,诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)(AROMASIN),和非类固醇芳香酶抑制剂类,诸如阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)、来曲唑(letrozole)(FEMARA)和氨鲁米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制剂类,包括伏氯唑(vorozole)(RIVISOR)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑;促黄体生成激素释放激素激动剂类,包括亮丙瑞林(leuprolide)(LUPRON和ELIGARD)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin);性类固醇类(sex steroids),包括妊娠素类(progestine),诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate),雌激素类,诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin),和雄激素类/类视黄酸类,诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide);奥那司酮(onapristone);抗孕酮类;雌激素受体下调剂类(ERD);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合。
在用于本文时,术语“EGFR抑制剂”指结合或以其它方式与EGFR直接相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物,或者称为“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn et al.)及其变体,诸如嵌合化的225(C225或Cetuximab;ERBUTIX)和重构的人225(H225)(参见WO 96/40210,Imclone SystemsInc);IMC-11F8,完全人的EGFR靶向抗体(Imclone);与II型突变体EGFR结合的抗体(美国专利No.5,212,290);与EGFR结合的人源化的和嵌合的抗体,如美国专利No.5,891,996中所记载的;和与EGFR结合的人抗体,诸如ABX-EGF或Panitumumab(参见WO 98/50433,Abgenix/Amgen);EMD 55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996));EMD7200(matuzumab),针对EGFR且与EGF和TGF-α竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体(EMD/Merck);人EGFR抗体,HuMax-EGFR(GenMab);称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3及US 6,235,883中记载的完全人的抗体;MDX-447(Medarex Inc.);及mAb 806或人源化的mAb 806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以与细胞毒剂偶联,由此产生免疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2,Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子,诸如美国专利No.5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498以及PCT出版物WO98/14451、WO 98/50038、WO 99/09016和WO 99/24037中所记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774,erlotinib,TARCEVA,Genentech/OSI Pharmaceuticals);PD 183805(CI 1033,2-丙烯酰胺(propenamide),N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二盐酸化物,Pfizer Inc.);ZD1839,gefitinib(IRESSATM,4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉,AstraZeneca);ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,BoehringerIngelheim);PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚);(R)-6-(4-羟苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶);CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide));EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺(butenamide),Wyeth);AG1478(Sugen);AG1571(SU 5271;Sugen);双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂,诸如lapatinib(GW 572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2-甲基磺酰基]乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(quinazolinamine);Glaxo-SmithKline)。
“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的例子包括上一段中提到的EGFR靶向药物;小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂,诸如可以从Takeda购买的TAK165;CP-724,714,一种口服的ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI);优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR二者过表达细胞的双重HER抑制剂,诸如EKB-569(可以从Wyeth购买);lapatinib(GW572016;可以从Glaxo-SmithKline购买),一种口服的HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂;PKI-166(可以从Novartis购买);泛(pan)HER抑制剂,诸如canertinib(CI-1033;Pharmacia);Raf-1抑制剂,诸如可以从ISIS Pharmaceuticals购买的、抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132;非HER靶向TK抑制剂,诸如可以从Glaxo购买的Imatinibmesylate(GLEEVACTM);MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可以从Pharmacia购买);喹唑啉类,诸如PD 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉;吡啶并嘧啶类;嘧啶并嘧啶类;吡咯并嘧啶类,诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706;吡唑并嘧啶类,4-(苯氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶;姜黄素(二阿魏酰甲烷,4,5-双(4-氟苯胺基)-酞亚胺);含硝基噻吩模块的tyrphostines;PD-0183805(Warner-Lambert);反义分子(例如那些与HER编码核酸结合的);喹喔啉类(美国专利No.5,804,396);tryphostins(美国专利No.5,804,396);ZD6474(Astra Zeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);泛HER抑制剂,诸如CI-1033(Pfizer);Affinitac(ISIS 3521;Isis/Lilly);Imatinib mesylate(Gleevac;Novartis);PKI 166(Novartis);GW2016(Glaxo SmithKline);CI-1033(Pfizer);EKB-569(Wyeth);Semaxinib(Sugen);ZD6474(AstraZeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);INC-1C11(Imclone);或任何以下专利出版物中所记载的:美国专利No.5,804,396;WO 99/09016(American Cyanamid);WO98/43960(American Cyanamid);WO 97/38983(Warner Lambert);WO99/06378(Warner Lambert);WO 99/06396(Warner Lambert);WO 96/30347(Pfizer,Inc.);WO 96/33978(Zeneca);WO 96/3397(Zeneca);WO 96/33980(Zeneca)。
“抗血管发生剂”指阻断或一定程度的干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如与牵涉促进血管发生的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。本文中优选的抗血管发生因子是与血管内皮生长因子(VEGF)或其受体结合的抗体,诸如bevacizumab(AVASTIN)或ranibizumab(LUCENTIS),或者是αvβ3抗体,诸如VITAXINTM(Medimmune)。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放,作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子;白介素(IL),诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15,包括PROLEUKINrIL-2和人IL-4及人IL-4的突变体,诸如例如在IL-4中牵涉结合IL-2Rγ的那个区中包含突变的突变体,例如Arg 21变成Glu残基;肿瘤坏死因子,诸如TNF-α或TNF-β;及其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物,包括通过人工合成产生的小分子实体,及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“激素”指多肽激素,其一般由具有导管的腺器官分泌。激素包括例如生长激素,诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;雌二醇;激素代替疗法;雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睾内酯(testolactone);松驰素原;糖蛋白激素类,诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);促乳素、胎盘催乳激素、小鼠促性腺激素相关肽、促性腺激素释放激素;抑制素;激活素;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质;及血小板生成素。在用于本文时,术语激素包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列激素的生物学活性等效物,包括通过人工合成产生的小分子实体,及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“生长因子”指促进生长的蛋白质,包括例如肝生长因子;成纤维细胞生长因子;血管内皮生长因子;神经生长因子,诸如NGF-β;血小板衍生生长因子;转化生长因子(TGF),诸如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductive factor);干扰素,诸如干扰素-α、-β和-γ;及集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)。在用于本文时,术语生长因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列生长因子的生物学活性等效物,包括通过人工合成产生的小分子实体,及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且牵涉多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡的受体蛋白质。它们是牵涉细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞粘附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成,称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性,β亚基也是如此。受体总是包含一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1等。在用于本文时,术语“整联蛋白”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列整联蛋白的生物学活性等效物,包括通过人工合成产生的小分子实体,及其药剂学可接受的衍生物和盐。
为本发明目的,“肿瘤坏死因子α(TNF-α)”指包含如Pennica et al.,Nature312:721(1984)或Aggarwal et al.,JBC 260:2345(1985)中所记载的氨基酸序列的人TNF-α分子。
“TNF-α抑制剂”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物学功能的药剂,一般通过结合TNF-α并中和其活性。本文中具体设想的TNF抑制剂的例子有依那西普(etanercept)(ENBREL)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)、阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)、PEG化可溶性TNF-R pegsunercept(sTNF-R1;Amgen)、PEG化抗TNF抗体片段、CDP-870(Celltech)。
“缓解病情的抗风湿药”或“DMARD”的例子包括羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)(加口服和皮下甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金盐(口服)、金盐(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine)包括环孢霉素A和表面环孢霉素、葡萄球菌蛋白A(Goodyear and Silverman,J.Exp.Med.197(9):1125-39(2003)),包括其盐和衍生物,等。
“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子包括阿司匹林(aspirin)、乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、COX-2抑制剂诸如塞来考昔(celecoxib)(CELEBREX;4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺和伐地考昔(valdecoxib)(BEXTRA)、及美洛昔康(meloxicam)(MOBIC),包括其盐和衍生物,等。优选的是,它们是阿司匹林、萘普生、布洛芬、吲哚美辛或托美丁。
本文中“整联蛋白拮抗剂或抗体”的例子包括CD11a或LFA-1抗体,诸如可以从Genentech购买的efalizumab(RAPTIVA),或α4整联蛋白抗体,诸如可以从Biogen Idec/Elan购买的natalizumab(ANTEGREN),或二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO 2003/89410)、苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO2002/28830、WO 2002/16329和WO 2003/53926)、苯基丙酸衍生物(WO2003/10135)、烯胺衍生物(WO 2001/79173)、丙酸衍生物(WO 2000/37444)、链烷酸衍生物(WO 2000/32575)、取代苯基衍生物(美国专利No.6,677,339和6,348,463)、芳香胺衍生物(美国专利No.6,369,229)、ADAM解联蛋白结构域多肽(US 2002/0042368)、αvβ3整联蛋白的抗体(EP 633945)、氮桥二环氨基酸衍生物(WO 2002/02556)、和683699(Tanabe)等。
“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构,模拟或提升天然存在皮质类固醇的效果的数种合成的或天然存在的物质中的任一种。合成的皮质类固醇的例子包括泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)(包括甲泼尼龙(methylprednisolone),诸如SOLU-MEDROL甲泼尼龙琥珀酸钠)、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松曲安西龙(dexamethasone triamcinolone)、氢化可的松(hydrocortisone)和倍他米松(betamethasone)。本文中优选的皮质类固醇是泼尼松、甲泼尼龙、氢化可的松或地塞米松。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体(diabody);线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。任选的是,完整抗体具有功能性Fc区。
“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。例如,抗体可以在体外和/或在体内阻止或降低B细胞增殖。
“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定,诱导(例如B细胞的)程序性细胞死亡的抗体,所述测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL),而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起,而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR,它们大多采取β-折叠片构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起,并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应器功能,诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,及一个剩余的“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中,各可变域的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定域的氨基酸序列,来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其“重链”恒定域的氨基酸序列,(如果有的话)抗体可归入不同的类。完整抗体有五大类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
除非另有说明,本文中免疫球蛋白重链残基的编号方式是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的EU索引的编号方式,明确收入本文作为参考。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区,包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447,依照EU编号系统)可以消除,例如在生产或纯化抗体的过程中,或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程。相应的,完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群、没有消除K447残基的抗体群、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体;BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)联合,而且可使用多种测定法来评估,例如本文中所公开的。
“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4 Fc区,以及上述任一种的天然存在变体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰,优选一处或多处氨基酸替代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是,变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代,例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代,优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性,更优选至少约90%的同源性,最优选至少约95%的同源性。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体,随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是,该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞,优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods4:25-34(1994);de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿及免疫球蛋白体内稳态(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976);Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是,Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头,使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Plückthun,于:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外,此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如,选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解,选定的靶物结合序列可进一步改变,例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等,而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外,单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如,将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成,包括例如杂交瘤法(例如Kohler et al.,Nature 256:495(1975);Harlow et al.,Antibodies.:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版,1988;Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year inImmuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,806;5,569,825;5,591,669(都属于GenPharm);5,545,807;WO 1997/17852;美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern,Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey),诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体(美国专利No.5,693,780)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域,其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR,除了上文所述FR替代。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区,通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。
“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定,抗体重量超过95%,最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色,达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个高变区中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变:Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“抗体暴露”指接触或暴露于在大约1-20天期间里施用的一剂或多剂中的本文抗体。所述剂量可以一次性给予,或在该暴露期间里以固定的或无规律的时间间隔给予。正如本文详述的,首次和后续(例如第二次或第三次)抗体暴露彼此在时间上隔开。
“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书,它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品和/或警告等的信息。
II.样品预处理
在下文实施例中发现来自患有自身免疫性疾病诸如RA或SLE的受试者的血清包含干扰基于细胞的生物测定法诸如中和性抗体测定的再现性的物质。所述干扰不是类风湿因子(RF)或免疫球蛋白。
评估了多种方法来解决该问题,但在回收特异性抗体或消除测定干扰方面都不是特别成功。尽管提高样品稀释度使干扰最小化,但测定法的灵敏度大大降低。评估了用于解决干扰问题的其它方法。例如,改变测定读数或基于细胞的结合测定法都没有解决这个问题,通过脱盐、脱脂、细胞因子相关性或饱和硫酸铵沉淀对样品进行的预处理也没有解决这个问题。
免疫球蛋白亲和纯化最终被鉴定为用于除去干扰的优选方法。该步骤回收得到受试者的免疫球蛋白而除去了干扰,使得经过纯化的免疫球蛋白可以更可靠的进行基于细胞的生物测定法。
因此,本发明关注处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品的方法,包括:
(a)使样品脱脂;
(b)亲和纯化样品中的免疫球蛋白;
(c)浓缩经纯化的免疫球蛋白;并
(d)将经浓缩的免疫球蛋白进行基于细胞的生物学活性测定法(优选中和性抗体测定法)。
步骤(a)、(b)和(c)可以以任何次序执行,但优选的次序为步骤(a),接着是步骤(b),接着是步骤(c)。
本文中的生物学样品包括各种样品,包括血清、血浆、溶胞物、乳汁、唾液、玻璃状液、和其它分泌物、滑液、腹膜腔液、泪液、和组织匀浆,但优选的是,样品包括血清样品。此外,样品可以是各种形式的,包括液体的、冷冻的、冷却的、冻干的、等等。在本文中的亲和纯化步骤之前和/或之后可以对样品进行另外的纯化或处理步骤。
生物学样品可包含来自受试者的与已经用于治疗患者的抗体或免疫粘附素结合的免疫球蛋白,诸如人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)。HAHA可针对人源化的或人的治疗用抗体。在一个实施方案中,样品是经测定包含此类抗体的样品。例如,通过ELISA测定法,诸如美国专利申请No.2005/0032130A1(Beresini and Song)或美国专利申请No.2003/0068664(Albitar et al.)中所记载的ELISA测定法,可能发现来自患者的血清包含针对所研究药物的抗体。
样品来自患有自身免疫性疾病的受试者,诸如那些上文所列举的,但优选类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、或斯耶格伦氏(Sjogren)病,最优选RA。
此外,获取样品的受试者可能、或者已经用治疗性抗体、免疫粘附素或其它生物药物治疗过,诸如PEG化的可溶性TNF-R(包括sTNF-R1pegsunercept,Amgen)、IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)诸如anakira(KINERET)、DN-BAFF(Xencor)、或疫苗诸如B细胞淋巴瘤疫苗(包括那些可获自CRV/ATROS、Intracel、Large Scale Biology、Favrille、NCI、Genitope等公司的)或LeukoVAX(Inflammatics)。
若受试者已经用治疗用抗体治疗过,则所述抗体可结合B细胞表面标志,诸如CD20抗体,例示性的此类抗体包括rituximab、人源化2H7、2F2(HuMax-CD20)人CD20抗体(Genmab)、人源化A20抗体或IMMU-106(Immunomedics)、TRU 015(Trubion)等。本文中优选的CD20抗体是rituximab或人源化2H7。
其它感兴趣的治疗用抗体包括肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(诸如infliximab(REMICADE)、CDP571、MAK-195、adalimumab(HUMIRATM)、PEG化TNF-α抗体片段诸如CDP-870、抗TNF-α多克隆抗体诸如PassTNF);整联蛋白抗体(诸如efalizumab或natalizumab);BAFF抗体(例如WO03/33658);BR3抗体;BAFF受体抗体(例如WO 02/24909);Blys抗体(诸如LYMPHOSTAT-BTM,belimumab;HGS/CAT);CD37抗体(诸如TRU 016;Trubion);CD22抗体诸如LL2或epratuzumab(LYMPHOCIDE;Immunomedics);Abiogen的CD22抗体,CMC 544(Wyeth/Celltech),combotox(UT Soutwestem),BL22(NIH),LIF 226(Enhanced Lifesci.);VEGF或VEGF受体抗体,包括bevacizumab(AVASTIN7)和ranibizumab(LUCENTIS);抗HER抗体,包括trastuzumab(HERCEPTIN)、pertuzumab(OMNITARGTM)和cetuximab(ERBUTIX);抗IgE抗体,包括omalizumab(XOLAIR);IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗B细胞抗体(Impheron);B细胞靶向单抗(Immunogen/Aventis);1D09C3(Morphosys/GPC);Lym-1抗体诸如抗-Lym-1Oncolym(USC/Peregrine);ISF 154(UCSD/Roche/Tragen);gomilixina(Idec152;Biogen Idec);IL-6受体抗体诸如atlizumab(ACTEMRATM;Chugai/Roche);IL-15抗体诸如HuMax-I1-15(Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体,诸如CCR2抗体(例如MLN1202;Millieneum);抗补体抗体,诸如C5抗体(例如eculizumab,5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白口服剂型(例如IgPO;Protein Therapeutics);IL-12抗体诸如ABT-874(CAT/Abbott);Teneliximab(BMS-224818;BMS);CD40抗体,包括S2C6及其人源化变体(WO 00/75348)和TNX 100(Chiron/Tanox);CD52抗体(例如Campath);αvβ3抗体(VITAXIN;Medimmune)等。
若自身免疫性疾病受试者已经用免疫粘附素治疗过,则所述免疫粘附素可以是BR3-Ig;TNF-α免疫粘附素(例如,依那西普(etanercept));抗BAFF肽体(peptibody)(例如WO 02/092620;Amgen);TACI-Ig(Zymogenetics)(例如WO 00/40716);BCMA-Ig(ZymoGenetics)(例如WO 01/12812);CTLA4-Ig,一种B7和CD28共刺激阻断剂,诸如abatacept(BMS);BAFF-R-Fc(例如WO02/24909);等。
一般在患者用药物、抗体或免疫粘附素治疗之前和/或之后从患者处获取生物学样品。通常在一系列时间点从患者处获取生物学样品,例如从预处理到贯穿治疗周期。为了避免药物对测定效果的干扰,通常在发生药物清除后采集生物学样品。例如,可以在基线和3个、6个和9个月时测试样品。如果患者后来进行了复治,那么可预处理来自基线和3个或6个月时的样品,然后测试中和性抗体。
亲和纯化之前的脱脂步骤对于减少亲和纯化步骤期间的堵塞是理想的。可使用脂质吸收剂(诸如LIPOSORB;山梨聚糖酯/聚氧乙烯山梨聚糖酯)进行脱脂,但也可利用其它方法诸如有机提取、过滤、离心等使样品脱脂。
亲和纯化步骤优选包含纯化基本上所有的免疫球蛋白同种型(即人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE,即时所选吸附剂的亲和力对于不同同种型是不同的)。亲和纯化可通过下列方式实现:蛋白A层析、蛋白G层析、蛋白A+G层析(例如例示的蛋白A/G层析,或者蛋白A与蛋白G树脂的混合物,等等)、IgG亲和纯化(例如使用Pierce的MELON GELTM)、抗免疫球蛋白抗体亲和纯化(其中抗免疫球蛋白抗体单独使用或者联合针对一种或全部同种型的特异性;例如抗人IgG、IgA、IgM和IgE的组合,为每一种同种型的特异性亲和纯化而偶联)、具有免疫球蛋白结合特性的其它吸附剂(例如PIERCE T-GELTM)、等等。优选的是,亲和纯化包含蛋白A+G亲和纯化。
亲和纯化(例如蛋白A+G亲和纯化)优选重复两次、三次、四次或更多次,最优选三次。亲和柱加载后,优选清洗固相以除去非特异性结合,然后可使用多种洗脱缓冲液洗脱免疫球蛋白。优选的洗脱缓冲液与后续的基于细胞的中和性抗体测定法相容。例如,洗脱缓冲液可以是低pH的,和/或含有盐酸(HCl)、甘氨酸、三氟乙酸(TFA)、乙酸等。洗脱缓冲液任选用碱性缓冲液中和,并且/或者可以在进行中和性抗体测定法之前加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中,经纯化的免疫球蛋白进行另外的纯化、浓缩处理步骤。例如,免疫球蛋白可浓缩,例如使用浓缩器,或者沉淀和重悬,或者冻干,等等。
然后包含浓缩或纯化的免疫球蛋白的样品能够进行中和性抗体测定法,诸如下一节中所描述的测定法。样品可包含经纯化的含Fc多肽,诸如受试者的免疫球蛋白(包括自身抗体和抗药物抗体)、治疗用抗体和免疫粘附素、及类风湿因子(RF)。
尽管中和性抗体测定法是本文中优选的基于细胞的生物测定法,但是经过预处理的样品也可进行其它的基于细胞的生物学测定法,包括例如可测量药物在患者血清中对细胞的功能活性的药效(PD)生物标志测定法,等等。
III.中和性抗体测定法
本文中的样品预处理方法优选连同用于检测针对药物(诸如治疗用抗体、免疫粘附素或其它生物制品)或者针对与B细胞表面标志结合的拮抗剂或抗体(例如针对与CD20结合的抗体)的中和性抗体的测定法一起采用。所述测定法测定来自用治疗用抗体、免疫粘附素或其它药物治疗过的患者的生物学样品阻断该药物生物学活性的能力,其中阻断活性可指示药物功效降低。
中和性抗体可降低所输注药物的预期药理水平,由此降低功效或者使应答的可能性更反复无常。中和性抗体可能与复治的血清病或免疫复合物病有关。举例而言,在看到中和性抗体应答的情形下,可以停止或推迟治疗,或者可以提高剂量,或者可以进一步给予患者提高该药物功效和/或降低针对它的任何免疫应答的药剂。在观察到中和性抗体应答的情况下,可以与降低免疫应答的治疗联合的多种免疫抑制剂是已知的,而且本文具体提及了此类药物的例证。
测定结果在供临床医师在患者的治疗中使用之外,抗药物抗体的中和特性连同HAMA、HACA或HAHA数据证明了药物的免疫原性,或免疫原性的趋势,以及药物的免疫原性的本质。该信息可用于评估药物安全性和预测患者对治疗的潜在免疫应答。
在CD20抗体或与B细胞表面标志结合的其它拮抗剂的情形中,若以此进行的治疗只导致部分B细胞消减,若发生B细胞过度激活(例如在SLE中),或者若持续的疾病症状常年存在(例如在SLE和RA中),则认为所述测定法特别有用。
所述测定法对于正在用药物治疗自身免疫性疾病的患者的用途是尤其理想的。本文记载了多种自身免疫性疾病,例示性的包括类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏(Wegener)病、炎性肠病(IBD)、特发性或免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化(MS)、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、雷诺氏(Reynaud)综合征、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血等。
在本发明的优选实施方案中,生物学活性测定法包括基于细胞的生物学测定法,诸如测定补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、凋亡、离子通道调控、或细胞生长抑制的测定法。
优选的是,所述测定法研究CDC活性。依照本发明的这个实施方案,可以将表达治疗用抗体或免疫粘附素所结合的抗原(例如B细胞表面标志,诸如CD20)的细胞在存在(或缺乏)该药物以及来自用该药物治疗的患者的生物学样品的情况下暴露于补体(优选人补体)。本申请设想了同时或以任何次序暴露四种组分(细胞、补体、药物和生物学样品),所有这些可能性都涵盖在本文中。然而,依照本发明的优选实施方案,将生物学样品(例如血清)与药物混合以容许中和药物的活性,然后向此混合物中加入细胞和补体。
通过Rituximab中和性抗体测定法得出的补体依赖性细胞毒性(CDC)描绘于图4。Rituximab的Fab结构域结合CD20,B淋巴细胞上的一种细胞表面抗原。一旦结合,Rituximab的Fc结构域将募集补体,并介导细胞裂解。在体外,将Rituximab与正常的人血清补体一起加至WIL2-S细胞。使用ALAMARBLUETM或CELLTITER GLO测量与活细胞的线粒体新陈代谢活性成比例的细胞裂解(上部小图)。在使用此CDC测定法来评估患者血清中的Rituximab中和性抗体时,在引入补体和细胞之前将Rituximab与患者抗体一起预温育(下部小图)。中和性抗体将降低Rituximab的效力,导致更多数目的新陈代谢活跃的活细胞。测量患者血清中中和活性的量,其与ALAMAR BLUETM或CELLTITER GLO信号相对于阴性对照的升高成比例。
在暴露步骤之后,测定CDC活性,优选通过评估细胞生存能力(即通过对活细胞定量)。有多种方法可用于测定细胞生存能力,包括测定通过碘化丙啶(PI)摄取、锥虫蓝(参见Moore et al.,Cytotechnology 17:1-11(1995))、膜联蛋白V或7AAD评估的膜完整性相对于未处理细胞的丧失,如美国专利申请No.2005/0032130A1(Beresini and Song)中的ALAMAR BLUETM(刃天青)测定法,或者如下文所述使用CELLTITER-GLO发光细胞生存能力测定法来测定读数的改良测定法,等等。抗体或免疫粘附素介导CDC的能力降低可能指示生物学样品中存在中和性抗体。
对于基于细胞的测定法,一般使用表达抗体或免疫粘附素所结合的抗原的细胞系。在CD20抗原的案例中,可利用多种细胞,包括WIL2-S细胞(ATCCCRL 8885,American Type Culture Collection)或WIL2-NS(ATCC CRL-8155)、SU-DHL-4(DSMZ No.ACC495,Deutsche Sammlung Von Mikroorganismenund Zelkulturen)、或表达CD20的类淋巴母细胞B细胞系。使用CD20阳性细胞的CDC测定法记载于Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000);Idusogie et al.,J.Immunol.166:2571-2575(2001);Reff et al.,Blood83(2):435-445(1994);美国专利No.6,194,551 B1(Idusogie et al.);美国专利No.5,736,137(Anderson et al.)。
若测定法评估ADCC,则可以对抗体或免疫粘附素测定其介导天然杀伤细胞(NK细胞)和/或外周血单个核细胞(PBMC)裂解表达治疗用抗体所结合之抗原的细胞的能力。在CD20抗原的案例中,可使用WIL2-S细胞,Shields etal.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)和WO 00/42072(Presta,L.)记载了使用那些细胞的例示性ADCC测定法。还可参见Clynes et al.,Nature Medicine6:443-6(2000)。美国专利No.5,736,137(Anderson et al.)也记载了使用CD20阳性细胞的ADCC测定法。
凋亡指程序性细胞死亡,例如B细胞的,而且可通过多种不同测定法测定,诸如膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞皱缩、内质网的膨胀、细胞碎裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)的形成。测定抗体(例如Rituximab)诱导凋亡的能力的测定法记载于例如Shan et al.,Cancer Immunol Immunther48:673-83(2000);Pedersen et al.,Blood 99:1314-9(2002);Demidem et al.,Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186(1997)。
抗体或免疫粘附素抑制细胞(例如表达拮抗剂或抗体所结合之抗原的癌性B细胞)生长的能力可通过多种不同测定法评估。Taji et al.,Jpn J.CancerRes 89:748-56(1998)记载了如何测定CD20抗体对CD20阳性B淋巴瘤细胞系的生长抑制。
使用本文中的中和性抗体测定法,可测定药物(例如与CD20结合的药物)的功效,通过测量来自用该药物治疗的患者的生物学样品阻断其生物学活性的能力,其中生物学活性相对于对照样品的降低指示患者正产生针对所研究药物的抗体和/或此类抗体可中和,至少在一定程度上,其生物学活性。显著的应答可以是由于中和性抗体产生导致安全性相关问题的和/或响应变更的药物清除而需要改变原来药物的剂量给药方案的。例如,与相同量的预处理对应物(例如HAMA、HACA和HAHA阴性的)相比,在给定的浓度中和药物的大约20%或更多活性(例如在大约20%至大约100%的范围内)的样品可视为针对该药物的中和性抗体是阳性的。
本文中优选的中和性抗体测定法基于2005年2月10日公布的US2005/0032130 A1(Beresini and Song)中所披露的内容,但在多个方面进行了修改,如下文实施例1中所述。具体而言,所述生物学样品(即血清)现在是经预处理的血清;CELLTITER-GLO发光细胞生存能力测定法现在是测定读数而非ALAMAR BLUETM(刃天青);所用对照抗体是猕猴蛋白A纯化的(HER2吸附的)制剂,而非山羊抗Rituximab;而且缓冲液、体积、补体、对照、血清基体效应、数据分析和解释有变化,如实施例1中所述。
IV.抗体的生产
本文中感兴趣的药物可以是治疗用抗体,例如与B细胞表面标志结合的抗体,尤其是与CD20结合的抗体。因此,本文将描述用于生成抗体的方法。
将用于生成或筛选抗体的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的部分。或者/另外,在其细胞表面表达该抗原的细胞可用于生成或筛选抗体。可用于生成抗体的其它形式的抗原对本领域技术人员将是显而易见的。
下面的描述例示了用于生产依照本发明使用的抗体的方法。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物中生成,通过多次皮下(sc)、腹膜内(ip)或肌肉内(im)注射相关抗原和佐剂。使用双功能或衍生化试剂,例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烃基),将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的,例如匙孔戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位,将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。1个月后,通过多个部位的皮下注射,用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后,采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫直到滴度达到平台(plateau)。优选的是,将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样,适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了在生产单克隆抗体的过程中产生的可能变体外,此类变体一般以极小量存在。由此,修饰语“单克隆”指明抗体的特征,即不是分立的或多克隆的抗体的混合物。
例如,单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备,或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中,如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物,诸如仓鼠,以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞,所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者,可以在体外免疫淋巴细胞。然后,使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养,所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系,诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是,通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化规程,诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析,将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离,可将DNA置于表达载体中,然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中,诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在又一个实施方案中,可以从使用McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段。Clackson etal.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids Res.21:2265-2266(1993)),生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此,这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA,例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)),或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。
典型的是,用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域,或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域,以产生嵌合二价抗体,其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是,人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基,它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science239:1534-1536(1988)),通过用高变区序列替代人抗体的相应序列。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567),其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中,人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择,包括轻链和重链二者,对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法,用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993))。
更为重要的是,抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现这一目标,依照一种优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样,可以从受体和输入序列选出FR残基并进行组合,从而获得期望的抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言,高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方法,可生成人抗体。例如,现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggermann et al.,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者,噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术,将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因,并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝,以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此,噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种格式进行;有关综述参见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗唑酮抗体。可本质上遵循Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734(1993)所记载的技术,自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24:107-117(1992);Brennan et al.,Science 229:81(1985))。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如,可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或者,可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中,所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利No.5,571,894;美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合B细胞表面标志的两种不同表位。其它此类抗体可结合B细胞表面标志并进一步结合第二种不同的B细胞表面标志。或者,可将抗B细胞表面标志结合臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)(诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合在一起,使得细胞防御机制聚焦于B细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位至B细胞。这些抗体具有B细胞表面标志结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达,其中两条链具有不同的特异性(Millstein et al.,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991)中披露了类似的规程。
依照一种不同的方法,将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是,至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的重链第一恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比率提供了极大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径,因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中记载的另一种方法,可改造一对抗体分子之间的界面,以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域的CH3结构域。在该方法中,将第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换,在第二抗体分子的界面上产生大小与大侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如,异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联,另一种与生物素偶联。例如,此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980),及用于治疗HIV感染(WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的,并且连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如,可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science 229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原,以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合,以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
还已记载了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体,然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL),所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此,迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对,由此形成两个抗原结合位点。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略(参见Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994))。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体(Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991))。
V.免疫粘附素的生产
在另一个实施方案中,本文中的药物可以是免疫粘附素,例如BR3-Ig或TNF-α免疫粘附素。用于制备免疫粘附素的例示性方法下文有更为详细的描述。
最简单且最直接的免疫粘附素设计将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的Fc区组合在一起。通常,在制备本发明的免疫粘附素时,将编码粘附素结合结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定域序列N-末端的核酸的C-末端,然而N-末端融化也是可能的。
通常,在此类融合物中,所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链、CH2和CH3结构域。还可以对恒定域Fc部分的C-末端进行融合,或者紧挨着重链CH1或轻链对应区的N-末端进行。进行融合的精确位点不是至关重要的;具体位点是众所周知的,而且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。
在一个优选的实施方案中,将粘附素序列融合在免疫球蛋白G1(IgG1)Fc区的N-末端。有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而,更优选的是,在融合中使用在铰链区中紧挨着在化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216,以重链恒定区的第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游开始的序列。在一个特别优选的实施方案中,将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区、CH2和CH3或(b)CH1、铰链、CH2和CH3结构域融合。
对于双特异性免疫粘附素,将免疫粘附素装配成多聚体,特别是异二聚体或异四聚体。一般而言,这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。基本的四链结构单元就是IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复;IgM一般作为通过二硫键保持在一起的四链基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中。在多聚体的情况中,各个四链单元可以是相同的或不同的。
下面示意性的列举了在本文范围内的各种例示性的装配好的免疫粘附素:
(a)ACL-ACL;
(b)ACH-(ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,或VLCL-ACH);
(c)ACL-ACH-(ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,或VLCL-VHCH);
(d)ACL-VHCH-(ACH,ACL-VHCH,或VLCL-ACH);
(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,或VLCL-ACH);和
(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2,
其中各个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列;
VL是免疫球蛋白轻链可变域;
VH是免疫球蛋白重链可变域;
CL是免疫球蛋白轻链恒定域;
CH是免疫球蛋白重链恒定域;
n是大于1的整数;
Y代表共价交联剂的残基。
为简短起见,上述结构只显示了关键特征;它们没有标示免疫球蛋白的连接(J)或其它结构域,也没有显示二硫键。然而,若结合活性需要此类结构域,则它们应当构建成存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置。
或者,可以将粘附素序列插入免疫球蛋白重链与轻链序列之间,从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中,将粘附素序列融合在免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3’端,或是在铰链与CH2结构域之间,或是在CH2与CH3结构域之间。类似的构建物已报道于Hoogenboom et al.,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)。
尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链,然而可以存在免疫球蛋白轻链,或是与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合,或是直接与粘附素融合。在前一种情况中,通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后,杂合重链与轻链将共价结合以提供包含两对二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于例如1989年3月28日公告的美国专利No.4,816,567。
最方便的是通过将编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列以符合读码框的形式融合来构建免疫粘附素。然而,也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如Aruffo et al.,Cell 61:1303-1313(1990);Stamenkovic et al.,Cell 66:1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在Ig调控序列以供表达。编码IgG重链恒定区的cDNA可以根据已发表的序列自衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库分离,通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术。将编码免疫粘附素的“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA串联插入在所选宿主细胞中指导高效表达的质粒载体。
本文中的免疫粘附素包括肽体(peptibody),其可以如例如WO 02/092620中所记载的来制备。
记载感兴趣的免疫粘附素的其它出版物包括:WO 01/12812,其记载了BCMA-Fc;WO 02/24909,其涉及BAFF-R-Fc;WO 00/40716,其关注TACI-Ig;等等。
VI.抗体或免疫粘附素的偶联物和其它修饰
本文中的抗体或免疫粘附素任选偶联另一药剂,诸如细胞毒剂或细胞因子(例如IL-2;参见例如WO 2005/016969)。
偶联通常将通过共价连接来实现,共价连接的确切性质将由靶向性分子和CD20拮抗剂或抗体多肽上的连接位点来决定。通常,非肽药剂通过添加接头来修饰,通过该接头的氨基酸侧链、糖链或由化学修饰导入到抗体或免疫粘附素上的反应性基团容许与抗体或免疫粘附素偶联。例如,可通过以下手段附着药物:通过赖氨酸残基的ε-氨基;通过游离的α-氨基;通过与半胱氨酸残基的二硫键交换;或通过用高碘酸氧化碳水化合物链中的1,2-二醇,使含有各种亲核试剂的药物通过席夫(Schiff)碱连接而附着。参见例如美国专利No.4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应性试剂(例如反应性酯、异硫氰酸酯、醛和磺酰卤)、硫醇反应性试剂(例如卤代乙酰基衍生物和马来酰亚胺)、及羧酸反应性和醛反应性试剂。CD20拮抗剂或抗体多肽可通过使用双功能交联试剂与肽试剂共价连接。异双功能试剂更为常用,允许两种不同蛋白质通过两种不同反应性模块(例如胺反应性加硫醇、碘乙酰胺或马来酰亚胺)受控偶联。此类连接剂的使用在本领域是众所周知的。参见例如美国专利No.4,671,958。也可采用肽接头。或者,可通过制备融合多肽将抗体或免疫粘附素与肽模块连接。
其它双功能蛋白质偶联剂的例子包括:N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫醇)-丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯,亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯类(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。
或者,可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体/免疫粘附素和药剂的融合蛋白。
本文设想了抗体或免疫粘附素的其它修饰。例如,可以将抗体或免疫粘附素与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接,例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。
本文公开的抗体或免疫粘附素还可配制成脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含拮抗剂或抗体的脂质体,诸如Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);美国专利No.4,485,045和4,544,545;WO 97/38731,公布于1997年10月23日中所记载的。美国专利No.5,013,556中披露了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可以用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器,以产生具有期望直径的脂质体。可以将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联,如Martin et al.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所记载的。任选在脂质体内包含化疗剂。参见Gabizon etal.,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
设想了抗体或免疫粘附素的氨基酸序列修饰。例如,可能希望改进抗体或免疫粘附素的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望的特性,可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工,诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)所记载的。这里,鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基,诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸),并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换,以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体,推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此,虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的,但是突变本身的性质不需要预先决定。例如,为了分析给定位点处的突变的后果,在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变,并对所表达的抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合,长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或延长抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。抗体中最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区,但也设想了FR改变。保守替代显示在表2中标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的变化,那么可以引入表2中称为“例示替代”的更多实质性变化,或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述,并筛选产物。
表2
原始残基 | 例示替代 | 优选替代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Asp;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu;Asn | Glu |
Cys(C) | Ser;Ala | Ser |
Gln(Q) | Asn;Glu | Asn |
Glu(E) | Asp;Gln | Asp |
Gly(G) | Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 | Leu |
Leu(L) | 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val:Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成:(a)替代区域的多肽主链的结构,例如作为折叠片或螺旋构象,(b)靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性,可以将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,Biochemistry,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York,(1975)):
(1)非极性的:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的:Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者,基于共同的侧链特性,可以将天然存在残基如下分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性、亲水性的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性的:Asp、Glu;
(4)碱性的:His、Lys、Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
(6)芳香族的:Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
任何不牵涉保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代,一般用丝氨酸,以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反,可以向抗体中添加半胱氨酸键以改进其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。一般而言,选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。用于产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之,将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变,在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上,作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外,分析抗原-抗体复合物的晶体结构,以鉴定抗体与抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体,就如本文所述对该组变体进行筛选,可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体或免疫粘附素的原始糖基化样式。此类改变包括删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块,和/或添加抗体或免疫粘附素中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此,多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含-个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。该改变还可通过向原始蛋白质的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若蛋白质包含Fc区,则可改变附着其上的碳水化合物。例如,美国专利申请US 2003/0157108 A1(Presta,L.)中记载了有缺少岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621 A1(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd.),它关注CD20抗体组合物。WO 03/011878(Jean-Mairet et al.)和美国专利No.6,602,684(Umana et al.)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087(Patel et al.)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964(Raju,S.)和WO99/22764(Raju,S.)。
本文中优选的糖基化变体包含Fc区,其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺少岩藻糖。此类变体具有改良的ADCC功能。任选的是,Fc区进一步包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代,例如Fc区第298、333和/或334位(Eu残基编号方式)的替代。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺陷型”抗体的出版物的例子包括:美国专利申请US 2003/0157108 A1,Presta,L;WO00/61739 A1;WO 01/29246 A1;US 2003/0115614 A1;US 2002/0164328 A1;US 2004/0093621 A1;US 2004/0132140 A1;US 2004/0110704 A1;US2004/0110282 A1;US 2004/0109865 A1;WO 03/085119 A1;WO 03/084570 A1;WO 2005/035778;WO 2005/035586(记载岩藻糖化的RNA抑制(RNAi));Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请US 2003/0157108 A1,Presta,L;WO2004/056312 A1,Adams et al.,尤其是实施例11)和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004))。
编码氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中),或者通过对早期制备的变体或非变体型式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体或免疫粘附素,例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一处或多处氨基酸替代来实现。或者/另外,可以在Fc区中引入半胱氨酸残基,从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.,CancerResearch 53:2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者,抗体可改造成具有双重Fc区,由此可具有增强的补体溶胞和ADCC能力。参见Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta,L.)记载了在存在人效应细胞时具有改良的ADCC功能的抗体,其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是,具有改良的ADCC的抗体在Fc区的第298、333和/或334位(Eu残基编号方式)包含替代。优选的是,改变的Fc区是在这些位置中的一个、两个或三个处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。此类替代任选联合提高C1q结合和/或CDC的替代。
WO 99/51642、美国专利No.6,194,551 B1、美国专利No.6,242,195 B1、美国专利No.6,528,624 B1和美国专利No.6,538,124(Idusogie et al.)中记载了具有改变的C1q结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。所述抗体在其Fc区的第270、322、326、327、329、313、333和/或334位(Eu残基编号方式)氨基酸中的一个或多个处包含氨基酸替代。第326、327、333和/或334位处一个或多个残基的替代可改进C1q结合和/或CDC功能。
为了延长抗体的血清半衰期,可以将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段),如例如美国专利No.5,739,277中所记载的。在用于本文时,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
WO 00/42072(Presta,L.)和US 2005/0014934 A1(Hinton et al.)中记载了具有改良的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一处或多处改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。例如,Fc区可以在第238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434位(Eu残基编号方式)中的一个或多个处具有替代。优选的具有改良的FcRn结合的含Fc区抗体变体在其Fc区的第307、380和434位(Eu残基编号方式)中的一个、两个或三个处包含氨基酸替代。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(美国专利申请US 2002/0004587 A1,Miller et al.)。
VII.药用配制剂
依照本发明使用的抗体或免疫粘附素的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体或免疫粘附素与任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))混合,以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化己烷双胺;苯扎氯铵、苯索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐反荷离子,诸如钠;金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物);和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性的抗CD20抗体配制剂记载于WO 98/56418。该出版物记载了一种液体多剂配制剂,其包含40mg/mL rituximab,25mM乙酸盐,150mM海藻糖,0.9%苯甲醇,0.02%聚山梨醇酯20 pH5.0,最小保存期是于2-8℃保存两年。另一种感兴趣的抗CD20配制剂在9.0mg/mL氯化钠,7.35mg/mL二水合柠檬酸钠,0.7mg/mL聚山梨醇酯80,和注射用无菌水pH6.5中包含10mg/mLrituximab。
适于皮下施用的冻干配制剂记载于美国专利No.6,267,958(Andya etal.)。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度,重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。
还设想了结晶形式的抗体或免疫粘附素。参见例如US 2002/0136719 A1(Shenoy et al.)。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物,优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如,可能希望进一步提供第二药物,诸如那些下文治疗部分中所讨论的。所述其它药剂的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的抗体的量、所治疗自身免疫性疾病的类型、及受试者的临床参数。这些一般是以与上文所用相同的剂量、以上文所用施用路径而使用的,或是迄今所采用的剂量的大约1-99%。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊),或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′s PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质是定型产品的形式,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
VIII.自身免疫性疾病受试者的治疗
本发明提供了治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,包括:对受试者施用治疗用抗体、免疫粘附素或其它生物学药物以治疗自身免疫性疾病;从该受试者获取生物学样品;从该生物学样品亲和纯化免疫球蛋白;并对经过纯化的免疫球蛋白进行中和性抗体测定法。优选的是,所述生物学样品是血清,而且可以是已经发现包含干扰(interference)的,即干扰中和性抗体测定法的实施。
上文定义部分中描述了在此可治疗的各种自身免疫性疾病。例示性的优选自身免疫性疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸如类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、硬皮病、狼疮诸如SLE和狼疮肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、银屑病关节炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏(Crohn)病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、乳糜泻)、血管炎(ANCA相关血管炎、丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病、和多动脉炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如多发性硬化、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏(Parkinson)病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、自身免疫性多神经病)、肾病症(肾小球肾炎、古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征、贝格尔氏(Berger)病)、自身免疫性皮肤病学病症(银屑病、荨麻疹、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、皮肤红斑狼疮)、血液病学病症(血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉疾病诸如内耳病和听觉丧失、贝切特氏(Behcet)病、雷诺氏(Raynaud)综合征、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(糖尿病相关自身免疫性疾病、阿狄森氏(Addison)病、自身免疫性甲状腺病(格雷夫斯氏(Graves)病、甲状腺炎)。为本发明目的,更优选的自身免疫性适应证包括类风湿性关节炎(RA)、SLE、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、格雷夫斯氏(Graves)病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎,最优选RA和SLE。
本文中优选的治疗用抗体是与B细胞表面标志结合的抗体,最优选CD20抗体,最优选嵌合的、人源化的或人的CD20抗体,更优选rituximab、人源化2H7、2F2(HuMax-CD20)人CD20抗体(Genmab)、人源化A20抗体(Immunomedics)、抗CD20 auristatin E偶联物(Seattle Genetics)、抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)、抗CD20单抗疗法(EpiCyte)、或抗CD20抗体TRU 015(Trubion)等。仍然更优选的是rituximab或人源化2H7。
本文中感兴趣的其它治疗用抗体或免疫粘附素包括:rituximab(利妥昔单抗)、人源化2H7、2F2(HuMax-CD20)人CD20抗体、人源化A20抗体或IMMU-106、TRU 015、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体、infliximab(英夫利昔单抗)、CDP571、MAK-195、adalimumab(阿达木单抗)、PEG化TNF-α抗体片段、CDP-870、抗TNF-α多克隆抗体、PassTNF、整联蛋白抗体、efalizumab、natalizumab(那他珠单抗)、BAFF抗体、BR3抗体、BAFF受体抗体、Blys抗体、belimumab、CD37抗体、TRU 016、CD22抗体、epratuzumab(依帕珠单抗)、Abiogen CD22抗体、CMC 544、combotox、BL22、LIF 226、VEGF抗体、VEGF受体抗体、bevacizumab(贝伐单抗)、抗HER抗体、trastuzumab(曲妥单抗)、pertuzumab、cetuximab(西妥昔单抗)、抗IgE抗体、omalizumab、IL-21抗体、Impheron抗B细胞抗体、1D09C3、Lym-1抗体、oncolym、ISF 154、gomilixima、IL-6受体抗体、atlizumab、IL-15抗体、HuMax-I1-15、趋化因子受体抗体、CCR2抗体、MLN1202、抗补体抗体、C5抗体、eculizuma、人免疫球蛋白口服剂型、IgPO、IL-12抗体、ABT-874、teneliximab、CD40抗体、人源化S2C6、TNX 100、CD52抗体、campath-1H、和αvβ3抗体。
若抗体是CD20抗体,诸如rituximab或人源化2H7,则抗体的剂量可以是1gm×2、375mg/m2×4、等。优选的是,给予两次或更多次抗体暴露,例如大约每6个月或大约每12个月。
抗体以任何合适手段施用,包括肠胃外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还设想了膜/鞘内施用(参见例如美国专利申请No.2002/0009444,Grillo-Lopez,A,其关注CD20抗体的鞘内投递)。优选的是,静脉内或皮下给予剂量给药。
尽管可以作为单一药剂施用治疗用抗体、免疫粘附素或其它生物制品来治疗自身免疫性疾病,一般而言,治疗用抗体或免疫粘附素将联合一种或多种第二药物。例如,对于RA和其它自身免疫性疾病,抗体、免疫粘附素或其它生物学药物优选联合任何一种或多种上文定义部分列出的免疫抑制剂、化疗剂、BAFF拮抗剂、整联蛋白拮抗剂或抗体、和/或细胞因子;任何一种或多种缓解病情的抗风湿药(DMARD),诸如羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine);葡萄球菌蛋白A免疫吸附;静脉内免疫球蛋白(IVIG);非类固醇抗炎药(NSAID);糖皮质激素(例如经由关节注射);皮质类固醇(例如甲泼尼龙(methylprednisolone)和/或泼尼松(prednisone));叶酸;抗肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂,例如依那西普(etanercept)/ENBRELTM、英夫利昔单抗(infliximab)/REMICADETM、D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech);IL-1R拮抗剂(例如Kineret);1L-10拮抗剂(例如Ilodecakin);血液凝结调控剂(例如WinRho);IL-6拮抗剂/抗TNF(CBP1011);CD40拮抗剂(例如IDEC 131);Ig-Fc受体拮抗剂(MDX33);免疫调控剂(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn);抗CD5抗体(例如H5g1.1);巨噬细胞抑制剂(例如MDX 33);共刺激阻断剂(例如BMS 188667或Tolerimab);补体抑制剂(例如h5G1.1、3E10或抗衰变加速因子(DAF)抗体);IL-2拮抗剂(zxSMART);EGFR抑制剂(见上文定义);酪氨酸激酶抑制剂(见上文定义);抗血管发生剂(例如VEGF抗体,诸如贝伐单抗(bevacizumab));CD22抗体,诸如LL2或epratuzumab(LYMPHOCIDE;Immunomedics),包括epratuzumab Y-90(Juweid et al.,Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s(1995))、Abiogen的CD22抗体(Abiogen,Italy)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、combotox(UT Soutwestern)、BL22(NIH)、和LympoScan Tc99(Immunomedics);EpCAM抗体,诸如17-1A(PANOREX);αvβ3抗体(例如VITAXIN;Medimmune);CD37抗体,诸如TRU 016(Trubion);IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗B细胞抗体(Impheron);B细胞靶向单抗(Immunogen/Aventis);1D09C3(Morphosys/GPC);LymphoRad 131(HGS);Lym-1抗体Y-90(USC);LIF 226(Enhanced Lifesci.);BAFF抗体(例如WO 03/33658);BAFF受体抗体(例如WO02/24909);BR3抗体;Blys抗体,诸如belimumab;LYMPHOSTAT-BTM;抗Lym-1 Oncolym(USC/Peregrine);ISF 154(UCSD/Roche/Tragen);gomilixima(Idec 152;Biogen Idec);IL-6受体抗体,诸如atlizumab(ACTEMRATM;Chugai/Roche);IL-15抗体,诸如HuMax-I1-15(Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体,诸如CCR2抗体(例如MLN1202;Millieneum);抗补体抗体,诸如C5抗体(例如eculizumab,5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白口服剂型(例如IgPO:Protein Therapeutics);IL-12抗体,诸如ABT-874(CAT/Abbott);Teneliximab(BMS-224818);B细胞疫苗;DN-BAFF(Xencor);CRx-119(CombinatoRx);Amgen的BAFF拮抗剂;喷司他丁(Pentostatin)(Pfizer);IC-485(ICOS);趋化因子拮抗剂,诸如T-487(Tularik)或Reticulose(AVR-118);SCO-323(SCIOS);整联蛋白拮抗剂683699、Tanabe、NGD-2001-1(Neurogen);SCIO-469(SCIOS);BIRB-796(Boehringer Ingelheim);VX702、VX850(Vertex);白三烯B-4拮抗剂(诸如amelubunt,BIIL-284;BI);微管调控剂(Paxceed;Angiotech);蛋白酶抑制剂(MBS561392;BMS);AGIX-4207(Atherogenics);ISIS-104838(ISIS/Elan);MFG-IRAP(Univ.Pitt.);IL-1 Trap(RGN-303;Regeneron/Novartis);oprelvekin(Wyeth);everolimus(Certican;Novartis);Amevive(Biogen Idec);ORG-39141(Organon);FK-506(Fujisawa);IL-2拮抗剂(他克莫司(tacrolimus);Fujisawa);等。
第二药物可以与治疗用抗体或免疫粘附素的初次暴露和/或稍后暴露一起施用,此类联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用,及任一次序的序贯施用,其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。
在对受试者直接施用抗体或免疫粘附素之外,本申请设想了通过基因疗法来施用抗体或免疫粘附素。编码抗体的核酸的这种施用涵盖在表述施用“有效量”的抗体内。参见例如1996年3月14日公布的WO 96/07321,其关注使用基因疗法来生成胞内抗体。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入受试者的细胞,即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递,通常在需要抗体的部位将核酸直接注射入受试者。对于回体治疗,采集受试者的细胞,将核酸导入这些分离的细胞,并将经过修饰的细胞或是直接施用于受试者,或是例如装入多孔膜内并植入受试者(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移入体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中,希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源,诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时,与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入,例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和延长细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987);Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述参见Anderson et al.,Science 256:808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。
IX.诊断试剂盒
本发明还提供了供本文预处理方法使用的诊断试剂盒或制品。诊断试剂盒可包含下列任何一项或多项:拮抗剂/抗体/药物参比材料(例如rituximab参比材料);阳性对照中和性抗体(优选山羊抗猕猴);蛋白A+G柱(例如蛋白A/G柱);脱脂试剂;免疫球蛋白亲和纯化缓冲液(例如结合、洗脱和中和缓冲液);补体血清;适合细胞的测定稀释剂;使用手册或文献;小管冷冻细胞(例如WIL2细胞);细胞标记试剂(诸如CELL TITER GLO),等等。
例如,诊断试剂盒可包含(a)脱脂试剂;(b)用于免疫球蛋白亲和纯化的缓冲液(例如结合和洗脱缓冲液);及(c)使用手册,其指导诊断试剂盒的使用者在对样品进行基于细胞的生物测定法(诸如中和性抗体测定法)之前预处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品(例如为了避免血清干扰的问题)。任选的是,所述生物学样品已经用药物诸如治疗用抗体或免疫粘附素处理过。
诊断试剂盒任选进一步包含下列任何一项或多项:药物参比材料、阳性对照中和性抗体、补体血清、适于细胞的测定稀释剂、和细胞标记试剂,等等。
下面的非限制性实施例例示了本发明的进一步细节。将说明书中所有引用的公开内容明确收入本文作为参考。
实施例1:中和性抗体测定法,带有血清预处理的
此实施例涉及针对自身免疫性适应症中CD20抗体rituximab的中和性抗体测定法的研发。rituximab是人-小鼠嵌合单克隆抗体,它识别B细胞上的人CD20分子,并通过抗体效应器功能消减B细胞。rituximab在美国和欧洲批准用于无痛型复发性非何杰氏淋巴瘤(NHL),并且正研发用于自身免疫性适应症,包括类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)等。
针对rituximab的血清阳性中和性抗体(NAb)活性的评估是基于效力测定法,即一种补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法开发的。在此测定法中,将rituximab与标准化来源的人血清补体和靶B淋巴细胞细胞系WIL2-S一起温育2小时。2小时后测量rituximab-CDC所杀死的细胞量与剩余的存活细胞量的比例。
试剂
脱脂试剂:PHM-L LIPOSORB稀释剂(Absorbent),Calbiochem,cat 524371
IMMUNOPURETM固定化蛋白A/G:Pierce,cat 20422
5mL聚丙烯柱:Pierce,cat 29922
洗脱缓冲液:无菌ddH2O中的HCl,pH 2.1
中和缓冲液:20X PBS,A410,(无Ca++/Mg++),pH 6.5,HyClone cat SH3 A648.01
封闭缓冲液:PBS中的1%BSA
BSA:7.5%BSA,级分V,经细胞培养测试,Sigma cat A8412
PBS:GNE B5 Media Prep,编号A0829
CENTRICON-30浓缩器:2mL规格,Amicon cat 4209
用于脱脂的离心机:EPPENDORF离心机5415C
用于细胞和浓缩的离心机:Beckman GS-6R
WIL2-S细胞(ATCC CRL-8885)
生长培养基:RPMI 1640,2mM L-谷氨酰胺,10%FBS,庆大霉素
测定稀释剂(AD):RPMI 1640,20mM HEPES,0.1%BSA,25μg/mL庆大霉素
饥饿培养基:AD中的10%生长培养基
补体:人补体血清,Quidel part A112,lot 3MO174
rituximab标准品:参比材料C2B81298-2,9.8mg/mL
rituximab NAb标准品:猕猴(Cyno)抗rituxan pAb(lot 44082-81),0.5mg/mL
rituximab NAb对照:含NAb的NHS集合(低滴度和高滴度的,批号44083-48)
CELLTITER-GLO:Promega,cat G7571(10×10mL小管)
GUAVAVIACOUNTTM:GUAVAInc.4000-0040
96孔白色TC板,透明底,有盖子:Corning costar 3610
Molecular Devices SOFTMAXPro Lmax读数器
Pierce iCONTM浓缩器,7mL规格,cat-89886(或者CENRICON-30)
Pierce IMMUNOPURE蛋白A Plus(cat 22811)(或者蛋白A/G)
Pierce IMMUNOPURE固定化蛋白G Plus(cat 22851)(或者蛋白A/G)
样品预处理规程
1.血清脱脂。将200μL LIPOSORB(依照制造商的说明书在PBS中重建)溶液加至硅化的1.5mL聚丙烯管中的0.25mL血清。漩涡振荡45秒并以4500rpm(1600×g)离心10分钟。取出上清液并在硅化的1.5mL聚丙烯管中稀释到1mL PBS中。(若有一些LIPOSORB留在样品里,是容许的;这不会堵塞柱子。)
2.为每份患者样品和对照准备单独的0.5mL蛋白A/G柱。将1mL Protein A/G浆液加至5mL柱,测量柱床高度以确保0.5mL的柱床体积。
3.若凝胶先前使用过,则加5mL洗脱缓冲液流过柱子以清洗柱内的珠子。柱子可重复使用的次数尚未确定。
4.用2×5mL PBS平衡柱子。
5.将1.25mL稀释血清加至柱子。在硅化的1.5mL聚丙烯管中收集流出液,并重加样两次。
6.用3×5mL PBS洗柱。
7.用4mL洗脱缓冲液将抗体洗脱至装有0.2mL中和缓冲液的15mLFALCON管。
8.通过加入0.5mL封闭缓冲液并将浓缩器以3000rpm(1000×g)离心10分钟来封闭2mL CENTRICON-30浓缩器。去除任何残留在浓缩器顶部或底部的封闭缓冲液。
9.浓缩经过中和的洗脱液直至达到终体积0.25mL。若样品过度浓缩,则使用CENTRICON-30流出液将其稀释回0.25mL。用硅化的1.5mL聚丙烯管测量终体积是否到达0.25mL的标志线。
10.将浓缩液保存于-70℃直至准备在中和CDC测定法中进行测试。
中和测定法规程
本文中的中和性抗体测定法是基于2005年2月10日公布的US2005/0032130 A1(Beresini和Song)中的公开内容。然而,所述测定法在以下方面有所改进:生物学样品(即血清)现在是经过预处理的血清;CELLTITER-GLO现在是测定读数而非ALAMAR BLUETM(刃天青);所用的对照抗体是猕猴蛋白A纯化(猕猴蛋白A纯化的)(经过HER2吸附的)制品,而非山羊抗rituximab;而缓冲液、体积、补体、对照、血清基体效应、数据分析和解释已如下文所述有所改变。
1.在测定前的那天,接种8×106个细胞于20mL饥饿培养基中(0.4×106个细胞/mL)。
2.准备100(CDCmax)、0.4(CDCNAb)和0(CDCzero)μg/mL Rituximab。
100μg/mL:加10.2μL Rituximab标准品至1mL AD中
20μg/mL:加150μL 100μg/mL Rituximab至600μL AD中
0.4μg/mL:加100μL 20μg/mL Rituximab至4.9mL AD中
0μμ/mL:只有AD
3.如下所示将25μl加至测定孔(表3)。
表3-Rituximab浓度的平板布局
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | ||
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | ||
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | ||
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | ||
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | ||
0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | ||
4.如表4所示加入双份阴性对照、低水平对照、和样品各25μL。当前的平板布局有供24份样品的空间。有可能使用更多平板,但还未测试过。
表4-对照和样品的平板布局
NEG | NEG | LO | RA1 | RA2 | RA3 | RA4 | RA5 | RA6 | RA7 | ||
NEG | NEG | LO | RA1 | RA2 | RA3 | RA4 | RA5 | RA6 | RA7 | ||
RA8 | RA9 | RA10 | RA11 | RA12 | RA13 | RA14 | RA15 | RA16 | RA17 | ||
RA8 | RA9 | RA10 | RA11 | RA12 | RA13 | RA14 | RA15 | RA16 | RA17 | ||
RA18 | RA19 | RA20 | RA21 | RA22 | RA23 | RA24 | RA25 | NEG | NEG | ||
RA18 | RA19 | RA20 | RA21 | RA22 | RA23 | RA24 | RA25 | NEG | NEG | ||
5.于室温温和摇动温育至少2小时使血清纯化抗体结合并中和Rituximab。
6.于室温(RT)融化补体血清然后置于冰上。
7.从摇瓶侧壁清下,将WIL2-S细胞从摇瓶转移至50mL falcon管中。取出10μl细胞悬浮液并加上190μl VIACOUNT。2分钟后,对细胞进行计数并记录#/mL(20X稀释)和%存活力。或者,可用血球计对细胞进行计数。
8.以1200rpm(150xg)离心8分钟将细胞旋下来。轻轻倒出培养基并将细胞重悬于1mL AD中。准备10-20mL配制于AD中的0.25×106/mL WIL2-S细胞供测定。
9.向每个孔中加入50μl补体。
10.向每个孔中加入步骤9中准备的0.25×106/mL WIL2-S细胞50μl。
11.于室温摇动平板混合1分钟。于37℃/5% CO2中温育2小时。最后10分钟将平板放置至室温。
12.使CELLTITER-GLO试剂达到室温。向每个孔中加入100μl。CELLTITER-GLO缓冲液和底物贮存于-20℃。这两种成分可于4-8℃放置过夜进行解冻,并在测定当天,使用前混合并在实验台上放置30-45分钟。多余的混合试剂可于-20℃贮存至少1个月。
13.于室温摇动平板混合10分钟。
14.在Molecular Devices LMAX读数仪上读取发光值,使用的积分时间为1秒,未扣除空白。
数据分析
1.计算所有样品和对照的平行测定的平均值。若平均值的%CV>25%,则不使用该数值。
2.如下计算分割点:
(O.4μg/mL Rituximab时的平均阴性对照CELLTITER-GLO值)×1.03测定法的分割点定义为测定法的这样一种应答水平,高于它的样品定义为阳性的、低于它的样品定义为阴性的。统计学上由测定法中的非特异性背景水平确定分割点,参见(Mire-Sluis et al.,Journal of ImmunologicalMethods 289:1-16(2004))。在此测定法中,1.03的分割点系数是通过测定3天内10名RA个体的未治疗血清确定的,代表超过测定法内部阴性对照应答的3%的增量。这10份RA个体血清是从总共100名个体中选择的,以反映全范围的血清干扰和非特异性影响。血清预处理规程,作为每个测定的一部分进行,使样品应答标准化并使1.03的低分割点系数得以应用。通过使用1.03的分割点系数,所有未用Rituximab治疗过的RA血清将定义为阴性的,而1μg/ml猕猴抗Rituximab pAb或0.25μg/mL山羊抗Rituximab pAb将定义为阳性的。
3.检验样品平均值并按照以下标准报告:
若样品平均值≤分割点,则报告样品为阴性的
若样品平均值>分割点,则报告样品为阳性的
4.若低水平对照下降比率大于分割点,且若在0μg/mL和100μg/mLRituximab之间测定应答的信号下降10倍,则该测定是有效的。
5.目前,样品以测定法内部分割点为基础报告为阳性或阴性。未来可能希望计算样品的滴度值。“滴度”是以所述方法测试为阳性的最高样品稀释度的倒数。通常习惯将滴度表述为以所述方法测试为阳性的最高样品稀释度的常用对数。(Mire-Sluis et al.,Journal of Immunological Methods289:1-16(2004))。若此项工作完成了,高滴度对照也会包括在内。
滴度的插值法(Interpolation of Titer)
样品的滴度定义为导致测定应答相当于该测定法分割点的样品稀释系数的log10。因此,若1/100稀释样品导致测定信号相当于分割点,则所述滴度应为log10100或2.00。需要1/1000稀释的样品将给予3.00的滴度。若分割点应答落在两个稀释度的样品应答之间(常常如此),则用求解X-Y轴向线条上未知点的公式来计算所述滴度,假设所有的Y点是已知的(“信号单位”),且两个X点是已知的(“稀释单位”)。
使用的公式如下:
假设a=高于分割点的阳性样品或对照的信号
假设b=低于分割点的阳性样品或对照的信号
假设c=分割点的信号
假设d=信号高于分割点的阳性样品或对照的稀释度
假设e=信号低于分割点的阳性样品或对照的稀释度
计算滴度:
滴度=log(a-c)·(e-d)+d(a-b)
6.若低水平对照的比率大于1.03,且高水平对照的滴度大于2.0,则该测定是有效的。
7.记录样品的中和活性滴度值。若0μg/mL Rituximab时的样品应答显示出测定干扰,则将数据报告为“由于干扰物质造成不确定”。
WIL2-S细胞传代
1.Rituximab-CDC中和测定法使用了永生的WIL2-S,一种B成淋巴细胞细胞系作为靶细胞。此细胞系最好在达到1-2×106个细胞/mL的密度后传代。对于维持细胞,新的接种密度应目标为生长培养基中有0.04-0.3×106个细胞/mL。为了准备CDC测定,在含10%生长培养基的测定稀释剂中以0.4×106个细胞/mL的密度接种细胞。细胞可至少传代到P31。理想的是,细胞应维持在0.25-2.5×106个/mL的细胞密度。
表5-接种WIL2-S细胞供传代
再传代之前的天数 | #细胞加入量/20mL生长培养基 |
2 | 6×106 |
3 | 1.6×106 |
4 | 8×105 |
结果和讨论
Rituximab CDC中和性抗体测定法图示于图4中。图5显示了Rituximab补体依赖性细胞毒性(CDC)可在Fab和Fc结构域二者受到中和。Rituximab以剂量依赖性方式介导CDC,最大细胞裂解发生在5μg/mL浓度(对照数据以圆圈显示)。为了测试此测定法检测中和性抗体的能力,将Rituximab与山羊抗人Fcγ(数据以菱形显示)或山羊抗Rituximab(CDR特异性的;数据以正方形显示)多克隆抗体预温育。2小时后,加入正常人血清补体和12,500个细胞。2小时后,用CELLTITER GLO测量活细胞数目。在存在抗CDR或Fc抗体时,Rituximab-CDC活性的效力下降了,表现为剂量-应答曲线向右移动。例如,如箭头所指示的,与对照(40%)相比,1μg/mL Rituximab时剩余的活细胞百分数在与山羊抗CDR预保温的样品中是最大的(100%),其次是与山羊抗Fcγ预保温的样品(70%)。
从效力向中和性测定法形式转变中的第一步是测试所述测定法耐受未接受过治疗、未用过药物的血清的能力。在存在正常人血清时Rituximab-CDC测定法的最初测试显示了在20名男性和女性个体中同等的剂量依赖性效果。然而,在NAb测定法目标人群类风湿性关节炎(RA)患者中,所述测定法是不可靠的,证明了个体之间高度易变的Rituximab-CDC细胞应答。在有些个体中,向测定体系中加入未治疗过的血清完全抑制了Rituximab介导CDC的能力。
图6显示了Rituximab-CDC测定法中的血清耐受。对Rituximab-CDC测定法测试耐受未接受过治疗、未用过药物的血清的能力。在存在正常人血清时所述测定法的最初测试显示了在10名男性和女性个体中同等的剂量依赖性效果(左图)。然而,在NAb测定法目标人群类风湿性关节炎(RA)患者中,所述测定法是不可靠的,证明了个体之间高度易变的Rituxan-CDC细胞应答(右图)。在有些个体中,向测定体系中加入未治疗过的血清完全抑制了Rituxan介导CDC的能力(例如以菱形显示的个体数据)。
存在RA血清即所谓“血清干扰”时缺乏测定的特异性和Rituximab效力的易变性,导致增加了血清预处理步骤,以便在进行Rituximab CDC测定法之前“净化”样品。
随着逐渐提高的操作水平开发了经测试适于血清预处理的方法。
首先,尽管通过提高最小样品稀释度(达到至少1/80)可以使干扰最小化,但是测定法的灵敏度降低过多(>5μg/mL抗Rituximab抗体)。
其次,对数种备选的测定读数进行了比较。在此测定法中,Rituximab引起的CDC的量可通过剩余的活细胞数目或被杀死的细胞数目进行测量。活细胞通常通过新陈代谢读数进行测量,诸如氧化还原作用指示剂ALAMARBLUETM或ATP指示剂CELLTITER GLOTM。被杀死的细胞可通过胞质内容物(或者是内源的(例如乳糖脱氢酶)或者是预先加载的染料(例如钙黄绿素))的释放进行测量。从概念上说,若试剂在10分钟后给出测定读数(例如CELLTITER GLOTM),较之16小时(例如ALAMAR BLUETM),血清对细胞新陈代谢的非特异性干扰的时间会更少。或者,若外源加入试剂,且因此与细胞新陈代谢不相关联(例如钙黄绿素),则干扰可能更少。
图7描述了用于Rituximab-CDC测定法的备选测定读数。Rituximab-CDC引起的细胞裂解量可通过剩余的活细胞数目或被杀死的细胞数目进行测量。活细胞通常通过新陈代谢读数进行测量,诸如氧化还原作用指示剂ALAMAR BLUETM或ATP指示剂CELLTITER GLOTM。被杀死的细胞可通过胞质内容物(或者是内源的(例如乳糖脱氢酶)或者是预先加载的染料(例如钙黄绿素))的释放进行测量。ALAMAR BLUETM(数据以x表示)和CELLTITER GLOTM(数据以圆圈表示)显示了相似的Rituximab-CDC图谱,CELLTITER GLO具有明显改良的动态范围(dynamic range)。钙黄绿素(数据以正方形表示)也能够检测Rituximab-CDC,虽然灵敏度较低及动态范围较小。乳糖脱氢酶(数据以菱形表示)不是Rituximab-CDC的灵敏指标。
图8比较了在Rituximab-CDC测定法中使用不同读数时的RA血清干扰。为了降低Rituximab-CDC测定法中类风湿性关节炎血清的干扰,测试了三种不同CDC测定读数(见图7)对五份单独的RA血清的耐受情况。用全部三种检测试剂CELLTITER GLO、ALAMAR BLUETM(中间的曲线)和钙黄绿素都观察到血清干扰。选定CELLTITER GLO作为用于进一步测定法研发的读数,因为它显示出最小的血清干扰、最佳的动态范围和最均一灵敏的Rituxirnab EC50。
如图7和8中所示,在此测定法中,备选的读数未解决RA血清干扰问题,表明干扰发生在测定的早期,在细胞与Rituximab和标准化补体血清一起温育的2小时期间。不幸的是,没有针对Rituximab的合适的备选功能性MOA测定法或者针对CDC测量的备选途径。
第三条途径是去除干扰性物质。首先测试的两种比较温和的方法包括:用脱盐柱(NAP-5TM柱,Pharmacia Biotech)去除小分子;并通过脱脂规程(PHM-L LIPOSORBTM Calbiochem)去除血清脂质。这两种方法都不能去除干扰性物质。第三种可能性是加入针对干扰性细胞因子的抑制性抗体,或热灭活的。然而,尽管RA患者血清的细胞因子图谱不是正常的,但它们并未证明特定细胞因子水平和测定干扰之间的关联性。优先沉淀全部免疫球蛋白的粗制方法是通过加入饱和硫酸铵(SAS)至终体积33%而“将它们盐析出来”。SAS规程后样品干扰仍然是一个问题。最后,认为在以Rituximab-CDC测定法测定样品之前必需特异性的纯化血清免疫球蛋白。
血清免疫球蛋白的特异性纯化可通过(a)特异性纯化抗Rituximab抗体,或(b)特异性纯化总的免疫球蛋白来进行。
抗Rituximab抗体的纯化看起来是最直接的方法,具有的额外好处是捕获全部的抗药物抗体同种型和去除患者样品中残余治疗药物所引起的Rituximab干扰。测试了数种Rituximab亲和纯化策略,包括:Rituximab-GLY-CPGTM(Controlled Pore Glass Products Inc.)、Rituximab-BIOMAG(Bangs Laboratories,Inc.)和Rituximab-EMPORETM(3MBioanalytical Technologies)。在对偶联、封闭、结合和洗脱参数进行广泛的优化之后,这些方法由于低回收率而遭到放弃,特别是在血清特异性抗体浓度小于1μg/mL时(<25%回收率)。
纯化总免疫球蛋白的一种经典方法是使用微生物起源的重组蛋白质,即蛋白A和蛋白G。蛋白G强烈结合全部四种IgG亚型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4),而蛋白A强烈结合IgG1、IgG2和IgG4,微弱结合IgG3、IgM、IgA,而中等结合IgE。蛋白A和蛋白G二者特性的联合将捕获所有的抗药物抗体同种型,虽然具有对IgG1,2,4亚型的倾向性。利用此方法,CDC测定法中抗体对Rituximab的中和活性在正常人血清和预处理的正常人血清中是等同的。重要的是,Rituximab-CDC活性的剂量应答性在RA个体(在未处理血清中显示CDC测定法极度易变的个体)的预处理血清中变得等同。中和活性的低灵敏度分别确定为0.25μg/mL和1μg/mL(纯血清浓度)的山羊和猕猴抗Rituximab抗体。最后,在基于细胞的Rituximab-CDC测定法中在测定血清阳性的抗Rituximab抗体样品之前利用蛋白A+G纯化的规程得以开发、优化和准予。发现了测定法的工作特性对于已确认的临床抗体表征测定法而言是可接受的。
图9显示了用于从血清样品中纯化全部免疫球蛋白的血清预处理规程。用于纯化全部血清免疫球蛋白的这种方法开发成用以消除Rituximab-CDC测定法中的血清干扰。此图中显示了总结此规程的流程图。
血清预处理规程克服了干扰问题。图10显示了在血清预处理规程之前和之后进行Rituximab-CDC测定法的效果。在NAb测定法目标人群类风湿性关节炎(RA)患者中,Rituximab-CDC测定法是不可靠的,展示出个体之间高度易变的Rituxan-CDC细胞应答(左图)。在进行血清预处理规程之前(左图)和之后(右图)的测定中测试了10名个体的RA血清。血清预处理去除了干扰性基质成分并使RA个体间Rituxan-CDC活性的剂量-应答性标准化。
除了血清预处理规程之外,对中和性抗体测定法中多项另外的改进也进行了研发。
评估了使用不同细胞数的测定法的灵敏度。图11显示了Rituximab-CDC测定法在较低细胞数对中和的较高灵敏度。将用于材料批次释放的Rituximab-CDC效力测定法修改为中和测定法。在中和测定法优化过程中,使用比效力测定法(左图)中所用低4倍的细胞数时(右图)观察到灵敏度提高,但保持测定法的稳定性。将浓度从0.125逐步提高到2μg/mL的山羊抗Rituximab CDR多克隆抗体与覆盖测定法的整个剂量-应答范围的Rituximab一起预温育。剂量-应答曲线向右的移动以与针对Rituximab之pAb的浓度直接成比例的方式增大(左图和右图)。在较低细胞数时向右的移动较大(右图)。同样,还观察到在所有的中和性抗体浓度处较之对照的偏移是非线性的,在较低的Rituximab浓度时偏移的程度较大(左图和右图的上部)。
Rituximab剂量选择也作为用于提高中和性抗体测定法灵敏度的另一方法进行了评估。图12反映了用于评估中和活性的Rituximab浓度的选择。在患者样品的评估中,希望在单一的、选定的Rituximab浓度相对于分割点报告中和活性。以为了在较低Rituximab浓度进行中和而提高的Rituximab剂量-应答曲线的灵敏度为基础(图12),用逐渐增加量的山羊抗Rituximab CDR pAb(从0.1-1μg/mL)测试在0.2、0.4和0.6μg/mL处的Rituximab浓度。当Rituximab浓度为0.2μg/mL时,CDC活性只是刚刚高于缺少药物时的背景细胞裂解,而中和作用低于统计学显著性。在Rituximab浓度为0.4μg/mL时,CDC活性比缺少药物时的背景细胞裂解高25-30%,而中和作用在统计学上是显著的,并且与中和性抗体浓度成比例。进一步提高Rituximab浓度,损害测定法检测较低水平中和性抗体的灵敏度。例如,正如上文星号所指出的,0.1μg/mL山羊抗Rituximab CDR pAb不中和0.6μg/mL以及0.4μg/mL Rituximab。
图13显示了药物干扰对中和性Rituximab-CDC测定法的影响。用于在中和性Rituximab-CDC测定法中测试的患者血清可含有残余的治疗性Rituximab。若中和性抗体水平不足以在生物学上灭活循环的治疗剂,则样品可能在测定中提供有活性的Rituximab,导致异常高的CDC活性。针对测定法内部的阴性对照和低阳性对照评估测定法中的中和活性。样品中的异常高CDC活性会产生假阴性读数。左边的曲线显示了加入1μg/mL Rituximab(方块)对正常测定Rituximab剂量-应答曲线(圆圈)的影响。基线毒性是较高的,而EC50偏移为较低的表观浓度。然而,正如右边的曲线所示,当同样的1μg/mL Rituximab浓度与5倍摩尔过量(5μg/mL)的山羊抗Rituximab CDR多克隆抗体一起加入时(方块),基线毒性回复正常,仍有对Rituximab过量的足够中和性抗体使得在测定中测量为阳性(正如剂量-应答曲线显著向右偏移所指示的)。
Claims (28)
1.处理来自自身免疫性疾病受试者的生物学样品的方法,其包括:
(a)使样品脱脂;
(b)亲和纯化样品中的免疫球蛋白;
(c)浓缩经纯化的免疫球蛋白;并
(d)将经浓缩的免疫球蛋白进行基于细胞的生物学活性测定法。
2.权利要求1的方法,其中(d)中的测定法是中和性抗体测定法。
3.权利要求1的方法,其中(a)中的样品是血清样品。
4.前述权利要求任一项的方法,其中的受试者患有类风湿性关节炎。
5.权利要求1-3任一项的方法,其中的受试者患有系统性红斑狼疮(SLE)。
6.前述权利要求任一项的方法,其中的步骤(b)包括纯化基本上所有的免疫球蛋白同种型。
7.前述权利要求任一项的方法,其中的步骤(b)包括蛋白A+G亲和纯化。
8.权利要求7的方法,其中的蛋白A+G亲和纯化重复两次或更多次。
9.权利要求8的方法,其中的蛋白A+G亲和纯化重复三次。
10.前述权利要求任一项的方法,其中步骤(a)中的样品包含干扰。
11.前述权利要求任一项的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用治疗性抗体或免疫粘附素进行过治疗。
12.权利要求11的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用治疗性抗体进行过治疗。
13.权利要求12的方法,其中的治疗性抗体是CD20抗体。
14.权利要求13的方法,其中的治疗性抗体是rituximab或人源化2H7。
15.权利要求12的方法,其中的治疗性抗体选自:rituximab、人源化2H7、2F2(HuMax-CD20)人CD20抗体、人源化A20抗体或IMMU-106、TRU015、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体、infliximab、CDP571、MAK-195、adalimumab、PEG化TNF-α抗体片段、CDP-870、抗TNF-α多克隆抗体PassTNF、整联蛋白抗体、efalizumab、natalizumab、BAFF抗体、BR3抗体、BAFF受体抗体、Blys抗体、belimumab、CD37抗体、TRU 016、CD22抗体、epratuzumab、Abiogen CD22抗体、CMC 544、combotox、BL22、LIF 226、VEGF抗体、VEGF受体抗体、bevacizumab、ranibizumab、抗HER抗体、trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、抗IgE抗体、omalizumab、IL-21抗体、Impheron抗B细胞抗体、1D09C3、Lym-1抗体、oncolym、ISF 154、gomilixima、IL-6受体抗体、atlizumab、IL-15抗体、HuMax-I1-15、趋化因子受体抗体、CCR2抗体、MLN1202、抗补体抗体、C5抗体、eculizuma、人免疫球蛋白口服剂型、IgPO、IL-12抗体、ABT-874、teneliximab、CD40抗体、人源化S2C6、TNX 100、CD52抗体、campath-1H、和αvβ3抗体。
16.权利要求12的方法,其中的治疗性抗体是整联蛋白抗体。
17.权利要求16的方法,其中的整联蛋白抗体是efalizumab或natalizumab。
18.权利要求11的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用免疫粘附素进行过治疗。
19.权利要求18的方法,其中的免疫粘附素选自:BR3-Ig、TNF-α免疫粘附素、依那西普、抗BAFF肽体(peptibody)、TACI-Ig、BCMA-Ig、CTLA4-Ig、abatacept、和BAFF-R-Ig。
20.权利要求11的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体或TNF-α免疫粘附素进行过治疗。
21.权利要求20的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用infliximab、adalimumab、依那西普、CDP-870或D2E7进行过治疗。
22.权利要求1的方法,其中的自身免疫性疾病受试者已经用选自下组的药物进行过治疗:PEG化的可溶性TNF-R、pegsunercept、IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、anakira、DN-BAFF、和疫苗。
23.治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,其包括:
(a)对受试者施用治疗性抗体或免疫粘附素以治疗自身免疫性疾病;
(b)获取来自受试者的生物学样品;
(c)亲和纯化生物学样品中的免疫球蛋白;并
(d)将经纯化的免疫球蛋白进行中和性抗体测定。
24.权利要求23的方法,其中步骤(b)中的样品包括人血清。
25.权利要求23的方法,其中的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)或斯耶格伦氏病。
26.权利要求23的方法,其中步骤(b)中的样品包含干扰。
27.诊断试剂盒,其包含:
(a)脱脂试剂;
(b)用于亲和纯化免疫球蛋白的缓冲液;和
(c)指导诊断试剂盒的使用者实施权利要求1的方法的使用手册。
28.权利要求27的诊断试剂盒,其进一步包含以下任一项或多项:药物参比材料、阳性对照中和性抗体、补体血清、适于细胞的测定稀释剂、和细胞标记试剂。
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