CN101809036A - 奥瑞珠单抗(2h7)的固定的单次注射剂量 - Google Patents

奥瑞珠单抗(2h7)的固定的单次注射剂量 Download PDF

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Abstract

本发明涉及CD20拮抗剂在制备用于治疗自体免疫疾病的药物中的应用，其中所述药物用于以所述拮抗剂的单次治疗有效的静脉内(i.v.)输注形式施用给人患者。所述CD20拮抗剂优选是CD20抗体，并且所述自体免疫疾病优选是类风湿性关节炎。

Description

奥瑞珠单抗(2H7)的固定的单次注射剂量
发明领域
本发明涉及通过使用在治疗开始时包括全效剂量的单次静脉内输注的治疗方案施用CD20抗体而进行的自体免疫疾病包括类风湿性关节炎的治疗。
发明背景
淋巴细胞是数种白血细胞群体中的一种；它们专门识别和响应外来抗原。三种主要种类的淋巴细胞为B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是负责抗体生产的细胞，并且提供体液免疫。B细胞在骨髓内成熟，并且使得骨髓在它们的细胞表面上表达抗原结合抗体。当天然B细胞首次遇到对其膜结合的抗体是特异性的抗原时，细胞开始快速分裂，并且其子代分化成记忆B细胞和称为“浆细胞”的效应子细胞。记忆B细胞具有更长久的生命期限，并且继续表达与初始母细胞具有相同特异性的膜结合的抗体。浆细胞不产生膜结合的抗体，而是产生分泌形式的抗体。分泌的抗体是体液免疫的主要效应子分子。
CD20抗原(还称为人B-淋巴细胞-限制性分化抗原，Bp35)是具有约35kD的分子量、位于前-B(pre-B)和成熟的B淋巴细胞上的疏水跨膜蛋白(Valentine等.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)264(19)：11282-11287(1989)；和Einfeld等.EMBO J.(胚胎学杂志)7(3)：711-717(1988))。所述抗原还在超过90％的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等.Blood(血液)63(6)：1424-1433(1984))，但是没有在造血干细胞、前-B(pro-B)细胞、正常浆细胞或其它正常组织上发现(Tedder等.J.Immunol.(免疫学杂志)135(2)：973-979(1985))。认为CD20调控细胞周期起始和分化的活化过程的早期步骤(Tedder等.，同前所述)，并且可能起钙离子通道的作用(Tedder等.J.Cell.Biochem.(细胞生物化学杂志)14D：195(1990))。
已知CD20在B细胞淋巴瘤中的表达，该抗原已经成为治疗所述淋巴瘤的有效治疗靶标。在美国有超过300,000人患有B-细胞NHL，并且每年诊断超过56,000例新病例。CD20也是用于治疗自体免疫疾病的有用的靶标抗原。
利妥昔单抗(
Figure GPA00001068272100021
在欧洲为
Figure GPA00001068272100022
)抗体，其是针对人CD20抗原的遗传加工的嵌合鼠/人单克隆抗体(可从美国加利福尼亚州South San Francisco的Genentech公司(Genentech，Inc.)商购)，用于治疗患有复发的或难治愈的低级或囊泡、CD20阳性的、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者。利妥昔单抗是在1998年4月7日授权的美国专利号5,736,137(Anderson等.)中、和在美国专利号5,776,456中称为“C2B8”的抗体。
已经在多种非恶性自体免疫病症中研究了利妥昔单抗，其中B细胞和自体抗体似乎在疾病病理生理学中起作用。Edwards等.，Biochem Soc.Trans.(生物化学学会学报)30：824-828(2002)。已经报道利妥昔单抗有力地减轻下列各项的征兆和症状：例如，类风湿性关节炎(RA)(Leandro等.，Ann.Rheum.Dis.(类风湿病年刊)61：883-888(2002)；Edwards等.，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)，46(增刊9)：S46(2002)；Stahl等.，Ann.Rheum.Dis.(类风湿病年刊)，62(增刊1)：OP004(2003)；Emery等.，Arthritis Rheum.48(9)：S439(2003))，狼疮(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.(关节病研究和治疗)5：157-159(2003)；Leandro等.Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)46：2673-2677(2002)；Gorman等.，Lupus(狼疮)，13：312-316(2004))，免疫血小板减少性紫癜(D’Arena等.，leuk.Lymphoma(白血病和淋巴瘤)44：561-562(2003)；Stasi等.，Blood(血液)，98：952-957(2001)；Saleh等.，Semin.Oncol.(肿瘤学研讨)，27(增刊12)：99-103(2000)；Zaja等.，Haematolgica(血液病学)，87：189-195(2002)；Ratanatharathorn等.，Ann.Int.Med.(国际医学年刊)，133：275-279(2000))，纯红细胞发育不全(Auner等.，Br.J.Haematol.(英国血液病学杂志)，116：725-728(2002))；自体免疫性贫血(Zaja等.，Haematologica(血液病学)87：189-195(2002)(勘误在Haematologica(血液病学)87：336(2002))，冷凝集素病(Layios等.，Leukemia(白血病)，15：187-8(2001)；Berentsen等.，Blood(血液)，103：2925-2928(2004)；Berentsen等.，Br.J.Haematol.(英国血液病学杂志)，115：79-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol.(英国血液病学杂志)，112：1083-1090(2001)；Zaja等.，Br.J.Haematol.(英国血液病学杂志)，115：232-233(2001))，严重胰岛素抗性的B型综合征(Coll等.，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)，350：310-311(2004)，混合的冷球蛋白血症(DeVita等.，Arthritis Rheum(类风湿性关节炎).46增刊9：S206/S469(2002))，重症肌无力(Zaja等.，Neurology(神经学)，55：1062-63(2000)；Wylam等.，J.Pediatr.(小儿科杂志)，143：674-677(2003))，韦格纳肉芽肿病(Specks等.，Arthritis&Rheumatism(关节炎和风湿病)44：2836-2840(2001))，难治愈的普通天疱疮(refractory pemphigus vulgaris)(Dupuy等.，Arch Dermatol.(皮肤病学学报)，140：91-96(2004))，皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)，46(增刊9)：S1299(2002))，斯耶格伦综合征(Somer等.，Arthritis&Rheumatism(关节炎和风湿病)，49：394-398(2003))，活性II型混合的冷球蛋白血症(Zaja等.，Blood(血液)，101：3827-3834(2003))，普通天疱疮(pemphigus vulgaris)(Dupay等.，Arch.Dermatol.(皮肤病学学报)，140：91-95(2004))，自体免疫神经病(Pestronk等.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry(神经学神经外科和精神病学杂志)74：485-489(2003))，副肿瘤性斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等.Neurology(神经学)60(增刊1)PO5.128：A395(2003))，和复发的-减轻的多发性硬化病(RRMS).Cross等.(摘要)″PreliminaryResults from a Phase II Trial of Rituximab in MS(利妥昔单抗在MS中的II期试验的初步结果)″Eighth Annual Meeting of the Americas Committeesfor Research and Treatment in Multiple Sclerosis(美国多发性硬化病研究和治疗协会第八次年会)，20-21(2003)。
已经在患有类风湿性关节炎(RA)的患者中进行II期研究(WA16291)，提供关于利妥昔单抗的安全性和功效的48周随访数据。Emery等.Arthritis Rheum(类风湿性关节炎)48(9)：S439(2003)；Szczepanski等.Arthritis Rheum(类风湿性关节炎)48(9)：S121(2003)。将总共161名患者平均随机分成4个治疗组：甲氨蝶呤，单独的利妥昔单抗，利妥昔单抗加甲氨蝶呤，和利妥昔单抗加环磷酰胺(CTX)。利妥昔单抗治疗方案是在第1和15天进行一组静脉内施用。利妥昔单抗在大部分患有RA的患者的输注被大部分患者很好地耐受，在他们的第一次输注过程中，36％的患者经历至少一次不利事件(与接受安慰剂的患者中有30％相比较)。总之，认为大部分不利事件为轻微-中等严重性，并且在所有的治疗组中得到很好地平衡。在48周内在4个组中总共有19次严重的不利事件，这在利妥昔单抗/CTX组中略微更频繁些。在所有组中感染的发病率得到很好地平衡，在该RA患者群体中严重感染的平均率为4.66/100名患者-年，其低于在基于社区的流行病学研究中报道的需要住院的RA患者中的感染率(9.57/100名患者-年)。Doran等.，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)46：2287-2293(2002)。
在患有神经病症的少数患者中报道的利妥昔单抗安全模式与在肿瘤学或RA中报道的相似，所述神经病症包括自体免疫神经病(Pestronk等.，同前所述)，斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等.，同前所述)，和RRMS(Cross等.，同前所述)。在患有RRMS的患者中正在进行的研究者资助的利妥昔单抗与干扰素β(IFN-β)或乙酸格拉默组合试验(IST)中(Cross等.，同前所述)，10名治疗的患者中有1名在首次输注利妥昔单抗后经历了中等发烧和发冷后住院进行过夜观察，而其余9名患者完成了4次输注方案，没有任何报道的不利事件。
关于CD20抗体、CD20-结合分子、和自抗原疫苗的专利和专利出版物包括：美国专利号5,776,456，5,736,137，5,843,439，6,399,061，和6,682,734，以及US 2002/0197255，US 2003/0021781，US 2003/0082172，US 2003/0095963，US 2003/0147885，US 2005/0186205，和WO 1994/11026(Anderson等.)；美国专利号6,455,043，US 2003/0026804，US 2003/0206903，和WO 2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 2000/27428(Grillo-Lopez和White)；US 2004/0213784和WO 2000/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO2000/44788(Braslawsky等.)；WO 2001/10462(Rastetter，W.)；WO2001/10461(Rastetter和White)；WO 2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US 2001/0018041，US 2003/0180292，US 2002/0028178，WO 2001/34194，和WO 2002/22212(Hanna和Hariharan)；US 2002/0006404和WO2002/04021(Hanna和Hariharan)；US 2002/0012665，US 2005/0180975，WO2001/74388，和美国专利号6,896,885B5(Hanna，N.)；US 2002/0058029(Hanna，N.)；US 2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US 2005/0123540(Hanna等.)；US 2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO2001/97858；US 2005/0112060，US 2002/0039557，和美国专利号6,846,476(White，C.)；US 2002/0128448和WO 2002/34790(Reff，M.)；WO2002/060955(Braslawsky等.)；WO 2002/096948(Braslawsky等.)；WO2002/079255(Reff和Davies)；美国专利号6,171,586和6,991,790，和WO1998/56418(Lam等.)；US 2004/0191256和WO 1998/58964(Raju，S.)；WO1999/22764(Raju，S.)；WO 1999/51642，美国专利号6,194,551，美国专利号6,242,195，美国专利号6,528,624和美国专利号6,538,124(Idusogie等.)；美国专利号7,122,637，US 2005/0118174，US 2005/0233382，US2006/0194291，US 2006/0194290，US 2006/0194957，和WO 2000/42072(Presta，L.)；WO 2000/67796(Curd等.)；WO 2001/03734(Grillo-Lopez等.)；US 2002/0004587，US 2006/0025576，和WO 2001/77342(Miller和Presta)；US 2002/0197256和WO 2002/078766(Grewal，I.)；US 2003/0157108和WO 2003/035835(Presta，L.)；美国专利号5,648,267，5,733,779，6,017,733，和6,159,730，和WO 1994/11523(Reff等.关于表达技术)；美国专利号6,565,827，6,090,365，6,287,537，6,015,542，5,843,398，和5,595,721(Kaminski等.)；美国专利号5,500,362，5,677,180，5,721,108，6,120,767，6,652,852，和6,893,625以及WO 1988/04936(Robinson等.)；美国专利号6,410,391(Zelsacher)；美国专利号6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO  2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO2000/67795(Goldenberg)；美国专利号7,074,403(Goldenberg和Hansen)；美国专利号7,151,164(Hansen等.)；US 2003/0133930；WO 2000/74718和US 2005/0191300A1(Goldenberg和Hansen)；US 2003/0219433和WO2003/68821(Hansen等.)；WO 2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO2000/76542(Golay等.)；WO 2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利号6,368,596(Ghetie等.)；美国专利号6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg，D.)；US 2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO 2002/102312(Engleman，E.)；US 2003/0068664(Albitar等.)；WO 2003/002607(Leung，S.)；WO 2003/049694，US 2002/0009427，和US 2003/0185796(Wolin等.)；WO 2003/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818(Bohen等.)；US2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen等.)；US 2003/0219818(Bohen等.)；US 2002/0136719(Shenoy等.)；WO 2004/032828和US 2005/0180972(Wahl等.)；和WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。还参见美国专利号5,849,898和EP 330,191(Seed等.)；EP332,865A2(Meyer和Weiss)；美国专利号4,861,579(Meyer等.)；US 2001/0056066(Bugelski等.)；WO1995/03770(Bhat等.)；US 2003/0219433A1(Hansen等.)；WO 2004/035607和US 2004/167319(Teeling等.)；WO 2005/103081(Teeling等.)；US2006/0034835，US 2006/0024300，和WO 2004/056312(Lowman等.)；US2004/0093621(Shitara等.)；WO 2004/103404(Watkins等.)；WO2005/000901(Tedder等.)；US 2005/0025764(Watkins  等.)；US2006/0251652(Watkins等.)；WO 2005/016969(Carr等.)；US 2005/0069545(Carr等.)；WO 2005/014618(Chang 等.)；US 2005/0079174(Barbera-Guillem和Nelson)；US 2005/0106108(Leung和Hansen)；US2005/0123546(Umana等.)；US 2004/0072290(Umana等.)；US2003/0175884(Umana等.)；和WO 2005/044859(Umana等.)；WO2005/070963(Allan等.)；US 2005/0186216(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US  2005/0202534(Hayden-Ledbetter  和Ledbetter)；US 2005/136049(Ledbetter等.)；US  2003/118592(Ledbetter等.)；US 2003/133939(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0202012(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US 2005/0175614(Ledbetter和Hayden-Ledbetter)；US2005/0180970(Ledbetter  和Hayden-Ledbetter)；US  2005/0202028(Hayden-Ledbetter和Ledbetter)；US 2005/0202023(Hayden-Ledbetter和Ledbetter)；WO 2005/017148(Ledbetter等.)；WO 2005/037989(Ledbetter等.)；美国专利号6,183,744(Goldenberg)；美国专利号6,897,044(Braslawski等.)；WO 2006/005477(Krause等.)；US 2006/0029543(Krause等.)；US 2006/0018900(McCormick等.)；US 2006/0051349(Goldenberg和Hansen)；WO  2006/042240(Iyer  和Dunussi-Joannopoulos)；US2006/0121032(Dahiyat等.)；WO 2006/064121(Teillaud等.)；US2006/0153838(Watkins)，CN 1718587(Chen等.)；WO 2006/084264(Adams等.)；US 2006/0188495(Barron等.)；US 2004/0202658和WO 2004/091657(Benynes，K.)；US 2005/0095243，US 2005/0163775，WO 2005/00351，和WO 2006/068867(Chan，A.)；US 2006/0135430和WO 2005/005462(Chan等.)；US 2005/0032130和WO 2005/017529(Beresini等.)；US 2005/0053602和WO 2005/023302(Brunetta，P.)；US 2006/0179501and WO 2004/060052(Chan等.)；WO 2004/060053(Chan等.)；US 2005/0186206和WO2005/060999(Brunetta，P.)；US 2005/0191297和WO 2005/061542(Brunetta，P.)；US 2006/0002930和WO 2005/115453(Brunetta等.)；US 2006/0099662和WO 2005/108989(Chuntharapai等.)；CN 1420129A(Zhongxin GuojianPharmaceutical)；US 2005/0276803和WO 2005/113003(Chan等.)；US2005/0271658和WO 2005/117972(Brunetta等.)；US 2005/0255527和WO2005/11428(Yang，J.)；US 2006/0024295和WO 2005/120437(Brunetta，P.)；US 2006/0051345和WO 2005/117978(Frohna，P.)；US 2006/0062787和WO 2006/012508(Hitraya，E.)；US 2006/0067930和WO 2006/31370(Lowman等.)；WO 2006/29224(Ashkenazi，A.)；US 2006/0110387和WO2006/41680(Brunetta，P.)；US 2006/0134111和WO 2006/066086(Agarwal，S.)；WO 2006/069403(Ernst和Yansura)；US 2006/0188495和WO2006/076651(Dummer，W.)；WO 2006/084264(Lowman，H.)；WO2006/093923(Quan和Sewell)；WO 2006/106959(Numazaki等.)；WO2006/126069(Morawala)；WO 2006/130458(Gazit-Bornstein等.)；US2006/0275284(Hanna，G)；US 2007/0014785(Golay等.)；US 2007/0014720(Gazit-Bornstein  等.)；和US  2007/0020259(Hansen等.)；US2007/0020265(Goldenberg和Hansen)；US 2007/0014797(Hitraya)；US2006/0246004和WO 06/084264。
关于使用利妥昔单抗进行治疗的科学出版物包括：Perotta和Abuel，“Response of chronic relapsing ITP of 10years duration to rituximab(持续10年的慢性复发性ITP对利妥昔单抗的响应)”摘要#3360Blood(血液)10(1)(part 1-2)：第88B页(1998)；Perotta等.，″Rituxan in the treatment ofchronic idiopathic thrombocytopaenic purpura(ITP)(Rituxan用于治疗慢性特发性血小板减少性紫癜)″，Blood(血液)，94：49(摘要)(1999)；Matthews，R.，“Medical Heretics”New Scientist(4月7日，2001)；Leandro等.，“Clinicaloutcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion(用淋巴细胞消耗治疗22名患有类风湿性关节炎患者的临床结果)”Ann Rheum Dis(风湿病年刊)，同前所述；Leandro等.，“lymphocytedepletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and doseresponse(淋巴细胞消耗在类风湿性关节炎中：关于安全性、功效和剂量反应的早期证据)″Arthritis and Rheumatism(关节炎和风湿病)44(9)：S370(2001)；Leandro等.，“An open study of B lymphocyte depletion insystemic lupus erythematosus(B淋巴细胞消耗在系统红斑狼疮中的开放研究)”，Arthritis and Rheumatism(关节炎和风湿病)，46：2673-2677(2002)，其中在2-周的期间过程中，每名患者接受两次500-mg利妥昔单抗输注，两次750-mg环磷酰胺输注，和高剂量的口服皮质类固醇，并且其中两名治疗的患者分别在第7和8月复发，并且已经进行了再次治疗，尽管使用不同的方案；″Successful long-term treatment of systemic lupuserythematosus with rituximab maintenance therapy(使用利妥昔单抗维持治疗对系统红斑狼疮的成功的长期治疗)″Weide等.，Lupus(狼疮)，12：779-782(2003)，其中患者使用利妥昔单抗(375mg/m2x 4，以每周一次的时间间隔重复)进行治疗，并且每5-6个月递送进一步的利妥昔单抗应用，然后使用每3个月利妥昔单抗375mg/m2接受维持治疗，患有难治愈SLE的第二名患者成功地用利妥昔单抗进行治疗，且每3个月接受维持治疗，两名患者均对利妥昔单抗治疗响应良好；Edwards和Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designedto deplete B lymphocytes(在设计为消耗B淋巴细胞的方案之后，在类风湿性关节炎中持续的改善)”Rheumatology(风湿病学)40：205-211(2001)；Cambridge等.，″B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis：serial studies of immunological parameters(在患有类风湿性关节炎的患者中的B淋巴细胞消耗：免疫学参数的系列研究)″Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)，46(增刊9)：S 1350(2002)；Cambridge等.，″Serologic changesfollowing B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis(在用于类风湿性关节炎的B淋巴细胞消耗治疗后的血清学改变)″Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)，48：2146-2154(2003)；Edwards等.，“B-lymphocytedepletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders(在类风湿性关节炎和其他自体免疫病症中的B-淋巴细胞消耗治疗)”Biochem Soc.Trans.，同前所述；Edwards等.，“Efficacy and safety ofrituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antiboy：A randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis(B-细胞靶向的嵌合单克隆抗体利妥昔单抗的功效和安全性：在患有类风湿性关节炎患者中的随机的、安慰剂对照的试验).Arthritis andRheumatism(关节炎和风湿病)46(9)：S197(2002)；Edwards等..″Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis(在患有类风湿性关节炎 的患者中使用利妥昔单抗的B细胞靶向治疗的功效)″N Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)350：2572-2582(2004)；Pavelka等.，Ann.Rheum.Dis.(风湿病年刊)63：(S1)：289-290(2004)；Emery等.，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)50(S9)：S659(2004)；Levine和Pestronk，“IgM antibody-relatedpolyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy using rituximab(IgM抗体相关的polyneuropathies：使用利妥昔单抗的B细胞消耗化疗)”Neurology(神经学)52：1701-1704(1999)；Uchida等.，″The innate mononuclearphagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependentmechanisms during anti-CD20antibody immunotherapy(在抗-CD20抗体免疫治疗过程中，先天单核噬菌细胞网络通过Fc受体依赖性机制消耗B淋巴细胞)″J.Exp.Med.(医学实验杂志)199：1659-1669(2004)；Gong等.，″Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cellimmunotherapy(细胞微环境和循环动力学在B细胞免疫治疗中的重要性)″J.Immunol.(免疫学杂志)174：817-826(2005)；Hamaguchi等.，″Theperitoneal cavity provides a protective niche for B 1and conventional Blymphocytes during anti-CD20immunotherapy in mice(在小鼠中在抗-CD20免疫治疗过程中，腹腔为B1和一般B淋巴细胞提供保护性小环境)″J.Immunol.(免疫学杂志)174：4389-4399(2005)；Cragg等.″The biology ofCD20and its potential as a target for mAb therapy(CD20生物学及其作为mAb治疗的靶标的潜力)″Curr.Dir.Autoimmun.8：140-174(2005)；Eisenberg，″Mechanisms of autoimmunity(自体免疫性机制)″Immunol.Res.(免疫学研究)27：203-218(2003)；DeVita等.，“Efficacy of selective B cellblockade in the treatment of rheumatoid arthritis(选择性B细胞阻断在类风湿性关节炎治疗中的功效)”Arthritis&Rheum(关节炎和风湿病)46：2029-2033(2002)；Higashida等.“Treatment of DMARD-refractoryrheumatoid arthritis with rituximab(使用利妥昔单抗治疗DMARD-难治愈类风湿性关节炎).”在美国风湿病学学院年度科学会议(Annual ScientificMeeting of the American College ofRheumatology)上的演讲；10月24-29日；(摘要#LB11)，New Orleans，LA 2002；Tuscano，J.“Successful treatmentofinfliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab(使用利妥昔单抗成功治疗英利昔单抗-难治愈的类风湿性关节炎)”在美国风湿病学学院年度科学会议(Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology)上的演讲；10月24-29日；New Orleans，LA 2002和公布的Tuscano，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)46：3420(2002)；″Pathogenicroles of B cells in human autoimmunity；insights from the clinic(B细胞在人自体免疫性中的致病作用；来自临床的观点)″Martin和Chan，Immunity(免疫性)20：517-527(2004)；Silverman和Weisman，″rituximab therapyand autoimmune disorders，prospects for anti-B cell therapy(利妥昔单抗和自体免疫病症，抗-B细胞治疗的前景)″，Arthritis andRheumatism(关节炎和风湿病)，48：1484-1492(2003)；Kazkaz和Isenberg，″Anti B cell therapy(rituximab)in the treatment of autoimmune diseases(在自体免疫疾病治疗中的抗B细胞治疗(利妥昔单抗))″，Current opinion in pharmacology(现代药理学观点)，4：398-402(2004)；Virgolini和Vanda，″rituximab inautoimmune diseases(利妥昔单抗在自体免疫疾病中)″，Biomedicine&pharmacotherapy(生物医学和药物治疗)，58：299-309(2004)；Klemmer等.，″Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20monoclonal antibody rituximab(使用抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗治疗抗体介导的自体免疫病症)″，Arthritis And Rheumatism(关节炎和风湿病)，48：(9)9，S(SEP)，页码：S624-S624(2003)；Kneitz等.，″Effective B celldepletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases(在自体免疫疾病治疗中使用利妥昔单抗进行的有效B细胞消耗)″，Immunobiology(免疫生物学)，206：519-527(2002)；Arzoo等.，″Treatment of refractoryantibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20monoclonalantibody  (rituximab)(使用抗-CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)治疗难治愈的抗体介导的自体免疫病症)″Annals of the Rheumatic Diseases(风湿病年刊)，61(10)，第922-924页(2002)Comment in Ann Rheum Dis.(风湿病年刊评论)61：863-866(2002)；″Future strategies in immunotherapy(免疫治疗的未来策略)″Lake和Dionne，在Burger′s Medicinal Chemistry andDrug Discovery(Burger′s医学化学和药物发现)中(2003by John Wiley&Sons，Inc.)于2003年1月15日后在线论文(第二章″Antibody-DirectedImmunotherapy(抗体-指导的免疫治疗)″)；Liang和Tedder，WileyEncyclopedia ofMolecular Medicine(Wiley分子医学百科全书)，节：CD20as an Immunotherapy Target(CD20作为免疫治疗靶标)，于2002年1月15日后在线的论文，题目为″CD20″；附录4A，题目为″MonoclonalAntibodies to Human Cell Surface Antigens(针对人细胞表面抗原的单克隆抗体)″由Stockinger等编：Coligan等.，在Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)中(2003John Wiley&Sons，Inc)于2003年5月后在线；打印公布日期：2003年2月；Penichet和Morrison，″CDAntibodies/molecules：Definition；Antibody Engineering(CD抗体/分子：定义；抗体加工)″在Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine(Wiley分子医学百科全书)，节：Chimeric，Humanized and Human Antibodies(嵌合的、人源化的和人抗体)中；于2002年1月15日后在线。
此外，参见Looney″B cells as a therapeutic target in autoimmunediseases other than rheumatoid arthritis(B细胞在除类风湿性关节炎之外的自体免疫疾病中作为治疗靶标)″Rheumatology(风湿病学)，44增刊2：ii13-ii17(2005)；Chambers和Isenberg，″Anti-B cell therapy(rituximab)inthe treatment of autoimmune diseases(自体免疫疾病治疗中的抗-B细胞治疗(利妥昔单抗))″Lupus(狼疮)14(3)：210-214(2005)；Looney等.，″B-cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus：aphase I/II dose-escalating trial of rituximab(作为系统性红斑狼疮的新治疗的B-细胞消耗法：利妥昔单抗的I/II期剂量-递增的试验)″Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)50：2580-2589(2004)；Looney，″Treating humanautoimmune disease by depleting B cells(通过消耗B细胞治疗人自体免疫疾病)″Ann Rheum.Dis.(风湿病年刊)61：863-866(2002)；Edelbauer等.，″Rituximab in childhood systemic lupus erythematosus refractory toconventional immunosuppression Case report(对常规免疫抑制法难以治愈的儿童系统性红斑狼疮中的利妥昔单抗病例报告)″Pediatr.Nephrol.(儿科：肾脏学)20(6)：811-813(2005)；D′Cruz和Hughes，″The treatment oflupus nephritis(狼疮性肾炎的治疗)″BMJ 330(7488)：377-378(2005)；Looney，″B cell-targeted therapy in diseases other than rheumatoid arthritis(在除类风湿性关节炎之外的疾病中的靶向B-细胞的治疗)″J.Rheumatol.(风湿病学杂志)增刊73：25-28；讨论29-30(2005)；Sfikakis等.，″Remission of proliferative lupus nephritis following B cell depletiontherapy is preceded by down-regulation of the T cell costimulatory moleculeCD40ligand：an open-label trial(下调T细胞共刺激分子CD40配体先于在B细胞消耗治疗后增殖性狼疮肾炎的好转：开放标记的试验)″ArthritisRheum.(类风湿性关节炎)52(2)：501-513(2005)；Rastetter等.，″Rituximab：expanding role in therapy for lymphomas and autoimmunediseases(利妥昔单抗：在用于淋巴瘤和自体免疫疾病的治疗中的扩大的作用)″Annu.Rev.Med.(医学年度综述)55：477-503(2004)；Silverman，″Anti-CD20therapy in systemic lupus erythematosus：a step closer to theclinic(在系统性红斑狼疮中的抗-CD20治疗：更接近临床的一步)″Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)52(2)：371-7(2005)，Erratum在：Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)中52(4)：1342(2005)；Ahn等.，″Long-term remission from life-threatening hypercoagulable state associatedwith lupus anticoagulant(LA)following rituximab therapy(利妥昔单抗治疗后与狼疮抗凝血剂(LA)相关的有生命危险的高凝血病况的长期好转)″Am.J.Hematol.(美国血液学杂志)78(2)：127-129(2005)；Tahir等.，″Humanizedanti-CD20monoclonal antibody in the treatment of severe resistant systemiclupus erythematosus in a patient with antibodies against rituximab(在使用针对利妥昔单抗的抗体的患者中的严重抗性系统性红斑狼疮的治疗中的人源化抗-CD20单克隆抗体)″Rheumatology(风湿病学)，44(4)：561-562(2005)，Epub 2005年1月11日；Looney等.，″Treatment of SLE withanti-CD20monoclonal antibody(使用抗-CD20单克隆抗体治疗SLE)″Curr.Dir.Autoimmun.8：193-205(2005)；Cragg等.，″The biology of CD20and itspotential as a target for mAb therapy(CD20的生物学及其作为mAb治疗的靶标的潜力)″Curr.Dir.Autoimmun.8：140-174(2005)；Gottenberg等.，″Tolerance and short term efficacy of rituximab in 43patients with systemicautoimmune diseases(在患有系统性自体免疫疾病的43名患者中利妥昔单抗的耐受性和短期功效)″Ann.Rheum.Dis.(风湿病年刊)64(6)：913-920(2005)Epub 2004年11月18日；Tokunaga等.，″Down-regulation of CD40and CD80on B cells in patients with life-threatening systemic lupuserythematosus after successful treatment with rituximab(在使用利妥昔单抗成功治疗之后，在患有有生命危险的系统性红斑狼疮的患者中B细胞上CD40和CD80的下调)″Rheumatology(风湿病学)44(2)：176-182(2005)，Epub 2004年10月19日。还参见Leandro等.，″B cell repopulation occursmainly from
Figure GPA00001068272100131
B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemiclupus erythematosus(在患有类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的患者中，B细胞再募集主要由天然B细胞发生)″Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)，48(增刊9)：S 1160(2003)。
Specks等.“Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20chimeric monoclonal antibody therapy(韦格纳肉芽肿病对抗-CD20嵌合的单克隆抗体治疗的响应)”Arthritis&Rheumatism(关节炎和风湿病)44(12)：2836-2840(2001)公开了成功的使用4次375mg/m2利妥昔单抗输注和高剂量的糖皮质激素治疗韦格纳肉芽肿病。在cANCA复发11个月后重复该治疗，但是治疗不用糖皮质激素。在第二疗程的利妥昔单抗后8个月，患者的疾病基本保持完全消除。此外，在另一个研究中，发现当以375mg/m2x 4的剂量与口服泼尼松1mg/kg/日使用时，利妥昔单抗是用于严重ANCA-相关的血管炎的一种很好耐受的、有效的好转诱导剂，其中口服泼尼松到第4周减少至40mg/日，并且在之后的16周完全终止。4名患者仅用利妥昔单抗再次治疗复发的/升高的ANCA滴度。除了糖皮质激素之外，对于好转诱导和保持持续的好转(6个月或更久)似乎不需要任何其他的免疫抑制剂。Keogh等.，Kidney BloodPress.Res.(肾脏和血压研究)26：293(2003)报道了11名患有难治愈的ANCA-相关的血管炎的患者用4次每周剂量的375mg/m2利妥昔单抗和高剂量的糖皮质激素治疗，导致好转。
患有难治愈ANCA-相关的血管炎的患者施用利妥昔单抗和免疫抑制药物，如静脉内环磷酰胺，麦考酚酸酯，硫唑嘌呤，或来氟米特，具有明显的功效。Eriksson，″Short-term outcome and safety in 5patients withANCA-positive vasculitis treated with rituximab(使用利妥昔单抗治疗的5名患有ANCA-阳性血管炎的患者中的短期结果和安全性)″，Kidney andBlood Pressure Research(肾脏和血压研究)，26：294(2003)(使用利妥昔单抗375mg/m2每周一次持续4周治疗的5名患有ANCA-相关的血管炎的患者响应该治疗)；Jayne等.，″B-cell depletion with rituximab forrefractory vasculitis(对于难治愈的血管炎使用利妥昔单抗进行B-细胞消耗)″Kidney and Blood Pressure Research(肾脏和血压研究)，26：294-295(2003)(接受4次每周375mg/m2的利妥昔单抗输注和环磷酰胺以及背景抑制和泼尼松龙的6名患有难治愈的血管炎的患者经历主要的血管炎活性下降)。Smith和Jayne，A prospective，open label trial of B-cell depletionwith rituximab in refractory systemic vasculitis(在难治愈的系统性血管炎中使用利妥昔单抗的B-细胞消耗的预期的、开放标记的试验)，海报998(11th International Vasculitis and ANCA workshop)，American Society ofNephrology(美国肾脏学学会)，J.Am.Soc.Nephrol.(美国肾脏学学会)杂志，14：第755A页(2003)提供了另一份报道，其使用利妥昔单抗与静脉内环磷酰胺以375mg/m2/剂量给药4次施用给患有难治愈的系统性血管炎的患者。还参见Eriksson，J.Internal Med.(国际医学杂志)，257：540-548(2005)，其关于使用两次或四次每周剂量的500mg利妥昔单抗成功治疗的患有ANCA-阳性血管炎的9名患者，以及Keogh等.，Arthritis andRheumatism(血管炎和风湿病)，52：262-268(2005)，其报道在11名患有难治愈的ANCA-相关的血管炎的患者中，使用4次每周剂量的375mg/m2利妥昔单抗的治疗或再次治疗通过B淋巴细胞消耗诱导好转，该研究在2000年1月和2002年9月期间进行。
关于人源化抗-CD20抗体的活性，参见，例如，Vugmeyster等.，″Depletion of B cells by a humanized anti-CD20antibody PRO70769inMacaca fascicularis(在Macaca fascicularis中通过人源化抗-CD20抗体PRO70769消耗B细胞)″J.Immunother.(免疫治疗杂志)28：212-219(2005)。对于人单克隆抗体的讨论，参见Baker等.，″Generation andcharacterization of LymphoStat-B，a human monoclonal antibody thatantagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator(拮抗B淋巴细胞刺激剂的生物活性的人单克隆抗体LymphoStat-B的产生和表征)″ArthritisRheum.(类风湿性关节炎)48：3253-3265(2003)。此外，使用利妥昔单抗的MINT试验成功的治疗了较年轻的患者中的侵入性非霍奇金氏淋巴瘤Lancet Oncology(柳叶刀肿瘤学)(2006年4月5日)。
Trubion制药公司(Trubion Pharmaceuticals Inc.)最近在用276名患有类风湿性关节炎的、还接受甲氨喋呤作为背景治疗的患者中进行的IIb期随机的、双盲、安慰剂对照的、多中心临床试验中评估了命名为TRU-015的抗-CD20抗体片段-类型的分子的安全性和功效。患者随机分成5组，其接受安慰剂、200mg，400mg，800mg或1600mg TRU-015，作为单次静脉内输注施用。据报道TRU-015通常是很好耐受的。
在治疗疾病时，能够以有效的、安全的和由患者很好耐受的具有很少或没有副作用、并且可以有利地在日常临床实践中实施、对于患者具有尽可能少的不便的方式施用药物是有益的。如将通过下文的详细描述所清楚的，本发明通过为治疗自体免疫疾病提供施用CD20抗体的新方法而满足该需要。
发明概述
在一个方面中，本发明涉及在患有自体免疫疾病的人患者中消耗B细胞的方法，其包括给所述患者以单次静脉内(i.v.)输注施用完全治疗有效量的CD20拮抗剂。因此，本发明涉及CD20拮抗剂在制备用于治疗自体免疫疾病的药物中的应用，其中所述药物以所述拮抗剂的单次治疗有效的静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
在本发明所述的应用的一个实施方案中，所述施用之后是在第一次施用后4-6个月进行的第二次完全治疗有效量的CD20拮抗剂的静脉内输注。第二次施用通常在被治疗的患者响应第一次治疗但是表现出复发迹象时开始。因此，在本发明所述的应用的另一个实施方案中，所述第二次静脉内输注的所述施用是施用给响应但是在第一次施用后复发的患者。在本发明所述的应用的另一个实施方案中，在第一次和第二次静脉内输注用于施用的所述治疗有效剂量基本上是相同的。
在本发明所述的应用的另一个实施方案中，所述CD20拮抗剂是CD20单克隆抗体。在本发明所述的应用的优选实施方案中，所述CD20单克隆抗体是嵌合的、人源化的或人的。更优选地，所述CD20抗体是人源化2H7抗体。
在本发明所述的应用的另一个实施方案中，所述自体免疫疾病选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，溃疡性结肠炎，局限性回肠炎，斯耶格伦综合征，视神经脊髓炎(neuormyelitis optica)(NMO)，ANCA相关的血管炎，韦格纳病，炎性肠病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，自体免疫血小板减少症，多发性硬化病，银屑病，IgA肾病，IgM多神经病，重症肌无力，糖尿病，Reynaud’s综合征，和肾小球肾炎。在优选的实施方案中，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。在甚至更优选的实施方案中，所述自体免疫疾病是活动期类风湿性关节炎。在最优选的实施方案中，所述活动期类风湿性关节炎是中度-严重的类风湿性关节炎。
在本发明所述的应用的另一个实施方案中，所治疗的患者表现出对先前施用的下列各项的不充分的响应：甲氨喋呤，TNF拮抗剂，和/或其他抗-CD20拮抗剂，包括除了按照本发明施用的抗体之外的CD20抗体。
在本发明所述的应用中的治疗有效量典型地为10mg-2000mg，优选为约400mg-1500mg。在独立的实施方案中，所述治疗有效量为400mg，1000mg，和1500mg。
在一个优选的实施方案中，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎，且所述CD20抗体是人源化2H7抗体。
在不同的实施方案中，所述人源化的CD20抗体(1)选自由下列各项组成的组：2H7变体A，B和I，其分别包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7，8和15的全长重链，或其片段；或(2)为2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段；或(3)是这样的抗体，其基本上结合于与下述物质结合的表位相同的表位：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段；或(4)选自由下列各项组成的组：2H7变体C，D，F，G，和H，其分别包括SEQ ID NO：9的全长L链和SEQ ID NO：10，11，12，l 3，和14的全长H链，或其片段；(5)是2H7变体B，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：8的全长H链，或其片段；或(6)是2H7变体C，其包括SEQ ID NO：9的全长L链和SEQ ID NO：10的全长H链，或其片段。
在一个具体的实施方案中，所述抗体是嵌合抗体利妥昔单抗。
在另一个实施方案中，所述CD20抗体是人抗体HUMAX-CD20TM。
在本发明所述的应用的另一个实施方案中，所述CD20抗体用于与选自由下列各项组成的组药物联合施用：非甾类抗炎药(NSAIDs)，止痛剂，糖皮质类固醇，环磷酰胺，阿达木单抗，来氟米特，英利昔单抗，依那西普，奥法木单抗，托珠单抗，AME-133，Immu-106，和COX-2抑制剂。
在另一个实施方案中，所述应用是用于施用，包括第二治疗剂，其可以例如是免疫抑制剂。优选地，所述应用包括甲氨喋呤。更优选地，甲氨喋呤是10-25mg/周的施用剂量。
在另一个实施方案中，所述应用包括在施用CD20抗体之前施用1-6次DMARDS。
在另一个实施方案中，所述应用包括在施用CD20抗体之前无类固醇治疗。
在另一个方面中，本发明涉及CD20抗体在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用，其中所述药物用于给人患者以400mg-1500mg的剂量施用单次治疗有效的所述抗体的静脉内(i.v.)输注。更优选地，所述剂量选自由400mg，1000mg或1500mg组成的组。
正如前述，所述抗体可以是嵌合的、人源化的或人单克隆抗体，并且可以是，例如，上文列出的任意CD20抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及下述物质在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段，其中所述药物用于以所述抗体剂量为400mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
在另一个实施方案中，本发明涉及下述物质在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段，其中所述药物用于以所述抗体剂量为1000mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
在另一个实施方案中，本发明涉及下述物质在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段，其中所述药物用于以所述抗体剂量为1500mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
在本发明所述的应用的一个具体实施方案中，所述CD20抗体用于这样的施用，其后至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月没有进行CD20抗体的第二次施用。
在其他方面，本发明涉及用于治疗人患者中的活动期类风湿性关节炎(RA)的方法，其包括给所述患者施用400mg的2H7变体A，其包括SEQID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
在其他方面，本发明涉及用于治疗人患者中的活动期类风湿性关节炎(RA)的方法，其包括给所述患者施用1000mg的CD20抗体2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段，。
在一个具体实施方案中，第一次施用之后至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月，不进行CD20抗体的第二次施用。
在本文的所有应用中，初始输注速率可以在正常的标准输注速率范围内，诸如例如，50mg/小时-100mg/小时。在整个施用时间内，输注速率不必是相同的，而是可以递增的，例如，如实施例1中所述。
在不同的方面中，本发明涉及制品，其包括：(a)容器，其包括CD20拮抗剂；和(b)包装插页，其具有用于治疗人受试者中的自体免疫疾病的使用说明，其中所述使用说明指示所述受试者以单次静脉内输注施用完全治疗有效量的CD20拮抗剂。优选地，所述CD20拮抗剂是嵌合的、人源化的或人CD20单克隆抗体。还优选地，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
在更优选的实施方案中，所述CD20拮抗剂是CD20抗体2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。在另一个优选实施方案中，所述使用说明指示完全治疗有效量为400mg-1500mg。更优选地，所述制品包括：(a)容器，其包括CD20抗体；和(b)包装插页，其具有用于治疗人受试者中的类风湿性关节炎的使用说明，其中所述使用说明指示所述受试者以单次静脉内输注施用400mg-1500mg完全治疗有效量的CD20抗体。
更优选地，在本发明所述的制品中，所述CD20抗体是人源化的2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。最优选地，所述人源化的2H7变体A以20mg/ml抗体配制在pH 5.8的10mM组氨酸硫酸盐(histidine sulfate)，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，和注射用无菌水中。
在其他方面中，本发明涉及一种药物制剂，其包括以适用于一次静脉内施用的形式存在的完全有效量的CD20抗体。优选地，本发明所述的药物制剂包括CD20抗体，CD20抗体作为人源化2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。更优选地，所述药物制剂包括400mg-1500mg的有效量。甚至更优选地，所述量选自下组：400mg，1000mg或1500mg。最优选地，所述人源化2H7变体A以20mg/ml抗体配制在pH 5.8的10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，和注射用无菌水中。
优选实施方案详述
I.定义
“B细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞，且包括处于所有发育阶段的天然B细胞、记忆B细胞、或效应B细胞(浆细胞)。本文的B细胞时正常的或非恶性B细胞。
当用于本文时，“B细胞消耗”是指当与治疗前的水平相比较时，药物或抗体治疗之后动物或人中的B细胞水平的下降。B细胞水平可以使用公知的测定法测量，诸如通过获得全血计数、通过用于已知的B细胞标记的FACS分析染色、和本领域公知的其他方法。在一个实施方案中，表达CD20的B细胞的消耗为至少25％。在接受消耗B细胞的药物的患者中，B细胞通常在药物在患者体内循环的时间和B细胞恢复的时间持续过程中被消耗。
在本文中，“B-细胞表面标记”或“B-细胞表面抗原”或“B细胞抗原”是可以用与其结合的拮抗剂靶向的B细胞表面上表达的抗原。示例性的B细胞表面标记包括CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白细胞表面标记(关于描述，参见The Leukocyte Antigen Facts Book，第2版.1997，ed.Barclay等.Academic Press(学院出版社)，Harcourt Brace&Co.，纽约)。其他B细胞表面标记包括RP105，FcRH2，B-细胞CR2，CCR6，P2X5，HLA-DOB，CXCR5，FCER2，BR3，Btig，NAG14，SLGC16270，FcRH1，IRTA2，ATWD578，FcRH3，IRTA1，FcRH6，BCMA，和239287。与哺乳动物的其他非B细胞组织相比较，特别感兴趣的B细胞表面标记优先在B细胞上表达，并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。本文优选的B细胞表面标记为CD20和CD22。
″CD20″抗原，或″CD20，″是在多于90％的来自外周血或淋巴器官的B细胞表面上发现的约35-kDa的非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞和恶性B细胞二者上，但是不在干细胞上表达。在参考文献中，CD20的其他名称包括″B-淋巴细胞-限制性抗原″和″Bp35″。例如，所述CD20抗原记述在Clark等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)82：1766(1985)中。
“CD20拮抗剂”是这样的分子，其在与B细胞上的CD20结合时，破坏或消耗哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能，例如，通过减少或防止由所述B细胞引发的体液应答进行。所述CD20拮抗剂优选能够消耗用其治疗的哺乳动物如人受试者中的B细胞(即，减少循环的B细胞水平)。所述消耗可以通过各种机制实现，如ADCC和/或CDC，抑制B-细胞增殖和/或诱导B-细胞死亡(例如，通过程序性细胞死亡)。在本发明的范围内包括的拮抗剂包括抗体，其他CD20靶向的(结合的)蛋白，合成的或天然序列的肽，免疫黏附素，和与CD20结合的、任选地缀合到或融合到另一种分子的小分子拮抗剂。优选的拮抗剂由抗体组成、或基本上由抗体组成、或包括抗体。
在本文中，“抗体拮抗剂”是这样的抗体，其在结合B细胞上的B细胞表面标记时，破坏或消耗哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能，例如，通过减少或防止由所述B细胞引发的体液应答进行。所述抗体拮抗剂优选能够消耗用其治疗的哺乳动物中的B细胞(即，减少循环的B细胞水平)。所述消耗可以通过各种机制实现，如ADCC和/或CDC，抑制B-细胞增殖和/或诱导B-细胞死亡(例如，通过程序性细胞死亡)。因此，“CD20抗体拮抗剂”或拮抗剂CD20抗体”是这样的抗体，其在与B细胞上的CD20结合时，破坏或消耗哺乳动物如人受试者中的B细胞，和/或干扰一种或多种B细胞功能，例如，通过减少或防止由所述B细胞引发的体液应答进行。CD20拮抗剂抗体包括利妥昔单抗(Genentech)，TRU-015(Trubion，Wyeth)，奥法木单抗(HuMax-CD20；Genmab)；AME-133(Eli Lilly)，Immu-106(Immunomedics)，均参考背景部分。
术语“对CD20拮抗剂的不充分响应”是指由于毒性和/或不充分的功效对使用CD20拮抗剂的先前或当前治疗的不充分响应。所述不充分响应可以由熟练治疗讨论疾病的临床医师评估。经历来自使用CD20拮抗剂的先前或当前治疗的“毒性”的哺乳动物，如人，经历一种或多种与其相关的不利的副作用，如心脏、肺、肾脏副作用，特别是严重的副作用，如急性呼吸窘迫综合征、心肌梗死、心室纤颤、心脏性休克、缺氧、肺部渗透、急性肾衰、mococutaneous反应，或感染，诸如病毒感染。经历“不充分功效”的哺乳动物在使用CD20拮抗剂的先前或当前治疗之后继续患有急性疾病。例如，所述患者可能在使用CD20拮抗剂治疗后1个月或3个月患有急性疾病。
术语“自体免疫疾病”和“自体免疫病症”可互换使用，并且是指由个体自身组织或共隔离(co-segregate)或其表现或由其导致的病症引起的且针对于其的疾病或病症。″自体免疫疾病″可以是器官特异性疾病(即，免疫反应特别针对器官系统，如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、消化和肝系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等等)，或是可以影响多个器官系统的系统疾病(例如，系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎，多肌炎，等等)。自体免疫疾病或病症的实例包括，但不限于，自体免疫风湿性病症，如关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎，慢性类风湿性关节炎，痛风关节炎，急性痛风关节炎，慢性炎性关节炎，变性关节炎，感染性关节炎，Lyme关节炎，增生性关节炎，银屑性关节炎，脊椎关节炎，和青少年期发作的类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进育型关节炎(arthritis chronica progrediente)，变形性关节炎，慢性原发性(primaria)多发性关节炎，反应性关节炎，和僵硬脊椎炎)，炎性高增殖性皮肤病，银屑病如斑状银屑病，滴状银屑病，脓疱性银屑病，和钉状银屑病，特异性变态反应包括特异反应性疾病如干草热和约伯综合征，皮炎包括接触性皮炎，慢性接触性皮炎，过敏性皮炎，过敏性接触性皮炎，疱疹样皮炎(dermatitis herpetiformis)，和特异反应性皮炎，x-连锁的高IgM综合征，荨麻疹如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自体免疫荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎，毒性表皮坏死松解，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化症如系统性硬化症，多发性硬化病(MS)如脊髓-眼MS(spino-optical MS)，原发性进展性MS(PPMS)，和复发性缓和型MS(RRMS)，进展性系统性硬化病，动脉粥样硬化，动脉硬化，弥散性硬化病，和共济失调硬化病，炎性肠病(IBD)(例如，局限性回肠炎，自体免疫-介导的胃肠病，结肠炎如溃疡性结肠炎，结肠炎溃疡，显微镜下结肠炎，胶性结肠炎(collagenous colitis)，结肠炎息肉，坏死性小肠结肠炎，和透壁结肠炎，以及自体免疫炎性肠病)，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎)，呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫征(ARDS)，脑膜炎，全部或部分的葡萄膜炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自体免疫性血液病症，类风湿性脊椎炎，突发性听觉损耗，IgE-介导的疾病如过敏症和过敏性和特异反应性鼻炎，脑炎如腊斯默森脑炎和边缘性和/或脑干脑炎，葡萄膜炎，如前葡萄膜炎，急性前葡萄膜炎，肉芽肿性葡萄膜炎，非肉芽肿性葡萄膜炎，晶状体抗原性葡萄膜炎(phacoantigenicuveitis)，后葡萄膜炎，或自体免疫性葡萄膜炎，具有或不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN，免疫介导的GN，膜状GN(膜状肾病)，特发性膜状GN或特发性膜状肾病，膜-或膜状增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和快速进展性GN，过敏性病症和反应，过敏反应，湿疹包括过敏性或特异反应性湿疹，哮喘如支气管哮喘(asthma bronchiale)，支气管哮喘(bronchial asthma)，和自体免疫性哮喘，包括T细胞渗透和慢性炎症反应的病症，针对外源抗原如怀孕过程中的胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢性肺炎，自体免疫性心肌炎，白细胞粘连不足，系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematodes)如皮肤SLE，亚急性皮肤红斑狼疮，新生儿狼疮综合征(NLE)，弥散性红斑狼疮，狼疮(包括肾炎，大脑炎，儿科的，非肾脏的，肾外的，盘状的，秃头症)，青少年发作的(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素-依赖性糖尿病(IDDM)，成年发作的糖尿病(II型糖尿病)，自体免疫糖尿病，特发性糖尿病乏味(idiopathic diabetes insipidus)，与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟的超敏性相关的免疫反应，肺结核，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤肉芽肿病，韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺乏症，vasculitides包括血管炎(包括大血管血管炎(包括多肌痛风湿病和巨细胞(Takayasu’s)动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周炎)，显微多动脉炎，CNS血管炎，坏死性的、皮肤的、或超敏性血管炎，系统坏死性血管炎，ANCA-相关的血管炎(AAV)如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS))，ANCA-阴性血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自体免疫性再生障碍性贫血，库姆斯阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自体免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia perniciosa)，艾迪森病，纯红细胞贫血或发育不全(PRCA)，因子VIII不足，A型血友病，自体免疫性中性白细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，包括白血球渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征如由于败血病、外伤或出血继发的那些，抗原-抗体复合体-介导的疾病，抗-血管小球基底膜病，抗-磷脂抗体综合征，过敏性神经炎，Bechet′s或Behcet′s病，Castleman’s综合征，古德帕斯彻综合征，Reynaud′s综合征，斯耶格伦综合征，史蒂文斯-约翰逊综合征，类天疱疮如大疱类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括普通天疱疮(pemphigus vulgaris)，pemphigus foliaceus，天疱疮粘膜类天疱疮，和红斑天疱疮)，自体免疫性多内分泌腺病，Reiter′s病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体-介导的肾炎，视神经脊髓炎(NMO；还称为Devic’s综合征)，多神经病，慢性神经病如IgM多神经病或IgM-介导的神经病，血小板减少症(例如，由心肌梗死患者发展的)，包括血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)，输血后紫癜(PTP)，肝素-诱导的血小板减少症，和自体免疫性或免疫-介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢自体免疫疾病包括自体免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺功能减退，自体免疫性内分泌病包括甲状腺炎如自体免疫性甲状腺炎，Hashimoto′s病，慢性甲状腺炎(Hashimoto’s甲状腺炎)，或亚急性甲状腺炎，自体免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退，Grave′s病，多腺综合征如自体免疫性多腺综合征(或多腺内分泌综合征)，副肿瘤性综合征，包括神经副肿瘤性综合征如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征，stiff-man或stiff-person综合征，脑脊髓炎如过敏性脑脊髓炎或脑脊髓炎过敏症和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力如胸腺瘤-相关的重症肌无力，小脑变性，神经肌强直，阵挛或阵挛性肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动元神经病，Sheehan’s综合征，自体免疫肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，巨细胞肝炎，慢性急性肝炎或自体免疫性慢性急性肝炎，淋巴间质局限性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非-植入性)vs NSIP，Guillain-Barré综合征，Berger’s病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬变，肺硬变，自体免疫性肠病综合征，腹腔病，下腹疾病，乳糜性口炎性腹泻(非热带性口炎性腹泻)，难治愈的口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化(ALS；Lou Gehrig′s病)，冠状动脉病，自体免疫性耳病如自体免疫性内耳病(AIED)，自体免疫性听觉损耗，斜视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎如难治愈的或复发的多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，淀粉样变性，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多症，原发性淋巴细胞增多症，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆丙球蛋白病和未确定意义的单克隆garnmopathy，MGUS)，外周神经病，副肿瘤性综合征，通道病(channelopathies)如癫痫病，偏头痛，心律不齐，肌肉病症，聋，失明，周期性麻痹，和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌眼病，巩膜炎，脉络视网膜炎，自体免疫性肝病，纤维性肌痛(fibromyalgia)，多发性内分泌衰竭，Schmidt′s综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆症，神经脱髓鞘病如自体免疫性神经脱髓鞘病和慢性炎性神经脱髓鞘多神经病，糖尿病性神经病，Dressler′s综合征，簇状秃头症，CREST综合征(钙质沉着，Raynaud′s现象，食管运动异常(esophagealdysmotility)，指端硬化，和毛细管扩张)，男性和女性自体免疫性不育，混合性结缔组织病，Chagas′病，风湿热，复发性流产，农民肺病，多形性红斑，心切开术后综合征，Cushing′s综合征，养鸟者肺病(bird-fancier′s lung)，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞血管炎，Alport′s综合征，肺泡炎如过敏性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质肺病，输血反应，麻风病，疟疾，利什曼病，kypanosomiasis，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter′s综合征，Caplan′s综合征，登革热，心内膜炎，心肌内纤维化，扩散性间质肺纤维化，间质肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，erythema elevatum et diutinum，胎儿成红细胞血症，eosinophilic faciitis，Shulman′s综合征，Felty′s综合征，flariasis，睫状体炎如慢性睫状体炎，异源慢性睫状体炎，虹膜睫状体炎(急性的或慢性的)，或Fuch′s睫状体炎，Henoch-Schonlein紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃可病毒感染，心肌病，阿尔茨海默病，细小病毒感染，风疹病毒感染，接种后综合征，先天性风疹感染，埃巴病毒感染，腮腺炎，Evan′s综合征，自体免疫性性腺衰竭，Sydenham′s舞蹈症，链球菌后肾炎，闭塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺功能亢进，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌痛，内分泌眼病，慢性超敏性局限性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾脏综合征，最小变化的肾病(minimal changenephropathy)，良性家族性和缺血性-再灌损伤，视网膜自体免疫性，关节炎症，支气管炎，慢性闭塞性呼吸道病，硅肺病，口疮，口疮性口腔炎，动脉硬化病症，aspermiogenese，自体免疫性溶血，Boeck′s病，冷球蛋白血症，Dupuytren′s挛缩，endophthalmia phacoanaphylactica，过敏性肠炎，结节性麻风红斑(erythema nodosum leprosum)，特发性面神经瘫痪，慢性疲劳综合征，风湿热(febris rheumatica)，Hamman-Rich′s病，感觉神经听觉下降(sensoneural hearing loss)，血色蛋白尿阵发(haemoglobinuriaparoxysmatica)，性腺机能减退，局限性回肠炎(ileitis regionalis)，白血球减少症，单核细胞增多感染，横断脊髓炎，原发性特发性黏液水肿，肾变病，ophthalmia symphatica，睾丸炎肉芽肿瘤，胰腺炎，急性多脊神经根炎，坏疽性脓皮病，Quervain′s thyreoiditis，获得性spenic萎缩，由抗精子抗体引起的不育，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和埃巴病毒-相关的疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，寄生虫病如Lesihmania，中毒性休克综合征，食物中毒，包括T细胞渗透、白细胞-黏附不足、与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟的超敏性相关的免疫反应的病症，包括白细胞血球渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合体介导的疾病，抗小球基底膜病，过敏性神经炎，自体免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性黏液水肿，自体免疫性萎缩性胃炎，交感神经眼炎，风湿病，混合的结缔组织病，肾变综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，外周神经病，I型自体免疫性多腺综合征，成年发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，全面秃头症(alopecia totalis)，舒张的心肌症，获得性大疱性表皮松解(EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾变综合征，原发性硬化胆管炎，脓性或非脓性窦炎，急性或慢性窦炎，筛骨、前沿、上颌骨、或蝶骨窦炎，嗜酸细胞相关的病症如嗜酸粒细胞增多，肺渗透性嗜酸粒细胞增多，嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征，Loffler′s综合征，慢性嗜酸细胞肺炎，热带肺部嗜酸粒细胞增多，支气管肺炎曲霉病，曲霉肿，或包含嗜酸细胞的肉芽肿，过敏性反应，血清反应阴性的脊椎关节炎(spondyloarthritides)，多内分泌自体免疫疾病，硬化胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性黏膜皮肤念珠菌病，Bruton′s综合征，婴儿瞬时低丙球蛋白血症，Wiskott-Aldrich综合征，毛细管扩张共济失调，与胶原疾病相关的自体免疫病症，风湿病，神经学疾病，淋巴腺炎，缺血性再灌病症，血压反应的减少，血管功能不良，antgiectasis，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，大脑缺血，和伴随血管化的疾病，过敏性超敏病症，肾小球肾炎(glomerulonephritides)，再灌损伤，心肌或其它组织的再灌损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眼窝炎性病症，粒细胞输血相关的综合征，细胞因子诱导的毒性，急性严重炎症，慢性难治疗的炎症，肾盂炎，肺硬化，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，胃溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位。
术语“类风湿性关节炎”或“RA”在本文中以最广泛的意思使用，并且是指可以按照关于类风湿性关节炎分类的2000年修改的美国风湿病学会标准、或任何类似的标准诊断的公认的疾病状态。RA的生理指示包括，相称的关节肿胀，虽然在类风湿性关节炎中不是不变的，但是其是特征性的。手和掌指(MCP)、手腕、肘、膝、踝和跖趾(MTP)关节的近指骨间指节间关节的纺锭形肿胀通常受影响，且肿胀易于检测。被动运动的疼痛是关节炎症的最敏感的测试，并且炎症和结构变形通常限制被影响的关节的活动范围。典型的可见变化包括MCP关节的手指的尺骨偏离、MCP和PIP关节的过度伸展或过度弯曲、肘的弯曲挛缩、和腕骨与脚趾的半脱位。患有类风湿性关节炎的受试者可能耐受DMARDs，因为DMARDs在治疗症状中不是有效的或不是完全有效的。类风湿性关节炎可以描述为轻度、中度或严重的。轻度RA特征在于包括不具有其他关节疾病的至少3个关节(同时)。风湿病因子(RF)典型地是阴性的，且在X光照片上没有腐蚀。中度疾病包括6-20个关节的活性炎症，并且通常包括射线照片变化和阳性RF----典型地不存在关节外表现。中度疾病表明对NSAID和DMARD的共同需求，这与单纯的NSAID治疗相反。严重RA特征在于包括多于20个关节，包括阳性RF(通常是高滴度的)和关节外疾病，并且典型地另外引起其他系统性作用，包括慢性疾病的血清蛋白减少症和贫血症。在严重形式的RA中存在快速降低的功能能力。当用于本文时，术语“类风湿性关节炎”或“RA，”包括所有RA形式和阶段，包括但不限于，活动期类风湿性关节炎，基于患者患有RA有多久的早期和晚期RA，和中度至严重的类风湿性关节炎。
风湿病因子(RF)是针对另一种通常用作诊断类风湿性关节炎的血液检测的免疫球蛋白的Fc部分的免疫球蛋白。它可以在关节腔内自我聚集成栅格样形状，以提供炎性细胞可以黏附和作用的表面。具有高滴度的RF的类风湿性关节炎患者(约80％的患者)患有更严重的疾病，与具有阴性RF的那些相比较，具有更差的长期结果和增加的死亡率。
患有“活动期类风湿性关节炎”的患者意指患有活动的但非潜在的类风湿性关节炎症状的患者。为了本发明的目的，“活动期类风湿性关节炎”定义为存在至少4个肿胀的关节。
患有“早期活动期类风湿性关节炎”的受试者是患有按照关于RA分类修改的1987年ACR标准诊断为活动期类风湿性关节炎至少8周但少于4年的那些受试者。
“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”或“缓和”是指治疗性治疗和预防疾病或预防性措施，其中目的是防止或减缓(减轻)目的病理病况或病症。如果在接受治疗量的CD20拮抗剂如本发明方法所述的本发明的CD20结合抗体后，受试者表现出特定自体免疫疾病的一个或多个征兆和症状的明显的和/或可测量的减少或不存在其，则受试者的自体免疫疾病得到成功的“治疗”。例如，如果目标疾病是类风湿性关节炎，需要治疗的那些包括已经患有该疾病的那些以及要防止该疾病的发展，包括该疾病的各种特征，如关节损坏或关节损坏的进展的那些。因此，受试者可能已经被诊断患有类风湿性关节炎，或可能倾向于或容易患类风湿性关节炎，或者可能患有轻度或中度的类风湿性关节炎，其不进行治疗时可能发展。与施用之前相比较，如果疾病和/或疾病的各种特征或症状得到减轻或治愈，或者疾病的进展被终止或减缓，则治疗是成功的。成功的治疗还包括完全或部分防止疾病的发展。为了本文的目的，减缓或减轻疾病或疾病的症状或疾病症状的进展与症状的终止、减少或逆转等同。类风湿性关节炎的症状，不限于，包括在2000年修改的美国类风湿病学会关于类风湿性关节炎分类的标准中所列出的任何症状，诸如例如，关节肿胀、关节损坏、骨骼变形、骨骼磨损、疼痛、炎症、和与更高级形式的类风湿性关节炎相关的系统性影响，包括血清蛋白减少症和慢性疾病的贫血症。
短语“有效量”用在本文中是指治疗和预防有效的量。因此，在本发明的所述方法中，“有效量”是指有效治疗(包括预防)类风湿性关节炎的CD20抗体或另一种CD20拮抗剂的量。与施用之前相比较，由于施用了“有效量”，目标疾病和/或该疾病的各种特征或症状得到减轻或治愈，或者疾病的进展得到终止或减缓。成功的治疗还包括完全或部分防止疾病的发展。为了本文的目的，减缓或减轻疾病或疾病的症状或疾病症状的进展与症状的终止、减少或逆转等同。类风湿性关节炎的症状，不限于，包括在2000年修改的美国类风湿病学会关于类风湿性关节炎分类的标准中所列出的任何症状，诸如例如，关节肿胀、关节损坏、骨骼变形、骨骼磨损、疼痛、炎症、和与更高级形式的类风湿性关节炎相关的系统性影响，包括血清蛋白减少症和慢性疾病的贫血症。
短语作为“单次静脉内(i.v.)输注”施用的“完全治疗有效量”用在本文中是意指在目标疾病如类风湿性关节炎的治疗性治疗中有效的CD20拮抗剂如CD20抗体的总量作为单次静脉内输注施用，而不是两次或多次部分剂量(少于所述治疗有效量)以分开的输注如数天或数周分别连续施用。
“CD20”抗原是具有约35kD分子量的在超过90％的来自外周血或淋巴器官的B细胞表面上发现的非糖基化的、跨膜磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并且保持至浆细胞分化；它不在人干细胞、淋巴前体细胞或正常浆细胞上发现。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。在参考文献中关于CD20的其他名称包括″B-淋巴细胞-限制性分化抗原″和″Bp35″。例如，所述CD20抗原记述在Clark和Ledbetter，Adv.Can.Res.(癌症研究进展)52：81-149(1989)和Valentine等.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)264(19)：11282-11287(1989)中。
术语″抗体″以最宽泛的意义应用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(multispecific antibodies)(例如双特异性抗体)、单链抗体、和抗体片段，只要它们表现出理想的生物活性或功能。
本发明的CD20结合抗体的生物活性包括该抗体与人CD20的结合，更优选地与人和其他灵长动物CD20(包括食蟹猴(cynomolgus monkey)、恒河猴(rhesus monkey)、黑猩猩、狒狒)的结合。所述抗体以不高于1x10-8的Kd值、优选不高于约1x10-9的Kd值结合CD20，并且能够在体内杀死或消耗B细胞，优选地当与不用所述抗体处理的适当的阴性对照比较时杀死或消耗至少20％。B细胞消耗可以是ADCC、CDC、程序性细胞死亡、或其他机制中的一种或多种的结果。在本文的疾病治疗的一些实施方案中，与其他相比，特定的效应器功能或机制可能是理想的，并且人源化2H7的某些变体或某些人CD20结合抗体是优选的，从而实现那些生物功能，如ADCC。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。″Fv″是包括完整的抗原-识别和-结合位点的最小抗体片段。该片段由一条重链和一条轻链可变区结构域以紧密的、非共价缔合的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发散(emanate)出6个超可变环(分别来自H和L链的3个环)，其提供用于抗原结合的氨基酸残基并且赋予该抗体的抗原结合特异性。然而，甚至单可变结构域(或仅包括对抗原特异的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整的结合位点低的亲和性结合。
当用于本文时，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即，包括所述群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的产生过程中可能存在的变体之外，而且这样的变体通常以较少量存在。所述单克隆抗体典型地包括这样的抗体，所述抗体包括结合靶标的多肽序列，其中结合靶标的多肽序列通过包括由多个多肽序列选择单一靶标结合多肽的过程获得。例如，所述选择过程可以是由多个克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆池选择独特的克隆。应该理解，所选择的靶标结合序列可以进一步改变，例如，以提高对靶标的亲和力，以人源化该靶标结合序列，以提高其在细胞培养物中的生产，以减少其体内免疫原性，以产生多特异性抗体等等，并且包括所述改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。多克隆抗体制备物典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，由于它们典型地不受其它免疫球蛋白的污染，所以单克隆抗体制备物是有利的。修饰词“单克隆”是指抗体的特征，即从基本上均一的抗体群体获得，并且不解释成需要通过任何具体方法的抗体生产。例如，按照本发明应用的单克隆抗体可以通过多种技术制得，其包括，例如，杂交瘤法(例如，Kohler等.，Nature(自然)，256：495(1975)；Harlow等.，A ntibodies：ALaboratory Manual，(抗体：实验室手册)(Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第二版1988)；Hammerling等.，在：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)中563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA法(参见例如，美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等.，Nature(自然)，352：624-628(1991)；Marks等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)；Sidhu等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等.J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)，和用于在动物中生产具有部分或全部的人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的人或人样抗体的技术(参见例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等.，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等.，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利号5,545,806；5,569,825；5,591,669(均属于GenPharm)；5,545,807；WO1997/17852；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等.，Bio/Technology(生物技术)，10：779-783(1992)；Lonberg等.，Nature(自然)，368：856-859(1994)；Morrison，Nature (自然)，368：812-813(1994)；Fishwild等.，Nature Biotechnology(自然生 物技术)，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology(自然生物 技术)，14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.(国 际免疫学综述)，13：65-93(1995)。
本发明的CD20结合抗体的“功能片段”是保持以与它们从之获得的完整的全长分子基本相同的亲和性结合CD20的那些片段，并且当通过体外或体内测定法如本文所述的那些测量时表现出包括消耗B细胞的生物学活性。
术语“可变”是指这样的事实，即，在抗体中可变结构域的某些片段在序列上广泛不同。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸的跨度不是平均分布的。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FRs)的相对不变的序列组成，所述构架区由每个为9-12个氨基酸长的称为“超变区”的极度可变性的更短区域分开。天然重链和轻链的可变结构域分别包括4个FRs，大部分采用β-折叠构型，通过三个超可变区连接，其形成环连接，并且在某些情形中，形成部分的β-折叠结构。每条链中的超可变区通过FRs紧密相邻地保持在一起，并且利用来自另一条链的超可变区，有助于形成抗体的抗原-结合位点(参见，Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白质序列)，第5版，Public HealthService(公众健康服务)，National Institutes of Health(全国卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应器功能，诸如以抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)的抗体参与。
用于本文时，术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基(例如，大约在VL中残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)附近，和大约在VH中31-35B(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(全国卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“超变环”的那些残基(例如，VL中残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，和VH中的26-32(H1)，52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。
如本文所指，“共有序列”或共有的V结构域序列是来自已知的人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列比较的人工序列。基于这些比较，制备编码为来自人κ和人H链亚组III V结构域的序列所共有的V结构域氨基酸的重组核酸序列。共有的V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和性。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有与来自特定物种的或属于特定抗体种类或亚组的抗体中的相对应序列相同或同源的一部分重链和/或轻链，而链的其余部分与来自另一种物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体、以及所述抗体片段中相对应的序列相同或同源，只要它们表现出需要的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。当用在本文中时，人源化的抗体是一组嵌合抗体。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者或受体抗体)，其中所述受者的超变区残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物的、具有需要的特异性、亲和性和能力的超变区残基替换。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包括在受者抗体或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰以进一步精炼抗体表现，如结合亲和性。一般地，所述人源化抗体包括基本上全部或至少一个、且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些，尽管所述FR区可以包括一个或多个提高结合亲和性的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数目典型地在H链中不超过6个，在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还包括至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的详情，参见，Jones等.，Nature(自然)321：522-525(1986)；Reichmann等.，Nature(自然)332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.(现代结构生物学观点)2：593-596(1992)。
抗体“效应器功能”是指归因于抗体的Fc区(Fc区天然序列或变体Fc区氨基酸序列)的那些生物活性，并且随着抗体同种型变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒作用；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
“抗体-依赖的细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是指这样形式的细胞毒作用，其中结合到存在于特定细胞毒性细胞上(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)的Fc受体(FcRs)的分泌的Ig能够使得这些细胞毒性效应器细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，并且随后用细胞毒素杀死所述靶细胞。抗体“武装”所述细胞毒性细胞，并且绝对需要所述杀伤。调控ADCC的主要的细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol(免疫学年度综述)9：457-92(1991)第464页的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如记述在美国专利号5,500,362或5,821,337中的测定。有效用于所述测定法的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内如在动物模型中，诸如在Clynes等.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI，FcγRII，和FcγRIII亚类的受体，其包括等位基因变体和这些受体的交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″激活受体″)和FcγRIIB(″抑制受体″)，其具有相似的氨基酸序列，所述序列主要在其胞质结构域不同。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见
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Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)15：203-234(1997)中的综述M)。FcRs在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol(免疫学年度综述)9：457-92(1991)；Capel等.，Immunomethods(免疫方法)4：25-34(1994)；和de Haas等.，J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)126：330-41(1995)中综述。其它FcRs，包括将来要鉴定的那些，包含在本文的术语″FcR″中。该术语还包括新生受体FcRn，其负责将母体IgGs转移到胎儿(Guyer等.，J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)和Kim等.，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。
WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman等.)记述了具有提高的或减少的针对FcRs的结合的抗体变体。这些专利出版物的内容通过引用特别结合在本文中。还参见，Shields等.，Journal of BiologicalChemistry(生物化学杂志)276(9)：6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活通过补体系统的第一补体(C1q)与结合到它们的同族抗原上的(适当的亚类)抗体的结合起始。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如，如在Gazzano-Santoro等.，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)中所述。
具有改变的Fc区氨基酸序列和提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记述在美国专利号6,194,551B1，WO99/51642中。这些专利出版物的内容通过引用特别结合在本文中。还参见，Idusogie等.J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)。
“裸抗体”是没有缀合到异源分子如细胞毒性结构部分、聚合物、或放射标记上的抗体(如本文定义)。
“分离的抗体”是一种已经鉴定并且从其天然环境成分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰该抗体的诊断或治疗应用的物质，并且可包括酶、激素、和其它蛋白样或非蛋白样溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化(1)至通过Lowry方法确定的大于95重量％抗体，并且最优选大于99重量％，(2)至利用旋转杯测序仪足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选地银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE的均一性。由于将不存在抗体天然环境的至少一种成分，所以分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，一般地，分离的抗体将通过至少一步纯化步骤制备。
“关节损伤”以最宽泛的意义使用，并且是指一个或多个关节的任一部分的损伤或部分或完全的破坏，所述关节包括结缔组织和软骨，其中损伤包括任何原因的结构和/或功能损伤，并且可以或可以不引起关节疼痛/arthalgia。其特别包括，不限于，与炎性关节病以及非炎性关节病相关的或由其引起的关节损伤。这种损伤可能引起，例如，自体免疫疾病如狼疮(例如，系统性红斑狼疮)，关节炎(例如，急性和慢性关节炎，类风湿性关节炎包括青少年发作的类风湿性关节炎，青少年特发性关节炎(JIA)，或青少年RA(JRA)，和各阶段如类风湿关结膜炎，痛风或痛风性关节炎，急性免疫性关节炎，慢性炎症性关节炎，变性关节炎，II型胶原蛋白诱导的关节炎，感染性关节炎，败血性关节炎，Lyme关节炎，增生性关节炎，银屑病关节炎，斯蒂尔病，脊椎关节炎，骨关节炎，慢性进育型关节炎，变形关节炎，慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，绝经期关节炎，雌激素-消耗关节炎，和僵硬脊椎炎/类风湿性脊椎炎)，除RA之外的风湿性自体免疫疾病，由RA继发的重要的系统参与(包括但不限于血管炎、肺纤维化或Felty′s综合征)，斯耶格伦综合征，特殊的继发性所述综合征，和具有RA的继发性局限性皮肤血管炎。
当在本文中用于辅助治疗时，术语“免疫抑制剂”是指作用为抑制或掩蔽本文中被治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生产、下调或抑制自抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。所述药剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；非甾类抗炎药(NSAIDs)；更昔洛韦，他克莫司，糖皮质激素如氢化可的松或醛甾酮，抗炎药剂如环加氧酶抑制剂，5-脂加氧酶抑制剂，或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂如硫唑嘌呤或麦考酚酸酯(MMF)；烷基化药剂如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑；胺苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环胞素A；类固醇如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如，泼尼松，甲泼尼龙，包括SOLU-
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甲泼尼龙琥珀酸钠，和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨蝶呤(口服的或皮下的)；抗疟药如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子拮抗剂如细胞因子抗体或细胞因子受体抗体包括抗-干扰素-α，-β，或-γ抗体，抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英利昔单抗
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或阿达木单抗)，抗-TNF-α免疫黏着素(依那西普)，抗-TNF-β抗体，抗-白介素-2(IL-2)抗体和抗-IL-2受体抗体，和抗-白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶肽(于7/26/90公布的WO 90/08187)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；，苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等.，美国专利号5,114,721)；T-细胞受体片段(Offner等.，Science(科学)，251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature(自然)，341：482(1989)；和WO91/01133)；BAFF拮抗剂如BAFF抗体和BR3抗体和zTNF4拮抗剂(关于综述，参见Mackay和Mackay，Trends Immunol.(免疫学趋势)，23：113-5(2002))；干扰T辅助细胞信号的生物药剂，如抗-CD40受体或抗-CD40配体(CD154)，包括针对CD40-CD40配体的封闭抗体(例如，Durie等.，Science(科学)，261：1328-30(1993)；Mohan等.，J.Immunol.(免疫学杂志)，154：1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等.，Science(科学)，265：1225-7(1994))；和T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。本文的一些免疫抑制剂还为DMARDs，如甲氨蝶呤。优选的免疫抑制剂的实例包括环磷酰胺，苯丁酸氮芥，硫唑嘌呤，来氟米特，MMF，或甲氨蝶呤。
“减轻疾病的抗风湿药”或“DMARDs”的实例包括羟氯喹，硫氮磺吡啶，甲氨蝶呤，来氟米特，依那西普，英利昔单抗(加口服和皮下的甲氨蝶呤)，硫唑嘌呤，D-青霉胺，金盐(gold salts)(口服)，金盐(肌内)，二甲胺四环素，环胞素包括环胞素A和局部用环胞素，葡萄球菌(staphylococcal)蛋白A(Goodyear和Silverman，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，197，(9)，第1125-39页(2003))，包括其盐和衍生物，等等。本文优选的DMARD是甲氨蝶呤。
“非甾类抗炎药”或“NSAIDs”的实例包括阿司匹林，乙酰水杨酸，布洛芬，氟比洛芬，萘普生，吲哚美辛，舒林酸，托美汀(tolmetin)，保泰松，双氯芬酸，酮洛芬，贝诺酯，甲芬那酸，甲氨蝶呤，芬布芬，阿扎丙宗；COX-2抑制剂如塞来考昔(
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4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺，伐地考昔
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美洛昔康
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GR 253035(Glaxo Wellcome)；和MK966(Merck Sharp&Dohme)，包括其盐和衍生物，等等。优选地，它们是阿司匹林、萘普生、布洛芬、吲哚美辛或托美汀。
本文的“整联蛋白拮抗剂或抗体”的实例包括LFA-1抗体，如可从Genentech商购的依法珠单抗
Figure GPA00001068272100374
或α4整联蛋白抗体如可从Biogen获得的那他珠单抗
Figure GPA00001068272100375
或二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO 2003/89410)，苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709，WO 2002/28830，WO2002/16329和WO 2003/53926)，苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)，烯胺衍生物(WO 2001/79173)，丙酸衍生物(WO 2000/37444)，链烷酸衍生物(WO 2000/32575)，取代的苯基衍生物(美国专利号6,677,339和6,348,463)，芳香胺衍生物(美国专利号6,369,229)，ADAM去整联蛋白结构域多肽(US2002/0042368)，针对alphavbeta3整联蛋白的抗体(EP 633945)，氮杂-桥连的二环氨基酸衍生物(WO 2002/02556)，等等。
“皮质类固醇”是指具有模拟或增大天然存在的皮质类固醇作用的类固醇化学结构的数种合成的或天然存在的物质中的任一种。合成的皮质类固醇的实例包括泼尼松，泼尼松龙(包括甲泼尼龙，如SOLU-甲泼尼龙琥珀酸钠)，地塞米松或地塞米松曲安西龙，羟化可的松，和倍他米松(betamethasone)。本文优选的皮质类固醇是泼尼松，甲泼尼龙，羟化可的松，或地塞米松。
用于治疗类风湿性关节炎的″TNF″药物包括靶向TNFα配体的分子，以及靶向TNF-TNFα即TNFR-1和TNFR-2的受体的分子。
为了本文的目的，“肿瘤坏死因子α(TNF-α)”是指包括如在Pennica等.，Nature(自然)，312：721(1984)或Aggarwal等.，JBC，260：2345(1985)中所述的氨基酸序列的人TNF-α分子。
本文中的“TNFα抑制剂”或“TNFα拮抗剂”是在某种程度上抑制TNFα的生物功能的药剂，其通常通过与TNFα或与TNFα受体结合，并且中和TNFα的活性而抑制。本文中特别考虑的TNF抑制剂的实例为依那西普)，英利昔单抗和阿达木单抗(HUMIRATM)。
术语“针对TNFα-抑制剂的不充分响应”是指由于毒性和/或不充分的功效针对先前或当前TNFα-抑制剂治疗的不充分的响应。所述不充分的响应可以由熟练治疗讨论疾病的临床医师评估。经历来自使用TNFα-抑制剂的先前或当前治疗的“毒性”的哺乳动物经历一种或多种与其相关的不利的副作用，如感染(特别是严重感染)，充血性心力衰竭，脱髓鞘(导致多发性硬化)，超敏性，神经学事件，自体免疫性，非霍奇金淋巴瘤，肺结核(TB)，自体抗体，等等。经历“不充分的功效”的哺乳动物在先前或当前TNFα-抑制剂治疗之后继续患有活性疾病。例如，患者可能在TNFα-抑制剂治疗1个月或3个月后患有急性疾病。
“包装插页”用来指商购治疗产品包装中通常包含的使用说明，其包含关于适应证、应用、剂量、施用、禁忌征候、与包装产品组合的其它治疗产品、和/或关于所述治疗产品的应用的警告等的信息。
“药物”是治疗关节损伤或其症状或副作用的活性药物。
术语“复发”用作本文中是指在患者已经缓解后疾病的征兆和症状的重现。因此，如果开始时目标疾病和/或该疾病的各种特征或症状得到减轻或治愈，或者疾病进展被终止或减缓，并且随后该疾病或该疾病的一种或多种特征重现，则认为患者“复发”了。类风湿性关节炎的症状，不限于，包括在关于类风湿性关节炎分类的2000年修改的美国风湿病学会标准中列出的任何症状，诸如例如，关节肿胀，关节损伤，骨骼变形，骨骼磨损，疼痛，炎症，和与更高级形式的类风湿性关节炎相关的系统影响，包括血清蛋白减少症和慢性疾病的贫血症。如果这些症状中的一种或多种在初始的成功治疗后重现，则认为患者复发了。
II.治疗方法
本发明涉及向人受试者施用CD20拮抗剂以治疗自体免疫疾病的新方式。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于施用CD20抗体以治疗自体免疫疾病如慢性CD20-相关的自体免疫疾病，如类风湿性关节炎(RA)或狼疮的新治疗方案。
如果所述CD20抗体为
Figure GPA00001068272100391
则当前方案包括间隔两周的两次1000mg静脉内输注。相反，本发明的治疗方案，如上文所讨论，包括在开始时以静脉内输注形式的完全有效剂量的施用、基本上由其组成或由其组成。
按照本发明，有效量的CD20拮抗剂，如CD20抗体，在治疗开始时，以完整剂量的第一次单次静脉内(i.v.)输注形式施用，任选地之后在第一次施用后约3-7个月，典型地约4-6个月，进行完整有效剂量(通常，但是不必须，基本上与第一次的剂量相同)的第二次静脉内输注。如果治疗的自体免疫疾病是RA，则第二次静脉内施用通常在最初治疗后6个月发生。在狼疮的情形中，通常在最初治疗后4个月或16周安排第二次静脉内施用，然而，第二次施用的时间可能取决于治疗的自体免疫疾病的性质和阶段、和可能在个体与个体之间不同的、患者对最初治疗的响应而改变。尽管第二次有效剂量典型地与第一次有效剂量相同，但是它可能更大或更小，这取决于患者对第一次治疗的响应，和所导致的患者病症的改变。
CD20抗体包括：“C2B8，″其现在称为“利妥昔单抗”
Figure GPA00001068272100401
(美国专利号5,736,137)；命名为“Y2B8″或“替伊莫单抗”
Figure GPA00001068272100402
的钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，可商购自IDEC制药公司(IDECPharmaceuticals，Inc.)(美国专利号5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏在ATCC，保藏号为HB113883)；鼠IgG2a“B1，″还叫作“托西莫单抗，”任选地用131I标记，以产生“131I-B1″或“碘I131托西莫单抗”抗体(BEXXARTM)，可商购自Corixa(还参见，美国专利号5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5″(Press等.Blood(血液)69(2)：584-591(1987)及其变体，包括“构架缀补的(framework patched)”或人源化的1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏HB-96450)；鼠2H7和嵌合的2H7抗体(美国专利号5,677,180)；人源化2H7(WO 2004/056312Lowman等.)以及下文所述的)；HUMAX-CD20TM完整人抗体(Genmab，丹麦；参见，例如，Glennie和van de Winkel，Drug Discovery Today(今日药物发现)8：503-510(2003)和Cragg等.，Blood(血液)101：1045-1052(2003))；记述在WO2004/035607(Teeling等.)中的人单克隆抗体；US 2004/0093621(Shitara等.)所述的具有结合到Fc区的复合的N-糖苷-连接的糖链的抗体；CD20结合分子，如AME系列的抗体，例如，WO 2004/103404(Watkins等.，AppliedMolecular Evolution(应用分子进展))中所述的AME-133TM抗体；A20抗体或其变体，如嵌合的或人源化的A20抗体(分别为cA20，hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；和可从国际白细胞分型工作室(International Leukocyte Typing Workshop)获得的单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等.，在：Leukocyte Typing III(白细胞分型III)(McMichael，Ed.，第440页，Oxford University Press(牛津大学出版社)(1987))。本文优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的、或人CD20抗体，更优选地，人源化的2H7抗体，利妥昔单抗，嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)，和HUMAX-CD20TM人CD20抗体(Genmab)。
结合人CD20和优选地其它灵长动物CD20的人源化抗体将包括重链(H)，其具有非人物种抗人CD20抗体(供体抗体)的至少一个、优选两个或全部H链CDRs，和作为受者抗体的人共有抗体的基本上所有构架残基。供体抗体可以来自不同的非人物种，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、马、灵长动物，但是最通常是鼠抗体。在该情形中，“基本上所有的”意指人源化抗体中的受者FR区可以包括一个或多个在人共有FR序列中原先不存在的氨基酸取代。这些FR改变可以包括没有在所述受者或供体抗体中找到的残基。
在一个实施方案中，所述供体抗体是鼠2H7抗体，V区包括图1A和1B中所示的H和L链每条连的CDR和FR序列。在具体实施方案中，用于人Fab构架的残基对应于人Vκ亚组I和VH亚组III的共有序列，这些共有序列分别显示在图1A和1B中。本发明的人源化2H7抗体将具有鼠供体抗体H链中的至少一个CDRs。在一个实施方案中，结合人CD20的人源化2H7抗体包括供体抗体的H和L链二者的CDRs。
在全长抗体中，本发明的人源化CD20结合抗体包括与人免疫球蛋白C结构域连接的人源化V结构域。在优选的实施方案中，所述H链C区来自人IgG，优选IgG1或IgG3。L链C结构域优选来自人κ链。
残基编号按照Kabat等.，Sequences ofImmunological Interest(免疫目的的序列).第5版，(公众健康服务)，National Institutes ofHealth(全国卫生研究所)，Bethesda，Md.(1991)进行，在序列图中，插入显示为a，b，c，d，和e，并且缺口显示为破折号。在包括Fc区的CD20结合抗体中，Fc区的C端赖氨酸(按照EU编号系统的残基447)可以去除，例如，在Ab纯化过程中或通过重组改造编码抗体多肽的核酸进行。因此，有效用于本发明的CD20结合抗体组合物可以包括具有K447、去除所有K447的抗体，或具有和不具有K447残基的抗体的混合物。
结合CD20的人源化2H7抗体的构建和产生已经记述在WO04/056312和US 2006/0034835中，其完整的公布内容通过引用结合在本文中。
在特定实施方案中，所述人源化2H7抗体是表1中列出的抗体。
表1-人源化抗-CD20抗体及其变体
2H7变    VL       VH           完整L链      完整H链
体
        SEQ ID    SEQ ID NO.   SEQ ID NO.   SEQ ID
         NO.                                NO.
A        1        2            6            7
B        1        2            6            8
C        3        4            9            10
D        3        4            9            11
F        3        4            9            12
G        3        4            9            13
H        3        5            9            14
I        1        2            6            15
表1的抗体变体A，B和I均包括轻链可变序列(VL)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR                                      (SEQ ID NO：1)和
重链可变序列(VH)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)。
表1的抗体变体C，D，F和G均包括轻链可变序列(VL)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：3)和
重链可变序列(VH)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS                (SEQ ID NO：4)。
表1的抗体变体H包括轻链可变序列(VL)SEQ ID NO：3(上述)和重链可变序列(VH)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS                (SEQ ID NO：5)
表1的抗体变体A，B和I均包括全长轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
                                (SEQ ID NO：6)。
表1的变体A包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                                (SEQ ID NO：7)。
表1的变体I包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK    (SEQ ID NO：15)。
表1的变体B包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                            (SEQ ID NO：8)。
表1的抗体变体C.D，F，G和H均包括全长轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
                             (SEQ ID NO：9)。
表1的变体C包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK     (SEQ ID NO：10)。
表1的变体D包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK              (SEQ ID NO：11)。
表1的变体F包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                                  (SEQ ID NO：12)。
表1的变体G包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK
                                (SEQ ID NO：13)。
表1的变体H包括全长重链序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK   
                        (SEQ ID NO：14)。
在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体还包括在IgG Fc中的氨基酸改变，并且表现出比具有野生型IgG Fc的抗体提高的针对人FcRn的结合亲和性，提高至少60倍，至少70倍，至少80倍，更优选至少100倍，优选至少125倍，甚至更优选至少150倍-约170倍。
IgG中的N-糖基化位点是CH2结构域中的Asn297。本发明的人源化2H7抗体组合物包括前述具有Fc区的任意人源化2H7抗体的组合物，其中所述组合物中约80-100％(且优选地约90-99％)的抗体包括附着在糖蛋白Fc区的、缺少岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。在本文中证明，在与Fc(RIIIA(F158)结合上，所述组合物表现出令人吃惊的提高，在与人IgG相互作用上，其不如Fc(RIIIA(V158)有效。在正常的、健康非洲美洲人和高加索人中，Fc(RIIIA(F158)比Fc(RIIIA(V158)更常见。参见，Lehrnbecher等.，Blood(血液)94：4220(1999)。历史上，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生的抗体在群体中包含约2-6％的非岩藻糖化，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种最常用的工业宿主。然而，YB2/0和Lec13可以产生具有78-98％非岩藻糖化部分的抗体。Shinkawa等.，J Bio.Chem.(生物化学杂志)278(5)，3466-347(2003)，报道了在YB2/0和Lec13细胞中产生的抗体，具有较少的FUT8活性，在体外表现出显著增加的ADCC活性。具有减少的岩藻糖含量的抗体的产生还记述在，例如，Li等.，(GlycoFi)“Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichiapastoris(人源化IgGs在糖改造的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的优化)”，在Nature Biology(自然生物学)2006年1月22日的在线公布中；Niwa R.等.，Cancer Res.(癌症研究)64(6)：2127-2133(2004)；US2003/0157108(Presta)；US 6,602,684和US 2003/0175884(Glycart生物技术(Glycart Biotechnology))；US 2004/0093621，US 2004/0110704，US2004/0132140(均属于Kyowa Hakko Kogyo)中。
CD20结合抗体包括双特异性CD20结合抗体，其中该抗体的一个臂具有CD20结合抗体的重链(H)和轻链(L)，如本发明的人源化2H7抗体的H和L链，并且另一个臂具有对于第二抗原V区结合特异性。在具体实施方案中，第二抗原选自由下列各项组成的组：CD3，CD64，CD32A，CD16，NKG2D或其他NK激活配体。
Genentech和Biogen Idec临床研究已经评估了使用范围在低至10mg高至1g剂量(参见背景部分关于利妥昔单抗的研究；和WO 04/056312，实施例16)的抗-CD20(人源化2H7变体和利妥昔单抗)的剂量的自体免疫疾病治疗的治疗效力。通常，在这些临床研究中抗体以两次剂量施用，间隔约两周。在临床研究中研究的方案的实例包括，对于人源化CD20抗体2H7，在类风湿性关节炎中，以2x10mg(意为以10mg/剂量的2次剂量；对于70kg，67英寸高的患者总剂量为～10.1mg/m2)，2x50mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为55mg/m2)，2x200mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为220mg/m2)，2x500mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为～550mg/m2)和2x1000mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为～1100mg/m2)；和对于美罗华，2x500mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为～550mg/m2)，2x1000mg(对于70kg，67英寸高的患者总剂量为～1100mg/m2)。
已经使用范围在低至1mg高至2g剂量的CD抗体剂量评估了自体免疫疾病治疗的治疗效力。由于，如在实施例中所示，对于所有检测的剂量(400mg，1000mg，1500mg和2000mg)，单次输注治疗表现出相似的结果，有效剂量可能在宽范围内变化，并且典型地约0.1mg-约2000mg，或约1mg-约2000mg，或约10mg-2000mg，或约400mg-2000mg的CD20抗体。有效剂量取决于通常由执行医师所考虑的所用的CD20抗体、治疗的疾病、包括疾病的严重性、患者性别、体重、年龄和总体身体条件、以及其它因素而变化。对于每种具体情形的有效剂量的确定充分在普通医师的能力范围内。因此，在不同实施方案中，CD20抗体可以以0.1，0.5，1，5，10，15，20，25，30，40，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400，500，1000，1500，或2000mg的剂量施用。评估自体免疫或自体免疫相关疾病治疗的功效和成功的参数是熟练处理适当的疾病的医师所知道的。一般地，熟练的医师将审视具体疾病迹象和症状的减少。
对于自体免疫疾病的治疗，可以取决于个体患者中的疾病和/或病症的严重性，通过调整CD20结合抗体的剂量而理想地调节B细胞消耗的程度。因此，B细胞消耗可以但是不必是完全的。或者，在最初的治疗中可能需要总B细胞消耗，但是在随后的治疗中，可以调整剂量以仅获得部分消耗。在一个实施方案中，B细胞消耗为至少20％，即，与治疗前的基线水平相比较，保留80％或更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方案中，B细胞消耗为25％，30％，40％，50％，60％，70％或更多。优选地，B细胞消耗足以终止疾病进展，更优选地足以减轻治疗的具体疾病的迹象和症状，甚至更优选地以治愈该疾病。如果目的是部分或短期的B细胞消耗，或者如果疾病不是慢性的或者较不严重，可以使用较低的CD20剂量，例如，20mg，10mg或更低。在另一个实施方案中，本发明以低剂量的治疗有效用在使用按照本发明施用的初始较高剂量的成功治疗之后的维持治疗中。在特定实施方案中，作为单次静脉内输注的完全有效剂量的第一次施用之后是在第一次施用后4-6个月的相同剂量的静脉内输注，其可以接着进行较低维持剂量的施用，典型地以4-6个月的时间间隔进行。
可以使用本发明的给药方案治疗患有自体免疫疾病的患者，对于该患者，一种或多种当前的标准护理治疗是无效的、很差耐受的、或禁忌的。例如，本发明考虑用于RA患者的本治疗方法，所述RA患者已经对肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂治疗或对减轻疾病的抗风湿药物(DMARD)治疗有不充分的响应。
在一个实施方案中，在治疗类风湿性关节炎(RA)，如活性RA，例如中度至严重的活性RA中，使用本剂量和给药方案。
RA是使人衰弱的自体免疫疾病，其影响多于两百万美国人，并且影响患者的日常活动。当身体自身的免疫系统不适当地攻击关节组织并且引起破坏健康组织的慢性炎症和在关节内的损伤时，发生RA。症状包括关节炎症，肿胀，僵硬，和疼痛。另外，由于RA是系统性疾病，其可能在其它组织中如肺、眼、和骨髓中具有影响。
目前，不存在已知的对RA的治愈。当前治疗包括多种类固醇和非甾类抗炎药，免疫抑制剂，减轻疾病的抗风湿药(DMARDs)，和生物制剂。然而，许多患者继续具有针对所述治疗的不充分的响应。
CD20抗体可以用作患有早期RA的患者中的一线治疗(即，甲氨蝶呤(MTX)首次使用)和用作单一治疗，或者与例如MTX或环磷酰胺组合。或者，所述抗体可以作为二线治疗用在DMARD和/或MTX难治愈的患者的治疗中，并且作为单一治疗或者与其它药物治疗如MTX组合。所述人源化CD20结合抗体有效用于防止和控制RA中的关节损伤，延迟结构损伤，减少与炎症相关的疼痛，并且通常减少活性RA如中度至严重RA的迹象和症状。可以在用于治疗RA的其它药物治疗之前、之后或一起使用人源化CD20抗体治疗RA患者(见下文的组合治疗)。在一个实施方案中，使用本文的人源化CD20结合抗体治疗先前减轻疾病的抗风湿药失败和/或对单独的甲氨蝶呤有不充分响应的患者。在该治疗的一个实施方案中，按照本发明的给药方案，患者最初接受单独的人源化CD20结合抗体，然后施用CD20抗体加环磷酰胺，或CD20抗体加甲氨蝶呤。
一种评估RA治疗功效的方法是基于美国风湿病学院(ACR)标准，其特别测量疼痛的和肿胀的关节中的改善的百分数。例如，与无抗体治疗(例如，治疗前的基线)或用安慰剂治疗相比较，RA患者可以以ACR 20(20％的改善)计分。其它评估抗体治疗功效的方法包括X射线计分如夏普(Sharp)X射线计分，其用于计分结构损伤如骨磨损和关节空间变窄。还可以基于在治疗过程中或之后的时间的健康评估问卷(HealthAssessment Questionnaire)[HAQ]计分、AIMS计分、SF-36评估患者残疾的预防或改善。ACR 20标准可以包括在疼痛的(痛)关节计数和肿胀关节计数中的20％的改善，加上在下述5种其它测量中的至少3种中的20％的改善：
1.通过视觉相似标准(VAS)的患者疼痛评估，
2.患者疾病活性的综合评估(VAS)，
3.医师疾病活性的综合评估(VAS)，
4.通过健康评估问卷测量的患者自我评估残疾，和
5.急性期反应物，CRP或ESR。
ACR 50和70相似地定义。优选地，患者施用这样的量的本发明的CD20抗体，其有效实现至少下述的计分：ACR 20，优选至少ACR 30，更优选至少ACR50，甚至更优选至少ACR70，更优选至少ACR 75和更高。
银屑病关节炎具有独特且明显的X光照片特征。对于银屑病关节炎，也可以通过夏普计分评估关节磨损和关节空间变窄。本发明的人源化CD20结合抗体可以用于防止关节损伤并且减少病症的疾病迹象和症状。
本发明的另一个方面是治疗狼疮或SLE的方法，其通过给患有SLE的患者施用治疗有效量的本发明的人源化CD20抗体进行。SLE患者包括具有肾外表现和具有狼疮肾炎的患者。SLEDAI得分提供疾病活性的数字定量。SLEDAI是已知与疾病活性相关的24个临床和实验室参数的加权指数，数字范围为0-103。参见Bryan Gescuk和John Davis，“Noveltherapeutic agent for systemic lupus erythematosus(用于系统性红斑狼疮的新治疗剂)”，在Current Opinion in Rheumatology(现代风湿病学观点)2002，14：515-521中。据信针对双链DNA的抗体引起肾红肿和其它狼疮表现。接受抗体治疗的患者可以监测肾红肿的时间，将其定义为血清肌酸酐、尿蛋白或尿血的显著的、重现的增加。备选地或者另外，可以监测患者抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平。关于SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。
关于血管炎，患有系统性血管炎的患者中约有75％具有抗-嗜酸细胞胞质抗体，并且集中在影响小/中等尺寸的血管的三种病症中的一种：韦格纳肉芽肿病(WG)，显微镜下多血管炎(MPA)和Churg Strauss综合征(CSS)，共同已知为ANCA相关的血管炎(AAV)。
脊椎关节病是一组关节病症，其包括僵硬脊椎炎、银屑病关节炎和局限性回肠炎。可以通过验证的患者和医师综合评估测量工具确定治疗成功。
使用多种药物治疗来治疗银屑病：治疗直接与疾病严重性相关而不同。患有较轻形式的银屑病的患者典型地使用局部治疗，诸如局部类固醇，地蒽酚，卡铂三烯(calcipotriene)，氯倍他索，和他扎罗汀，以管理所述疾病，而患有中度和严重银屑病的患者更可能使用系统性(甲氨蝶呤，类视色素，环胞素，PUVA和UVB)治疗。也使用Tars。这些治疗具有安全性考虑、费时的方案、或不便的治疗过程的组合。此外，一些需要昂贵的设备和办公室设置中的专门空间。系统性药物治疗可以产生严重的副作用，包括高血压、高血脂、骨髓抑制、肝病、肾病和胃肠不适。此外，使用光线疗法可以增加皮肤癌的发生。除了与使用局部治疗相关的不便和不适之外，光线疗法和系统性治疗需要使得患者循环开始和结束治疗，并且监测由于它们的副作用的寿命影响。
对于银屑病的治疗功效通过监测该疾病的临床迹象和症状的变化进行评估，包括与基线病症相比较的医师的综合评估(PGA)改变和银屑病面积和严重性指数(PASI)得分、银屑病症状评估(PSA)。患者可以在整个治疗过程中关于明显的类似标准定期进行测量，所述明显类似标准用来指示在特定时间点经历的痒的程度。
使用他们的第一次治疗抗体的输注，患者可能经历输注反应或与输注相关的症状。这些症状在严重性上不同，并且通常利用医学干预是可逆的。这些症状包括但不限于，流感样发烧，寒战/发冷，恶心，风疹，头痛，支气管痉挛，血管水肿。对于本发明的疾病治疗方法，最小化输注反应是理想的。为了减轻或最小化所述不利事件，患者可以接受初始调节性(conditioning)或耐受性剂量的抗体，然后再是治疗有效剂量。调节性剂量低于治疗有效剂量，以使得患者适应从而耐受较高剂量。
在自体免疫疾病治疗中，如上文所述的自体免疫疾病或自体免疫相关的病症，患者可以用与第二种治疗剂如免疫抑制剂联合的一种或多种CD20结合抗体进行治疗，如在多药方案中。CD20结合抗体可以与免疫抑制剂同时、顺序或交替施用，或在与其他治疗无响应性时施用。免疫抑制剂可以以与本领域所述的剂量相同或较低的剂量施用。优选的联合免疫抑制剂将取决于多种因素，包括治疗的病症的类型和患者的病史。
当在本文中用于联合治疗时，“免疫抑制剂”是指作用抑制或掩蔽患者的免疫系统的物质。所述药剂包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自体抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。所述药剂的实例包括类固醇如糖皮质类固醇，例如，泼尼松，甲泼尼龙，和地塞米松；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)，硫唑嘌呤(或如果存在针对硫唑嘌呤的不利反应，则为环磷酰胺)；溴隐亭；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环胞素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗-干扰素-α，-β，或-γ抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶肽(于7/26/90公布的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(美国专利号5,114,721)；T-细胞受体片段(Ofiner等.，Science(科学)251：430-432(1991)；WO 90/11294；和WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。
对于类风湿性关节炎的治疗，患者可以用与一种或多种下述药物的任一种联合的CD20结合抗体(如利妥昔单抗或奥瑞珠单抗或其变体)进行治疗：DMARDS(减轻疾病的抗风湿药(例如，甲氨喋呤)，NSAI或NSAID(非甾类抗炎药)，免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤；麦考酚酸酯(
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Roche))，止痛剂，糖皮质类固醇，环磷酰胺，HUMIRATM(阿达木单抗；Abbott Laboratories)，
Figure GPA00001068272100522
(来氟米特)，
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(英利昔单抗；Centocor Inc.，Malvern，Pa)，ENBREL(依那西普；Immunex，WA)，ACTEMRA(托珠单抗；罗氏，瑞士)，COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARDs为羟氯喹，硫氮磺吡啶，甲氨蝶呤，来氟米特，依那西普，英利昔单抗，硫唑嘌呤，D-青霉胺，Gold(口服)，Gold(肌内)，二甲胺四环素，环胞素，葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿达木单抗是一种人单克隆抗体，其结合
Figure GPA00001068272100524
英利昔单抗是一种嵌合单克隆抗体，其结合
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依那西普一种“免疫黏附素”融合蛋白，其由与人IgG1的Fc部分连接的人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成。Actemra(托珠单抗)是一种人源化的抗人白介素-6(IL-6)受体。对于RA的常规治疗，参见，例如，“Guidelines for the management of rheumatoidarthritis(类风湿性关节炎管理指南)”Arthritis&Rheumatism(关节炎和风湿病)46(2)：328-346(2002年2月)。在具体实施方案中，RA患者用与甲氨喋呤(MTX)联合的本发明的CD20抗体进行治疗。MTX的示例性剂量为约7.5-25mg/kg/wk。MTX可以口服和皮下施用。
对于僵硬脊椎炎、银屑病关节炎和局限性回肠炎的治疗，患者可以用与例如
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(英利昔单抗；获自Centocor Inc.，Malvern，Pa.)，ENBREL(依那西普；Immunex，WA)联合的本发明的CD20结合抗体进行治疗。
对于SLE的治疗包括CD20抗体与高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)的组合。患有SLE，AAV和NMO的患者可以用与下述任一种组合的本发明的CD20结合抗体进行治疗：皮质类固醇，NSAIDs，止痛剂，COX-2抑制剂，糖皮质类固醇，常规DMARDS(例如，甲氨喋呤，硫氮磺吡啶，羟氯喹，来氟米特)，生物DMARDs如抗-Blys(例如，贝利木单抗)，抗-IL6R如托珠单抗；CTLA4-Ig(abatacept)，(抗-CD22，例如，依帕珠单抗)，免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤；麦考酚酸酯(
Figure GPA00001068272100532
罗氏))，和细胞毒性药剂(例如，环磷酰胺)。
对于银屑病的治疗，患者可以施用与局部治疗联合的CD20结合抗体，所述局部治疗如局部类固醇，地蒽酚，卡铂三烯，氯倍他索，和他扎罗汀，或与甲氨喋呤，类视色素，环胞素，PUVA和UVB治疗联合。在一个实施方案中，银屑病患者用CD20结合抗体与环胞素顺序地或同时进行治疗。
为了最小化毒性，传统的系统治疗可以以轮流的、顺序的、组合的、或断续的治疗方案、或较低剂量组合方案与以该剂量的CD20结合抗体组合物进行施用。
通过将具有需要的纯度程度的抗体与任选地药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s制药科学)第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合以冻干制剂或水溶液的形式制备按照本发明使用的CD20-结合抗体的治疗制剂用以储存。可以接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸、柠檬酸、和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苯甲基醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲醇)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如olyvinylpyrrolidone；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡反离如钠；金属配合物(例如，Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
III.CD20抗体的制备
本发明的制备方法和制品使用或者结合与B细胞表面标记结合的抗体，特别是与CD20结合的抗体。因此，此处将描述产生所述抗体的方法。
用于生产、或筛选抗体的CD20抗原可以是，例如，可溶形式的CD20或其部分，其包含需要的表位。备选地，或者另外地，在它们的细胞表面表达CD20的细胞可以用来产生、或筛选抗体。有效用于产生抗体的其它形式的CD20对于本领域的技术人员是清楚的。
以下是关于生产按照本发明使用的抗体的示例性技术的描述。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。它可以有效用于将相关抗原缀合到在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白上，例如，匙孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂，缀合使用双官能或衍生剂进行，例如，马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。
通过组合，例如，100μg或5μg的蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂，并且将该溶液皮内注射到多个部位，而将动物针对所述抗原、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过在多个部位的皮下注射，将所述动物用在弗氏完全佐剂中的1/5-1/10初始量的肽或缀合物进行加强。7-14天后，对动物采血，并且测定血清的抗体滴度。对动物进行加强直至达到滴度稳定水平。优选地，将所述动物用相同的抗原但是缀合至不同的蛋白和/或通过不同交联剂的缀合物进去加强。缀合物还可以在重组细胞培养物中制备为蛋白融合体。此外，聚集试剂如明矾，适合用来增强免疫反应。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体获自一群基本上均一的抗体，即，包括在所述群体中的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的产生过程中可能存在的变体之外，而且这样的变体通常以较少量存在。因此，修饰词“单克隆”是指抗体的特征，不是离散的或多克隆抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以通过最初记述在Kohler等.，Nature(自然)，256：495(1975)中的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
在杂交瘤法中，将小鼠或其它适当的宿主动物，如仓鼠，按上述进行免疫，以激发生产或能够生产将与用来免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。备选地，淋巴细胞可以在体外免疫。然后，使用适当的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页(Academic Press(学院出版社)，1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种并且在适当的培养基上生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的、亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT-缺陷型细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是这样的细胞，其有效地融合，支持由所选择的生产抗体细胞的稳定、高水平的抗体生产，并且对培养基如HAT培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从美国加利福尼亚州圣地亚哥Salk细胞分类中心研究院(Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California USA)获得的源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从美国马里兰州Rockville美国典型培养物中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(单克隆抗体生产技术和应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。
测定杂交瘤细胞生长的培养基针对所述抗原的单克隆抗体的生产。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和性可以，例如，通过Munson等.，Anal.Biochem.(生物化学年刊)，107：220(1980)的Scatchard分析确定。
在鉴定了产生需要的特异性、亲和性、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可以通过有限稀释步骤进行亚克隆并且通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页(Academic Press(学院出版社)，1986))。用于该目的的适当的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法如例如蛋白质A-SEPHAROSETM，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析，将由所述亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水流体、或血清分离。
编码所述单克隆抗体的DNA利用常规方法易于分离和测序(例如，通过利用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为所述DNA的优选来源。一旦分离，可以将所述DNA置于表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述论文包括Skerra等.，Curr.Opinion inImmunol.(现代免疫学观点)，5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.(免疫学综述)，130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以分离自使用McCafferty等.，Nature(自然)，348：552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库。Clackson等.，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)分别描述了利用噬菌体文库的鼠和人抗体的分离。后续的出版物描述了通过链改组(Marks等.，Bio/Technology(生物技术)，10：779-783(1992))，以及组合感染和作为构建非常大的噬菌体文库策略的体内重组(Waterhouse等.，Nuc.Acids.Res.(核酸研究)，21：2265-2266(1993))生产高亲和性(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效备选。
DNA还可以进行修饰，例如，通过取代人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison，等.，Proc.NatlAcad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上进行修饰。
典型地，所述非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原-组合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，其包括具有针对抗原的特异性的一个抗原-组合位点、和具有针对不同抗原的特异性的另一个抗原-组合位点。
另外，包括具有针对FcγR的高亲和性的变体Fc区的抗体有效用于治疗疾病，其中需要效应器细胞功能的增强的功效，如自体免疫疾病，诸如例如在US 2005/0037000和WO 2004/63351(Macrogenics，Inc.STAVENHAGEN等.)中列出的。
(iii)人源化抗体
使非人抗体人源化的方法已经在本领域中描述过。优选地，人源化的抗体具有由非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和同事(Jones等.，Nature(自然)，321：522-525(1986)；Riechmann等.，Nature(自然)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等.，Science(科学)，239：1534-1536(1988))的方法通过用超变区序列取代人抗体的相对应序列而进行。因此，所述“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相对应序列取代。实践中，人源化抗体典型地为这样的人抗体，其中一些超变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域、轻链和重链的选择，对于降低抗原性是非常重要的。按照所谓的“最佳适配(best-fit)”方法，从完整的已知的人可变结构域序列的文库中筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，接受最接近啮齿动物的序列的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等.，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2296(1993)；Chothia等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，196：901(1987))。另一种方法使用源自特定亚组的轻链或重链可变区的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可以用于数种不同的人源化抗体(Carter等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4285(1992)；Presta等.，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2623(1993))。
抗体应该被这样人源化，即，保持对所述抗原的高亲和性和其它有利的生物特性，也是重要的。为了实现该目的，按照优选方法，通过利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念上人源化的产物的过程制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，并且为本领域的技术人员所熟悉。举例说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些展示的校验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列选择FR残基，并且组合，以致获得需要的抗体特征，如提高的针对靶抗原的亲和性。通常，超变区残基直接且最充分地参与影响抗原结合。
(iv)人抗体
作为人源化的备选方案，可以产生人抗体。例如，现在可以产生当免疫时能够在不存在内源免疫球蛋白生产的条件下产生人抗体的完整所有成员的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连结区(JH)基因的纯合缺失导致对内源性抗体生产的完全抑制。在所述种系突变小鼠中，人种系免疫球蛋白基因点阵的转移将在抗原刺激时导致产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等.，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggermann等.，Year in Immuno.，7：33(1993)；和美国专利号5,591,669，5,589,369和5,545,807。
备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等.，Nature(自然)348：552-553(1990))可以用来在体外由来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有成员产生人抗体和抗体片段。按照这一技术，将抗体V结构域基因符合阅读框地克隆至丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要衣壳蛋白基因上，并且作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒包含单链DNA拷贝的噬菌体基因组，基于抗体的功能特异性的选择还导致对编码展示那些特定的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以各种形式进行；关于它们的综述，参见，例如，Johnson等.，Current Opinion in Structural Biology(现代结构生物学观点)3：564-571(1993)。一些来源的V-基因片段可以用于噬菌体展示。Clackson等.，Nature(自然)，352：624-628(1991)从源自免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机组合文库分离了抗唑酮抗体的多样点阵。可以构建来自未免疫的人供体的V基因的所有成员，并且针对抗原(包括自体抗原)的多样点阵的抗体可以基本上按照由Marks等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1991)，或Griffith等.，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术分离。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
人抗体还可以由体外活化的B细胞产生(参见，美国专利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗体片段
已经开发了多种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整的抗体而获得(参见，例如，Morimoto等.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods(生物化学和生物物理学方法杂志)24：107-117(1992)和Brennan等.，Science(科学)，229：81(1985))。然而，现在，这些片段可以直接通过重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可以分离自上文讨论的抗体噬菌体文库。备选地，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌回收，并且化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等.，Bio/Technology(生物技术)10：163-167(1992))。按照另一种方法，F(ab′)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。用于生产抗体片段的其它技术是熟练的实践者所清楚的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如例如在美国专利5,641,870中所述。所述线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以结合CD20抗原的两个不同的表位。其它所述抗体可以结合CD20，并且另外结合第二个B-细胞表面标记。备选地，抗-CD20结合臂可以与结合白细胞上的引发分子如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，以将细胞防御机制集中在B细胞上。双特异性抗体还可以用来使某些药剂局部停留在B细胞中。这些抗体具有CD20-结合臂和结合所述药剂(例如，甲氨蝶呤)的臂。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。传统生产全长双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等.，Nature(自然)，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类。这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同的抗体分子的可能的混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和层析步骤进行，是相当繁重的，并且产物产量低。相似的步骤公开在WO 93/08829中，和在Traunecker等.，EMBOJ.，10：3655-3659(1991)中。
按照不同的方法，将具有需要的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列上。融合体优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包括至少部分铰链、CH2和CH3区。优选地在至少一个融合体中存在包含轻链结合必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码所述免疫球蛋白重链融合体和，如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体中，并且共转染到适当的宿主生物体中。这在调整实施方案中三种多肽片段的突变比例中提供了很大的灵活性，此时用于构建的不等比例的三种多肽链提供最佳产量。然而，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中，此时至少两种以相同比例的多肽链表达导致高产量，或者此时比例没有特别的显著性。
在该方法的一个优选的实施方案中，双特异性抗体包括在一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另外一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(其提供第二结合特异性)。发现该不对称的结构促进所需要的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在一半的双特异性分子中的免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。该方法公开在WO 94/04690中。对于产生双特异性抗体的进一步的详情，参见，例如，Suresh等.，Methods in Enzymology(酶学方法)，121：210(1986)。
按照美国专利号5,731,168中所述的另一种方法，可以改造在一对抗体分子之间的界面，以使由重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比最大化。优选的界面包括抗体恒定结构域CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的补偿性的“洞”。与其它不需要的终产物如同源二聚体相比，这提供了一种增加异源二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，在异源缀合物中的一个抗体可以偶联到抗生物素蛋白上，另一个抗体偶联到生物素上。例如，已经提议所述抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。异源缀合物抗体可以使用任何便利的交联分方法制备。合适的交联剂在本领域中是公知的，并且与多种交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。
已经在参考文献中描述了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可以使用化学连接制备。Brennan等.，Science(科学)，229：81(1985)描述了一种方法，其中将完整的抗体蛋白水解分裂以产生F(ab′)2片段。在存在二硫醇配位剂亚砷酸钠的条件下，将这些片段还原，以稳定邻近的二硫醇，并且防止形成分子间二硫化物。然后，将所产生的Fab′片段转变为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺还原，将一种Fab′-TNB衍生物重新转变为Fab′-硫醇，并且与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用作用于酶的选择性固定的试剂。
也已经描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny等.，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两种不同的抗体的Fab′部分。在铰链区还原抗体同源二聚体，以形成单体，并且然后再氧化形成抗体异源二聚体。该方法还可以用于生产抗体同源二聚体。Hollinger等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：6444-6448(1993)所述的“双抗体技术”已经提供了一种制备双特异性抗体片段的备选机制。所述片段包括通过连接体与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述连接体太短而不能允许在同一链上的两个结构域之间的配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VH和VL结构域配对，由此形成两个抗原-结合位点。还已经报道了利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见，Gruber等.，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994)。
考虑了具有多于两个化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)。
(vii)抗体的缀合物和其它修饰
本文考虑的抗体的修饰。因此，在一个实施方案中，可以缀合到另一个分子上，例如，以增加半衰期或稳定性，或者另外提高抗体的药物代谢动力学。例如，抗体可以连接到多种非蛋白样聚合物的一种上，例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。与一个或多个PEG分子连接的抗体片段，如Fab’，是本发明特别优选的实施方案。
本发明公开的抗体还可以配制为脂质体。包含所述抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，如Epstein等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82：3688(1985)；Hwang等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和于1997年10月23日公布的WO 97/38731中所述的。具有增加的循环时间的脂质体公开在美国专利号5,013,556中。
可以通过反相蒸发法，利用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，产生特别有用的脂质体。通过限定孔尺寸的滤器挤压脂质体，以产生具有需要的直径的脂质体。本发明抗体的Fab′片段可以通过二硫化物相互交换反应缀合到脂质体上，如在Martin等.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)257：286-288(1982)中所述。
考虑了本文所述的蛋白或肽抗体的氨基酸序列修饰。例如，它可以理想地提高所述抗体的结合亲和性和/或其它生物特性。通过将适当的核苷酸改变引入到抗体核酸中，或通过肽合成，制备所述抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括，例如，所述抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或取代。进行删除、插入、和取代的任意组合，以达到最终的构建体，条件是所述最终的构建体具有所需要的特征。氨基酸改变还可以改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
有效用于鉴定所述抗体作为诱变的优选位置的特定残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science(科学)，244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定残基或目标残基组(例如，带电残基如arg，asp，his，lys，和glu)并且替换为中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在所述取代位点或为其引入另外或其它变体，而精选表现出针对所述取代的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变化的位点，但是突变性质本身不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点的突变的表现，在目标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并且筛选所表达的抗体变体的需要的活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，其范围在长度上由一个残基至包含一百以上残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲二磺酰基残基的抗体或与多肽或聚合物融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N端或C端与酶、或与增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在所述抗体分子中具有由不同残基替换的至少一个氨基酸残基。对于抗体的取代诱变最感兴趣的位点包括超变区，但是也考虑了FR改变。在下表中以“优选的取代”的标题显示了保守取代。如果所述取代导致生物活性的改变，那么可以引入更充分的改变，在下表中显示为“示例性取代”，或这如下文参照氨基酸种类进一步所述，并且筛选产物。
表2
Figure GPA00001068272100641
Figure GPA00001068272100651
通过选择它们对保持下列各项的作用的显著改变的取代：(a)在取代区域的多肽骨架的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大体积(bulk)，而实现抗体生物特性中的充分修饰。氨基酸可以按照它们的侧链特性的相似性分组(在A.L.Lehninger，Biochemistry(生物化学)，第二版，第73-75页，Worth Publishers，New York(1975)中)：
(1)无极性的：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不带电荷极性的：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)，Arg(R)，His(H)
备选地，基于常见的侧链特性，天然存在的残基可以分成下列各组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香的：Trp，Tyr，Phe.
非保守取代限定为这些种类中的一种的一个成员与另一种类的交换。
还可以取代不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基，通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性，并且防止异常交联。相反，可以向抗体中加入半胱氨酸键，以提高其稳定性(特别是在所述抗体为抗体片段如Fv片段的情形中)。
特别优选类型的取代变体包括取代亲本抗体的一个或多个超变区残基。通常，相对于它们由之所产生的亲本抗体，所形成的选择用于进一步开发的变体将具有提高的生物特性。产生所述取代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，将一些超变区位点(例如，6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体展示在丝状噬菌体颗粒上。然后，如本文公开那样，对噬菌体-展示的变体筛选它们的生物活性(例如，结合亲和性)。为了鉴定用于修饰的候选超变区，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定主要有助于抗原结合的超变区残基。备选地，或者另外地，可以有利地分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定在所述抗体与抗原之间的接触点。按照本文详细描述的技术，所述接触残基和邻近的残基为取代的候选。一旦产生所述变体，对一组变体进行本文所述的筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有优越特性的抗体用于进一步的开发。
所述抗体的另一种类型的氨基酸变体改变所述抗体的原始糖基化模式。所述改变包括删除在所述抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个在所述抗体中不存在的糖基化位点。
多肽的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X还是除脯氨酸外的任何氨基酸，所述三肽是用于将碳水化合物部分酶促附着在天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，这些三肽序列的任一种在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一种与羟基氨基酸、最常见的为丝氨酸或苏氨酸的附着，尽管还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，以致其包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，便利地实现向抗体中加入糖基化位点。还可以通过向原始抗体序列中加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基、或用其取代而进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。
当抗体包括Fc区时，附着在其上的碳水化合物可以改变。例如，美国专利申请号US 2003/0157108(Presta，L.)中描述了具有成熟的碳水化合物结构的抗体，其缺少附着在所述抗体的Fc区的岩藻糖。还参见，US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。WO 2003/011878，Jean-Mairet等.和美国专利号6,602,684，Umana等中提及了在附着在所述抗体的Fc区的碳水化合物中具有对开的(bisecting)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087，Patel等中报道了在附着在抗体的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。还参见，WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)，其涉及具有改变的附着在其Fc区的碳水化合物的抗体。还参见US 2005/0123546(Umana等.)，其关于具有修饰的糖基化的抗原-结合分子。
本文优选的糖基化变体包括Fc区，其中附着在所述Fc区上的碳水化合物结构缺少岩藻糖。所述变体具有提高的ADCC功能。任选地，所述Fc区还在其中包括一个或多个氨基酸取代，其进一步提高ADCC，例如，在Fc区位置298，333，和/或334的取代(残基的EU编号)。关于“去岩藻糖基化的”或“缺乏岩藻糖的”抗体的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等.J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等.Biotech.Bioeng.(生物技术生物工程)87：614(2004)。产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺失蛋白质岩藻糖基化作用的Lecl3CHO细胞(Ripka等.Arch.Biochem.Biophys.(生物化学生物物理学学报)249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO2004/056312A1，Adams等.，特别是实施例11)，和敲除的细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等.Biotech.Bioeng.(生物技术生物工程)87：614(2004))。
通过本领域已知的多种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情形中)或通过寡核苷酸-介导的(或位点定向)诱变、PCR诱变、和该抗体的较早制备的变体或非变体版本的盒诱变而制备。
可以理想地关于效应器功能修饰本发明的抗体，例如，以提高抗体的ADCC和/或CDC。这可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸取代实现。备选地或另外地，可以向Fc区引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域形成链间二硫键。这样产生的同源二聚体抗体可以具有提高的内在化能力和/或提高的补体-介导的细胞杀伤和ADCC。参见，Caron等.，J.Exp Med.(实验医学杂志)176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.(免疫学杂志)148：2918-2922(1992)。同源二聚体抗体还可以使用Wolff等.CancerResearch(癌症研究)53：2560-2565(1993)中所述的异源双官能交联接头制备。备选地，可以加工具有双Fc区的抗体，并且可以由此具有提高的补体裂解和ADCC能力。参见，Stevenson等.Anti-Cancer DrugDesign(抗癌药物设计)3：219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta，L.)描述了在人效应器细胞的存在下具有提高的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区包括氨基酸取代。优选地，具有提高的ADCC的所述抗体包括在Fc区的位置298，333，和/或334的取代。优选地，所改变的Fc区是人IgG1Fc区，其包括在这些位置中的一个、两个或三个的取代或由其组成。
WO 99/51642，美国专利号6,194,551B1,美国专利号6,242,195B1，美国专利号6,528,624B1和美国专利号6,538,124(Idusogie等.)中描述了具有改变的C1q结合和/或CDC的抗体。所述抗体包括在其Fc区的氨基酸位置270，322，326，327，329，313，333和/或334的一个或多个处的氨基酸取代。
为了提高抗体的血清半衰期，人们可以向抗体(特别是抗体片段)中结合补救受体结合表位，例如，如在美国专利5,739,277中所述。当用于本文时，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)的Fc区的表位，该表位负责提高该IgG分子的体内血清半衰期。具有在其Fc区的取代和增加的血清半衰期的抗体还记述在WO00/42072(Presta，L.)中。
还考虑了具有三个以上(优选四个)功能性抗原结合位点的改造抗体(美国申请号US 2002/0004587A1，Miller等.)。
IV.药物制剂
示例性的抗-CD20抗体制剂记述在WO98/56418中，其通过引用清楚地结合在本文中。另一种制剂是液体多剂量制剂，其包括40mg/mL的抗-CD20抗体，25mM乙酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酯20，pH 5.0，其保存在2-8℃具有两年的最小保存期。另一种目的抗-CD20制剂包括在pH 6.5的9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物，0.7mg/mL聚山梨酯80，和注射用无菌水中的10mg/mL抗体。另一种水性药物制剂包括约pH 4.8-约pH 5.5、优选pH5.5的10-30mM乙酸钠，处于约0.01-0.1％v/v的量的作为表面活性剂的聚山梨酯，处于约2-10％w/v的量的海藻糖，和作为防腐剂的苯甲醇(U.S.6,171,586)。适于皮下施用的冻干制剂记述在WO97/04801中。所述冻干制剂可以用适当的稀释剂重构至高蛋白浓度，并且所重构的制剂可以皮下施用给本文待治疗的哺乳动物。
关于人源化2H7变体的一种制剂是在pH 5.8的10mM组氨酸，6％蔗糖，0.02％聚山梨酯20中的12-14mg/mL的抗体。
在具体实施方案中，2H7变体且特别是变体A以20mg/mL抗体配制在pH5.8的10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，和注射用无菌水中。
当对于治疗的具体适应征需要时，本文的制剂还可以包含多于一种的活性化合物，优选是具有彼此没有不利影响的互补活性的那些。例如，可以理想地进一步提供细胞毒性试剂，化学治疗剂，细胞因子或免疫抑制剂(例如，作用在T细胞上的一种，如环胞素，或结合T细胞的抗体，例如，结合LFA-1的一种)。所述其它试剂的有效量取决于在所述制剂中存在的抗体的量，疾病或病症或治疗的类型，和上文讨论的其它因素。这些通常以相同的剂量和本文所述的施用途径或约为此前所用的剂量的1-99％使用。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这易于通过经过无菌滤膜的过滤实现。
V.制品(Article of manufacture)
在本发明的另一个实施方案中，提供包含有效用于治疗自体免疫疾病的物质的制品。特别地，本发明提供这样的制品，其包括：(a)容器，其包括拮抗剂，如结合B细胞表面标记的抗体(例如，CD20抗体)(优选地，所述容器在该容器内包括抗体和药用载体或稀释剂)；和(b)包装插页，其具有用于治疗受试者中的自体免疫疾病如类风湿性关节炎的使用说明，其中所述使用说明指示所述受试者以单次静脉内输注施用完全治疗有效量的拮抗剂或抗体(例如，CD20抗体)。
在一个特定实施方案中，本文的制品还包括包含第二种药物的容器，其中所述拮抗剂或抗体是第一种药物，并且所述制品还在包装插页上包括关于用有效量的第二种药物治疗受试者的使用说明。第二种药物可以是上述那些中的任一种，示例性的第二种药物是上述那些，包括抗生素，免疫抑制剂，减轻疾病的抗风湿药(DMARD)，疼痛控制剂，整联蛋白拮抗剂，非类固醇消炎药(NSAID)，细胞因子拮抗剂，二磷酸酯，或激素，或它们的组合，更优选为DMARD，NSAID，疼痛控制剂，或免疫抑制剂。最优选地，第二种药物是甲氨蝶呤。
在该方面中，所述包装插页是在容器上或与容器关联。适当的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳或包含有效用于治疗目标自体免疫疾病的组合物，并且可以具有无菌的进入端口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针穿透的塞子的小瓶)。该组合物中的至少一种活性药剂是CD20拮抗剂，诸如CD20抗体。所述制品还可以包括另外的容器，所述容器包括药用稀释缓冲液，诸如抑制细菌的注射用水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，Ringer′s溶液，和/或葡萄糖溶液(dextrose solution)。所述制品还可以包括来自商购和使用者站点的其它需要的材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，和注射器。
本发明的其它详情将通过下述非限制性实施例变得清楚。
参照实施例
制备人源化2H7抗体变体，并且测定生物功能，包括人CD20结合亲和性，效应器功能和B细胞消耗记述在WO 04/056312中，其通过引用完全结合在本文中。以及描述了鼠2H7抗体可变区序列和具有小鼠V和人C的嵌合2H7，参见，例如，美国专利5,846,818和6,204,023，其通过引用完全结合在本文中。
实施例1
研究作为单次静脉内输注施用给患有活动期类风湿性关节炎的患者的奥瑞珠单抗的功效和安全性的I/II期临床试验
关于ACR(美国风湿病学学院(American College ofRheumatology))响应，在患有中度至严重的类风湿性关节炎(RA)的患者中检测作为单次静脉内(i.v.)输注施用的奥瑞珠单抗(OCR)的功效，所述奥瑞珠单抗(OCR)是一种CD20B细胞靶向的人源化单克隆抗体，其中所述患者在1-6次DMARDS(包括生物制剂)失败后接受稳定剂量(10-25mg/周)的伴随的甲氨蝶呤(MTX)。
特别地，在患有中度至严重的类风湿性关节炎的患者中进行递增的单次静脉内剂量的rhuMAb 2H7(Ro 496-4913，PRO70769)的安全性的随机的安慰剂对照的、多中心、I/II期研究，所述患者接受稳定剂量的伴随甲氨蝶呤，但是具有不令人满意的临床响应。本试验的目的是评估递增的单次静脉内(IV)剂量的rhuMAb 2H7与甲氨蝶呤(MTX)组合在患有中度至严重的类风湿性关节炎(RA)的患者中的安全性和耐受性。
试验使用下述流程进行：
部分I-剂量递增
患者接受等价于下述剂量水平中的一种的rhuMAb 2H7或安慰剂的单次IV输注：
组1：400mg
组2：1000mg
组3：1500mg
在每个剂量水平治疗最少10名患者(8名活性的；2名安慰剂的)后开始剂量递增。递增的决定是基于对来自本研究内前组的数据的总结。评估剂量限制的毒性数目，并且取决于该数目，本研究可以继续到下一剂量水平，或者另外的患者可以加入到同一剂量水平。
部分II
在剂量递增阶段和数据的临时分析之后，将另外120名患者(96名活性的，24名安慰剂的)随机分成部分I所用的三种剂量(预计为400，1000和1500mg)，条件是这些已经在剂量递增阶段证明是可耐受的。
患者数目
部分I中至少40名；部分II 120名
目标群体
-成年患者(年龄为18-80岁)
-中度至严重RA
-一种减轻疾病的抗风湿药(DMARD)或生物制剂是失败的(通过缺乏功效或耐受性)，但是使用多于5种这些药剂没有失败
-当前接受MTX，但是对MTX治疗具有不令人满意的临床响应(即，部分响应者)
研究持续时间
-单次IV输注；评估至24周，然后是另一48周的随访：总共72周
-在任意时间退出或在第72周仍然是B细胞消耗的患者将进入持续48周的安全性随访或者直到它们的B细胞得到恢复(更久的那一种)。显著包含标准
具有活动期RA：
-诊断RA至少6个月(按照修改的1987年ACR标准)
-阳性血清类风湿因子(≥20IU/L)
-在筛选时，C-反应蛋白≥1.5mg/dL或红血球沉积速率≥28mm/hr
-在筛选时，肿胀的关节计数≥8(66个关节计数)和疼痛的关节计数≥8(68个关节计数)，并且是随机的
先前治疗/背景治疗：
-基于门诊患者的当前治疗
-使用MTX以10-25mg每周持续至少12周的当前治疗，在筛选前稳定至少4周
-在随机化前4-8周，停止所有的DMARDs(除MTX之外)；对于伊那西普，英利昔单抗，阿达木单抗和来氟米特(在接受来氟米特的那些中在消胆胺药物冲失后)，为8周
-皮质类固醇剂量不超过10mg/天泼尼松或等价物，在筛选前稳定至少4周
-如果接受NSAIDs，在筛选前2周剂量必须稳定。
-愿意接受口服叶酸
研究的产品
剂量-400，1000，1500和2000mg的单剂量rhuMAb 2H7
途径-IV输注(在本方案的附件3中提供速率)
比较“药物”剂量/途径/方案
-单次安慰剂输注
伴随的治疗
Peri-输注治疗
预防性(推荐的)-推荐对乙酰氨基酚和苯海拉明(或其它非镇静性抗组胺药)的预防剂量，在开始rhuMAB 2H7输注前30-90分钟给药。
输注过程中可能的类固醇范围-如果在给定的剂量水平观察到显著的输注-相关事件，并且输注速率的降低不减少输注-相关的事件的数目，则主办人可能为后续治疗的患者推荐使用IV皮质类固醇的术前用药。
甲氨蝶呤(需要的)-以10-25mg(口服或肠胃外)的稳定的每周剂量；由研究中心药房提供
皮质类固醇(任选的)-以多至10mg/天泼尼松或泼尼松等价物的稳定的口服剂量继续
NSAIDs-以稳定剂量继续
再次治疗
预计临床响应的发作可能是缓慢的。因此，当可能时，应该保持背景治疗不变直至第24周。在第24周后，合格的患者可以接受独立的再次治疗方案下的再次治疗。
怎样提供
rhuMAb 2H7和匹配的安慰剂由主办人提供在10mL小瓶中；rhuMAb 2H7将处于20mg/mL的浓度。在输注之前，rhuMAb 2H7必须稀释在0.9％的氯化钠中，以在250或500mL的体积中提供适合的剂量(在本方案的附件3中提供稀释信息)
其它药物将由研究者开出，并且由中心药房在本地提供。
评估下述：
-安全性
不利事件
-不利事件的发生(性质，强度，严重性，关系，可逆性和治疗；使用NCI CTCAE v3.0分级)，包括输注-相关的反应和剂量限制性毒性(关于定义参见步骤部分)
血液学，临床化学和utinalysis
-临床实验室异常的发生
免疫学
-人抗-rhuMAB 2H7抗体的发生
-类风湿因子浓度
-血清免疫球蛋白浓度(IgG， IgM，IgA，IgE)
-破伤风毒素(tetanus toxoid)抗体的血清浓度
-外周B-细胞计数；T-细胞计数
-功效
-按照ACR标准具有20％，50％和70％的临床响应的患者百分数，并且该结果的组成在第24周测量，其使用在输注前第1天的ACR得分(core)设定值作为基线。
-在第24周的疾病活性得分和EULAR响应者比例
统计学分析：
所有分析本质上均是探测性的。患者按照实际接受的治疗进行分组。为了分析的目的，将包括所有接受任何研究药物(rhuMAb 2H7或安慰剂)的患者。
在功效分析中，在研究的前24周内，需要增加MTX剂量、糖皮质激素剂量、引入另外的干预或排斥药物的患者认为是非响应者。
不同剂量水平的对照(安慰剂)患者组合为一个对照组。对于对照组和每个活性剂量组：400mg，1000mg，1500mg和2000mg，所有结果将分开显示。
将进行两个亚组分析：一组基于所有参与的患者，并且另一组基于在本研究部分I的剂量递增结束后的部分II中随机化的那些患者。药物代谢动力学：
rhuMAb 2H7的血清浓度和计算的药物代谢动力学参数将由患者和剂量组列出，并且进行叙述性地总结(平均值，标准偏差，变化的百分比系数，最小值，最大值)。个体和平均浓度相对时间的图将以线性和对数比例来表示。将使用不分割法计算药物代谢动力学参数。
在所有计算中，低于测定定量界限的浓度将被删除，或者基于测定的报告下限指定为某数值。
药效学：
确定对于每名患者的B-细胞消耗模式，并且对于每个剂量水平进行叙述性地总结。外周B细胞消耗和补充的药效学由在每一剂量水平消耗的程度和持续时间进行表征。另外，将准备预测分析计划，以提供群体药物代谢动力学建模作为rhuMAb 2H7的药物代谢动力学和外周B细胞消耗和补充之间的关系的药物代谢动力学/药效学分析。
配制：
rhuMAb 2H7药物产品有Genentech制备为无菌、清澈、无色、不含防腐剂的液体，其意欲稀释用于IV施用。rhuMAb 2H7药物产品以20mg/mL的浓度提供在10cc一次性的小瓶中，其包含名义上(nominal)10mL(200mg)的rhuMAb 2H7/小瓶。所述rhuMAb 2H7药物产品配制在10mM组氨酸硫酸盐，60mg/mL蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯20，和注射液无菌水中。pH调整为5.8。
rhuMAb 2H7药物产品在施用前必须稀释。通过将该药物产品稀释在包含0.9％氯化钠的输注袋中至终药物浓度为1.6-6mg/mL，而制备用于IV施用的rhuMAb 2H7溶液。rhuMAb 2H7-匹配的安慰剂也提供在10cc一次性小瓶中，其包含名义上10mL安慰剂溶液/小瓶。其在组成上与rhuMAb 2H7药物产品相同，但是不包含rhuMAb 2H7。通过使用与用于rhuMAb 2H7药物产品相同的方法将rhuMAb 2H7安慰剂稀释在包含0.9％氯化钠的输注袋中，而制备用于IV施用的rhuMAb 2H7安慰剂溶液。剂量、施用：
研究药物应该以所示速率的缓慢IV输注给予。该速率取决于所施用的剂量，并且将不超过250mL/小时。其不应该作为IV挤压或推注施用。研究药物输注应该通过专线制备。等张的0.9％氯化钠溶液应该用作输注介质(vehicle)。推荐患者在开始输注之前30-60分钟口服接受乙酰氨基酚(1g)和盐酸苯海拉明(50mg；或等价剂量的类似药剂)预防治疗。除了2000mg外的所有剂量均以250mL的体积施用；2000mg剂量(和匹配的安慰剂)将以500mL的体积施用。
再治疗的合格性
对于症状复发的患者的再治疗可以在24周后仅提供给下述患者：那些患者接受活性治疗并且在接受他们的初始治疗后的第24周已经获得至少ACR20响应，并且在研究过程中没有经历显著的不利事件。如果症状复发(由第24周后SJC≥8和TJC≥8指示)，对于这些患者的再治疗将以与他们的初始方案相同的剂量进行。
输注时间
rhuMAb 2H7药物产品以浓度为20mg/mL的液体提供在10cc一次性小瓶中，其包含名义上10mL(200mg)的rhuMAb 2H7/小瓶。匹配的安慰剂，组成相同，但是不含rhuMAb 2H7，也作为液体提供在10cc一次性小瓶中，其包含名义上10mL安慰剂溶液/小瓶。
利妥昔单抗(MabThera)处方信息提供下述关于输注的信息：
第一次输注：推荐的初始输注速率为50mg/小时；前30分钟后，其可以每30分钟以50mg/小时的增加量递增至最大400mg/小时。如果发展了超敏性或输注相关的事件，输注应该暂时减缓或者中止，并且可以随着症状的改善以先前速率的一半继续。如果相同的不利反应第二次严重地发生，应该考虑作出终止治疗的决定。输注速率可以随着症状的改善而增加。
后续输注：以100mg/小时的初始速率输注，并且以30分钟的时间间隔以100mg/小时的增加量增加，至最大值400mg/小时。
正在进行的ACT2847g研究使用相同的标准输注速率，它们的最高剂量为1000mg，递增至400mg/小时，整个输注时间约为4小时15分钟。
为了研究更快的输注时间，该方案将使用下述时间表，尽管如果存在来自部分I最低剂量组的不耐受较快的输注速率的任何指示，则对于后续的剂量组，它们将减少，并且以mg/小时增加的输注速率减少至50mg/小时步骤的标准速率。
400mg剂量组，以1.6mg/mL的浓度；总输注体积为250mL
Figure GPA00001068272100781
1000mg剂量组，以4mg/mL的浓度；总输注体积为250mL
1500mg剂量组，以6mg/mL的浓度；总输注体积为250mL
Figure GPA00001068272100793
Figure GPA00001068272100801
约总输注时间＝3小时32分钟
2000mg剂量组，以4mg/mL的浓度；总输注体积为500mL
约总输注时间＝4小时10分钟
活动期RA定义为≥8个肿胀和≥8个疼痛的关节和升高的C-反应蛋白(CRP)或红血球沉积速率(ESR)。患者(n＝175)随机接受OCR(400，1000，1500，或2000mg)或匹配的安慰剂(PLO)的单次静脉内输注。在安全性和ITT分析中包括40名参与本研究的4剂量递增部分I(2次安慰剂，每组8名活动期的)的患者和135名另外随机至较低的三种剂量或PLO的患者。在研究药物(OCR)之前，没有给予预先输注的糖皮质激素。以2-周的时间间隔进行临床评估直至第8周，然后4周一次至24周。主要的终点是在第24周获得ACR20响应的患者比例。
结果
70％和89％的OCR和PLO组是女性，并且在基线处，疼痛和肿胀的关节的平均数分别为16&17和28&28，ESR 45&49，CRP 25&21，RF+92％&94％。在所有OCR剂量组中观察到B细胞消耗(对于OCR，在第12周为96％)和临床响应。在第24周的ACR20/50/70响应分别为：对于组合的OCR组为57％，31％和15％，对于PLO组为40％，10％和3％。
Figure GPA00001068272100811
结论
在接受背景MTX的RA患者中使用人源化抗CD20奥瑞珠单抗单次输注且无预先输注的类固醇的治疗在所有剂量均实现B细胞消耗，并且相对于单独的MTX，伴随着增加的ACR20/50/70响应。单次输注很好耐受，仅有2名由于不耐受而退出。在PLO和OCR组中，感染的发生和类型相似。
认为前述撰写的说明书足以能够使得本领域技术人员实施本发明。本发明在范围上不限于所保藏的构建体，因为所保藏的实施方案意欲作为本发明某些方面的一个举例说明，并且功能上等价的任何构建体均在本发明范围内。本文材料的保藏不组成对本文撰写的说明书不足以实施本发明的任何方面、包括其最佳模式的承认，其也不解释为将权利要求的范围限制为其代表的具体的举例说明。事实上，除了本文所示和所示的之外，对于本领域的技术人员，通过前述描述，本发明的各种修改将是清楚的，并且落入后附的权利要求的范围之内。
通过本文对本发明的描述，表明在不背离其范围的条件下，各种等价物可以用来实施本发明的概念。此外，尽管本发明已经具体参考某些实施方案进行了描述，但是本领域的普通技术人员将认识到在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以在形式和细节上进行改变。所述的实施方案在所有方面被认为是举例说明性的而不是限制性的。还应该理解本发明不限于本文所述的具体的实施方案，而可以是不背离本发明的范围的多种等价物、重排、修改和取代。因此，另外的实施方案在本发明的范围内和在下述权利要求之内。
本文提及的所有美国专利和申请；外国专利和申请；科学论文；书；和其他出版物通过引用完全结合，如同每个单独的文献通过引用特别且单独指示结合，包括任何附图、图和表格，如同完全列出那样。
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
 
<120>治疗方法
 
<130>24515
 
<150>US60/974641
<151>2007-09-24
 
<160>15
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>1
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>2
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>2
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>3
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>4
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>4
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val  Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>5
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
<400>5
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>6
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>6
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
 
<210>7
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
<400>7
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys  Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val  Phe  Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
<210>8
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>8
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
 
<210>9
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>9
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
 
<210>10
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>10
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
 
<210>11
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>11
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                 25                 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                 40                 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                 55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                 70                 75                 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Glu Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
 
<210>12
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>12
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
 
<210>13
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
<400>13
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys  Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
<210>14
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>14
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
 
<210>15
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化抗体2H7的可变区序列
 
<400>15
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450

Claims (62)

1.CD20拮抗剂在制备用于治疗自体免疫疾病的药物中的应用，其中所述药物用于以所述拮抗剂的单次治疗有效的静脉内(i.v.)输注形式施用给人患者。
2.权利要求1的应用，其中所述施用之后是在第一次施用后4-6个月进行的第二次完全治疗有效量的CD20拮抗剂的静脉内输注。
3.权利要求2的应用，其中所述第二次静脉内输注的施用是用于施用给响应但是在所述第一次施用之后复发的患者。
4.权利要求1-3中任一项的应用，其中所述CD20拮抗剂是CD20单克隆抗体。
5.权利要求1-4中任一项的应用，其中用于第一次和第二次静脉内输注施用的所述治疗有效量基本上相同。
6.权利要求4-5中任一项的应用，其中所述CD20单克隆抗体是嵌合的、人源化的或人的。
7.权利要求1-6中任一项的应用，其中所述自体免疫疾病选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，溃疡性结肠炎，局限性回肠炎，斯耶格伦综合征，视神经脊髓炎(NMO)，ANCA相关的血管炎，韦格纳病，炎性肠病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，自体免疫血小板减少症，多发性硬化病，银屑病，IgA肾病，IgM多神经病，重症肌无力，糖尿病，Reynaud’s综合征，和肾小球肾炎。
8.权利要求1-7中任一项的应用，其中所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
9.权利要求1-8中任一项的应用，其中所述患者已经表现出针对使用甲氨蝶呤、TNF拮抗剂或不同的CD20拮抗剂的先前治疗的不充分的响应。
10.权利要求1-9中任一项的应用，其中所述自体免疫疾病是活动期类风湿性关节炎。
11.权利要求10的应用，其中所述活动期类风湿性关节炎是中度至严重的类风湿性关节炎。
12.权利要求1-11中任一项的应用，其中所述治疗有效量为10mg-2000mg。
13.权利要求1-12中任一项的应用，其中所述CD20抗体是人源化的2H7抗体。
14.权利要求1-13中任一项的应用，其中所述治疗有效量为400mg-1500mg。
15.权利要求1-14中任一项的应用，其中所述治疗有效量为400mg。
16.权利要求1-15中任一项的应用，其中所述治疗有效量为1000mg。
17.权利要求1-16中任一项的应用，其中所述治疗有效量为1500mg。
18.权利要求1-17中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体选自由下列各项组成的组：2H7变体A，B和I，其分别包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7，8和15的全长重链，或其片段。
19.权利要求1-18中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体为2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
20.权利要求1-17中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体结合于与下述物质结合的表位基本上相同的表位：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
21.权利要求1-17中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体选自由下列各项组成的组：2H7变体C，D，F，G，和H，其分别包括SEQ IDNO：9的全长L链和SEQ ID NO：10，11，12，13，和14的全长H链，或其片段。
22.权利要求1-18中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体是2H7变体B，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：8的全长H链，或其片段。
23.权利要求1-17和21中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体是2H7变体C，其包括SEQ ID NO：9的全长L链和SEQ ID NO：10的全长H链，或其片段。
24.权利要求1-17中任一项的应用，其中所述抗体是嵌合抗体利妥昔单抗。
25.权利要求1-17中任一项的应用，其中所述CD20抗体是人抗体HUMAX-CD20TM。
26.权利要求1-25中任一项的应用，其中所述CD20抗体用于与选自由下列各项组成的组的药物联合施用：非甾类抗炎药(NSAIDs)，止痛剂，糖皮质类固醇，环磷酰胺，阿达木单抗，来氟米特，英利昔单抗，依那西普，奥法木单抗，托珠单抗，AME-133，Immu-106，和COX-2抑制剂。
27.权利要求1-26中任一项的应用，其用于包括第二治疗剂的施用。
28.权利要求1-27中任一项的应用，其中所述第二治疗剂是免疫抑制剂。
29.权利要求1-28中任一项的应用，其中所述第二治疗剂是甲氨蝶吟。
30.权利要求1-29中任一项的应用，其中甲氨蝶呤的使用是用于以10-25mg/周的剂量施用。
31.权利要求1-30中任一项的应用，其中所述应用包括在施用所述CD20抗体之前施用1-6次DMARDS。
32.权利要求1-31中任一项的应用，其中所述应用在施用所述CD20抗体之前不包括类固醇治疗。
33.CD20抗体在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用，其中所述药物用于以所述抗体剂量为400mg-1500mg的单次治疗有效的静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
34.权利要求33的应用，其中所述CD20抗体是嵌合的、人源化的或人的单克隆抗体。
35.权利要求33-34中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体选自由下列各项组成的组：2H7变体A，B和I，其分别包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7，8和15的全长重链，或其片段。
36.权利要求33-35中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体为2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
37.权利要求33-34中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体结合与与下述物质结合的表位基本相同的表位：2H7变体A，其包括SEQID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
38.权利要求33-34中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体选自由下列各项组成的组：2H7变体C，D，F，G，和H，其分别包括SEQ IDNO：9的全长L链和SEQ ID NO：10，11，12，13，和14的全长H链，或其片段。
39.权利要求33-35中任一项的应用，其中所述人源化的CD20抗体是2H7变体B，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：8的全长H链，或其片段。
40.权利要求38的应用，其中所述人源化的CD20抗体是2H7变体C，其包括SEQ ID NO：9的全长L链和SEQ ID NO：10的全长H链，或其片段。
41.权利要求33-34中任一项的应用，其中所述抗体是嵌合抗体利妥昔单抗。
42.权利要求33-41中任一项的应用，其中所述施用之后至少4个月不进行第二次CD20抗体施用。
43.权利要求33-42中任一项的应用，其中施用剂量为400mg的CD20抗体。
44.权利要求33-42中任一项的应用，其中施用剂量为1000mg的CD20抗体。
45.权利要求33-42中任一项的应用，其中施用剂量为1500mg的CD20抗体。
46.下述物质：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQID NO：7的全长H链，或其片段在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用，其中所述药物用于以所述抗体剂量为400mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
47.下述物质：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQID NO：7的全长H链，或其片段在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用，其中所述药物用于以所述抗体剂量为1000mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
48.下述物质：2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQID NO：7的全长H链，或其片段在制备用于治疗活动期类风湿性关节炎(RA)的药物中的应用，其中所述药物用于以所述抗体剂量为1500mg的单次治疗有效静脉内(i.v.)输注的形式施用给人患者。
49.权利要求46-48中任一项的应用，其中所述施用之后至少4个月不进行第二次CD20抗体施用。
50.制品，其包括：(a)容器，其包括CD20拮抗剂；和(b)包装插页，其具有用于治疗人受试者中的自体免疫疾病的使用说明，其中所述使用说明指示所述受试者以单次静脉内输注的形式施用完全治疗有效量的CD20拮抗剂。
51.权利要求51的制品，其中所述CD20拮抗剂是嵌合的、人源化的或人CD20单克隆抗体。
52.权利要求50-51中任一项的制品，其中所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
53.权利要求50-52中任一项的制品，其中所述CD20拮抗剂是CD20抗体2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
54.权利要求50-53中任一项的制品，其中所述使用说明指示完全治疗有效量为400mg-1500mg。
55.制品，其包括：(a)容器，其包括CD20抗体；和(b)包装插页，其具有用于治疗人受试者中的类风湿性关节炎的使用说明，其中所述使用说明指示所述受试者以单次静脉内输注的形式施用400mg-1500mg完全治疗有效量的CD20抗体。
56.权利要求56的制品，其中所述CD20抗体是人源化的2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
57.权利要求55-56中任一项的制品，其中所述人源化的2H7变体A以20mg/ml抗体配制在pH 5.8的10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，和注射用无菌水中。
58.药物制剂，其包括以适用于一次静脉内施用的形式存在的完全有效量的CD20抗体。
59.权利要求58的药物制剂，其中所述CD20抗体是人源化2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
60.权利要求58-59中任一项的药物制剂，其中所述有效量为400mg-1500mg。
61.权利要求58-60中任一项的药物制剂，其中所述CD20抗体人源化2H7变体A，其包括SEQ ID NO：6的全长L链和SEQ ID NO：7的全长H链，或其片段。
62.权利要求58-61中任一项的药物制剂，其中所述人源化2H7变体A以20mg/ml抗体配制在pH 5.8的10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，和注射用无菌水中。
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