发明内容:
本发明的目的是提供一种美拉诺坦-II的固相合成工艺。解决现有成环多肽原料难以合成或去保护条件苛刻的问题,本发明的任务是:选择一组保护基团组合,使其满足:(1)在多肽合成中具有稳定性;(2)原料比较容易制备;(3)同时,所选用的保护基团可以在比较温和的条件切除。本发明的技术方案为:一种美拉诺坦-II的固相合成工艺,其合成工艺步骤如下:以Fmoc-LinkerAmide AM Resin为起始树脂,通过Fmoc/tBu固相多肽合成的方法将Fmoc保护的氨基酸逐个连上,其中Asp用的是Fmoc-Asp(OMe)-OH,Lys用的是Fmoc-Lys(Tfa)-OH,其它氨基酸分别为Fmoc-Nle-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Hi s(Trt)-OH,最后脱掉Fmoc,用乙酸酐与吡啶进行乙酰化,然后用NaOH的水与有机溶剂的混合液去掉Asp上的甲酯以及Lys上的三氟乙酰基团,通过缩合剂在树脂上直接成环,最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇的混合溶液将肽从树脂上切下,得到的粗品,经制备型HPLC纯化,转醋酸盐后,冷冻干燥得到醋酸美拉诺坦-II。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义:
Fmoc:芴甲氧羰基
tfa:三氟乙酰基
HOBt:1-羟基苯骈三唑
Phe:苯丙氨酸
Asp:天冬氨酸
Trp:色氨酸
Nle:正亮氨酸
Lys:赖氨酸
Arg:精氨酸
His:组氨酸
Trt:三苯甲基
Me:甲基
Pbf:2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基
Linker:连接剂
HBTU:苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯
HATU:O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt:1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DIEA:二异丙基乙胺
DIC:N,N’-二异丙基碳二亚胺
DMF:N,N-二甲基酰胺
Piperidine:六氢吡啶
Ac2O:醋酸酐
pyridine:吡啶
Collidine:2,3,5-三甲基吡啶
Boc:叔丁氧羰基
Amide AM Resin:氨甲基树脂
TFA:三氟醋酸
EDT:乙二硫醇
NaOH:氢氧化钠
MeOH:甲醇
CH2Cl2:二氯甲烷
HPLC:(Varian 210高效液相色谱仪柱子:Vydac C18 120A[A上面有个O]25*300mm)
Fmoc-Linker Amide AM Resin:Fmoc-Linker氨甲基树脂
Fmoc-AA:Fmoc保护的氨基酸
合成路线如下:
从Fmoc-Linker Amide AM Resin开始,通过Fmoc-AA/HBTU/HOBt/DIEA的方法,脱帽用20%Piperidine的DMF,依次将Fmoc-Lys(Tfa)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OMe)-OH,Fmoc-Nle-OH连到树脂上,然后进行乙酰化,然后用1-2NNaOH的水溶液与二氧六环(1∶1-1∶4体积比)反应2-12小时,水解掉Lys侧链上的tfa以及Asp侧链上的甲酯,树脂洗涤后,通过缩合剂在树脂上直接成环。我们选用了三种缩合试剂进行成环的研究分别是DIC,HBTU,HATU,缩合的时间2-4小时。最后用6-10ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5,为体积比)的混合液将肽从树脂上切下,得到的粗品经过HPLC的纯化得到HPLC为98%以上的美拉诺坦-II。经过我们的实验发现在水解去保护时用1N NaOH与二氧六环1∶3(体积比)反应2-12小时可以完全反应,最后成环时DIC成环的效果不佳,而HATU的成环是最好的,时间3小时就可以完成,检验反应的情况可以通过树脂的Kasier test来判断,树脂颜色从紫蓝色变为无色或淡黄色为反应完全。在小样的基础上我们也进行了放大合成,同样取得良好的纯度与收率,所以此方法也可以用于大规模美拉诺坦-II的生产。
本发明的有益效果是:我们选择Fmoc-Lys(Tfa)-OH,Fmoc-Asp(OMe)-OH作为保护氨基酸的组合,一方面此原料比较容易合成,原料也比较便宜,另一方面,它们可以通过NaOH非常方便的同时去除。而且成环反应是在树脂上进行,简单并且专一。在缩合反应中我们发现HATU作为缩合剂成环效果是最好的。
具体实施方式:
实施工艺中仪器和试剂的选用:
HPLC:PE200-785A
ESI:PE Mariner API-TOF
恒温摇床:HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)
其它试剂均为市售分析试剂
CF3COOH:中国医药(集团)上海化学试剂公司
苯甲硫醚:购于Acros
二硫乙醇:购于TCI
接肽中所用试剂全部经过无水MgSO4干燥处理
Fmoc-Linker Amide AM Resin 0.36mmol/g
Fmoc-Lys(Tfa)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OMe)-OH,Fmoc-Nle-OH 98%以上
HBTU,HOBt,DIC,HOAt,HATU 99%以上
以上原料由吉尔生化(上海)有限公司提供。
文中的%含量均指原料的纯度。
1、直链肽树脂的合成
Ac-Nle-Asp(OMe)-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Tfa)-Linkeramide AM Resin的合成
取3g Fmoc-Linker Amide AM Resin 0.36mmol/g放入接肽瓶中,加24ml 20%piperidine(DMF)振荡5min,抽干。再加24ml 20%DMF振荡15min,然后抽干,用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,然后依次接Fmoc-Lys(Tfa)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OMe)-OH,Fmoc-Nle-OH,用3.24mmol的Fmoc-AA/HBTU/HOBt/DIEA(1∶1∶1∶2,为体积比)缩合,通过Kasier test检验缩合反应的情况,脱Fmoc用20%DMF,脱2次,第一次5分钟,第二次15分钟。
最后通过醋酸酐/吡啶/DMF(1∶1∶2,为体积比)24毫升反应2小时进行乙酰化。树脂经过用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,乙醚洗三次,干燥。得5.2克树脂。
取0.2克上述树脂通过三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5,为体积比)切割2小时,乙醚沉淀,洗涤。
得产物Ac-Nle-Asp(OMe)-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Tfa)-NH2
分子量:1152.22 ESI:1153.13(M+)577.36(M++2H)HPLC:73.57%
2.水解反应合成
Ac-Nle-Asp-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-Linker amide AM Resin
实例一:
将步骤1得到的树脂1克加入到接肽瓶中,加入10ml的2N NaOH/二氧六环(1∶4,为体积比)在室温下反应4小时,树脂用DMF/水(1∶1,为体积比)洗三次,DMF洗三次,甲醇洗三次,2%冰醋酸/甲醇(1∶1,为体积比)洗三次,甲醇洗三次,二氯甲烷洗三次。Kaiser test树脂为蓝紫色。
取一半树脂用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5),室温振荡2hr,过滤,用三氟醋酸洗树脂二次,滤液浓缩,加无水乙醚,微黄固体。反复用无水乙醚洗涤,得到粗品Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH296mg。
分子量:1042.22 ESI:1042.74(M+)521.82(M++2H)HPLC:47.63%
实例二:
将步骤1得到的树脂1克加入到接肽瓶中,加入10ml的1N NaOH/二氧六环(1∶1,为体积比)在室温下反应2小时,同实例一的方法得到粗品85mg。ESI:1043.17(M+)HPLC:52.46%
实例三:
将步骤1得到的树脂1克加入到接肽瓶中,加入10ml的1N NaOH/二氧六环(1∶3,为体积比)在室温下反应2小时,同实例一的方法得到粗品102mg。ESI:1043.09(M+)522.54(M++2H)HPLC:67.59%
实例四:
将步骤1得到的树脂2克加入到接肽瓶中,加入20ml的1N NaOH/二氧六环(1∶3,为体积比)在室温下反应2小时,同实例一的树脂洗涤方法得到Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Linker amide AM Resin
3.成环反应合成
实例一:
将步骤2水解反应中实例四中得到的树脂0.6克加入到接肽瓶中,加入DIC0.96ml,0.84克HOBt,Collidine 1.92ml以及5ml的DMF在室温下反应过夜,树脂用DMF洗三次,甲醇洗三次,二氯甲烷洗三次。Kaisertest树脂为淡蓝色。树脂用10毫升三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5,为体积比),室温振荡2hr,过滤,用三氟醋酸洗树脂二次,滤液浓缩,加无水乙醚,微黄固体。反复用无水乙醚洗涤,得到MelanotanII粗品103mg。分子量:1024.22 ESI:1025.11(M+)HPLC:41.27%
实例二:
将步骤2水解反应中实例四中得到的树脂0.6克加入到接肽瓶中,加入HBTU0.31克,0.84克HOBt,Collidine 1.92ml以及5ml的DMF在室温下反应3小时,同步骤3成环反应实例一的方法,Kaiser test树脂为淡蓝色,得MelanotanII粗品97mg。
ESI:1024.84(M+)513.32(M++2H)HPLC:52.78%
实例三:
将步骤2水解反应中实例四中得到的树脂0.6克加入到接肽瓶中,加入HATU0.32克,0.92克HOAt,Collidine 1.92ml以及5ml的DMF在室温下反应3小时,同步骤3成环反应实例一的方法,Kaisertest树脂为无色,得MelanotanII粗品112mg。
ESI:1024.73(M+)513.36(M++2H)HPLC:68.42%
4.大规模合成醋酸美拉诺坦-II:
Fmoc-Linker Amide AM Resin 0.36mmol/g 30g
放入接肽瓶中,加20%DMF振荡5分钟,抽干。再加20%DMF振荡15min,然后抽干,用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,然后依次接Fmoc-Lys(Tfa)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OMe)-OH,Fmoc-Nle-OH,用Fmoc-AA/HBTU/HOBt/DIEA(1∶1∶1∶2,为体积比)缩合过量3倍,脱Fmoc用20%DMF,脱2次,第一次5分钟,第二次15分钟。醋酸酐/吡啶/DMF(1∶1∶2,为体积比)300毫升反应2小时进行乙酰化。树脂经过用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,乙醚洗三次,干燥。
然后在树脂中加入360ml的1N NaOH/二氧六环(1∶3体积比)在室温下反应2小时,树脂用DMF/水(1∶1)洗三次,DMF洗三次,甲醇洗三次,2%冰醋酸/甲醇(1∶1)洗三次,甲醇洗三次,二氯甲烷洗三次。Kaiser test树脂为深蓝紫色。
在树脂中加入14.6克HATU,4.4克HOAt,10ml Collidine以及300ml的DMF在室温下反应3小时,树脂用DMF洗三次,甲醇洗三次,二氯甲烷洗三次。Kaiser test树脂为无色。树脂用500毫升三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶二硫乙醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5,为体积比),室温振荡2hr,过滤,用三氟醋酸洗树脂二次,滤液浓缩,加无水乙醚,微黄固体。反复用无水乙醚洗涤,得到Melanotan II粗品9.5g。ESI:1025.05(M+)513.52(M++2H)HPLC:66.73%
粗品经过制备型HPLC纯化转醋酸盐,冷冻干燥得3.1g醋酸美拉诺坦-II。HPLC 98.64% ESI:1025.16(M+)513.62(M++2H)