CN101151264B

CN101151264B - 喹啉酮甲酰胺化合物的结晶形式

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Publication number: CN101151264B
Application number: CN2006800107676A
Authority: CN
Inventors: 保罗·R·法瑟雷; S·德里克·特纳; 亚当·戈德布卢姆; 罗伯特·晁; 丹尼尔·格诺夫
Original assignee: SHIWAN PHARMACEUTICALS Inc
Current assignee: Theravance Biopharma R&D IP LLC
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2026-04-05
Also published as: US8658671B2; US9402840B2; ZA200708071B; DE602006016586D1; CY1111275T1; IL186023A0; CA2603654A1; HRP20100629T1; SI1874766T1; CN101151264A; AR053208A1; TWI377206B; ES2350495T3; US9126994B2; MX2007012438A; NO20075574L; PT1874766E; EA012115B1; US20160095849A1; ATE479682T1

Abstract

本发明提供一种1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐或其溶剂化物。本发明还提供包含所述结晶盐形式的医药组合物、使用所述结晶盐形式治疗与5HT₄受体活性相关的疾病的方法和用于制备所述结晶盐形式的方法。

Description

喹啉酮甲酰胺化合物的结晶形式

技术领域

本发明涉及可用作5-HT₄受体激动剂的喹啉酮甲酰胺化合物的结晶盐形式。本发明还涉及包含所述结晶化合物的医药组合物、使用所述化合物治疗由5-HT₄受体活性介导的医学病况的方法和可用于制备所述化合物的方法。

背景技术

共同转让的于2004年4月7日申请的美国临时申请案第60/560,076号和2005年4月6日申请的美国专利申请案第11/100,113号中公开新颖的喹啉酮甲酰胺化合物，预期所述化合物可用于治疗胃肠道蠕动减弱的病症。具体说来，在这些申请案中特别公开化合物1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺具有5-HT4激动剂活性。

1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的化学结构如式I所示：

为将这一化合物有效地用作治疗剂，将需要具有可易于生产且具有可接受的化学和物理稳定性的固态盐形式。举例来说，特别需要具有例如在超过约200℃的温度下热稳定并且既不吸湿也不会潮解，由此有利于材料的加工和储存的盐形式。对于增强所生产的产品的纯度和稳定性来说，结晶固体一般优于非晶形形式。

先前尚未对式I化合物的结晶盐形式有所报导。因此，需要一种稳定的式I化合物的结晶盐形式，其不具吸湿性也不会潮解并且展现出优良的热稳定性。

发明内容

本发明提供一种1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐或其溶剂化物。一方面，本发明的结晶盐形式为式I化合物的结晶盐酸盐。另一方面，本发明的结晶盐形式为式I化合物的盐酸盐的结晶水合物。

意外的是，已发现本发明的结晶盐酸盐在大于约200℃的温度下热稳定，并且当在室温下暴露到介于约2％与约90％之间的相对湿度范围时，展现出小于约0.2％的重量改变。此外，当在室温下暴露到高达90％的相对湿度时，本发明的结晶盐酸盐和其水合物都不会潮解。

在其它用途中，预期本发明的结晶盐形式可用于制备用以治疗胃肠道蠕动减弱的病症的医药组合物。因此，在有关其组合物的另一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐或其溶剂化物。

本发明还提供一种治疗与5-HT₄受体活性相关的疾病或病况(例如，胃肠道蠕动减弱的病症)的方法，所述方法包含向哺乳动物投与治疗有效量的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐或其溶剂化物。

在另一方法方面中，本发明提供一种用于制备本发明的结晶盐酸盐的方法，所述方法包含使1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺与盐酸接触以形成反应混合物，并将所述结晶盐酸盐从所述反应混合物中分离。

本发明还提供一种用于疗法中或用作药物的如本文所述的本发明的结晶盐酸盐，以及本发明的结晶盐酸盐用于制备药物、尤其制备用以治疗哺乳动物胃肠道蠕动减弱的病症的药物的用途。

附图说明

可参考随附图式对本发明的各个方面进行说明。

图1绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐的粉末x射线衍射(PXRD)图。

图2绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐的差示扫描量热(DSC)迹线(下部迹线，右侧纵轴)和热重分析(TGA)迹线(上部迹线，左侧纵轴)。

图3绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐的动态吸湿(DMS)迹线。

图4绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐的结晶水合物的粉末x射线衍射(PXRD)图。

图5绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐的结晶水合物的差示扫描量热(DSC)迹线(上部迹线，左侧纵轴)和热重分析(TGA)迹线(下部迹线，右侧纵轴)。

图6绘示本发明的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐的结晶水合物的动态吸湿(DMS)迹线。

具体实施方式

本发明提供一种1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐和其溶剂化物。

定义

当描述本发明的化合物、组合物和方法时，除非另作说明，否则以下术语具有以下含义。

术语“治疗有效量”意谓当投与需要治疗的患者时足以实现治疗的量。

如本文所使用的术语“治疗”意谓对患者(诸如，哺乳动物(尤其人类))的疾病、病症或医学病况的治疗，其包括：

(a)预防所述疾病、病症或医学病况发生，即对患者的预防治疗；

(b)改善所述疾病、病症或医学病况，即消除患者的疾病、病症或医学病况或引起患者的疾病、病症或医学病况的衰退；

(c)抑制所述疾病、病症或医学病况，即减缓或阻止患者的疾病、病症或医学病况的发展；或

(d)缓解患者的疾病、病症或医学病况的症状。

术语“溶剂化物”意谓由一个或一个以上溶质分子(即，本发明的化合物或其医药学上可接受的盐)与一个或一个以上溶剂分子形成的复合物或聚集体。所述溶剂化物通常为具有实质上固定的溶质与溶剂摩尔比的结晶固体。代表性溶剂例如包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等。当溶剂为水时，所形成的溶剂化物特别称为水合物。

如本文所使用的术语“结晶盐酸盐”意谓在晶格中不包括实质上固定摩尔分率的溶剂分子的结晶固体，即不为溶剂化物者。本发明的溶剂化物或尤其水合物将明确标识。

必须注意，除非另作明确说明，否则如说明书和随附权利要求中所使用的单数形式“一”和“所述”可包括复数个参考物。

术语“氨基保护基”意谓适于防止氨基氮发生不合需要的反应的保护基。代表性氨基保护基包括(但不限于)甲酰基；酰基，例如烷酰基，诸如乙酰基；烷氧羰基，诸如叔丁氧羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，诸如苯甲氧基羰基(Cbz)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基，诸如苯甲基(Bn)、三苯甲基(Tr)和1，1-二-(4′-甲氧基苯基)甲基；硅烷基，诸如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)等。

活性剂

本发明盐形式的活性剂、即式I化合物为使用市面有售的AutoNom软件(MDLInformation Systems，GmbH，Frankfurt，Germany)命名的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺。名称(1S，3R，5R)描述与双环系统相关的键的相对定向。所述化合物另外称为N-[(3-内)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-1-(1-甲基乙基)-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉甲酰胺。

本发明的盐形式

一方面，本发明提供结晶1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐。

本发明的结晶盐酸盐通常含有每摩尔当量式I化合物介于约0.8摩尔当量与约1.2摩尔当量之间的盐酸，包括每摩尔当量式I化合物介于约0.9摩尔当量与约1.1摩尔当量之间的盐酸。

盐酸与活性剂的摩尔比可易于通过所属领域技术人员可用的方法测定。举例来说，所述摩尔比可易于通过用硝酸银标准溶液进行滴定来测定。或者，可使用元素分析、¹HNMR和离子色谱法测定摩尔比。

一方面，本发明的结晶盐酸盐可以在选自以下值的2θ值处具有两个或两个以上衍射峰的粉末x射线衍射(PXRD)图为特征：4.41±0.2、8.82±0.2、9.08±0.2、11.21±0.2、14.40±0.2、16.42±0.2、17.35±0.2、17.61±0.2、18.14±0.2、19.04±0.2、19.95±0.2、20.20±0.2、21.23±0.2、22.13±0.2、22.48±0.2、22.83±0.2、24.16±0.2、25.37±0.2、25.56±0.2、26.22±0.2、27.33±0.2、29.08±0.2和29.61±0.2。具体说来，在这一方面中，结晶形式是以在选自14.40±0.2、17.35±0.2、17.61±0.2、19.04±0.2、21.23±0.2和22.13±0.2的2θ值处具有两个或两个以上衍射峰的粉末x射线衍射图为特征。

如粉末x射线衍射领域中众所周知，与相对峰高度相比，PXRD谱的峰位置对于诸如样本制备和仪器几何学细节的实验细节相对不太敏感。因此，一方面，式I化合物的结晶盐酸盐是以峰位置实质上与图1中所示的峰位置一致的粉末x射线衍射图为特征。

本发明的结晶盐酸盐还以如通过其差示扫描量热(DSC)迹线证实的高温热稳定性为特征，如图2所示，所述迹线展现在约230℃到约260℃范围内的吸热型热流量峰值。此外，热重分析(TGA)迹线展示在低于约225℃下无显著热事件。

另一方面，结晶盐酸盐是以其在约758、783、795、802、949、981、1149、1158、1217、1332、1377、1453、1467、1487、1525、1566、1575、1615、1672和3197cm^-1处展示显著吸收谱带的红外吸收光谱为特征。

如图3所示，经证实，式I化合物的结晶盐酸盐具有可逆的吸附/解吸附概况和特别低的吸湿性水平(即，室温下在2％相对湿度到90％相对湿度的湿度范围内小于约0.2％的重量增加)。

此外，已发现，式I化合物的结晶盐酸盐当暴露到高温和高湿度一段较长时间后仍然稳定。举例说来，在40℃和75％相对湿度下储存24周后，HPLC分析展示并无化学降解且DSC、TGA或PXRD结果也不存在任何可检测的改变。

另一方面，本发明提供一种式I化合物的盐酸盐的结晶水合物。

一方面，本发明盐酸盐的结晶水合物是以在选自以下值的2θ值处具有两个或两个以上衍射峰的粉末x射线衍射(PXRD)图为特征：5.30±0.2、7.43±0.2、8.72±0.2、10.52±0.2、13.85±0.2、14.11±0.2、15.80±0.2、15.99±0.2、17.26±0.2、19.53±0.2、20.08±0.2、21.06±0.2、21.48±0.2、21.92±0.2、22.85±0.2、23.91±0.2、25.28±0.2、26.06±0.2、27.34±0.2、27.51±0.2和29.67±0.2。具体说来，在这一方面中，结晶形式是以在选自10.52±0.2、13.85±0.2、15.80±0.2、17.26±0.2和21.06±0.2的2θ值处具有两个或两个以上衍射峰的粉末x射线衍射图为特征。

另一方面，式I化合物的盐酸盐的结晶水合物是以峰位置实质上与图4中所示的峰位置一致的粉末x射线衍射图为特征。

本发明盐酸盐的结晶水合物也是以其差示扫描量热(DSC)迹线为特征，如图5所示，所述迹线展现通过在约225℃到约250℃的范围内结晶熔解所鉴别的吸热型热流量的实质峰，其中在较低温度下具有宽或弱的吸热峰。此外，热重分析(TGA)迹线表明降解温度高于约250℃。

如图6所示，经证实，室温下在约2％相对湿度到约90％相对湿度的整个范围内，式I化合物的盐酸盐的结晶水合物具有可逆的吸附/解吸附特性。结晶水合物在约40％与约75％相对湿度之间展现小于约0.25％的重量增加。

本发明盐形式的这些特性将于下文的实例中进一步说明。

合成程序

活性剂1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺可使用下文实例中所述的程序或使用本申请案背景技术部分中所列的共同让与的美国申请案中所述的程序由容易获得的原材料制备。

为制备本发明的结晶盐酸盐，通常使1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺与约1摩尔当量到约1.5摩尔当量(包括约1摩尔当量到约1.2摩尔当量)的浓盐酸接触。一般来说，这一反应是在约20℃到约80℃范围内的温度下于惰性稀释剂中进行。用于这一反应的适当惰性稀释剂包括(但不限于)乙醇、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、四氢呋哺和其组合。

反应完成后，通过诸如沉淀、浓缩、离心等任何常规方式将本发明的结晶盐从反应混合物中分离。

可通过将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的盐酸盐以高于约50mg/mL的浓度溶解于水中以提供悬浮液，随后可通过常规方式将所得结晶水合物从所述悬浮液中分离，以此来制备结晶水合物。

医药组合物

本发明的结晶盐酸盐形式通常是以医药组合物的形式投与患者。所述医药组合物可通过任何可接受的投药途径投与患者，所述投药途径包括(但不限于)经口、经直肠、经阴道、经鼻、吸入、经局部(包括透皮)和不经肠投药模式。

因此，在有关其组合物的一个方面中，本发明涉及一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂或赋形剂和治疗有效量的式I化合物的结晶盐酸盐。视情况，所述医药组合物可视需要含有其它治疗剂和/或调配剂。

本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明的结晶盐。通常，所述医药组合物将含有约0.1重量％到约95重量％的活性剂，包括约1重量％到约70重量％、诸如约5重量％到约60重量％的活性剂。

可将任何常规载剂或赋形剂用于本发明的医药组合物中。对特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂组合的选择将视用于治疗特定患者或医学病况或疾病状态类型的投药模式而定。从这一点看，用于特定投药模式的适当医药组合物的制备处于医药技术领域技术人员的技术范围内。此外，所述组合物的成分是从例如Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis，MO63178购得。借助进一步说明，常规调配技术描述于Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第20版，Lippincott Williams&White，Baltimore，Maryland(2000)；和H.C.Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，LippincottWilliams&White，Baltimore，Maryland(1999)中。

可用作医药学上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)下述材料：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，诸如微晶纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于医药组合物中的其它无毒可相容物质。

本发明的医药组合物通常是通过将本发明的化合物与医药学上可接受的载剂和一种或一种以上可选成分充分且紧密混合或掺合来制备。如果必需或需要，那么随后可使用常规程序和设备使所得均匀掺合的混合物成形为或装载入片剂、胶囊、丸剂等。

优选将本发明的医药组合物包装成单位剂型。术语“单位剂型”是指适于向患者给药的物理上分散的单位，即各单位都含有经计算以单独或与一个或一个以上其它单位组合产生所需治疗作用的预定量的活性剂。举例来说，所述单位剂型可为胶囊、片剂、丸剂等。

在优选实施例中，本发明的医药组合物适于经口投与。经口投与的适当医药组合物可为胶囊、片剂、丸剂、糖锭、扁囊剂、糖衣丸、粉末、颗粒剂的形式；或为于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式；或为水包油型或油包水型液体乳液的形式；或为酏剂或糖浆的形式等；其各自含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。

当打算以固体剂型(即，以胶囊、片剂、丸剂等形式)经口投药时，本发明的医药组合物通常将包含作为活性成分的本发明的化合物，和一种或一种以上医药学上可接受的载剂，诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙。视情况或另外，所述剂型也可包含：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；(5)溶解延缓剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如十六烷醇和/或单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和/或膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；(10)着色剂；和(11)缓冲剂。

本发明的医药组合物中也可存在脱模剂、润湿剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。医药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。用于片剂、胶囊、丸剂等的涂布剂包括用于肠包衣的涂布剂，诸如邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、偏苯三酸乙酸纤维素(CAT)、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)等。

视需要，也可使用例如各种比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体调配本发明的医药组合物以提供活性成分的缓释或控释。

此外，本发明的医药组合物可视情况含有遮光剂，并且可经调配从而使其仅或优先在胃肠道某部分中视情况以延缓的方式释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。适当时，活性成分也可为与一种或一种以上上述赋形剂一起微封装的形式。

经口投与的适当液体剂型包括(借助说明)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。所述液体剂型通常包含活性成分和诸如水或其它溶剂的惰性稀释剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨聚糖脂肪酸酯和其混合物。除活性成分外，悬浮液还可含有悬浮剂，诸如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶和其混合物。

或者，本发明的医药组合物经调配以供吸入投药。通过吸入投与的适当医药组合物通常将为气雾剂或粉末的形式。所述组合物一般是使用众所周知的传递装置投与，诸如定计量吸入器、干粉吸入器、喷雾器或类似传递装置。

当使用加压容器通过吸入投与时，本发明的医药组合物通常将包含活性成分和适当推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。

此外，医药组合物可为包含本发明化合物的胶囊或药筒(例如由明胶制成)和适于用于粉末吸入器中的粉末的形式。适当粉末基质包括(例如)乳糖或淀粉。

本发明的化合物亦可使用已知的透皮传递系统和赋形剂透皮投与。举例来说，可将本发明的化合物与渗透增强剂(诸如丙二醇、聚乙二醇单月桂酸酯、氮杂环烷-2-酮等)混合且并入贴片或类似传递系统中。可视需要将包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂的其它赋形剂用于所述透皮组合物中。

以下调配物说明本发明的代表性医药组合物：

调配物实例A

经口投与的硬质明胶胶囊制备如下：

成分	量
		本发明的盐乳糖(经喷雾干燥)硬脂酸镁	50mg200mg10mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后将其装载于硬质明胶胶囊中(每粒胶囊260mg组合物)。

调配物实例B

经口投与的硬质明胶胶囊制备如下：

成分	量
		本发明的盐淀粉微晶纤维素硬脂酸镁	20mg89mg89mg2mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后使其通过45号筛目的美国标准筛网(No.45mesh U.S.sieve)，并且将其装载于硬质明胶胶囊中(每粒胶囊200mg组合物)。

调配物实例C

经口投与的胶囊制备如下：

成分	量
		本发明的盐聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯淀粉粉末	10mg50mg250mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后将其装载于明胶胶囊中(每粒胶囊310mg组合物)。

调配物实例D

经口投与的片剂制备如下：

成分	量
		本发明的盐淀粉微晶纤维素聚乙烯吡咯烷酮(10重量％的水溶液)羧甲基淀粉钠硬脂酸镁滑石	5mg50mg35mg4mg4.5mg0.5mg1mg

代表性程序：使活性成分、淀粉和纤维素通过45号筛目的美国标准筛网并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，且随后使所述混合物通过14号筛目的美国标准筛网。在50-60℃下干燥如此得到的颗粒并使其通过18号筛目的美国标准筛网。然后将羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石(先前已通过60号筛目的美国标准筛网)加到所述颗粒中。混合后，在制片机上压制混合物以得到重100mg的片剂。

调配物实例E

经口投与的片剂制备如下：

成分	量
		本发明的盐微晶纤维素烟雾状二氧化硅硬脂酸	25mg400mg10mg5mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后进行压制以形成片剂(每片片剂400mg组合物)。

调配物实例F

经口投与的单刻痕片剂制备如下：

成分	量
		本发明的盐玉米淀粉交联羧甲基纤维素钠乳糖硬脂酸镁	15mg50mg25mg120mg5mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且进行压制以形成单刻痕片剂(每片片剂215mg组合物)。

调配物实例G

经口投与的悬浮液制备如下：

成分	量
		本发明的盐富马酸氯化钠对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸丙酯砂糖山梨糖醇(70％溶液)Veegum k(Vanderbilt Co.)调味剂着色剂蒸馏水	0.1g0.5g2.0g0.15g0.05g25.5g12.85g1.0g0.035mL0.5mg补足到100mL

代表性程序：将所述成分混合以形成每10mL悬浮液含有10mg活性成分的悬浮液。

调配物实例H

经吸入投与的干粉制备如下：

成分	量
		本发明的盐乳糖	1.0mg25mg

代表性程序：将活性成分微粉化且随后与乳糖掺合。然后将这一经掺合混合物装载于明胶吸入药筒中。所述药筒中的内容物是使用粉末吸入器投与。

调配物实例I

通过在定剂量吸入器中吸入而投与的干粉制备如下：

代表性程序：通过将10g平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒状活性化合物分散于由0.2g卵磷脂溶解于200mL去矿物质水中所形成的溶液中来制备含有5重量％本发明的盐和0.1重量％卵磷脂的悬浮液。对所述悬浮液进行喷雾干燥并且使所得物质微粉化成平均直径小于1.5μm的颗粒。将所述颗粒装载于具有加压1，1，2，2-四氟乙烷的药筒中。

调配物实例J

可注射调配物制备如下：

成分	量
		本发明的盐乙酸钠缓冲溶液(0.4M)HCl(0.5N)或NaOH(0.5N)水(经蒸馏，无菌)	0.2g40mL补足到pH4补足到20mL

代表性程序：将上述成分掺合并且使用0.5N HCl或0.5N NaOH将pH值调节到4±0.5。

调配物实例K

经口投与的胶囊制备如下：

成分	量
		本发明的盐微晶纤维素(Avicel PH 103)硬脂酸镁	4.05mg259.2mg0.75mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后将其装载于明胶胶囊(1号尺寸，白色，不透明)中(每粒胶囊264mg组合物)。

调配物实例L

经口投与的胶囊制备如下：

成分	量
		本发明的盐微晶纤维素(Avicel PH103)硬脂酸镁	8.2mg139.05mg0.75mg

代表性程序：将所述成分充分掺合且随后将其装载于明胶胶囊(1号尺寸，白色，不透明)中(每粒胶囊148mg组合物)。

效用

式I化合物1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺为5-HT₄受体激动剂，且因此，预期本发明的式I化合物的结晶盐形式可用于治疗由5-HT₄受体介导或与5-HT₄受体活性相关的医学病况，即通过用5-HT₄受体激动剂治疗可得以改善的医学病况。所述医学病况包括(但不限于)肠易激综合症(IBS)、慢性便秘、功能性消化不良、胃排空延迟、胃食管返流疾病(GERD)、胃轻瘫、糖尿病性和特发性胃病、术后肠梗阻、假性肠梗阻和药物诱导的运输延缓。此外，已提出，一些5-HT₄受体激动剂化合物可用于治疗中枢神经系统病症，包括认知病症、行为病症、情绪病症和自主功能控制病症。

具体来说，本发明的盐形式会增加胃肠(GI)道蠕动且因此预期其可用于治疗哺乳动物(包括人类)的由蠕动减弱引起的胃肠道病症。所述胃肠蠕动病症包括(举例来说)慢性便秘、便秘型肠易激综合症(C-IBS)、糖尿病性和特发性胃轻瘫和功能性消化不良。

因此，一方面，本发明提供一种增加哺乳动物胃肠道蠕动的方法，所述方法包含向所述哺乳动物投与治疗有效量的包含医药学上可接受的载剂和本发明的结晶盐的医药组合物。

当用于治疗胃肠道蠕动减弱病症或由5-HT₄受体介导的其它病况时，本发明的盐形式通常将以单一每日剂量或以每日多剂量经口投与，但也可使用其它投药形式。每次给药所投与的活性剂的量或每日所投与的总量通常将由医师根据相关情况确定，所述情况包括待治疗的病况、所选择的投药途径、所投与的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。

用于治疗胃肠道蠕动减弱病症或由5-HT₄受体介导的其它病症的适当剂量预期在约0.0007毫克/千克/天到约20毫克/千克/天的活性剂、包括约0.0007毫克/千克/天到约1毫克/千克/天的范围内。对于一个平均体重为70千克的人来说，这将为约每天0.05毫克活性剂到约每天70毫克活性剂的量。

在本发明的一个方面中，本发明的盐形式用于治疗慢性便秘。当用于治疗慢性便秘时，本发明的盐通常将以单一每日剂量或每天多剂量经口投与。用于治疗慢性便秘的剂量预期将在约每天0.05毫克到约每天70毫克的范围内。

在本发明的另一方面中，将本发明的盐形式用于治疗肠易激综合症。当用于治疗便秘型肠易激综合症时，本发明的盐通常将以单一每日剂量或以每天多剂量经口投与。预期用于治疗便秘型肠易激综合症的剂量将在约每天0.05毫克到约每天70毫克的范围内。

在本发明的另一方面中，将本发明的盐形式用于治疗糖尿病性和特发性胃轻瘫。当用于治疗糖尿病性和特发性胃轻瘫时，本发明的盐通常将以单一每日剂量或以每天多剂量经口投与。预期用于治疗糖尿病性胃轻瘫的剂量将在约每天0.05毫克到约每天70毫克的范围内。

在本发明的另一方面中，将本发明的盐形式用于治疗功能性消化不良。当用于治疗功能性消化不良时，本发明的化合物通常将以单一每日剂量或以每天多剂量经口投与。预期用于治疗功能性消化不良的剂量将在约每天0.05毫克到约每天70毫克的范围内。

本发明还提供一种治疗患有与5-HT₄受体活性相关的疾病或病况的哺乳动物的方法，所述方法包含向所述哺乳动物投与治疗有效量的本发明的盐形式或包含本发明盐形式的医药组合物。

如上文所述，本发明的盐形式为5-HT₄受体激动剂。因此，本发明另外提供一种使哺乳动物的5-HT₄受体激动的方法，所述方法包含向所述哺乳动物投与本发明的盐形式。

本发明的盐酸盐形式的这些特性以及效用可使用所属领域技术人员众所周知的各种活体外和活体内检定证实。代表性检定将于以下实例中予以详细描述。

实例

提供以下合成和生物学实例以说明本发明，且不应将其解释为以任何方式限制本发明的范围。在以下实例中，除非另作说明，否则以下缩写将具有以下含义。下文未定义的缩写将具有其通常所接受的含义。

Boc＝叔丁氧羰基

(Boc)₂O＝二碳酸二叔丁酯

DCM＝二氯甲烷

DMF＝N，N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲亚砜

EtOAc＝乙酸乙酯

mCPBA＝间氯苯甲酸

MeCN＝乙腈

MTBE＝叔丁基甲基醚

PyBop＝苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

R_f＝保留因子

RT＝室温

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

试剂(包括仲胺)和溶剂都是从贸易供应商(Aldrich、Fluka、Sigma等)购得，并且不经进一步纯化即使用。除非另作说明，否则反应是在氮气氛下进行。反应混合物的进程是通过薄层色谱(TLC)、分析型高效液相色谱(分析型HPLC)和质谱监测，所述技术的细节将于下文且在特定反应实例中单独提供。如在各反应中特别描述对反应混合物进行处理；通常，所述混合物是通过萃取和诸如温度和溶剂依赖性结晶和沉淀的其它纯化方法予以纯化。此外，反应混合物通常通过制备型HPLC进行纯化。反应产物通常是通过质谱和¹H-NMR谱表征。对于NMR测量来说，将样本溶解于氘化溶剂(CD₃OD、CDCl₃或DMSO-d₆)中，并且用Varian Gemini 2000仪器(300MHz)在标准观察条件下获取¹H-NMR谱。化合物的质谱鉴别是用Applied Biosystems(Foster City，CA)型API 150EX仪器或Agilent(Palo Alto，CA)型1100 LC/MSD仪器通过电喷雾电离方法(ESMS)进行。含水量是使用Brinkmann(Westbury，NY)Metrohm Karl Fischer 813型库仑计通过Karl Fischer滴定来测定。

制备1：(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯

a.8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮的制备

搅拌下，将浓盐酸(30mL)加到2，5-二甲氧基四氢呋喃(82.2g，0.622mol)于水(170mL)中的不均匀溶液中。在冷却到0℃(冰浴)的单独烧瓶中，将浓盐酸(92mL)缓慢加到苯甲胺(100g，0.933mol)于水(350mL)中的溶液中。将2，5-二甲氧基四氢呋喃溶液搅拌约20分钟，用水(250mL)稀释且随后加入苯甲胺溶液，接着加入1，3-丙酮二甲酸(100g，0.684mol)于水(400mL)中的溶液，且然后加入水(200mL)中的磷酸氢二钠(44g，0.31mol)。使用40％NaOH将pH值调到pH1到pH约4.5。将所得混浊且呈浅黄色的溶液搅拌整夜。随后使用50％盐酸将溶液由pH7.5酸化到pH3，加热到85℃且搅拌2小时。将溶液冷却到室温，使用40％NaOH将其碱化到pH12并且用二氯甲烷(3×500mL)进行萃取。将已合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤并且在减压下浓缩，得到呈褐色粘性油状物的粗标题中间物。

0℃下向粗中间物于甲醇(1000mL)中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(74.6g，0.342mol)。使溶液温到室温并搅拌整夜。减压移除甲醇并且将所得油状物溶解于二氯甲烷(1000mL)中。将中间物萃取到1M H₃PO₄(1000mL)中并用二氯甲烷(3×250mL)洗涤。使用NaOH水溶液将水层碱化到pH12，并且用二氯甲烷(3×500mL)萃取。将已合并的有机层干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩，得到呈浅褐色粘性油状物的标题中间物。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)7.5-7.2(m，5H，C₆H₅)，3.7(s，2H，CH₂Ph)，3.45(宽单峰，2H，CH-NBn)，2.7-2.6(dd，2H，CH₂CO)，2.2-2.1(dd，2H，CH₂CO)，2.1-2.0(m，2H，CH₂CH₂)，1.6(m，2H，CH₂CH₂)。C₁₄H₁₇NO的(m/z)：[M+H]⁺计算值216.14；实验值216.0。

b.3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备

向8-苯甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(75g，0.348mol)于EtOAc(300mL)中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(83.6g，0.383mol，1.1eq)于EtOAc(300mL)中的溶液。在氮气流下，将所得溶液和漂洗液(100mL EtOAc)加入含有23g氢氧化钯(以干重计20重量％Pd/碳，用水约50％润湿，例如Pearlman催化剂)的1L Parr氢化容器中。使反应容器脱气(交替真空与N₂五次)并且加压到60psi的H₂气。将反应溶液搅动2天并且视需要再充入H₂以将H₂压力保持在60psi，直到当通过硅胶薄层色谱监测时反应完成为止。随后，使黑色溶液滤过Celite

垫并且减压浓缩，得到呈黄色到橙色粘性油状物的定量标题中间物。不经进一步处理即将其用于下一步骤中。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)4.5(宽峰，2H，CH-NBoc)，2.7(宽峰，2H，CH₂CO)，2.4-2.3(dd，2H，CH₂CH₂)，2.1(宽峰m，2H，CH₂CO)，1.7-1.6(dd，2H，CH₂CH₂)，1.5(s，9H，(CH₃)₃COCON))。

c.(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的制备

在机械搅拌器搅拌下，于N₂气流下向前一步骤中的产物(75.4g，0.335mol)于甲醇(1L)中的溶液中加入甲酸铵(422.5g，6.7mol)、水(115mL)和65g钯/活性碳(以干重计10％，用水约50％润湿；Degussa E101NE/W型)。24小时和48小时后，每次加入另一份甲酸铵(132g，2.1mol)。如通过分析型HPLC所监测当反应进程停止后，加入Celite

(＞500g)并且过滤所得稠悬浮液，且随后用甲醇(约500mL)漂洗所收集的固体。合并滤液并且进行减压浓缩直到移除所有甲醇为止。接着用1M磷酸将所得混浊两相溶液稀释到最终体积为约1.5到2.0L(pH2)，并用二氯甲烷(3×700mL)进行洗涤。使用40％NaOH水溶液将水层碱化到pH12，并且用二氯甲烷(3×700mL)进行萃取。将已合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并且通过旋转蒸发、随后高真空进行浓缩，得到52g(70％)呈白色到浅黄色固体状的标题中间物，其通常为N-Boc-内-3-氨基莨菪烷(tropane)。基于¹H-NMR分析，产物中内型胺比外型胺的异构体比率＞99(通过分析型HPLC，＞96％纯度)。¹HNMR(CDCl₃)δ(ppm)4.2-4.0(宽峰d，2H，CHNBoc)，3.25(t，1H，CHNH₂)，2.1-2.05(m，4H)，1.9(m，2H)，1.4(s，9H，(CH₃)₃OCON)，1.2-1.1(宽峰，2H)。C₁₂H₂₂N₂O₂的(m/z)：[M+H]⁺计算值227.18；实验值227.2。分析型HPLC(等度方法；经5分钟2∶98(A∶B)到90∶10(A∶B))：滞留时间＝2.14min。

制备2：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸

首先，在室温下，将丙酮(228.2mL，3.11mol)加到经搅拌的2-氨基苯甲醇(255.2g，2.07mol)和乙酸(3.56mL，62mmol)于水(2L)中的悬浮液中。4小时后，将悬浮液冷却到0℃且再搅拌2.5小时，且随后过滤。将固体收集并且用水进行洗涤，且将潮湿固体冷却并通过冻干法干燥，得到呈灰白色固体状的2，2-二甲基-1，4-二氢-2H-苯并[1，3]噁嗪(332.2g，98％)。¹H NMR(CDCl₃；300MHz)：1.48(s，6H，C(CH ₃)₂)，4.00(bs，1H，NH)，4.86(s，2H，CH ₂)，6.66(d，1H，ArH)，6.81(t，1H，ArH)，6.96(d，1H，ArH)，7.10(t，1H，ArH)。

0℃下，使2，2，-二甲基-1，4-二氢-2H-苯并[1，3]噁嗪(125g，0.77mol)于THF(1L)中的溶液滤过闪烁漏斗，且随后经2.5小时的时间经由加料漏斗将其逐滴加入经搅拌的1.0 LiAlH₄于THF(800mL)中的溶液中。0℃下，通过经1.5小时时间逐份缓慢加入Na₂SO₄·10H₂O(110g)中止反应。将反应混合物搅拌整夜，过滤并且用THF充分洗涤固体盐。减压浓缩滤液，得到呈黄色油状物的2-异丙基氨基苯甲醇(120g，95％)。¹H NMR(CDCl₃；300MHz)：1.24 (d，6H，CH(CH ₃)₂)，3.15(bs，1H，OH)，3.61(七重峰，1H，CH(CH₃)₂)，4.57(s，2H，CH ₂)，6.59(t，1H，ArH)，6.65(d，1H，ArH)，6.99(d，1H，ArH)，7.15(t，1H，ArH)。

将二氧化锰(85％，182.6g，1.79mol)加到经搅拌的2-异丙基氨基苯甲醇(118g，0.71mol)于甲苯(800mL)中的溶液中，并且将反应混合物加热到117℃历时4小时。将反应混合物冷却到室温历时整夜且随后使其滤过用甲苯进行洗脱的Celite垫。减压浓缩滤液，得到呈橙色油状物的2-异丙基氨基苯甲醛(105g，90％)。¹H NMR(CDCl₃；300MHz)：1.28(d，6H，CH(CH ₃)₂)，3.76(七重峰，1H，CH(CH₃)₂)，6.65(t，1H，ArH)，6.69(d，1H，ArH)，7.37(d，1H，ArH)，7.44(t，1H，ArH)，9.79(s，1H，CHO)。

0℃下，将2，2-二甲基-[1，3]二噁烷-4，6-二酮(通常称为Meldrum酸)(166.9g，1.16mol)加到经搅拌的2-异丙基氨基苯甲醛(105g，0.64mol)、乙酸(73.6mL，1.29mol)和乙二胺(43.0mL，0.64mol)于甲醇(1L)中的溶液中。在0℃下将反应混合物搅拌1小时且随后在室温下搅拌整夜。过滤所得悬浮液并且用甲醇洗涤固体且进行收集，得到呈灰白色固体状的标题中间物1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸(146g，98％)。¹H NMR(CDCl₃；300MHz)：1.72(d，6H，CH(CH ₃)₂)，5.50(bs，1H，CH(CH₃)₂)，7.44(tArH)，7.75-7.77(m，2H，ArH)，7.82(d，1H，ArH)，8.89(s，1H，CH)。

实例1：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的合成

a.(1S，3R，5R)-3-[1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-羰基)氨基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷 -8-甲酸叔丁酯的制备

在3L烧瓶中，将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸(112.4g，0.486mol，1.1eq)悬浮于甲苯(1L)中。将混合物加热到85℃且经70分钟逐滴加入亚硫酰氯(86.74g，0.729mol)。搅拌下，在95℃下将混合物加热1.5小时，且随后将其冷却到室温。

在单独的12L烧瓶中，将(1S，3R，5R)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(100.0g，0.442mol，1eq)悬浮于甲苯(1L)中并且加入3M NaOH(4eq)。在室温下将混合物搅拌10分钟且随后将其冷却到约5℃。搅拌下，经40分钟缓慢加入酸性氯化物溶液，同时保持内部温度低于10℃。在3-5℃下将混合物搅拌30分钟且使各层分离整夜。收集甲苯层(约2.5L)，通过旋转蒸发将其浓缩到约一半(约1.2L)且直接将其用于下一步骤中。

b.1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的制备

搅拌下，在20℃下经20分钟向前一步骤中制备的甲苯溶液(约1.2L)中加入三氟乙酸(200mL)。在20℃下搅拌混合物2小时。加入水(1.55L)且在20℃下搅拌混合物30分钟。30分钟后，混合物分成三层。底层(约350mL)的褐色粘性油状物中含有粗中间物。

搅拌下，在1-2℃下经1小时向装有MTBE(2.8L)的12L烧瓶中加入粗褐色油状物。在相同温度下将悬浮液搅拌1小时且随后过滤。将滤液用MTBE(2×300mL)洗涤且在室温下真空干燥4天，得到呈浅黄色粉末状的标题中间物的三氟乙酸盐(163.3g)。

c.N-甲基-N-[(S)-2-环氧乙烷-2-基甲基]甲烷磺酰胺的制备

将水(1L)装入12L烧瓶中，随后加入NaOH(50％水溶液，146.81g，1.835mol)。将含有NaOH的烧杯用水(2×500mL)洗涤且随后将洗涤液加入烧瓶中。在室温下将混合物搅拌10分钟且将其冷却到约8℃。经5分钟加入水(500mL)中的(N-甲基)甲烷磺酰胺(200.2g，1.835mol)。在约4℃下将混合物搅拌1小时且加入(S)-2-氯甲基环氧乙烷(339.6g，3.67mol)。在3-4℃下将混合物搅拌20小时。加入二氯甲烷(2L)并且在5-10℃下将混合物搅拌30分钟。经10分钟将两层分离并加以收集。将有机层(约2.5L)加回12L烧瓶中并且用1M H₃PO₄(800mL)和盐水(800mL)洗涤。通过旋转蒸发移除二氯甲烷。向粗产物中加入甲苯(400mL)并通过旋转蒸发将其移除。另外三次甲苯处理循环后，获得标题中间物(228.2g)，不经进一步纯化即将其用于下一步骤中。

d.1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的合成

在3L烧瓶中，将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺三氟乙酸盐(105.0g，0.232mol)悬浮于无水乙醇(400mL)中。在室温下，向此悬浮液中加入溶解于无水乙醇(100mL)中的NaOH(50％水溶液，0.243mol，1.05eq)。用乙醇(2×50mL)洗涤含有NaOH的烧杯并且将洗涤液加入反应混合物中。搅拌30分钟后，加入N-甲基-N-[(S)-2-环氧乙烷-2-基甲基]甲烷磺酰胺(62.0g，1.5eq)于无水乙醇(100mL)中的溶液。使混合物回流2小时，将其冷却到室温且加入标题化合物的晶种。搅拌约5分钟后，形成白色固体。将混合物冷却到3-5℃且搅拌2小时。过滤白色固体且用冷的无水乙醇(3×50mL)洗涤潮湿滤饼。在30℃下真空干燥固体60小时，得到标题化合物(93.8g，通过Karl Fischer方法检测含水量为2.03％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm 10.52(d，1H)，8.83(s，1H)，7.75(d，2H)，7.64-7.60(m，2H)，7.28-7.26m，1H)，4.33-4.26(m，2H)，3.78-3.75(m，1H)，3.27-3.20(m，4H)，3.01(s，3H)，2.88(s，3H)，2.58-2.53(m，1H)，2.30-1.81(m，11H)，1.68(d，6H)。

晶种是通过较小规模的本实例的方法由标题化合物的前述制备中获得，其中结晶作用是自发发生。

实例2：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐的合成

在1L烧瓶中，将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺(34.7g，0.069mol)悬浮于无水乙醇(210mL)中。搅拌下，在室温下加入浓HCl(1.1eq)。在回流下将混合物搅拌30分钟并且将其冷却到室温，并搅拌2小时。过滤固体且用冷的无水乙醇(3×50mL)洗涤潮湿滤饼。在30℃下真空干燥固体48小时，得到标题化合物(34.5g，产率93.7％，通过Karl Fischer方法检测含水量为0.13％)。

实例3：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐的结晶水合物的合成

将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐(139mg，0.28mmol)溶解于注射用无菌水(2mL)中。数小时后，溶液变为混浊悬浮液。搅拌悬浮液并且使其在环境温度下静置整夜，得到白色沉淀。通过过滤收集固体并且在环境条件(约40-50％相对湿度)下干燥2分钟，得到标题化合物(130mg，产率91％)。

实例4-9：本发明盐形式的特性

通过粉末x射线衍射(PXRD)、差示扫描量热(DSC)、热重分析(TGA)、红外光谱(IR)和元素分析来分析如实例2中所制备的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺(式I化合物)的结晶盐酸盐样本和如实例3中所制备的式I化合物盐酸盐的结晶水合物样本。

实例4：粉末X射线衍射

用X’TRA型Thermo ARL X射线衍射仪(Thermo ARL SA，Switzerland)使用1.542埃的Cu Kα辐射(45kV，40mA)和Si(Li)固态检测器获得粉末x射线衍射图。所述分析通常是在2°/min的扫描速率和每点0.03°的步长于2°到35°的2θ角范围内进行。将以原样使用或研磨成细粉的样本小心包装于经设计以适合仪器顶部装载样本杯的常用小体积插管中以供分析。每周通过与硅金属标准品相比较来核实仪器校准处在±0.02°的2θ角内。本发明的结晶盐酸盐样本和本发明的盐酸盐水合物样本的代表性PXRD图分别绘示于图1和图4中。

实例5：热分析

使用TA Instruments Model Q-100模块进行差示扫描量热(DSC)。收集数据并且使用TA Instruments Thermal Advantage for Q Series^TM软件进行分析。将约1-10mg样本精确称至具有盖子的铝盘中。使用10℃/min的线性加热速率从5℃缓慢升至通常265℃来评估样本。使用过程中用干燥氮气净化DSC室。化合物I的结晶盐酸盐样本和化合物I的盐酸盐结晶水合物的代表性DSC迹线分别绘示于图2和图5中。

使用TA Instruments Model Q-500模块进行热重分析(TGA)。收集数据并且使用TAInstruments Thermal Advantage for Q Series^TM软件进行分析。将重约1-5mg的样本放入铂支架上的铝盘中且在以10℃/min的线性加热速率使环境温度升到300℃的过程中进行扫描。使用期间用氮气净化平衡室和炉室。化合物I的结晶盐酸盐样本和化合物I的盐酸盐的结晶水合物样本也分别绘示于图2和图5中。

图2中的DSC迹线证实，本发明的盐酸盐在约230℃到约260℃范围内具有优良的热稳定性和最大的吸热型热流量，并且在低于约225℃时无显著热事件。对DSC与TGA迹线所进行的比较表明，本发明的盐酸盐在高于约230℃的温度下同时经历熔解和分解。

图5中本发明水合物形式的DSC迹线在约225℃到约250℃范围内于以晶体熔解鉴别的吸热型热流量中展现实质峰，且在较低温度下展现宽或弱的吸热作用。对DSC与TGA迹线所作的比较表明，水合物结晶形式的分解在熔解转变温度下并不显著。

实例6：动态吸湿评定

动态吸湿(DMS)评定是在25℃下使用VTI大气微平衡SGA-100系统(VTI Corp.，Hialeah，FL 33016)进行。使用约5-10mg的样本规格且在开始分析时将湿度设置在环境值。典型的DMS分析是由三次扫描组成：以每步骤5％相对湿度(RH)的扫描速率由环境RH到2％RH、2％RH到90％RH、90％RH到5％RH。每两分钟测量质量并且当5个连续点的样本质量在0.02％内保持稳定时，将RH变成下一个值(±5％RH)。化合物I的结晶盐酸盐样本和化合物I的盐酸盐结晶水合物样本的代表性DSC迹线分别绘示于图3和图6中。

盐酸盐在2％到90％RH的全范围内展现可逆的吸附/解吸附概况和小于0.2％的重量改变。当将样本从环境RH干燥到2％RH时，水合物形式展现可逆的吸附/解吸附概况和约2.3％的重量损失，这与将干燥试样由2％RH暴露到40％RH时的吸湿量相同。水合物形式在40％RH到75％RH范围内具有小于约0.25％的重量增加。

实例7：红外分析

红外(IR)吸收光谱是在4000到675cm^-1的频率范围内使用装备有Nicolet衰减全反射(ATR)样本固定器的Avatar 360 FT-IR光谱仪测定。本发明的结晶盐酸盐样本的代表性IR吸收光谱在758±1、783±1、795±1、802±1、949±1、981±1、1149±1、1158±1、1217±1、1332±1、1377±1、1453±1、1467±1、1487±1、1525±1、1566±1、1575±1、1615±1、1672±1和3197±1cm^-1下具有显著吸收谱带。

实例8：固态稳定性评定

在40℃和75％RH下将本发明盐酸盐的样本储存于多个敞开玻璃小瓶中。在特定间隔时，移出代表性小瓶中的内容物并且通过DSC、TGA、PXRD和HPLC分析化学纯度。储存24周后，DSC或TGA温谱图和PXRD图都无任何可检测的改变。所储存的样本的化学纯度为99.6％。

实例9：抗衡离子摩尔比率的测定

盐酸(HA)比1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺(式I化合物)的抗衡离子摩尔比率是根据下式计算：

抗衡离子比率＝(W_HA/MW_HA)/(W_I/MW_I)，

其中W_HA为样本中HCl的重量百分比，MW_HA为HCl的分子量，MW_I为式I化合物的分子量(504.6amu)，且W_I为样本中式I化合物的重量百分比，W_I是在假定化合物I无杂质的情况下根据下式计算：

W_I＝100-W_HX-W_H2O-W_RS，

其中W_H2O为含水量的重量百分比，W_RS为残余溶剂的重量百分比。

使用6.3％的HCl重量百分比(W_HA)和值W_H2O＝0.26％与W_RS＝0.47％计算本发明的结晶盐酸盐样本中盐酸比化合物I的摩尔比率为0.94∶1。HCl含量是通过用硝酸银标准溶液进行滴定来测定，含水量W_H2O是通过Karl Fischer库仑滴定法测定，且残余溶剂含量W_RS是通过气相色谱法测定。

比较实例1：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的柠檬酸盐的合成

将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺(0.1g，0.2mmol)悬浮于乙醇(1mL)中。向所述悬浮液中加入柠檬酸于乙醇中的1M溶液(0.072mL，0.072mmol，0.33eq)。用超声波短暂处理混合物直到其变澄清为止，将其封盖且随后静置整夜。接着移除盖子且在环境条件下蒸发混合物直到观察到固体为止。然后再封盖混合物并且使其静置72小时。将所得固体过滤且用冷乙醇洗涤，得到呈固体状的标题化合物(74.3mg)。

比较实例2：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的酸盐的合成

遵循比较实例1的程序，使用指定当量的酸(第二个括号中为产物重量)制备以下固体形式的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的酸盐：己二酸(0.5eq)(48.5mg)、磷酸(0.5eq)(86.6mg)、硫酸(0.5eq)(27.0mg)、酒石酸(0.5eq)(66.3mg)、苹果酸(0.5eq)(25.3mg)和氢溴酸(1eq)(62.9mg)。

比较实例3：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的甲烷磺酸盐的合成

向1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺(0.1g，0.2mmo1)于50％乙腈/水(1mL)中的溶液中加入甲烷磺酸于乙醇中的1M溶液(0.2mL，0.2mmol，1eq)。随后将混合物冷冻并且冻干至干历时整夜。在小心加温下，将所得固体溶解于异丙醇(1mL)中并且使其冷却。通过过滤收集所得固体并且用冷异丙醇洗涤，得到呈固体状的标题化合物(90mg)。

比较实例4：1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的酸盐的合成

遵循比较实例3的程序，使用指定当量的酸(第二个括号中为产物重量)制备以下固体形式的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的酸盐：富马酸(1eq)(107.2mg)、苯甲酸(1eq)(105.2mg)和(R)-扁桃酸(1eq)(96.1mg)。

比较实例5：比较实例1-4的化合物的特性

通过PXRD、DSC和TGA分析比较实例1-4的式I化合物的结晶酸盐。在所有情况中，在低于约100℃的温度下通过TGA都观察到重量损失，这很可能是由溶剂损失引起。通过DSC观察到吸热型热流量时所处的温度(排除由溶剂损失引起的低温特征)连同PXRD对结晶的确认结果都概括于表I中，其中化学计量是由制备酸盐所使用的酸的当量数表示。

表I：盐的比较

酸	酸的当量数	DSC吸热	PXRD
				柠檬酸	0.33	约125℃、约160-180℃	结晶
己二酸	0.5	约150℃	结晶
				磷酸	0.5	约215-220℃	结晶
硫酸	0.5	约150℃、约190-205℃、约240℃^*	结晶
				酒石酸	0.5	约140℃、约185℃	结晶
苹果酸	0.5	约110℃、约185℃^#	结晶
				氢溴酸	1	约155℃、约210℃	结晶
甲烷磺酸	1	约175℃、约235℃^*	结晶
				富马酸	1	约125℃	结晶
苯甲酸	1	＜150℃^#	结晶
				(R)-扁桃酸	1	约120℃	结晶

^*多种多晶型物，观察到放热

^#熔解和分解开始

检定1：对5-HT_4(c)人类受体的放射性配体结合检定

a.5-HT_4(c)的膜制备

在5％CO₂的潮湿恒温箱中于37℃下，使经人类5-HT_4(c)受体cDNA稳定转染的HEK-293(人胚肾)细胞(如使用[³H]-GR113808膜放射性配体结合检定所测定，Bmax＝约6.0皮摩尔/毫克蛋白)在T-225烧瓶中的含有4,500mg/L D-葡萄糖和吡哆醇盐酸盐且补充有10％胎牛血清(FBS)(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号10437)、2mM L-谷氨酰胺和(100单位)盘尼西林(penicillin)-(100微克)链霉素/毫升(GIBCO-InvitrogenCorp.：目录编号15140)的杜贝卡氏经修饰依格氏培养基(Dulbecco′s Modified EaglesMedium，DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.，Carlsbad CA：目录编号11965)中生长。通过将800μg/mL遗传霉素(geneticin)(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号10131)加到培养基中而使细胞在连续选择压力下生长。

使细胞生长到约60-80％长满(＜35个次培养传代)。在采集前20-22小时，洗涤细胞2次并且用无血清DMEM加以培养。膜制备的所有步骤都是在冰上进行。通过用25mL移液管轻柔地机械搅动并捣碎而使细胞单层上升。通过以1000rpm离心(5min)收集细胞。

对于膜制备而言，将细胞小球再悬浮于冰冷的50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(pH7.4)(膜制备缓冲液)中(40mL/从30-40个T225烧瓶得到的总细胞产量)并使用Polytron破碎仪(设置19，2×10s)在冰上使其均质化。4℃下，以1200g将所得匀浆离心5分钟。丢弃离心块且以40,000g将上清液离心(20min)。通过再悬浮于膜制备缓冲液中并以40,000g离心(20min)来洗涤离心块一次。将最终离心块再悬浮于50mM HEPES(pH7.4)(检定缓冲液)(相当于1个T225烧瓶/1mL)中。通过Bradford(Bradford，1976)方法测定膜悬浮液中的蛋白质浓度。将膜以等分试样形式冷冻储存于-80℃下。

b.放射性配体结合检定

放射性配体结合检定是在1.1mL的96深孔聚丙烯检定板(Axygen)中以含有50mMHEPES pH7.4(含有0.025％胎牛血清(BSA))中的2μg膜蛋白的400μL总检定体积进行。用于测定放射性配体K_d值的饱和结合研究是使用[³H]-GR113808(Amersham Inc.，Bucks，UK：目录编号TRK944；比活性约82Ci/mmol)以8-12种在0.001nM-5.0nM范围内的不同浓度进行。用于测定化合物pK_i值的置换检定是使用[³H]-GR113808在0.15nM下和在10pM-100μM范围内的11种不同化合物浓度下进行。

测试化合物以于DMSO中的10mM储备溶液形式使用，并且在25℃下于含有0.1％BSA的50mM HEPES pH7.4中稀释到400μM，且随后在相同缓冲液中进行连续稀释(1∶5)。在存在1μM未经标记的GR113808的情况下测定非特异性结合。在室温下培育检定60分钟，且随后通过迅速滤过预浸于0.3％聚乙烯亚胺中的96孔GF/B玻璃纤维过滤板(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)来终止结合反应。用过滤缓冲液(冰冷的50mM HEPES，pH7.4)洗涤过滤板3次以移除未结合的放射性。将板干燥，将35μLMicroscint-20液体闪烁液(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)加到各孔中并且通过Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)对板进行计数。

通过用GraphPad Prism软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)使用单位点竞争的3参数模型进行的非线性回归分析来分析结合数据。如在存在1μM GR113808的情况下所测定，BOTTOM(曲线最小值)固定在非特异性结合值。测试化合物的K_i值是以Prism由最佳拟合的IC₅₀值计算，且放射性配体的K_d值是使用Cheng-Prusoff等式(Cheng和Prusoff，Biochemical Pharmacology，1973，22，3099-108)计算：K_i＝IC₅₀/(1+[L]/K_d)，其中[L]＝[³H]-GR113808的浓度。结果表示为K_i值的以十为底的负对数pK_i。

在本检定中，具有较高pK_i值的测试化合物对5-HT₄受体具有较高结合亲和力。在本检定中式I化合物具有大于约7.5的pK_i值。

检定2：对5-HT_3A人类受体的放射性配体结合检定：受体亚型选择性的测定

a.5-HT_3A膜制备

经人类5-HT_3A受体cDNA稳定转染的HEK-293(人胚肾)细胞是从Dr.Michael Bruess(University of Bonn，GDR)获得(如使用[³H]-GR65630膜放射性配体结合检定所测定，Bmax＝约9.0皮摩尔/毫克蛋白)。在5％CO₂的潮湿恒温箱中于37℃下，使细胞在T-225烧瓶或细胞工厂中的补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT：目录编号SH30070.03)和(50单位)盘尼西林-(50微克)链霉素/毫升(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号15140)的50％杜贝卡氏经修饰依格氏培养基(DMEM)(GIBCO-InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA：目录编号11965)和50％Ham′s F12(GBCO-Invitrogen Corp.：目录编号11765)中生长。

使细胞生长到约70-80％长满(＜35个次培养传代)。膜制备的所有步骤都是在冰上进行。为采集细胞，抽吸培养基并且用无Ca²⁺、Mg²⁺的杜贝卡氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)漂洗细胞。通过轻柔地机械搅动使细胞单层上升。通过以1000rpm离心(5min)收集细胞。膜制备的随后步骤是遵循上文关于表达5-HT_4(c)受体的膜所述的方案进行。

b.放射性配体结合检定

放射性配体结合检定是在96孔聚丙烯检定板中以含有50mM HEPES pH7.4(含有0.025％BSA检定缓冲液)中的1.5-2μg膜蛋白的200μL总检定体积进行。用于测定放射性配体K_d值的饱和结合研究是使用[³H]-GR65630(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA：目录编号NET1011；比活性约85Ci/mmol)以12种在0.005nM到20nM范围内的不同浓度进行。用于测定化合物pK_i值的置换检定是使用[³H]-GR65630在0.50nM下和在10pM到100μM范围内的11种不同化合物浓度下进行。化合物以于DMSO中的10mM储备溶液形式使用(参看3.1部分)，在25℃下于含有0.1％BSA的50mMHEPES pH7.4中稀释到400μM，且随后在相同缓冲液中进行连续(1∶5)稀释。在存在10μM未经标记的MDL 72222的情况下测定非特异性结合。在室温下培育检定60分钟，随后通过迅速滤过预浸于0.3％聚乙烯亚胺中的96孔GF/B玻璃纤维过滤板(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)来终止结合反应。用过滤缓冲液(冰冷的50mM HEPES，pH7.4)洗涤过滤板3次以移除未结合的放射性。将板干燥，将35μLMicroscint-20液体闪烁液(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)加到各孔中并且通过Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)对板进行计数。

使用上文所述的非线性回归程序分析结合数据以测定K_i值。如在存在10μMMDL72222的情况下所测定，BOTTOM(曲线最小值)固定在非特异性结合值。Cheng-Prusoff等式中[L]的量是被定义为[³H]-GR65630的浓度。

5-HT₄受体亚型相对于5-HT₃受体亚型的选择性是以K_i(5-HT_3A)/K_i(5-HT_4(c))比率计算。在本检定中，式I化合物具有大于约1000的5-HT₄/5-HT₃受体亚型选择性。

检定3：用表达人类5-HT_4(c)受体的HEK-293细胞进行的全细胞cAMP积累Flashplate检定

在本检定中，通过测量当表达5-HT₄受体的HEK-293细胞与不同浓度的测试化合物接触时所产生的环AMP的量来测定测试化合物的功能效力。

a.细胞培养

制备经克隆人5-HT_4(c)受体cDNA稳定转染的HEK-293(人胚肾)细胞，其表达两种不同密度的受体：(1)如使用[³H]-GR113808膜放射性配体结合检定所测定，约0.5-0.6皮摩尔/毫克蛋白的密度；和(2)约6.0皮摩尔/毫克蛋白的密度。在5％CO₂的潮湿恒温箱中于37℃下，使细胞在T-225烧瓶中的含有4,500mg/LD-葡萄糖且补充有10％胎牛血清(FBS)(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号10437)和(100单位)盘尼西林-(100微克)链霉素/毫升(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号15140)的杜贝卡氏经修饰依格氏培养基(DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号11965)中生长。通过将遗传霉素(800μg/mL，GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号10131)加到培养基中而使细胞在连续选择压力下生长。

b.细胞制备

使细胞生长到约60-80％长满。在检定前20-22小时，洗涤细胞2次并且用含有4,500mg/L D-葡萄糖的无血清DMEM(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号11965)加以培养。为采集细胞，抽吸培养基并且将10mL Versene(GIBCO-Invitrogen Corp.：目录编号15040)加到各T-225烧瓶中。在室温下培育细胞5分钟，且随后通过机械搅动使其从烧瓶中移位。将细胞悬浮液转移到含有等体积预先加温(37℃)的dPBS的离心管中，并且以1000rpm离心5分钟。丢弃上清液且将离心块再悬浮于预先加温(37℃)的刺激缓冲液(10mL，每2-3个T-225烧瓶相等)中。对这一时刻进行标注且标为零点。用Coulter计数器对细胞进行计数(计数超过8μm的细胞，烧瓶产量为每个烧瓶1-2×10⁷个细胞)。将细胞以5×10⁵个细胞/毫升的浓度再悬浮于预先加温(37℃)的刺激缓冲液(如flashplate试剂盒中所提供)中并且在37℃下预先培育10分钟。

根据制造商的说明，使用具有¹²⁵I-cAMP的Flashplate腺苷酰基环化酶活化检定系统(SMP004B，PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)以放射免疫检定格式进行cAMP检定。

如上所述生长和制备细胞。检定中的最终细胞浓度为每孔25×10³个细胞且最终检定体积为100μL。测试化合物以于DMSO中的10mM储备溶液形式使用，在25℃下于含有0.1％BSA的50mM HEPES pH7.4中稀释到400μM，且随后在相同缓冲液中进行连续(1∶5)稀释。用11种在10pM到100μM(最终检定浓度)范围内的不同化合物浓度进行环AMP积累检定。每个板上都包括5-HT浓度-反应曲线(10pM到100μM)。振荡下，在37℃下培育细胞15分钟并通过将100μL冰冷的检测缓冲液(如Flashplate试剂盒中所提供)加到各孔中来终止反应。密封板并在4℃培育整夜。使用Topcount(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)通过闪烁亲近光谱测定结合放射性的量。

根据制造商的用户手册中所提供的说明，从cAMP标准曲线外推每毫升反应所产生的cAMP的量。通过用GraphPad Prism软件包使用3参数s形剂量-反应模型(斜率被限制为一致)进行的非线性回归分析来分析数据。以pEC₅₀值(即，EC₅₀值的以10为底的负对数)报导效力数据，其中EC₅₀为50％最大反应的有效浓度。

在本检定中展现较高pEC₅₀值的测试化合物对于使5-HT₄受体激动而言具有较高效力。在本检定中于具有约0.5-0.6皮摩尔/毫克蛋白的密度的细胞系(1)中所测试的式I化合物具有大于约7.5的pEC₅₀值。

检定4：对表达hERG心脏钾通道的全细胞中钾离子电流的抑制作用的活体外电压钳检定

经hERG cDNA稳定转染的CHO-K1细胞是从University of Wisconsin的GailRobertson获得。将细胞低温储存待用。使细胞在补充有10％胎牛血清和200μg/mL遗传霉素的杜贝卡氏经修饰依格培养基/F12中繁殖并传代。将细胞以使得能够选择经分离细胞以用于全细胞电压钳研究的密度接种于35mm²培养皿(含有2mL培养基)中经聚D-赖氨酸(100μg/mL)涂覆的玻璃盖玻片上。将培养皿保持在37℃下含5％CO₂的潮湿环境中。

至少每7天制备胞外溶液并且在不使用时于4℃下储存。胞外溶液含有(mM)：NaCl(137)、KCl(4)、CaCl₂(1.8)、MgCl₂(1)、葡萄糖(10)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(10)，pH值经NaOH调至7.4。在不存在或存在测试化合物的情况下，将胞外溶液放入储槽中，所述溶液以约0.5mL/min的速度由储槽流入记录室。制备胞内溶液，将其等分并且储存于-20℃下待用。胞内溶液含有(mM)：KCl(130)、MgCl₂(1)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸盐(EGTA)(5)、MgATP(5)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(10)，pH值经KOH调至7.2。所有实验都是在室温(20-22℃)下进行。

将接种有细胞的盖玻片转移到记录室中并持续灌注。细胞与膜片电极之间形成千兆欧姆阻抗封接。获得稳定膜片后，在电压钳模式下以-80mV的初始钳制电位开始记录。在获得稳定的全细胞电流后，将细胞暴露到测试化合物下。标准电压方案为以下步骤：经4.8秒由-80mV的钳制电位升到+20mV；经5秒再极化到-50mV；和随后回到最初钳制电位(-80mV)。每15秒(0.067Hz)执行这一电压方案1次。使用pClamp软件测定再极化期中的峰值电流幅值。经5分钟将3μM浓度的测试化合物灌注到细胞上，随后在不存在化合物的情况下进行为时5分钟的冲洗。最后，将阳性对照(西沙必利(cisapride)，20nM)加到灌注液中以测试细胞的功能。从-80mV到+20mV的步骤活化hERG通道，从而产生外向电流。回到-50mV的步骤将由于通道从失活恢复并失活而产生外向尾电流。

使用pCLAMP软件测定再极化期中的峰值电流幅值。将对照和测试物品的数据输出到Origin

(OriginLab Corp.，Northampton MA)，其中将个别电流幅值标准化为不存在化合物时的初始电流幅值。计算各条件下的经标准化电流平均值和标准误差，并相对于实验时程作图。

对暴露到测试物品或媒剂对照(通常为0.3％DMSO)5分钟后的所观察的K+电流抑制作用进行比较。使用两组独立t检验(Microcal Origin v.6.0)进行实验组之间的统计学比较。将p＜0.05的差异视为显著。

在本检定中，钾离子电流的抑制百分比越低，那么当用作治疗剂时测试化合物改变心脏再极化模式的可能性就越小。在本检定中对3μM浓度的式I化合物进行测试且其展现小于约15％的钾离子电流抑制作用。

检定5：口服生物可用性的活体外模型：Caco-2渗透检定

进行Caco-2渗透检定以模仿经口投与后测试化合物穿过肠并进入血流的能力。对测试化合物溶液渗透经设计以模拟人小肠单层的紧密接合的细胞单层的速率进行测定。

Caco-2(结肠，腺癌；人类)细胞是从ATCC(American Type Culture Collection；Rockville，MD)获得。对于渗透研究来说，将细胞以63,000个细胞/平方厘米的密度接种于预先润湿的Transwell聚碳酸酯过滤器(Costar；Cambridge，MA)上。培养21天后形成细胞单层。在Transwell培养板中进行细胞培养后，将含有细胞单层的膜从Transwell培养板分离并且将其插入扩散室(Costar；Cambridge，MA)中。将扩散室插入加热恒温器中，所述加热恒温器装备有恒温调控于37℃的外部循环水以控制温度。空气歧管将95％O2/5％CO₂传递到每一半扩散室中并且产生穿过细胞单层的层流模式，这将有效减少未经搅拌的边界层。

用100μM浓度的测试化合物和¹⁴C-甘露糖醇进行渗透研究以监测单层的完整性。所有实验都是在37℃下进行60分钟。在0、30和60分钟时从所述室的供体侧与接收体侧取样。通过HPLC或液体闪烁计数来分析样本中测试化合物和甘露糖醇的浓度。计算渗透系数(K_p)(以cm/sec为单位)。

在本检定中，将大于约10×10^-6cm/sec的K_p值视作良好生物可用性的指示。在本检定中测试式I化合物且其展现大于约20×10^-6cm/sec的K_p值。

检定6：大鼠的药物动力学研究

制备pH值介于约5与约6之间的测试化合物于0.1％乳酸中的水溶液调配物。经由静脉内投与(IV)2.5mg/kg剂量或口灌(PO)5mg/kg剂量的测试化合物对雄性Sprague-Dawley大鼠(CD品系，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)给药。IV投药的给药体积为1mL/kg且PO投药的给药体积为2mL/kg。在给药前和给药后2分钟(仅IV)、5分钟、15分钟和30分钟和1小时、2小时、4小时、8小时和24小时时，收集动物的连续血样。通过液相色谱-质谱分析(LC-MS/MS)(MDS SCIEX，API 4000，Applied Biosystems，Foster City，CA)测定血浆中测试化合物的浓度，其中定量下限为1ng/mL。

通过使用WinNonlin(4.0.1版，Pharsight，Mountain View，CA)的非房室分析(对于IV为201型且对于PO为200型)评定标准药物动力学参数。血浆中测试化合物浓度比时间的曲线中的最大值被称为C_max。通过线性梯形法则计算浓度比时间曲线下从给药时间到最后可测量浓度的面积(AUC(0-t))。以下式计算口服生物可用性(F(％))，即PO投药的AUC(0-t)比IV投药的AUC(0-t)的剂量标准化比率：

F(％)＝AUC_PO/AUC_IV×剂量_IV/剂量_PO×100％。

预期在本检定中当经口投与时展现较大参数C_max、AUC(0-t)和F(％)值的测试化合物具有较高生物可用性。式I化合物在大鼠模型中具有0.16μg/mL的C_max值、0.46μg·hr/mL的AUC(0-t)值和约19％的口服生物可用性(F(％))。

尽管已参考本发明的特定实施例描述本发明，但所属领域技术人员应了解，可在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下进行多种改变并且可进行相当内容的替代。此外，可进行许多修改以使物质、方法、方法步骤的特定情形、材料、组成与本发明的目的、精神和范围相适应。所有所述修改都打算处在随附权利要求的范围内。另外，上文所引用的所有公开案、专利和专利文献都是以全文引用的方式并入本文，就如同个别地以引用的方式并入一样。

Claims

1.1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐，其是以所述峰位置与图1中所示图形的峰位置一致的粉末x射线衍射图为特征。

2.根据权利要求1所述的结晶盐酸盐，其中所述结晶盐酸盐是以在大于230℃的温度下展示最大吸热型热流量的差示扫描量热迹线为特征。

3.根据权利要求1所述的结晶盐酸盐，其中所述结晶盐酸盐是以与图2所示的差示扫描量热迹线一致的差示扫描量热迹线为特征。

4.1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的盐酸盐的结晶水合物，其是以所述峰位置与图4中所示图形的峰位置一致的粉末x射线衍射图为特征。

5.根据权利要求4所述的结晶水合物，其中所述结晶水合物是以与图5所示的差示扫描量热迹线一致的差示扫描量热迹线为特征。

6.一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和权利要求1至3中任一权利要求所述的结晶盐酸盐或权利要求4-5中任一权利要求所述的结晶水合物。

7.一种权利要求1至3中任一权利要求所述的结晶盐酸盐或权利要求4-5中任一权利要求所述的结晶水合物用于制备用于治疗哺乳动物的与5-HT₄受体活性相关的医学病况的药物的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述医学病况为胃肠道蠕动减弱病症。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述医学病况选自慢性便秘、便秘型肠易激综合症、糖尿病性和特发性胃轻瘫和功能性消化不良。

10.一种制备如权利要求1所述的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺的结晶盐酸盐的方法，所述方法包含：

(a)使1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺与浓盐酸接触以形成反应混合物；

(b)将所述结晶盐酸盐从所述反应混合物中分离；和

(c)真空干燥所述结晶盐酸盐。

11.一种制备如权利要求4所述的1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐的结晶水合物的方法，所述方法包含：

(a)将1-异丙基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-甲酸{(1S，3R，5R)-8-[(R)-2-羟基-3-(甲烷磺酰基-甲基-氨基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基}酰胺盐酸盐以大于每毫升50毫克的浓度溶解于水中以形成悬浮液；和

(b)将所述结晶水合物从所述悬浮液中分离。