JP2012153725A - キノリン−カルボキサミド化合物の結晶形態物 - Google Patents

Abstract

【課題】５−ＨＴ_４受容体アゴニストとして有用なキノリノン−カルボキサミド化合物の結晶塩形態物を提供すること。
【解決手段】本発明は、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸{（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル}アミドの結晶塩酸塩またはその溶媒和物を提供する。本発明はまた、このような結晶塩形態物を含む製薬組成物、５ＨＴ_４受容体活性に関連した疾患を治療するためにこのような結晶塩形態物を使用する方法、およびこのような結晶塩形態物の調製に有用な方法を提供する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、５−ＨＴ_４受容体アゴニストとして有用なキノリノン−カルボキサミド化合物の結晶塩形態物に関する。本発明はまた、このような結晶化合物を含む製薬組成物、５ＨＴ_４受容体活性に媒介された病状を治療するためにこのような化合物を使用する方法、およびこのような化合物の調製に有用な方法に関する。

（当業界の状況）
本願と同一の譲受人に譲渡された２００４年４月７日出願の米国特許仮出願第６０／５６０，０７６号、および２００５年４月６日出願の米国特許出願第１１／１００，１１３号は、胃腸管運動性低下の疾患の治療に有用であると予想される、新規なキノリノン−カルボキサミド化合物を開示している。特に、化合物、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸{（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−
ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル}アミドは、５−ＨＴ_４受容体アゴニスト活性を示すも
のとして、上記出願に具体的に開示されている。１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸{（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒド
ロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル}アミドの化学構造は式Ｉにより表される：

治療薬としてこの化合物を効果的に使用するために、容易に製造でき、許容できる化学的および物理的安定性を有する固体状態の塩形態物を有することが望ましいと考えられる。例えば、熱的に安定、例えば、約２００℃を越える温度で安定であり、吸湿性でも潮解性でもなく、そのため処理および貯蔵が容易な塩形態物を有することがきわめて望ましいと考えられる。結晶固体は、製造品の純度および安定性が増加するので、非結晶形態物よりも一般的に好ましい。

式Ｉの化合物の非結晶塩形態物についてはまだ報告されていない。したがって、吸湿性でも潮解性でもなく、好適な熱的安定性を示す式Ｉの化合物の安定な結晶塩形態物が必要とされている。

（発明の要旨）
本発明は、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩またはその溶媒和物を提供する。一態様において、本発明の結晶塩形態物は、式Ｉの化合物の結晶塩酸塩である。他の態様において、本発明の結晶塩形態物は、式Ｉの化合物の塩酸塩の結晶水和物である。

驚くべきことに、本発明の結晶塩酸塩は、約２００℃を越える温度で熱的に安定であり、室温で約２％と約９０％との間の範囲の相対湿度に晒された場合に示す重量変化が約０．２％未満であることがわかった。さらに、本発明の結晶塩酸塩も、その水和物も、室温で９０％までの相対湿度に晒された場合、潮解性ではない。

他の使用法として、本発明の結晶塩形態物は、胃腸管の運動低下疾患を治療するための製薬組成物の調製に有用であることが予想される。したがって、その組成物の他の態様において、本発明は、製薬的に許容できる担体および１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩またはその溶媒和物を含む製薬組成物を提供する。

本発明はまた、５−ＨＴ_４受容体活性に関連した疾患または病態、例えば、胃腸管の運動低下疾患を治療する方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、治療的有効量の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶質塩酸塩またはその溶媒和物を投与することを含む。

他の方法態様において、本発明は、本発明の結晶塩酸塩を調製するための方法を提供し、該方法は、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドを塩酸と接触させて反応混合物を形成し、該反応混合物から該結晶塩酸塩を単離することを含む。
本発明はまた、療法において、または薬剤として使用するため、本明細書に記載された本発明の結晶塩酸塩、ならびに、薬剤の製造において、特に哺乳動物における胃腸管の運動低下疾患を治療するための薬剤製造に関して、本発明の結晶塩酸塩の使用法を提供する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの塩酸塩またはその溶媒和物である、結晶塩形態物。
（項目２）
前記結晶塩形態物が結晶塩酸塩である、項目１に記載の結晶塩形態物。
（項目３）
前記結晶塩形態物が、４．４１±０．２、８．８２±０．２、９．０８±０．２、１１．２１±０．２、１４．４０±０．２、１６．４２±０．２、１７．３５±０．２、１７．６１±０．２、１８．１４±０．２、１９．０４±０．２、１９．９５±０．２、２０．２０±０．２、２１．２３±０．２、２２．１３±０．２、２２．４８±０．２、２２．８３±０．２、２４．１６±０．２、２５．３７±０．２、２５．５６±０．２、２６．２２±０．２、２７．３３±０．２、２９．０８±０．２、および２９．６１±０．２から選択される２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折パターンを特徴とする、項目２に記載の結晶塩形態物。
（項目４）
前記粉末ｘ線回折パターンが、１４．４０±０．２、１７．３５±０．２、１７．６１±０．２、１９．０４±０．２、２１．２３±０．２、および２２．１３±０．２から選択される２θ値における２つ以上の回折ピークを含む、項目３に記載の結晶塩形態物。
（項目５）
前記結晶塩形態物は、ピーク位置が図１に示されたパターンのピーク位置に実質的に従う粉末ｘ線回折パターンを特徴とする、項目２に記載の結晶塩形態物。
（項目６）
前記結晶塩形態物が、約２３０℃超の温度において、吸熱性熱流の最大値を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、項目２に記載の結晶塩形態物。
（項目７）
前記結晶塩形態物が、図２に示された示差走査熱量測定トレースに実質的に従う示差走査熱量測定トレースを特徴とする、項目２に記載の結晶塩形態物。
（項目８）
前記結晶塩形態物が水和物である、項目１に記載の結晶塩形態物。
（項目９）
前記結晶塩形態物が、５．３０±０．２、７．４３±０．２、８．７２±０．２、１０．５２±０．２、１３．８５±０．２、１４．１１±０．２、１５．８０±０．２、１５．９９±０．２、１７．２６±０．２、１９．５３±０．２、２０．０８±０．２、２１．０６±０．２、２１．４８±０．２、２１．９２±０．２、２２．８５±０．２、２３．９１±０．２、２５．２８±０．２、２６．０６±０．２、２７．３４±０．２、２７．５１±０．２、および２９．６７±０．２から選択される２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折パターンを特徴とする、項目８に記載の結晶塩形態物。
（項目１０）
前記粉末ｘ線回折パターンが、１０．５２±０．２、１３．８５±０．２、１５．８０±０．２、１７．２６±０．２、および２１．０６±０．２から選択される２θ値における２つ以上の回折ピークを含む、項目９に記載の結晶塩形態物。
（項目１１）
前記結晶塩形態物は、ピーク位置が図４に示されたパターンのピーク位置に実質的に従う粉末ｘ線回折パターンを特徴とする、項目８に記載の結晶塩形態物。
（項目１２）
前記結晶塩形態物が、図５に示された示差走査熱量測定トレースに実質的に従う示差走査熱量測定トレースを特徴とする、項目８に記載の結晶塩形態物。
（項目１３）
製薬的に許容できる担体および項目１から１２のいずれか一項に記載の結晶塩形態物を含む製薬組成物。
（項目１４）
５−ＨＴ _４ 受容体活性に関連した病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、該方法は、治療的有効量の製薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、該製薬組成物は、製薬的に許容できる担体および項目１から１２のいずれか一項に記載の結晶塩形態物を含む、方法。
（項目１５）
哺乳動物における胃腸管の運動低下障害を治療する方法であって、該方法は、治療的有効量の製薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、該製薬組成物は、製薬的に許容できる担体および項目１から１２のいずれか一項に記載の結晶塩形態物を含む、方法。
（項目１６）
前記運動低下障害が、慢性便秘症、便秘優勢過敏性腸症候群、糖尿病性胃疾患および特発性胃疾患、ならびに機能性消化不良症から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
治療において使用するための、項目１から１２のいずれか一項に記載の結晶塩形態物。
（項目１８）
薬剤を製造するための、項目１から１２のいずれか一項に記載の結晶塩形態物の使用。
（項目１９）
前記薬剤が、５−ＨＴ _４ 受容体活性に関連した、哺乳動物における病状を治療するための薬剤である、項目１８に記載の使用。
（項目２０）
前記病状が、胃腸管の運動低下障害である、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
前記病状が、慢性便秘症、便秘優勢過敏性腸症候群、糖尿病性胃疾患および特発性胃疾患、ならびに機能性消化不良症から選択される、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
（ａ）１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドと塩酸とを接触させて、反応混合物を形成すること；および
（ｂ）前記反応混合物から前記結晶塩酸塩を単離すること、
を含む、プロセス。
（項目２３）
１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの塩酸塩の結晶水和物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
（ａ）１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩を、１ミリリットル当たり約５０ミリグラム超の濃度で水に溶解させ、懸濁液を形成すること；および
（ｂ）前記懸濁液から前記結晶水和物を単離すること、
を含む、プロセス。

本発明の種々の態様は、添付の図面を参照して例示される。
図１は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶質塩酸塩の粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示している。 図２は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩に関する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース（ボトムトレース、右側縦軸）および熱重量分析（ＴＧＡ）トレース（トップ追跡、左側縦軸）を示している。 図３は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩に関する動的水分吸収（ＤＭＳ）を示している。 図４は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの塩酸塩の結晶水和物の粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示している。 図５は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩の結晶水和物に関する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース（トップトレース、左側縦軸）および熱重量分析（ＴＧＡ）トレース（ボトムトレース、右側縦軸）を示している。 図６は、本発明の１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩の結晶水和物に関する動的水分吸収（ＤＭＳ）を示している。

（発明の詳細な説明）
本発明は、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩またはその溶媒和物を提供する。

定義
本発明の化合物、組成物および方法を記述する際、以下の用語は、別に指示されない限り、以下の意味を有する。

用語の「治療的有効量」は、治療を必要としている患者に投与した際に治療をもたらす上で十分な量を意味する。

本明細書に用いられる用語の「治療」は、哺乳動物（特にヒト）などの患者における疾患、障害、または病状の治療を意味し、以下を含む：
（ａ）疾患、障害、または病状の発現の予防、すなわち、患者の予防的処置；
（ｂ）疾患、障害、または病状の寛解、すなわち、患者における疾患、障害、または病状を除去することまたは退行を生じさせること；
（ｃ）疾患、障害、または病状の抑制、すなわち、患者における疾患、障害、または病状の発現の緩徐化または阻止；または
（ｄ）患者における疾患、障害、または病状の症状の軽減。

用語の「溶媒和物」は、一種または複数種の溶質分子、すなわち、本発明の化合物または製薬的に許容できるその塩および一種または複数種の溶媒分子により形成された複合体または凝集体を意味する。このような溶媒和物は、溶質と溶媒の実質的に一定のモル比を有する、典型的に結晶質の固体である。代表的な溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが挙げられる。溶媒が水の場合、形成された溶媒和物は特に水和物と称される。

本明細書に用いられる用語の「結晶塩酸塩」は、結晶格子中に溶媒分子の実質的に一定のモル分率を含まない結晶質固体、すなわち、溶媒和物ではないものを意味する。本発明の溶媒和物、または特に水和物は明白に同定される。

本明細書および添付の項目に用いられる単数形の「１つの」、「１個の」、「１つ」、および「前記」は、その内容が明らかに別を指示しない限り、複数の記述を含み得る。

用語の「アミノ保護基」は、アミノ窒素における望ましくない反応を防ぐために好適な保護基を意味する。代表的なアミノ保護基としては、限定はしないが、ホルミル；アシル基、例えば、アセチルなどのアルカノイル基；ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）などのアルコキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などのアリールメトキシカルボニル基；ベンジル（Ｂｎ）、トリチル（Ｔｒ）、および１，１−ジ−（４’−メトキシフェニル）メチルなどのアリールメチル基；トリメチルシリル（ＴＭＳ）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）などのシリル基；などが挙げられる。

活性剤
本発明の塩形態物、すなわち、式Ｉの化合物は、市販のＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ、フランクフルト、ドイツ国）を用いて、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドと命名される。（１Ｓ、３Ｒ、５Ｒ）の呼称は、二環式環系に結合した結合の相対的な方向を言う。あるいは、該化合物は、Ｎ−〔（３−エンド）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル〕−１−（１−メチルエチル）−２−オキソー１，２−ジヒドロ−３−キノリンカルボキサミドと表される。

本発明の塩形態物
一態様において、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの結晶塩酸塩を提供する。

本発明の結晶塩酸塩は、式Ｉの化合物の１モル当量当たり、約０．９モル当量と約１．１モル当量との間など、式Ｉの化合物の１モル当量当たり、約０．８モル当量と約１．２モル当量との間の塩酸を典型的に含有する。

活性剤に対する塩酸のモル比は、当業者に利用できる方法によって容易に決定できる。例えば、このようなモル比は、硝酸銀の標準溶液による滴定によって容易に決定できる。あるいは、該モル比を決定するために、元素分析、^１Ｈ ＮＭＲ、およびイオンクロマトグラフィ法が使用できる。

一態様において、本発明の結晶塩酸塩は、４．４１±０．２、８．８２±０．２、９．０８±０．２、１１．２１±０．２、１４．４０±０．２、１６．４２±０．２、１７．３５±０．２、１７．６１±０．２、１８．１４±０．２、１９．０４±０．２、１９．９５±０．２、２０．２０±０．２、２１．２３±０．２、２２．１３±０．２、２２．４８±０．２、２２．８３±０．２、２４．１６±０．２、２５．３７±０．２、２５．５６±０．２、２６．２２±０．２、２７．３３±０．２、２９．０８±０．２、および２９．６１±０．２から選択される２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする。この態様において、該結晶形態物は特に、１４．４０±０．２、１７．３５±０．２、１７．６１±０．２、１９．０４±０．２、２１．２３±０．２、および２２．１３±０．２から選択される、２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折パターンを特徴とする。

粉末ｘ線回折の分野で十分知られているように、ＰＸＲＤスペクトルのピーク位置は、サンプル調製および機器の幾何学的配置などの詳細などの実験的詳細に対して、相対的ピーク高さよりも相対的に感受性が低い。したがって、一態様において、式Ｉの化合物の結晶塩酸塩は、ピーク位置が実質的に図１に示されたものによる粉末ｘ線回折パターンを特徴とする。

また、本発明の結晶塩酸塩は、図２にしたがって、示されたように、約２３０℃から約２６０℃の範囲の吸熱性の熱流におけるピークを示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースにより実証される高温熱的安定性を特徴とする。さらに、熱重量分析（ＴＧＡ）トレースで、約２２５℃以下での有意な熱的事象は示されない。

さらに他の態様において、結晶塩酸塩は、約７５８、７８３、７９５、８０２、９４９、９８１、１１４９、１１５８、１２１７、１３３２、１３７７、１４５３、１４６７、１４８７、１５２５、１５６６、１５７５、１６１５、１６７２、および３１９７ｃｍ^−１における有意な吸収バンドを示す赤外線吸収スペクトルを特徴とする。

式Ｉの化合物の結晶塩酸塩は、図３に示されるように、例外的に低レベルの吸湿性（すなわち、室温で、２％相対湿度から９０％相対湿度の湿度範囲で、約０．２％未満の重量増加）の可逆的吸着／脱離プロフィルを有することが実証されている。

また、式Ｉの化合物の結晶塩酸塩は、長期間、高温および高湿に曝された際に安定であることが判明している。例えば、４０℃および相対湿度７５％で２４週間貯蔵後のＨＰＬＣで、化学的分解は示されず、ＤＳＣ、ＴＧＡ、またはＰＸＲＤの結果にも検出できる変化はなかった。

他の態様において、本発明は、式Ｉの化合物の塩酸塩の結晶水和物を提供する。

一態様において、本発明の塩酸塩の結晶水和物は、５．３０±０．２、７．４３±０．２、８．７２±０．２、１０．５２±０．２、１３．８５±０．２、１４．１１±０．２、１５．８０±０．２、１５．９９±０．２、１７．２６±０．２、１９．５３±０．２、２０．０８±０．２、２１．０６±０．２、２１．４８±０．２、２１．９２±０．２、２２．８５±０．２、２３．９１±０．２、２５．２８±０．２、２６．０６±０．２、２７．３４±０．２、２７．５１±０．２、および２９．６７±０．２から選択される、２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする。この態様において、該結晶形態物は特に、１０．５２±０．２、１３．８５±０．２、１５．８０±０．２、１７．２６±０．２、および２１．０６±０．２から選択される、２θ値における２つ以上の回折ピークを有する粉末ｘ線回折パターンを特徴とする。

他の態様において、式Ｉの化合物の塩酸塩の結晶水和物は、ピーク位置が実質的に図４に示されたものによる粉末ｘ線回折パターンを特徴とする。

本発明の塩酸塩の結晶水和物はまた、図５に示されるように、約２２５℃から約２５０℃の範囲での結晶の融解で確認される吸熱性の熱流における実質的ピーク、および低温での幅広いまたは弱い吸熱を示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースを特徴とする。さらに、熱重量分析（ＴＧＡ）トレースで、分解温度は約２５０℃以上であることが示されている。

式Ｉの化合物の塩酸塩の結晶水和物は、図６に示されるように、約２％から約９０％の相対湿度の全範囲にわたって、室温で可逆的吸着／脱離プロフィルを有することが実証されている。該結晶水和物は、約４０％と約７５％との間の相対湿度で、約０．２５％未満の重量増加を示す。

本発明のこれらの性質は、以下の実施例においてさらに例示されている。

合成法
活性剤、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドは、下記の実施例に記載された方法を用いて、または本出願の背景の節に挙げられた、本願と同一の譲受人に譲渡された米国特許出願に記載された方法を用いて、容易に入手できる出発材料から調製できる。

本発明の結晶質塩酸塩を調製するために、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドを、典型的に、約１モル当量から約１．２モル当量などの約１モル当量から約１．５モル当量の濃塩酸に接触させる。一般的にこの反応は、約２０℃から約８０℃の範囲の温度で、不活性希釈剤中で行われる。この反応に好適な不活性希釈剤としては、限定はしないが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトニトリル、トルエン、テトラヒドロフラン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

反応が完了したら、本発明の結晶塩を、沈殿、濃縮、遠心分離などの任意の慣例的手段により、該反応混合物から単離する。

１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ
，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩を、約５０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水に溶解することにより、結晶水和物を調製でき、これにより提供される懸濁液から、得られた結晶水和物を慣例的手段により単離できる。

製薬組成物
本発明の結晶塩酸塩形態物は典型的に、製薬組成物の形態で患者に投与される。このような製薬組成物は、限定はしないが、経口、経直腸、経膣、経鼻、吸入、局所（経皮を含む）および非経口の投与様式など、任意の許容できる投与経路によって患者に投与できる。

したがって、本発明は、その組成物態様の１つにおいて、製薬的に許容できる担体または賦形剤ならびに式Ｉの化合物の結晶塩酸塩の治療的有効量を含む製薬組成物に関する。任意に、所望の場合、このような製薬組成物は、他の治療的および／または製剤化剤を含有してもよい。

本発明の製薬組成物は典型的に、本発明の結晶塩の治療的有効量を含有する。典型的に、このような製薬組成物は、約５重量％から約６０重量％の活性剤など、約１重量％から約７０重量％の活性剤を含め、約０．１重量％から約９５重量％の活性剤を含有する。

本発明の製薬組成物中には、任意の慣例的な担体または賦形剤を使用できる。具体的な担体または賦形剤、もしくは担体または賦形剤の組み合わせの選択は、具体的な患者または病状または疾患状態のタイプの治療に用いられる投与様式に依存する。これに関して、具体的な投与様式に対して好適な製薬組成物の調製は、十分に製薬業界者の範囲内にある。また、そのような組成物のための成分は、例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５０８、セントルイス、ミズーリ州 ６３１７８から市販されている。さらに例えば、慣例的な製剤化法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｈｉｔｅ、バルチモア、メリーランド州（２０００）；およびＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｈｉｔｅ、バルチモア、メリーランド州（１９９９）に記載されている。

製薬的に許容できる担体として役立ち得る材料の代表例としては、限定はしないが、以下のものが挙げられる：（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉などの澱粉類；（３）微結晶セルロース、およびその誘導体など、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのセルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバターおよび座剤ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンのない水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）製薬組成物に用いられる他の非毒性適合性物質。

本発明の製薬組成物は、本発明の化合物を、製薬的に許容できる担体および一種または複数種の任意の成分と、十分に完全に混合またはブレンドすることによって典型的に調製される。必要または所望の場合、得られた均一にブレンドされた混合物を次に、慣例的な方法および装置を用いて、錠剤、カプセル剤、丸剤などに形状化または装填することができる。

本発明の製薬組成物は、単位投与量形態にパッケージ化することが好ましい。用語の「単位投与量形態」とは、患者への投与に好適な物理的に個別の単位、すなわち、単独で、または１つまたは複数の追加の単位と組み合わせて、所望の治療的効果を生じさせるように計算された活性剤の予め決められた量を含有する各単位を言う。例えば、このような単位投与量形態は、カプセル剤、錠剤、丸剤などであり得る。

好ましい一実施形態において、本発明の製薬組成物は、経口投与に好適である。経口投与に好適な製薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、舐剤、カシェ剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤の形態であり得るか；または水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤；または水中油もしくは油中水液乳剤；またはエリキシル剤またはシロップ剤；などであり得；各々が活性剤として本発明の化合物の予め決められた量を含有する。

固体投与形態（すなわち、カプセル剤、錠剤、丸剤など）における経口投与が意図される場合、本発明の製薬組成物は典型的に、活性剤としての本発明の化合物、およびクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの、一種または複数種の製薬的に許容できる担体を含む。任意に、または代替として、このような固体投与形態は、以下のものもまた含む；（１）澱粉、微結晶セルロース、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴム；（３）グリセロールなどの湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉またはタピオカ澱粉、アルギン酸、一定のケイ酸塩、および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）セチルアルコールおよび／またはモノステアリン酸グリセロールなどの浸潤剤；（８）カオリンおよび／またはベントナイトなどの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および／またはそれらの混合物；（１０）着色剤；および（１１）緩衝剤。

本発明の製薬組成物中には、放出剤、浸潤剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤ならびに香料、保存剤および抗酸化剤もまた存在し得る。製薬的に許容できる抗酸化剤の例としては以下のものが挙げられる：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸二ナトリウム、異性重硫酸ナトリウム重亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤。錠剤、カプセル剤、丸剤などのためのコーティング剤としては、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸エステルコポリマー、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）など、腸溶コーティングに用いられるものが挙げられる。

所望の場合、本発明の製薬組成物は、例えば、種々の比率でのヒドロキシメチルセルロース；または他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、活性剤の緩徐な、または制御された放出を提供するように製剤化することもできる。

また、本発明の製薬組成物は、任意に、隠蔽剤を含有でき、活性成分を、胃腸管のある一定の部分でのみ、または優先的に、任意に遅延様式で、放出するように製剤化できる。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。活性成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤の一種または複数種と共に、マイクロカプセル化形態においてあり得る。

経口投与用の好適な液体投与形態としては、例えば、製薬的に許容できる乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。このような液体投与形態は典型的に、活性成分、ならびに、例えば、水または他の溶媒などの不活性希釈剤、可溶化剤、およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール類およびソルビタンの脂肪酸エステル類およびそれらの混合物などの乳化剤を含む。懸濁剤は、活性成分に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールならびにソルビタンエステル類、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁化剤を含有できる。

あるいは、本発明の製薬組成物は、吸入による投与のために製剤化される。吸入による投与のための好適な製薬組成物は典型的に、エアロゾルまたは粉末の形態にある。このような組成物は一般的に、用量計測吸入器、ドライパウダー吸入器、ネブライザーまたは類似の送達デバイスなど、周知の送達デバイスを用いて投与される。

減圧容器を用いて吸入により投与される場合、本発明の製薬組成物は典型的に、活性成分、ならびにジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジ
クロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体などの好適な噴射剤を含む。

また、該製薬組成物は、本発明の化合物、ならびに粉末吸入器における使用にとって好適な粉末を含むカプセル剤またはカートリッジの形態にあってもよい。好適な粉末基材としては、例えば、ラクトースまたは澱粉が挙げられる。

本発明の化合物はまた、公知の経皮送達系および賦形剤を用いて、経皮投与もできる。例えば、本発明の化合物を、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールモノラウレート、アザシクロアルカン−２−オン類などの浸透増強剤と混合することができる。所望の場合、このような経皮組成物中に、ゲル化剤、乳化剤および緩衝剤などの追加の賦形剤を使用できる。

以下の製剤は、本発明の典型的な製薬組成物を例示している。

製剤例Ａ
経口投与用のハードゼラチンカプセル剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：成分を完全に混合してからハードゼラチンカプセルに充填する（１カプセル当たり２６０ｍｇの組成物）。

製剤例Ｂ
経口投与用のハードゼラチンカプセル剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：成分を完全に混合してから、４５号メッシュＵ．Ｓ．ふるいを通して、ハードゼラチンカプセルに充填する（１カプセル当たり２００ｍｇの組成物）。

製剤例Ｃ
経口投与用のカプセル剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：成分を完全に混合してからゼラチンカプセルに充填する（１カプセル当たり３１０ｍｇの組成物）。

製剤例Ｄ
経口投与用の錠剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該活性成分、澱粉およびセルロースを４５番メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通し、完全に混合する。得られた粉末とポリビニルピロリドンの溶液とを混合し、次いで、この混合物を１４番メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。このようにして作製された顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、１８番メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。次いで、この顆粒に、カルボキシメチルセルロース澱粉、ステアリン酸マグネシウムおよびタルク（先に６０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通した）を加える。混合後、該混合物を錠剤機で圧縮し１００ｍｇの重量の錠剤を得る。

製剤例Ｅ
経口投与用錠剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該成分を完全に混合してから圧縮して錠剤を形成する（１錠当たり４４０ｍｇの組成物）。

製剤例Ｆ
経口投与用単一刻み目入り錠剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該成分を完全に混合し、圧縮して単一刻み目入り錠剤を形成する（１錠当たり２１５ｍｇの組成物）。

製剤例Ｇ
経口投与用懸濁剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該成分を混合して、懸濁液１０ｍＬ当たり活性成分１０ｍｇを含有する懸濁剤を形成する。

製剤例Ｈ
吸入による投与のためのドライパウダーは以下のとおり調製される：

典型的操作：該活性成分を超微粉砕してからラクトースと混合する。次いで、このブレンドした混合物をゼラチン吸入カートリッジ内へ充填する。粉末吸入器を用いて、該カートリッジの内容物を投与する。

製剤例Ｉ
計測用量吸入器内の吸入による投与のためのドライパウダーは以下のとおり調製される：
典型的操作：２００ｍＬの脱塩水中に溶解させた０．２ｇのレシチンから形成した溶液中に、１０μｍ未満の平均サイズを有する超微粉砕粒子としての活性化合物１０ｇを分散させることによって、本発明の塩を５重量％およびレシチンを０．１重量％含有する懸濁液を調製する。該懸濁液をスプレー乾燥し、得られた物質を、１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子へと超微粉砕する。該粒子を、加圧した１，１，１，２−テトラフルオロエタンと共にカートリッジ内へ充填する。

製剤例Ｊ
注射用製剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：上記成分を混合し、０．５Ｎ ＨＣｌまたは０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを４±０．５に調整する。

製剤例Ｋ
経口投与用のカプセル剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該成分を完全に混合してから、ゼラチンカプセル（サイズ＃１、白、不透明）内へ充填する（１カプセル当たり２６４ｍｇの組成物）。

製剤例Ｌ
経口投与用のカプセル剤は以下のとおり調製される：

典型的操作：該成分を完全に混合してから、ゼラチンカプセル（サイズ＃１、白、不透明）内へ充填する（１カプセル当たり１４８ｍｇの組成物）。

有用性
式Ｉの化合物、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドは、５−ＨＴ_４受容体アゴニストであり、したがって、式Ｉの化合物の当該結晶塩形態物は、５−ＨＴ_４受容体に媒介された、または５−ＨＴ_４受容体活性に関連した病状、すなわち、５−ＨＴ_４受容体アゴニストを用いる治療によって寛解する病状の治療に有用であることが予想される。このような病状としては、限定はしないが、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性便秘症、機能性消化不良症、胃内容排出遅延、逆流性食道炎（ＧＥＲＤ）、胃不全麻痺、糖尿病性特発性胃疾患、術後腸閉塞症、腸偽性閉塞、および薬剤誘導移行遅延が挙げられる。また、いくつかの５−ＨＴ_４受容体アゴニスト化合物は、認知障害、行動障害、気分障害、および自律神経機能の制御障害などの中枢神経系障害の治療に使用できる。

特に、本発明の塩形態物は、胃腸（ＧＩ）管の運動性を高め、したがって、ヒトを含めた哺乳動物における、運動低下に起因するＧＩ管の障害を治療する上で有用であることが予想される。このようなＧＩ運動障害としては、例えば、慢性便秘症、便秘優勢過敏性腸症候群（Ｃ−ＩＢＳ）、糖尿病性および特発性胃疾患、および機能性消化不良症が挙げられる。

したがって、一態様において、本発明は、哺乳動物における胃腸管の運動を高める方法を提供し、該方法は、製薬的に許容できる担体および本発明の結晶塩を含む治療的有効量の製薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む。

５−ＨＴ_４受容体に媒介されたＧＩ管の運動低下障害または他の病態の治療に用いる場合、本発明の塩形態物は典型的に、一日単回投与で、または一日複数回投与で経口投与されるが、他の投与形態も使用できる。一投与当たりの活性剤の量または一日当たり投与される総量は、典型的には、治療される病態、選択された投与経路、投与される実際の化合物およびその相対的活性、年齢、体重、および個々の患者の応答、患者の症状の重症度などの関連状況に鑑みて、医師によって決定される。

５−ＨＴ_４受容体に媒介されたＧＩ管の運動低下障害または他の障害を治療するための好適な用量は、活性剤の約０．０００７ｍｇ／ｋｇ／日から約１ｍｇ／ｋｇ／日など、活性剤の約０．０００７ｍｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であると考えられる。平均７０ｋｇのヒトでは、これは、１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約７０ｍｇ／ｋｇ／日の活性剤の量になる。

本発明の一態様において、本発明の塩形態物は、慢性便秘症の治療に用いられる。慢性便秘症の治療に用いられる場合、本発明の塩は、典型的に、一日単回投与で、または一日複数回投与で、経口投与される。慢性便秘症を治療するための用量は、１日当たり、約０．０５ｍｇから約７０ｍｇの範囲であると考えられる。

本発明の他の態様において、本発明の塩形態物は、過敏性腸症候群の治療に用いられる。便秘優勢過敏性腸症候群の治療に用いられる場合、本発明の塩は、典型的に、一日単回投与で、または一日複数回投与で、経口投与される。便秘優勢過敏性腸症候群を治療するための用量は、１日当たり、約０．０５ｍｇから約７０ｍｇの範囲であると考えられる。

本発明の他の態様において、本発明の塩形態物は、糖尿病性および特発性胃疾患の治療に用いられる。糖尿病性および特発性胃疾患の治療に用いられる場合、本発明の塩は、典型的に、一日単回投与で、または一日複数回投与で、経口投与される。糖尿病性胃疾患を治療するための用量は、１日当たり、約０．０５ｍｇから約７０ｍｇの範囲であると考えられる。

本発明のさらに他の態様において、本発明の塩形態物は、機能性消化不良症の治療に用いられる。機能性消化不良症の治療に用いられる場合、本発明の化合物は、典型的に、一日単回投与で、または一日複数回投与で、経口投与される。機能性消化不良症を治療するための用量は、１日当たり、約０．０５ｍｇから約７０ｍｇの範囲であると考えられる。

本発明はまた、５−ＨＴ_４受容体活性に関連した疾患または病態を有する哺乳動物を治療する方法を提供し、該方法は、本発明の塩形態物、または本発明の塩形態を含む製薬組成物の治療的有効量を、哺乳動物に投与することを含む。

上記のとおり、本発明の塩形態物は、５−ＨＴ_４受容体アゴニストである。したがって、本発明はさらに、哺乳動物において、５−ＨＴ_４受容体に作動する方法を提供し、該方法は、本発明の塩形態物を哺乳動物に投与することがを含む。

本発明の塩酸塩形態物の性質、ならびに有用性は、当業者によく知られた種々のインビトロおよびインビボアッセイを用いて実証することができる。典型的なアッセイは、以下の実施例において、さらに詳細に記載されている。

以下の合成的および生物学的実施例は、本発明を例示するために提供されており、決して本発明の範囲を限定するものとして考えてはならない。下記の実施例において、以下の略号は、別に指示されない限り、以下の意味をもつ。下記に定義されていない略号は、一般に認められている意味をもつものである。

Ｂｏｃ ＝ ｔ−ブトキシカルボニル
（Ｂｏｃ）_２Ｏ ＝ ジ−ｔ−ブチルジカルボネート
ＤＣＭ ＝ ジクロロメタン
ＤＭＦ ＝ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ＝ ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ ＝ エチルアセテート
ｍＣＰＢＡ ＝ ｍ−クロロ安息香酸
ＭｅＣＮ ＝ アセトニトリル
ＭＴＢＥ ＝ ｔ−ブチルメチルエーテル
ＰｙＢｏｐ ＝ ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｒ_ｆ ＝ 保持因子
ＲＴ ＝ 室温
ＴＦＡ ＝ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ ＝ テトラヒドロフラン
試剤（第二級アミンを含む）および溶媒は、民間供給者（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａなど）から購入し、そのまま精製せずに使用した。反応は、別に注記しない限り、窒素雰囲気下で行った。反応混合物の経過は、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、分析用高性能液体クロマトグラフィ（ａｎａｌ．ＨＰＬＣ）、および質量分析によってモニターし、その詳細は、下記および反応の具体的な実施例において個別に提示されている。反応混合物は各反応において具体的に記載されているとおりに作製し；通常、抽出のほか温度および溶媒依存的な結晶化、沈殿などの精製法により精製した。また、反応混合物は分取ＨＰＬＣによって規定通りに精製した。反応生成物の特性解析は、質量分析および^１Ｈ−ＮＭＲ分光法により、規定通りに実施した。ＮＭＲ測定では、サンプルを重水素化溶媒（ＣＤ_３ＯＤ、ＣＤＣｌ_３、またはＤＭＳＯ−ｄ_６）中に溶解し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、標準的な観察条件下、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ２０００機器（３００ＭＨｚ）によって得た。化合物の質量分析による同定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、カリフォルニア州）モデルのＡＰＩ１５０ＥＸ機器またはＡｇｉｌｅｎｔ（パロアルト、カリフォルニア州）モデルの１１００ＬＣ／ＭＳＤ機器による電気スプレー電離法（ＥＳＭＳ）によって実施した。水分含量は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（ウェストベリー、ニューヨーク）のＭｅｔｒｏｈｍ Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｍｏｄｅｌ ８１３クーロメーターを用いて、カールフィッシャー滴定法により判定した。

調製１：（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−８−カルボン酸ｔ−ブチルエステル
ａ．８−ベンジル−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−３−オンの調製
水（１７０ｍＬ）に溶かした２，５−ジメトキシテトラヒドロフラン（８２．２ｇ、０．６２２モル）の不均一溶液に、濃塩酸（３０ｍＬ）を攪拌しながら加えた。０℃（氷浴）に冷却した別のフラスコ内で、水（３５０ｍＬ）に溶かしたベンジルアミン（１００ｇ、０．９３３モル）の溶液に、濃塩酸（９２ｍＬ）を徐々に加えた。２，５−ジメトキシテトラヒドロフラン溶液をおよそ２０分間攪拌し、水（２５０ｍＬ）で希釈し、次に、ベンジルアミン溶液を加え、引き続き、水（４００ｍＬ）に溶かした１，３−アセトンジカルボン酸（１００ｇ、０．６８４モル）の溶液を加え、次いで水（２００ｍＬ）に溶かしたリン酸水素ナトリウム（４４ｇ、０．３１モル）を加えた。４０％ＮａＯＨを用いて、ｐＨをｐＨ１からｐＨ約４．５に調整した。得られた混濁淡黄色溶液を一晩攪拌した。次いで、５０％塩酸を用いて、該溶液をｐＨ７．５からｐＨ３に酸性化し、８５℃に加熱し、２時間攪拌した。該溶液を室温まで冷却し、４０％ＮａＯＨを用いてｐＨ１２に塩基性化し、ジクロロメタン（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合せて、生理食塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、減圧下濃縮し、粘稠な褐色オイルとして、標題の粗中間体を得た。

０℃で、メタノール（１０００ｍＬ）に溶かした該粗中間体の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（７４．６ｇ、０．３４２モル）を加えた。該溶液を室温まで温め、一晩攪拌した。減圧下、メタノールを除去し、得られたオイルをジクロロメタン（１０００ｍＬ）に溶解させた。該中間体を１ＭのＨ_３ＰＯ_４（１０００ｍＬ）中に抽出し、ジクロロメタン（３×２５０ｍＬ）で洗浄した。水層を、水性ＮａＯＨを用いて、ｐＨ１２へ塩基性化し、ジクロロメタン（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合せて乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、減圧下濃縮して、粘稠な淡褐色オイルとして、標題中間体を得た。

ｂ．３−オキソ−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−８−カルボン酸ｔ−ブチルエステルの調製
ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶かした８−ベンジル−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−３−オン（７５ｇ、０．３４８モル）の溶液に、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶かしたジ−ｔ−ブチルジカーボネート（８３．６ｇ、０．３８３モル、１．１当量）を加えた。得られた溶液およびすすぎ液（１００ｍＬのＥｔＯＡｃ）を、窒素流下、２３ｇの水酸化パラジウム（２０重量％のＰｄ、乾燥ベース、炭素上、水で約５０％湿性；例えば、Ｐｅａｒｌｍａｎの触媒）を含有する１ＬのＰａｒｒ水素化容器に加えた。該反応容器を脱気し（真空とＮ_２を交互に５回）、６０ｐｓｉのＨ_２ガスへと加圧した。該反応溶液を２日間攪拌し、適宜Ｈ_２を再供給して、シリカ薄層クロマトグラフィでモニターして反応が完了するまで、Ｈ_２圧を６０ｐｓｉに保たせた。次いで、該黒色溶液をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通してろ過し、減圧下濃縮して、粘稠な黄色から橙色オイルとして、標題中間体を定量的に得た。これをそのまま処理せずに、次のステップに用いた。

ｃ．（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−８−カルボン酸ｔ−ブチルエステルの調製
メタノール（１Ｌ）に溶かした先のステップの生成物（７５．４ｇ、０．３３５モル）の溶液に、Ｎ_２流下、機械的攪拌器により攪拌しながら、フマル酸アンモニウム（４２２．５ｇ、６．７モル）、水（１１５ｍＬ）および活性炭素上パラジウム６５ｇ（乾燥ベース上１０％、水で約５０％湿性；ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ＮＥ／Ｗ）を加えた。２４時間後および４８時間後、各々の時点で、追加部分のフマル酸アンモニウム（１３２ｇ、２．１モル）を加えた。分析用ＨＰＬＣによるモニターで反応の進行が停止したら、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）（＞５００ｇ）を加え、得られた濃厚懸濁液をろ過してから、採取した固体をメタノール（約５００ｍＬ）ですすいだ。ろ液を合せて、全てのメタノールが除去されるまで、減圧下濃縮した。次いで、得られた混濁二相溶液をｐＨ２で約１．５Ｌから２．０Ｌの最終容量まで１Ｍのリン酸で希釈し、ジクロロメタン（３×７００ｍＬ）で洗浄した。水層を、４０％の水性ＮａＯＨを用いて、ｐＨ１２に塩基性化し、ジクロロメタン（３×７００ｍＬ）で抽出した。有機層を合せてＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、回転蒸発、次いで高真空により濃縮し、５２ｇ（７０％）の標題中間体、一般に、Ｎ−Ｂｏｃ−エンド−３−アミノトロパンを、白色から淡黄色固体として得た。この生成物のエンドアミン対エキソアミンの異性体比は、^１Ｈ−ＮＭＲ分析に基づき、＞９９であった（分析用ＨＰＬＣにより＞９６％の純度）。

分析用ＨＰＬＣ（無勾配方法；５分間にわたる９０：１０（Ａ：Ｂ）に対する２：９８（Ａ：Ｂ）：保持時間＝２．１４分）。

調製２：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸
先ず、水（２Ｌ）に溶かした２−アミノフェニルメタノール（２５５．２ｇ、２．０７モル）および酢酸（３．５６ｍＬ、６２ミリモル）の攪拌懸濁液に、室温で、アセトン（２２８．２ｍＬ、３．１１モル）を加えた。４時間後、該懸濁液を０℃に冷却し、さらに２．５時間攪拌してからろ過した。該固体を採取し、水で洗浄し、湿潤固体を凍結乾燥により冷却、乾燥し、２，２−ジメチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ〔１，３〕オキサジン（３３２．２ｇ、９８％）を、オフホワイトの固体として得た。

ＴＨＦ（１Ｌ）に溶かした２，２−ジメチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ〔１，３〕オキサジン（１２５ｇ、０．７７モル）の溶液を、シンチレーション漏斗を介してろ過してから、０℃で、ＴＨＦ（８００ｍＬ）中、１．０ＭのＬｉＡｌＨ_４の攪拌溶液に、２．５時間かけて添加漏斗を介し、滴下により加えた。０℃で、Ｎａ_２ＳＯ_４・１０Ｈ_２Ｏ（１１０ｇ）を、１．５時間かけて部分に分けて徐々に加えることによって、該反応をクエンチした。該反応混合物を一晩攪拌し、ろ過し、固体塩をＴＨＦで完全に洗浄した。ろ液を減圧下濃縮し、２−イソプロピルアミノフェニルメタノール（１２０ｇ、９５％）を黄色オイルとして得た。

トルエン（８００ｍＬ）に溶かした２−イソプロピルアミノフェニルメタノール（１１８ｇ、０．７１モル）の攪拌溶液に、二酸化マンガン（８５％、１８２．６ｇ、１．７９モル）を加え、該反応混合物を１１７℃に４時間加熱した。該反応混合物を一晩、室温まで冷却させてから、Ｃｅｌｉｔｅのパッドを介してろ過し、これをトルエンで溶出した。ろ液を減圧下濃縮し、２−イソプロピルアミノベンズアルデヒド（１０５ｇ、９０％）を橙色オイルとして得た。

０℃で、メタノール（１Ｌ）に溶かした２−イソプロピルアミノベンズアルデヒド（１０５ｇ、０．６４モル）、酢酸（７３．６ｍＬ、１．２９モル）およびエチレンジアミン（４３．０ｍＬ、０．６４モル）の攪拌溶液に、２，２−ジメチル−〔１，３〕ジオキサン−４，６−ジオン、一般にＭｅｌｄｒｕｍの酸（１６６．９ｇ、１．１６モル）を加えた。該反応混合物を０℃で１時間、次いで室温で一晩攪拌した。得られた懸濁液をろ過し、固体をメタノールで洗浄し採取しｔ、標題の中間体、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸を、オフホワイトの固体として得た。

（実施例１：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの合成）
ａ.｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−[１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボニル〕アミノ]−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−
イル｝アミドの調製
３Ｌフラスコ内に、トルエン（１Ｌ）に溶かした１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１１２．４ｇ、０．４８６モル、１．１当量）を懸濁させた。該混合物を８５℃に加熱し、塩化チオニル（８６．７４ｇ、０．７２９モル）を７０分かけて滴下して加えた。該混合物を攪拌しながら９５℃に１．５時間加熱してから、室温まで冷却させた。

別の１２Ｌフラスコに、トルエン（１Ｌ）に溶かした（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクタン−８−カルボン酸ｔ−ブチルエステル（１００．０ｇ、０．４４２モル、１当量）を懸濁させ、３ＭのＮａＯＨ（４当量）を加えた。該混合物を室温で１０分間攪拌してから、約５℃に冷却させた。内部温度を１０℃以下に保ちながら、４０分かけて、酸クロリド溶液を攪拌しながら徐々に加えた。該混合物を３℃〜５℃で３０分間攪拌し、一晩、層分離させた。トルエン層（約２．５Ｌ）を採取し、回転蒸発により、約半分（約１．２Ｌ）に濃縮し、次のステップに直接使用した。

ｂ．１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの調製
先のステップで調製したトルエン溶液（約１．２Ｌ）に、２０℃で２０分かけて、攪拌しながら、トリフルオロ酢酸（２００ｍＬ）を加えた。該混合物を、２０℃で２時間攪拌した。水（１．５５Ｌ）を加え、該混合物を２０℃で３０分間攪拌した。３０分後、該混合物は３層に分かれた。下層（約３５０ｍＬ）の粘稠褐色オイルが粗中間体を含有した。

ＭＴＢＥ（２．８Ｌ）を入れた１２Ｌフラスコに、該粗褐色オイルを、１℃〜２℃で１時間かけて攪拌しながら加えた。該懸濁液を同じ温度で１時間攪拌してからろ過した。ろ液をＭＴＢＥ（２×３００ｍＬ）で洗浄し、室温で４日間、真空下乾燥し、標題中間体のトリフルオロ酢酸塩（１６３．３ｇ）を淡黄色粉末として得た。

ｃ．Ｎ−メチル−Ｎ−〔（Ｓ）−２−オキシラン−２−イルメチル〕メタンスルホンアミドの調製
１２Ｌのフラスコに、水（１Ｌ）を入れ、次いでＮａＯＨ（水中５０％、１４６．８１ｇ、１．８３５モル）を加えた。ＮａＯＨを含むビーカーを水（２×５００ｍＬ）で洗浄し、洗浄液を該フラスコに加えた。該混合物を室温で１０分間攪拌し、約８℃に冷却した。水（５００ｍＬ）に溶かした（Ｎ−メチル）メタンスルホンアミド（２００．２ｇ、１．８３５モル）を５分間かけて加えた。該混合物を、３℃〜４℃で２０時間攪拌した。ジクロロメタン（２Ｌ）を加え、該混合物を５℃〜１０℃で３０分間攪拌した。２層を１０分間かけて分離させ、採取した。有機層（約２．５Ｌ）を１２Ｌフラスコに戻し加えて、１ＭのＨ_３ＰＯ_４（８００ｍＬ）および生理食塩水（８００ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタンを回転蒸発により除去した。粗生成物にトルエン（４００ｍＬ）を加え、回転蒸発により除去した。さらに３サイクルのトルエン処理の後、標題中間体を得（２２８．２ｇ）、これをそのまま精製せずに次のステップに使用した。

ｄ．１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの合成
３Ｌのフラスコ内に、無水エタノール（４００ｍＬ）に溶かした１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドトリフルオロアセテート（１０５．０ｇ、０．２３２モル）を懸濁させた。この懸濁液に、無水エタノール（１００ｍＬ）中に溶解させたＮａＯＨ（水中５０％、０．２４３モル、１．０５当量）を室温で加えた。ＮａＯＨを含むビーカーをエタノール（２×５０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液を該反応混合物に加えた。３０分の攪拌後、無水エタノール（１００ｍＬ）中のＮ−メチル−Ｎ−〔（Ｓ）−２−オキシラン−２−イルメチル〕メタンスルホンアミド（６２．０ｇ、１．５当量）を加えた。該混合物を２時間還流し、室温まで冷却し、標題化合物の種結晶を加えた。約５分の攪拌後、白色固体が形成した。該混合物を３℃〜５℃に冷却し、２時間攪拌した。白色固体をろ過し、湿潤ケークを冷無水エタノール（３×５０ｍＬ）で洗浄した。該固体を、３０℃で６０時間、真空下乾燥し、標題化合物（９３．８ｇ、カールフィッシャー法による含水量は２．０３％）を得た。

種結晶は、結晶化が自然に生じる、本実施例の方法による標題化合物の先の調製から得られた。

（実施例２：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの合成）
１Ｌフラスコ内に、無水エタノール（２１０ｍＬ）中、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸{（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル}アミド（３４．７ｇ、０．０６９モル）を懸濁
させた。室温で濃ＨＣｌ（１．１当量）を攪拌しながら加えた。該混合物を３０分間還流下攪拌し、室温まで冷却させて２時間攪拌した。固体をろ過し、湿潤ケークを冷無水エタノール（３×５０ｍＬ）で洗浄した。該固体を、３０℃で４８時間、真空下乾燥し、標題化合物（３４．５ｇ、収率９３．７％、カールフィッシャー法による含水量は０．１３％）を得た。

（実施例３：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩の結晶水和物合成）
１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザ−ビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド塩酸塩（１３９ｍｇ、０．２８ミリモル）を、注射用滅菌水（２ｍＬ）中に溶解させた。数時間経つと、該溶液は混濁した懸濁液になった。該懸濁液を攪拌し、周囲温度で一晩放置すると、白色沈殿が生じた。固体をろ過により採取し、周囲条件（およそ４０〜５０％の相対湿度）で２分間乾燥して、標題化合物（１３０ｍｇ、収率９１％）を得た。

（実施例４〜９：本発明の塩形態物の性質）
実施例２のとおり調製した、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド（式Ｉの化合物）の結晶塩酸塩のサンプル、および実施例３のとおり調製した、式Ｉの化合物の塩酸塩の結晶水和物のサンプルを、粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）赤外線分光法（ＩＲ）および元素分析により分析した。

（実施例４：粉末ｘ線回折）
Ｓｉ（Ｌｉ）ソリッドステート検出器と共に、１．５４２Å（４５ｋＶ、４０ｍＡ）でのＣｕ Ｋα放射線を用い、Ｔｈｅｒｍｏ ＡＲＬ Ｘ−Ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＸＴＲＡ（Ｔｈｅｒｍｏ ＡＲＬ ＳＡ、スイス国）により、粉末ｘ線回折パターンを得た。この分析は、典型的に、２シータ角における２°から３５°の範囲にわたって、１箇所当たり、０．０３°の段階サイズで、２°／分の走査速度で実施した。分析のため、受領されたサンプル、または微粉末へと粉砕したサンプルのいずれかを、機器のカップ充填サンプルカップにはめ込むようにデザインされた注文の少容量挿入体内へ静かに入れた。±０．０２°の２シータ角以内への機器補正は、シリコン金属標準と比較することにより、毎週検証した。本発明の結晶塩酸塩のサンプルおよび本発明の塩酸塩の水和物のサンプルに関する典型的なＰＸＲＤパターンは、それぞれ図１および図４に示されている。

（実施例５：熱分析）
ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ Ｑ−１００モジュールを用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施した。データを採取し、Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ（商標）ソフトウェア用のＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅを用いて分析した。約１ｍｇ〜１０ｍｇのサンプルを、ふた付きのアルミニウムパン内へ正確に量り入れた。５℃から、典型的には、２６５℃の、１０℃／分の線形加熱ランプを用いて、サンプルを評価した。使用中、ＤＳＣセルを乾燥窒素でパージした。化合物Ｉの結晶塩酸塩のサンプル、および化合物Ｉの塩酸塩の結晶水和物のサンプルに関する典型的なＤＳＣトレースは、それぞれ、図２および図５に示されている。

ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ Ｑ−５００モジュールを用いて、熱重量分析（ＴＧＡ）を実施した。データを採取し、Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ（商標）ソフトウェア用のＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅを用いて分析した。約１ｍｇ〜５ｍｇの重量のサンプルを、白金クレードル上のアルミニウムパン内に入れ、１０℃／分の線形加熱ランプを用いて、周囲温度から３００℃を走査した。使用中、天秤およびファーネスを窒素でパージした。化合物Ｉの結晶質塩酸塩のサンプル、および化合物Ｉの塩酸塩の結晶水和物のサンプルに関する典型的なＴＧＡトレースもまた、それぞれ、図２および図５に示されている。

図２のＤＳＣトレースは、本発明の塩酸塩が、約２３０℃から約２６０℃の範囲において吸熱性の熱流が最大となる優れた熱安定性を有し、約２２５℃以下で有意な熱事象を有さないことを実証している。ＤＳＣトレースとＴＧＡトレースとの比較により、本発明の塩酸塩が、約２３０℃以上の温度で、融解と分解を同時に受けることが示されている。

当該水和物形態に関する図５におけるＤＳＣトレースにより、約２２５℃から約２５０℃の範囲における該結晶が融解する吸熱性の熱流の実質的なピーク、ならびにより低温での幅広い、または弱い吸熱が示されている。ＤＳＣトレースとＴＧＡトレースとの比較により、水和物結晶形態の分解は、融解転移の温度において有意ではないことが示されている。

（実施例６：動的水分吸収の評価）
ＶＴＩ大気微量天秤であるＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ社、ヒアレー、フロリダ州）を用いて、２５℃で、動的水分吸収（ＤＭＳ）評価を実施した。およそ５ｍｇ〜１０ｍｇのサンプルサイズを用い、湿度は、分析開始時、周囲の数値に設定した。典型的なＤＭＳ分析は、３つの走査：５％ＲＨ／段階の走査速度で、周囲湿度から２％相対湿度（ＲＨ）、２％ＲＨから９０％ＲＨ、９０％ＲＨから５％ＲＨからなる。２分おきに質量を測定し、サンプルの質量が５つの連続箇所で０．０２％以内に安定していた場合はＲＨを次の値（±５％ＲＨ）に変化させる。化合物Ｉの結晶塩酸塩のサンプル、および化合物Ｉの塩酸塩の結晶水和物のサンプルに関する典型的なＤＭＳトレースは、それぞれ、図３および図６に示されている。

該塩酸塩は、２％ＲＨから９０％ＲＨの範囲全体にわたる０．２％未満の重量変化で、可逆的な吸着／脱離を示す。該水和物形態は、該サンプルを周囲ＲＨから２％ＲＨへと乾燥させた際、乾燥検体が２％ＲＨから４０％ＲＨに曝された際の水分率である、約２．３％の重量損失を有する吸着／脱離プロフィルを示す。該水和物形態は、４０％ＲＨから７５％ＲＨの範囲で、約０．２５％未満の重量増加であった。

（実施例７：赤外線分析）
Ｎｉｃｏｌｅｔ減衰全反射（ＡＴＲ）サンプルホールダーを装備したＡｖａｔａｒ ３６０ ＦＴ−ＩＲ分光器を用いて、４０００ｃｍ^−１から６７５ｃｍ^−１の周波数範囲にわたって、赤外線（ＩＲ）吸収スペクトルを判定した。本発明の結晶塩酸塩サンプルに関する典型的なＩＲ吸収スペクトルは、７５８±１、７８３±１、７９５±１、８０２±１、９４９±１、９８１±１、１１４９±１、１１５８±１、１２１７±１、１３３２±１、１３７７±１、１４５３±１、１４６７±１、１４８７±１、１５２５±１、１５６６±１、１５７５±１、１６１５±１、１６７２±１、および３１９７±１ｃｍ^−１に有意な吸収バンドを有した。

（実施例８：固体状態の安定性評価）
本発明の塩酸塩サンプルを、４０℃、７５％ＲＨで、複数の開放ガラスバイアルに貯蔵した。特定の間隔で、代表的なバイアルの内容物を取り出し、化学的純度に関して、ＤＳＣ、ＴＧＡ、ＰＸＲＤ、およびＨＰＬＣにより分析した。貯蔵２４週間後、ＤＳＣまたはＴＧＡの温熱図にもＰＸＲＤパターンにも、検出可能な変化は存在しなかった。該貯蔵サンプルの化学的純度は９９．６％であった。

（実施例９：対イオンモル比の判定）
塩酸塩（ＨＡ）対１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド（式Ｉの化合物）の対イオンモル比を、以下の式に従って算出した：
対イオン比＝（Ｗ_ＨＡ／ＭＷ_ＨＡ）／（Ｗ_Ｉ／ＭＷ_Ｉ）
式中、Ｗ_ＨＡは、サンプル中のＨＣｌの重量パーセンテージであり、ＭＷ_ＨＡは、ＨＣｌの分子量であり、ＭＷ_Ｉは、式Ｉの化合物の分子量（５０４．６ａｍｕ）であり、Ｗ_Ｉは、以下の式に従って算出した、サンプル中の式Ｉの化合物の重量パーセンテージであり：
Ｗ_Ｉ＝１００−Ｗ_ＨＸ−Ｗ_Ｈ２Ｏ−Ｗ_ＲＳ
化合物Ｉが不純物を有さないという仮定で、式中、Ｗ_Ｈ２Ｏは、水分含量の重量パーセンテージであり、Ｗ_ＲＳは残留溶媒の重量パーセンテージである。

本発明の結晶塩酸塩のサンプルに関して、塩酸塩対化合物Ｉのモル比は、ＨＣｌ（Ｗ_ＨＡ）の重量パーセンテージの６．３％、および値、Ｗ_Ｈ２Ｏ＝０．２６％およびＷ_ＲＳ＝０．４７％を用いて、０．９４：１と算出された。ＨＣｌ含量は、硝酸銀の標準溶液による滴定により判定し、水分含量Ｗ_Ｈ２Ｏは、電量的カールフィッシャー滴定により判定し、残留溶媒含量Ｗ_ＲＳは、ガスクロマトグラフィにより判定した。

（比較実施例１：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドのクエン酸塩の合成）
１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミド（０．１ｇ、０．２ミリモル）をエタノール（１ｍＬ）中に懸濁させた。この懸濁液に、エタノール（０．０７２ｍＬ、０．０７２ミリモル、０．３３当量）に溶かしたクエン酸の１Ｍ溶液を加えた。該混合物を、清澄になるまで簡単に超音波処理し、ふたをしてから一晩放置した。ふたを取り、該混合物を、周囲条件下で、固体が見られるまで蒸発させた。次いで、該混合物に再度ふたをして、７２時間放置した。得られた固体をろ過し、冷エタノールで洗浄し、標題化合物を固体として得た（７４．３ｍｇ）。

（比較実施例２：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの酸性塩の合成）
比較実施例１の手順に従って、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの以下の酸性塩を、以下の酸（二番目の括弧内に生成物の重量）の指示された当量を用いて、固体形態で調製した：アジピン酸（０．５当量）（４８．５ｍｇ）；リン酸（０．５当量）（８６．６ｍｇ）；硫酸（０．５当量）（２７．０ｍｇ）；酒石酸（０．５当量）（６６．３ｍｇ）；リンゴ酸（０．５当量）（２５．３ｍｇ）；および臭化水素酸（１当量）（６２．９ｍｇ）。

（比較実施例３：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドのメタンスルホン酸塩の合成）
５０％アセトニトリル／水（１ｍＬ）に溶かした１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの溶液に、エタノール（０．２ｍＬ、０．２ミリモル、１当量）に溶かしたメタンスルホン酸の１Ｍ溶液を加えた。次いで、該混合物を凍結させ、一晩凍結乾燥した。得られた固体を緩やかに温めながらイソプロパノール（１ｍＬ）中に溶解させ、冷却させた。得られた固体をろ過により採取し、冷イソプロパノールで洗浄し、標題化合物を固体として得た（９０ｍｇ）。

（比較実施例４：１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの酸性塩の合成）
比較実施例３の手順に従って、１−イソプロピル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸｛（１Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−８−〔（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（メタンスルホニル−メチル−アミノ）プロピル〕−８−アザビシクロ〔３．２．１〕オクト−３−イル｝アミドの以下の酸性塩を、以下の酸（二番目の括弧内に生成物の重量）の指示された当量を用いて、固体形態で調製した：フマル酸（１当量）（１０７．２ｍｇ）；安息香酸（１当量）（１０５．２ｍｇ）；および（Ｒ）−マンデル酸（１当量）（９６．１ｍｇ）。

（比較実施例５：比較実施例１〜４の化合物の性質）
比較実施例１〜４の式Ｉの化合物の検出塩酸塩を、ＰＸＲＤ、ＤＳＣ、およびＴＧＡにより分析した。全ての場合で、約１００℃以下の温度で、ＴＧＡによる重量損失が見られたが、これは、溶媒の損失に起因する可能性が高いと考えられる。溶媒損失に起因する低温特性を除いて、ＤＳＣによって吸熱性熱流が見られた温度、ならびにＰＸＲＤによる結晶性の確認を、表Ｉに要約してあり、ここで、化学量論組成は、該酸性塩の調製に用いられた酸の当量数によって示されている。

アッセイ１：５−ＨＴ_４（ｃ）ヒト受容体に対する放射性リガンド結合アッセイ
ａ．膜調製５−ＨＴ_４（ｃ）
ヒト５−ＨＴ_４（ｃ）受容体ｃＤＮＡ（〔^３Ｈ〕−ＧＲ１１３８０８膜放射性リガンド結合アッセイを用いて判定したＢｍａｘ＝約６．０ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を安定トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞を、３７℃において、５％ＣＯ_２、加湿インキュベーター中、Ｔ−２２５フラスコ内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：Ｃａｔ＃１０４３７）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび（１００ユニット）ペニシリン−（１００μｇ）ストレプトマイシン／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：Ｃａｔ＃１５１４０）を添加した、４，５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコースおよび塩酸ピリドキシン（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ番号１１９６５）を含有するダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。培地へ８００μｇ／ｍＬのジェネテシン（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カタログ番号１０１３１）を添加することによって、細胞を継続的な選択圧下で増殖させた。

細胞は、およそ６０％〜８０％の集密度（＜３５継代培養）まで増殖させた。採取２０〜２２時間前に、細胞を２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭを供給した。膜調製の全ての処置は氷上で実施した。２５ｍＬピペットを用いた緩やかな機械的攪拌と摩砕により、細胞単層を浮揚させた。細胞を１０００ｒｐｍ（５分）での遠心分離により採取した。

膜調製のため、細胞ペレットを氷冷した５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４（膜調製緩衝液）に再懸濁し（３０〜４０ Ｔ２２５フラスコから４０ｍＬ／全細胞産出）、氷上、ポリトロンディスラプター（１９，２×１０秒に設定）を用いて均一化した。得られた均一物を、４℃で５分間、１２００ｇで遠心分離した。ペレットを捨て、上澄み液を、４０，０００ｇ（２０分）遠心分離した。該ペレットは、膜調製緩衝液を用いた再懸濁により１回洗浄し、４０，０００ｇ（２０分）で遠心分離した。最終ペレットを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（アッセイ緩衝液）に再懸濁させた（当量１Ｔ２２５フラスコ／１ｍＬ）。膜懸濁液のタンパク質濃度は、ブラッドフォードの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６年）により判定した。膜は−８０℃で凍結保存した。

ｂ．放射性リガンド結合アッセイ
０．０２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中、２μｇの膜タンパク質を含有する４００μＬの全アッセイ容量において、１．１ｍＬの９６ディープウェルポリプロピレンアッセイプレート（Ａｘｙｇｅｎ）中で、放射性リガンド結合アッセイを実施した。０．００１ｎＭ〜５．０ｎＭの範囲で異なる８〜１２の濃度で、〔^３Ｈ〕−ＧＲ１１３０８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、バックス、英国：カタログ番号ＴＲＫ９４４；比放射能、約８２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、放射性リガンドのＫｄ値決定のための飽和結合試験を実施した。０．１５ｎＭでの〔^３Ｈ〕−ＧＲ１１３８０８および１０ｐＭ〜１００μＭの範囲で異なる１１の濃度の化合物により、化合物のｐＫ_ｉ値決定のための置換アッセイを実施した。

試験化合物は、ＤＭＳＯ中、１０ｍＭの原液として受領し、２５℃で、０．１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に４００μＭに希釈し、同じ緩衝液中に連続（１：５）希釈した。比特異的結合は、１μＭの非標識ＧＲ１１３８０８の存在下で判定した。アッセイは室温で６０分間インキュベートし、次いで、０．３％のポリエチレンイミンに予め浸漬した９６ウェルＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）上での迅速ろ過により、結合反応を終了させた。フィルタープレートをろ過緩衝液（氷冷した５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、非結合の放射能を除去した。プレートを乾燥し、各ウェルに、３５μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション液（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）を加え、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）において、プレートをカウントした。

結合データは、１部位競合に関する３−パラメーターモデルを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンジエゴ、カリフォルニア州）による非線形回帰解析によって解析した。ＢＯＴＴＯＭ（最小曲線）を、１μＭのＧＲ１１３８０８の存在下で決定した非特異的結合に関する値に調整した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９７３年、２２、３０９９−１０８頁）：Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋〔Ｌ〕／Ｋ_ｄ）、式中、〔Ｌ〕＝〔^３Ｈ〕−ＧＲ１１３８０８濃度、を用い、最良適合したＩＣ_５０値、および放射性リガンドのＫ_ｄ値から、Ｐｒｉｓｍにおいて、試験化合物に関するＫ_ｉ値を産出した。結果は、Ｋ_ｉ値の負の十進法対数、ｐＫ_ｉとして表される。

このアッセイにおいて、より高いｐＫ_ｉ値を有する試験化合物は、５−ＨＴ_４受容体に対して、より高い結合親和性を有する。式Ｉの化合物は、このアッセイにおいて、約７．５超のｐＫ_ｉ値を有した。

アッセイ２：５−ＨＴ_３Ａヒト受容体に対する放射性リガンド結合アッセイ：受容体サブタイプ選択性の判定
ａ．膜調製５−ＨＴ_３Ａ
ヒト５−ＨＴ_３Ａ受容体ｃＤＮＡを安定トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞を、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｒｕｅｓｓ博士（ボン大学、東ドイツ）から入手した（〔^３Ｈ〕−ＧＲ６５６３０膜放射性リガンド結合アッセイを用いて判定したＢｍａｘ＝約９．０ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）。３７℃において、５％ＣＯ_２、加湿インキュベーター中、Ｔ−２２５フラスコまたは細胞材料内で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州：カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、および（５０ユニット）ペニシリン−（５０μｇ）ストレプトマイシン／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カタログ番号１５１４０）を添加した、５０％ダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ番号１１９６５）および５０％ハムＦ１２（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カタログ番号１１７６５）中で、細胞を増殖させた。

細胞は、およそ７０％〜８０％の集密度（＜３５継代培養）まで増殖させた。膜調製の全ての処置は氷上で実施した。細胞を採取するために、培地を吸引し、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋のないダルベッコー燐酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）ですすいだ。緩やかな機械的攪拌により、細胞単層を浮揚させた。細胞を１０００ｒｐｍ（５分）での遠心分離により採取した。５−ＨＴ_４（ｃ）受容体を発現する膜に関して、上記のプロトコルに引き続いて膜調製の工程を行った。

ｂ．放射線リガンド結合アッセイ
０．０２５％ＢＳＡアッセイ緩衝液を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中、１．５〜２μｇの膜タンパク質を含有する２００μＬの全アッセイ容量において、９６ウェルポリプロピレンアッセイプレート中で、放射性リガンド結合アッセイを実施した。０．００５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲で１２の異なる濃度で、〔^３Ｈ〕−ＧＲ６５６３０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ボストン、マサチューセッツ州：カタログ番号ＮＥＴ１０１１；比放射能、約８５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、放射性リガンドのＫｄ値決定のための飽和結合試験を実施した。０．５０ｎＭでの〔^３Ｈ〕−ＧＲ６５６３０および１０ｐＭから１００μＭの範囲で１１の異なる濃度の化合物により、化合物のｐＫ_ｉ値決定のための置換アッセイを実施した。化合物は、ＤＭＳＯ中、１０ｍＭの原液として受領し（節３．１を参照）、２５℃で、０．１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に４００μＭに希釈し、連続（１：５）希釈してから同じ緩衝液中に作製した。非特異的結合は、１０μＭの非標識ＭＤＬ７２２２２の存在下で判定した。アッセイは室温で６０分間インキュベートし、次いで、０．３％のポリエチレンイミンに予め浸漬した９６ウェルＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）上での迅速ろ過により、結合反応を終了させた。フィルタープレートをろ過緩衝液（氷冷した５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、非結合の放射能を除去した。プレートを乾燥し、各ウェルに、３５μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション液（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）を加え、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）において、プレートをカウントした。

結合データは、上記の非線形回帰操作を用いて解析し、Ｋ_ｉ値を決定した。ＢＯＴＴＯＭ（最小曲線）を、１０μＭのＭＤＬ７２２２２の存在下で決定した非特異的結合に関する値に調整した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式中の量〔Ｌ〕を、〔^３Ｈ〕−ＧＲ６５６３０濃度として定義した。

５−ＨＴ_４受容体サブタイプに関し、５−ＨＴ_４受容体サブタイプに対する選択性を、Ｋ_ｉ（５−ＨＴ_３Ａ）／Ｋ_ｉ（５−ＨＴ_４（ｃ））比として産出した。このアッセイにおいて、式Ｉの化合物は、約１０００超の５−ＨＴ_４／５−ＨＴ_３受容体サブタイプ選択性を有した。

アッセイ３：ヒト５−ＨＴ_４（ｃ）受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞による細胞全体ｃＡＭＰ蓄積フラッシュアッセイ
このアッセイでは、５−ＨＴ_４受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を種々の濃度の試験化合物に接触させた際に産生されるサイクリックＡＭＰの量を測定することにより、試験化合物の機能的効力を判定した。

ａ．細胞培養
クローン化ヒト５−ＨＴ_４（ｃ）受容体ｃＤＮＡを安定トランスフェクトした、該受容体を発現するＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞を、２種の密度：（１）〔^３Ｈ〕−ＧＲ１１３８０８膜放射性リガンド結合アッセイを用いて判定した約０．５〜０．６ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質の密度で；および（２）約６．０ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質の密度で調製した。３７℃において、５％ＣＯ_２、加湿インキュベーター中、Ｔ−２２５フラスコ内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ−Ｉんヴぃｔろげｎ社：カタログ番号１０４３７）、および（１００ユニット）ペニシリン−（１００μｇ）ストレプトマイシン／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カタログ番号１５１４０）を添加した、４，５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１１９６５）を含有するダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、該細胞を増殖させた。培地へジェネテシン（８００μｇ／ｍＬ：ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カタログ番号１０１３１）を添加することによって、細胞を継続的な選択圧下で増殖させた。

ｂ．細胞調製
細胞は、およそ６０％〜８０％の集密度まで増殖させた。アッセイの２０〜２２時間前に、細胞を２回洗浄し、４，５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１１９６５）を含有する無血清ＤＭＥＭを供給した。該細胞を採取するために、培地を吸引し、各Ｔ−２２５フラスコに１０ｍＬのＶｅｒｓｅｎｅ（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１５０４０）を加えた。細胞を、室温で５分間インキュベートし、次いで、機械的攪拌によってフラスコから移動させた。該細胞懸濁液を等容量の予備加温した（３７℃）ｄＰＢＳを含有する遠心分離管に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを予備加温した（３７℃）刺激緩衝液（２〜３のＴ−２２５フラスコ当たり、１０ｍＭ当量）に再懸濁した。この時間を書きとめ、時間ゼロとして印づけた。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターにより細胞をカウントした（８μｍ以上をカウント、フラスコ収量は、１〜２×１０^７細胞／フラスコ）。予備加温した（３７℃）刺激緩衝液（フラッシュプレートキット内で提供されるような）中、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で、細胞を再懸濁させ、３７℃で１０分間予備インキュベートした。

ｃＡＭＰアッセイは、製造元の指示に従って、^１２５Ｉ−ｃＡＭＰ（ＳＭＰ００４Ｂ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs社、ボストン、マサチューセッツ
州）により、Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用い、放射免疫アッセイ様式において実施した。

細胞は上記のとおり増殖させ、調製した。該アッセイにおける最終細胞濃度は、２５×１０^３細胞／ウェルであり、最終アッセイ容量は、１００μＬであった。試験化合物は、ＤＭＳＯ中、１０ｍＭの原液として受領し、２５℃で、０．１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に４００μＭに希釈し、同じ緩衝液中に連続（１：５）希釈した。１０ｐＭから１００μＭ（最終アッセイ濃度）の範囲の異なる１１の濃度の化合物により、サイクリックＡＭＰ蓄積アッセイを実施した。各プレートについて、５−ＨＴ濃度−応答曲線（１０ｐＭから１００μＭ）を含めた。該細胞を振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートし、各ウェルに、１００μｌの氷冷検出用緩衝液（フラッシュプレートキット内で提供されるような）の添加によって該反応を終了させた。該プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、メリデン、コネチカット州）を用い、シンチレーション近接分光法により、結合した放射能を定量化した。

製造元の使用説明書に提供された指示に従って、反応液の１ｍＬ当たり産生されたｃＡＭＰの量を、ｃＡＭＰ標準曲線から外挿した。３−パラメーターＳ字形用量応答モデル（単一条件つき傾斜）を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージによる非線形回帰解析によって、データを解析した。効力データは、ＥＣ_５０値の負の十進法対数ｐＥＣ_５０値として報告され、ここで、ＥＣ_５０は、最大応答の５０％に関する有効濃度である。

このアッセイでより高いｐＥＣ_５０値を示す試験化合物は、５−ＨＴ_４受容体に作用するより高い効力を有する。約０．５〜０．６ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質の密度を有する細胞系（１）において、このアッセイにおいて試験された式Ｉの化合物は、約７．５超のｐＥＣ_５０値を有した。

アッセイ４：ｈＥＲＧ心臓カリウムチャネルを発現する細胞全体におけるカリウムイオン流阻害のインビトロ電圧固定アッセイ
ｈＥＲＧのｃＤＮＡを安定トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ウィスコンシン大学のＧａｉｌ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎから入手した。細胞は必要時まで低温保存庫に保持した。１０％ウシ胎仔活性および２００μｇ／ｍＬのジェネテシンを添加したダルベッコー修飾イーグル培地／Ｆ１２中で、細胞を増殖させ、継代した。細胞全体電圧固定試験用に単離細胞が選択され得る濃度で、３５ｍｍ^２のディッシュ（２ｍＬの培地を含有）中、ポリ−Ｄ−リシン（１００μｇ／ｍＬ）をコーティングしたガラスのカバースリップ上に、細胞を接種した。該ディッシュは、３７℃で、加湿、５％ＣＯ_２の環境中に維持した。

少なくとも７日ごとに、細胞外溶液を調製し、使用しない時は４℃に保存した。該細胞外溶液は、以下を含有した（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３７）、ＫＣｌ（４）、ＣａＣｌ_２（１．８）、ＭｇＣｌ_２（１）、グルコース（１０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）、ＮａＯＨによりｐＨ７．４。試験化合物の不在下または存在下での細胞外溶液をリザーバ内に入れ、そこからおよそ０．５ｍＬ／分で、該細胞外溶液を記録チャンバーに流入させた。細胞内溶液を調製し、分画し、使用日まで−２０℃で保存した。細胞内溶液は、以下を含有した（ｍＭ）：ＫＣｌ（１３０）、ＭｇＣｌ_２（１）、エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸塩（ＥＧＴＡ）（５）、ＭｇＡＴＰ（５）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）、ＫＯＨによりｐＨ７．２。全ての実験は、室温（２０〜２２℃）で実施した。

細胞を接種したカバースリップを記録チャンバーに移し、継続的に潅流した。該細胞とパッチ電極との間にギガオーム密封を形成した。安定なパッチが達成したら、開始保持電位を−８０ｍＶで、電圧固定様式で記録を始めた。安定な細胞全体電流の達成後、細胞を試験化合物に曝露させた。標準的な電圧プロトコルは：−８０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶへ４．８秒間、５秒間−５０ｍＶに再分極させ、次いで、元の保持電位（−８０ｍＶ）に戻す段階であった。この電圧プロトコルは１５秒ごとに１回行った（０．０６７Ｈｚ）。再分極段階時のピーク電流振幅は、ｐＣｌａｍｐソフトウェアを用いて判定した。細胞上に、３μＭの濃度の試験化合物を５分間潅流させ、次いで化合物の不在下で５分間の洗浄時間をとった。最後に、該細胞の機能を試験するために、陽性対照（シサプリド、２０ｎＭ）を潅流液に加えた。−８０ｍＶから＋２０ｍＶへの段階は、ｈＥＲＧチャネルを活性化し、外向きの電流をもたらす。−５０ｍＶへ戻す段階は、該チャネルが不活化から回復し、非活性化するため、外向きのテール電流をもたらす。

再分極段階時のピーク電流振幅は、ｐＣｌａｍｐソフトウェアを用いて判定した。対照および試験物のデータは、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）に送出し、そこで、個々の電流振幅は化合物不在下の最初の電流振幅へと正規化された。各条件に関する正規化電流の平均および標準誤差を算出し、該実験の時間経過に対してプロットした。

試験物または媒体対照（通常０．３％ＤＭＳＯ）のいずれかに５分間曝露後、観察されたＫ^＋流阻害間で比較を行った。２集団、独立ｔ検定（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ
ｖ．６．０）を用いて、実験群間の統計的比較を実施した。ｐ＜０．０５で差は有意と考えられた。

このアッセイにおいて、カリウムイオン流の阻害パーセンテージが小さいほど、治療薬として用いた場合の試験化合物の心臓再分極化パターンを変化させる潜在能力はより小さくなる。このアッセイにおいて、３μＭの濃度での式Ｉの化合物が試験され、約１５％未満のカリウムイオン流の阻害を示した。

アッセイ５：経口生物学的利用能のインビトロモデル：Ｃａｃｏ−２浸透アッセイ
経口投与後、腸を通過して血流に入る試験化合物の能力をモデル化するために、Ｃａｃｏ−２浸透アッセイを実施した。ヒト小腸単層の密着した接合を模倣してデザインされた細胞単層を溶液中の試験化合物が浸透する速度を判定した。

Ｃａｃｏ−２（大腸、腺癌；ヒト）細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ロックビル、メリーランド州）から入手した。浸透試験では、予め湿らせたトランスウェルポリカーボネートフィルター（Ｃｏｓｔａｒ；ケンブリッジ、マサチューセッツ州）上に、６３，０００細胞／ｃｍ^２の密度で細胞を接種した。培養液中、細胞単層は２１日後に形成された。トランスウェルプレート内での細胞培養後、細胞単層を含有する膜をトランスウェルプレートから引き離し、拡散チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ；ケンブリッジ、マサチューセッツ州）内に挿入した。該拡散チャンバーを、温度制御用に循環外部サーモスタット制御の３７℃水を備えた加熱ブロック内に挿入した。空気多枝管により拡散チャンバーの各半分に９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２が送達され、攪拌されない境界層の減少に効果的な、細胞単層を横切る層流を作り出した。

１００μＭの試験化合物濃度、および単層の完全性をモニターするための^１４Ｃ−マンニトールによって、浸透試験を実施した。全ての実験が、３７℃で６０分間行われた。チャンバーの供給側と受取側の双方から、０分、３０分および６０分でのサンプルを採取した。試験化合物およびマンニトールの濃度に関して、サンプルをＨＰＬＣまたは液体シンチレーションカウンティングにより分析した。ｃｍ／秒での浸透係数（Ｋ_ｐ）を算出した。

このアッセイにおいて、約１０×１０^−６ｃｍ／秒超のＫ_ｐ値が好適な生物学的利用能を示すと考えられる。式Ｉの化合物をこのアッセイにおいて試験すると、約２０×１０^−６ｃｍ／秒超のＫ_ｐ値を示した。

アッセイ６：ラットにおける薬物動態試験
約５と約６の間のｐＨで、０．１％乳酸中、試験化合物の水溶液製剤を調製した。オスのＳＤラット（ＣＤ株、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）に、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与（ＩＶ）により、または５ｍｇ／ｋｇの用量で経口胃管（ＰＯ）により、試験化合物を投与した。投与容量は、ＩＶでは１ｍＬ／ｋｇ、ＰＯ投与では、２ｍＬ／ｋｇであった。動物から、投与前に、ならびに投与後２分（ＩＶのみ）、５分、１５分、および３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間目に、連続血液サンプルを採取した。血漿中の試験化合物濃度は、１ｎｇ／ｍＬの定量化下限で、液体クロマトグラフィ−質量分光分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ、ＡＰＩ４０００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）により判定した。

標準的な薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｎｌｉｎ（４．０．１版、Ｐｈｒｓｉｇｈｔ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて非区画分析（ＩＶにはモデル２０１、ＰＯにはモデル２００）により評価した。血漿中試験化合物濃度の曲線における最大値対時間は、Ｃ_ｍａｘと表される。曲線下面積対投与時間から最後の測定可能濃度までの時間曲線（ＡＵＣ（０−ｔ））を、線形台形則により算出した。経口生物学的利用能、すなわち、ＩＶ投与のＡＵＣ（０−ｔ）に対するＰＯ投与のＡＵＣ（０−ｔ）の用量正規化比は：
Ｆ（％）＝ＡＵＣ_ＰＯ／ＡＵＣ_ＩＶ×用量_ＩＶ／用量_ＰＯ×１００％
として算出した。

このアッセイにおいて、パラメーターＣ_ｍａｘ、ＡＵＣ（０−ｔ）、およびＦ（％）のより大きな値を示す試験化合物は、経口投与された際により大きな生物学的利用能を有することが予想される。式Ｉの化合物は、０．１６μｇ／ｍＬのＣ_ｍａｘ値、０．４６μｇ・時間／ｍＬおよびラットモデルにおける約１９％の生物学的利用能（Ｆ（％））を有した。

本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更ができ、等価物に置換できることは、当業者により理解されるはずである。また、本発明の目的、精神および範囲に対して、特定の状況、材料、物質組成、方法、処理、処理工程または工程に適合させるために、多くの修飾をなすことができる。このような修飾は全て、本明細書に添付した請求項の範囲内にあることが意図されている。また、本明細書において上記で引用した全ての刊行物、特許、および特許文書は、個々に参照として組み込まれているように、全体が本明細書に参照として組み込まれている。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

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