NO339699B1

NO339699B1 - Krystallinsk form av en quinolinonkarboksamidforbindelse

Info

Publication number: NO339699B1
Application number: NO20075574A
Authority: NO
Inventors: Paul Ross Fatheree; Daniel Genov; Robert S Chao; Adam A Goldblum; S Derek Turner
Original assignee: Theravance Biopharma R&D Ip Llc
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2007-11-02
Publication date: 2017-01-23
Also published as: US8658671B2; US9402840B2; WO2006108127A2; EA200702161A1; KR20070116988A; US20100197728A1; HK1110866A1; MY151075A; US20160095849A1; IL186023A; SI1874766T1; US20060229332A1; NZ561900A; US20140256769A1; MX2007012438A; JP2012153725A; BRPI0610657A2; ATE479682T1; EA012115B1; CA2603654A1

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot krystallinske saltformer av en quinolinonkarboksamidforbindelse som er nyttige som 5-HT4reseptoragonister. Oppfinnelsen er også rettet mot farmasøytiske preparater omfattende slike krystallinske forbindelser. Slike forbindelser kan anvendes i behandling av medisinske tilstander formidlet ved 5-HT4reseptoraktivitet. Det er beskrevet fremgangsmåter som er nyttige for fremstilling av slike forbindelser.

Søkerens US Provisional søknad nr. 60/560,076, inngitt 7. april 2004, og US patentsøknad nr. 11/100,113, inngitt6. april 2005, beskriver nye quinolinonkarboksamidforbindelser som ventes å være nyttige for behandling av lidelser med redusert bevegelighet av gastrointestinalkanalen. Spesielt er forbindelsen 1 - isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ]okt-3-yl}amid spesifikt beskrevet i disse søknadene idet den demonstrerer 5-HT4agonistaktivitet. EP 0564650 Al beskriver quinolinderivater anvendelige som 5HT3antagonister.

Den kjemiske strukturen av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^SiJ^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyl]^-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid er representert ved formel I:

For effektivt å anvende denne forbindelsen som et terapeutisk middel, vil det være ønskelig å ha en saltformig fast tilstand som lett kan fremstilles og som har akseptabel kjemisk og fysikalsk stabilitet. For eksempel vil det være meget ønskelig å ha en saltform som er termisk stabil, for eksempel ved temperaturer som overskrider ca. 200°C, og som ikke er hygroskopisk eller væskeopptakende, for derved å lette bearbeidelse og lagring av materialet. Krystallinske faststoffer foretrekkes generelt fremfor amorfe former, for å fremme renhet og stabilitet av det fremstilte produktet. Ingen krystallinske saltformer av forbindelsen av formel I har tidligere vært rapportert. Følgelig eksisterer det et behov for en stabil, krystallinsk saltform av forbindelsen av formel I som verken er hygroskopisk eller væskeopptakende, og som viser fordelaktig termisk stabilitet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(lS,3Æ,5Æ)-8-[(Æ)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid eller et solvat derav. Ifølge et trekk er den krystallinske saltformen ifølge oppfinnelsen et krystallinsk hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I. Ifølge et annet trekk er den krystallinske saltformen ifølge oppfinnelsen et krystallinsk hydrat av hydrokloridsaltet av forbindelsen av formel I.

Overraskende er det krystallinske hydrokloridsaltet ifølge oppfinnelsen funnet å være termisk stabilt ved en temperatur høyere enn ca. 200°C og å vise en vektendring på mindre enn ca. 0,2% ved eksponering mot et område av relativ fuktighet mellom ca. 2% og ca. 90% ved romtemperatur. Videre er verken det krystallinske hydrokloridsaltet ifølge oppfinnelsen eller hydratet derav væskeopptakende når det eksponeres mot opp til 90% relativ fuktighet ved romtemperatur.

Blant andre anvendelser er de krystallinske saltformene ifølge oppfinnelsen ventet å

være nyttige for fremstilling av farmasøytiske preparater for behandling av lidelser med redusert motilitet av gastrointestinalkanalen. Ifølge et annet av sammensetningstrekkene tilveiebringer oppfinnelsen følgelig et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid eller et solvat derav.

Oppfinnelsen kan anvendes i fremgangsmåte for behandling av en sykdom eller lidelse forbundet med 5-HT4reseptoraktivitet, f. eks. en lidelse med redusert motilitet av gastrointestinalkanalen, idet fremgangsmåten omfatter administrering til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^S^S^-S-t^^-hydroksy-S-^etansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid eller et solvat derav.

Ifølge et fremgangsmåteaspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen, idet fremgangsmåten omfatter å bringe i kontakt l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^S.R^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyl]^-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid med saltsyre for å danne en reaksjonsblanding, og isolering av det krystallinske hydrokloridsaltet fra reaksjonsblandingen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen som beskrevet heri for anvendelse innen terapi eller som et medikament, så vel som anvendelsen av et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av et medikament, spesielt for fremstillingen av et medikament for å behandle en lidelse med redusert motilitet av gastrointestinalkanalen i et pattedyr.

Forskjellige trekk ved oppfinnelsen illustreres med referanse til de ledsagende tegningene. Figur 1 viser et røntgenpulverdiffraksjonsmønster (PXRD) av et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^S.R^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyl]^-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen. Figur 2 viser et differensielt sveipkalorimetri (DSC) spor (bunnspor, høyre side vertikal akse) og et termisk gravimetrisk analyse (TGA) spor (toppspor, venstre side vertikal akse) for et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen. Figur 3 viser et dynamisk fuktighetssorpsjon (DMS) spor for et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^SiJ^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyll-S-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen. Figur 4 viser et røntgenpulverdiffraksjonsmønster (PXRD) av et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^S.R^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyl]^-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen. Figur 5 viser et differensielt sveipkalorimetri (DSC) spor (toppspor, venstre side vertikal akse) og et termisk gravimetrisk analyse (TGA) spor (bunnspor, høyre side

vertikal akse) for et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3i2,5i2)-8-[(i2)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen.

Figur 6 viser et dynamisk fuktighetssorpsjon (DMS) spor for et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^SiJ^^-S-t^^-hydroksy-S-Cmetansulfonyl-metyl-am^propyll-S-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(lS,3Æ,5Æ)-8-[(Æ)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.l]okt-3-yl}amid og solvater derav.

Ved beskrivelse av forbindelsene, preparatene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen har følgende betegnelser følgende betydninger, med mindre annet er angitt.

Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" betyr en mengde som er tilstrekkelig til å bevirke behandling når den administreres til en pasient som har behov for behandling.

Betegnelsen "behandling" som anvendt heri betyr behandlingen av en sykdom, lidelse eller medisinsk tilstand i en pasient, så som et pattedyr (spesielt et menneske) som omfatter: (a) forhindring av at sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden opptrer, dvs. profylaktisk behandling av en pasient; (b) lettelse av sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden, dvs. eliminering eller regresjon av sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden i en pasient; (c) undertrykkelse av sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden, dvs. retardasjon eller stopping av utviklingen av sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden i en pasient; eller (d) lettelse av symptomene på sykdommen, lidelsen eller den medisinske tilstanden i en pasient.

Betegnelsen "solvat" betyr et kompleks eller et aggregat dannet ved ett eller flere molekyler av et oppløst stoff, dvs. en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og ett eller flere molekyler av et oppløsningsmiddel. Slike solvater er typisk krystallinske faststoffer som har et i det vesentlige fiksert molart forhold mellom oppløst stoff og oppløsningsmiddel. Representative oppløsningsmidler omfatter eksempelvis vann, metanol, etanol, isopropanol, eddiksyre og lignende. Når oppløsningsmidlet er vann, er det dannede solvatet spesifikt betegnet et hydrat.

Betegnelsen "krystallinsk hydrokloridsalt" som anvendt heri betyr et krystallinsk faststoff som ikke omfatter en betydelig fastsatt molar fraksjon av oppløsningsmolekyler i krystallgitteret, dvs. et som ikke er et solvat. Solvater, eller spesifikt hydrater, ifølge oppfinnelsen identifiseres eksplisitt.

Det skal bemerkes at i beskrivelsen og de etterfølgende kravene kan entallsformer "en", "ei" og "et" og "det" eller "den" omfatte henvisning til flertallsformer, med mindre sammenhengen tyder på det motsatte.

Betegnelsen "aminobeskyttende gruppe" betyr en beskyttende gruppe egnet for å forebygge uønskede reaksjoner ved et aminonitrogen. Representative aminobeskyttende grupper omfatter, men er ikke begrenset til, formyl; acylgrupper, for eksempel alkanoylgrupper, så som acetyl; alkoksykarbonylgrupper, så som tert-butoksykarbonyl (Boe); arylmetoksykarbonylgrupper, så som benzyloksykarbonyl (Cbz) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc); arylmetylgrupper, så som benzyl (Bn), trityl (Tr) og l,l-di-(4'-metoksyfenyl)metyl; silylgrupper, så som trimetylsilyl (TMS) og tert-butyldimetylsilyl (TBDMS); og lignende.

Aktivt middel

Det aktive midlet i de foreliggende saltformene, dvs. forbindelsen av formel I, er betegnet l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3i2,5i2)-8-[(i2)-2-hydroksy-3 -(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] - 8-azabicyklo [3.2.1] okt-3 -yl} amid ved å anvende den kommersielt tilgjengelig AutoNom software (MDL Information systems, GmbH, Frankfurt, Tyskland). Betegnelsen (\ S, 3R, 5R) beskriver den relative orienteringen av bindingene assosiert med det bicykliske ringsystemet. Forbindelsen betegnes alternativt som jV-[(3-e«<iø)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl] -1 -(1 -metyletyl)-2-okso-1,2-dihydro-3 - quinolinkarboksamid.

Saltformer ifølfie oppfinnelsen

Ifølge et trekk tilveiebringer oppfinnelsen krystallinsk l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3i2,5i2)-8-[(i2)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amidhydroklorid.

Et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen inneholder typisk mellom ca. 0,8 og ca. 1,2 molarekvivalenter av saltsyre per molarekvivalent av forbindelsen av formel I, innbefattende mellom ca. 0,9 og ca. 1,1 molarekvivalenter av saltsyre per molarekvivalent av forbindelsen av formel I.

Molarforholdet mellom saltsyre og det aktive midlet kan lett bestemmes ved fremgangsmåter som er tilgjengelige for fagmannen. For eksempel kan slike molarforhold lett bestemmes ved hjelp av titrering med en standard oppløsning av sølvnitrat. Alternativt kan elementanalyse, 'H-NMR og ionekromatografimetoder anvendes for å bestemme molforholdet.

Ifølge et trekk er det krystallinske hydrokloridsaltet ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster (PXRD) som har to eller flere diffraksjonstopper ved 29 verdier valgt fra 4,41 ±0,2, 8,82 ±0,2, 9,08 ±0,2, 11,21 ±0,2, 14,40 ±0,2, 16,42 ±0,2, 17,35 ±0,2, 17,61 ±0,2, 18,14 ±0,2, 19,04 ±0,2, 19,95 ±0,2, 20,20 ±0,2, 21,23 ±0,2, 22,13 ±0,2, 22,48±0,2, 22,83 ±0,2, 24,16 ±0,2, 25,37 ±0,2, 25,56 ±0,2, 26,22 ±0,2, 27,33 ±0,2, 29,08 ±0,2 og 29,61 ±0,2.1 dette trekket er spesielt den krystallinske formen kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster som har to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 14,40 ±0,2, 17,35 ±0,2, 17,61 ±0,2, 19,04 ±0,2, 21,23 ±0,2 og 22,13 ±0,2.

Som velkjent innenfor feltet røntgenpulverdiffraksjon, er topposisjoner av PXRD-spektere relativt mindre følsomme mot eksperimentelle detaljer, så som detaljer ved prøvepreparering og instrumentgeometri, enn de relative topphøydene. I et trekk er følgelig et krystallinsk hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster hvori topposisj onene er i det vesentlige i samsvar med de vist i Figur 1.

Det krystallinske hydrokloridsaltet ifølge foreliggende oppfinnelse er også kjennetegnet ved høytemperatur termisk stabilitet som det fremgår fra dets differensielle sveipkalorimetri (DSC) spor som viser en topp i endotermisk varmestrøm i området på ca. 230°C til ca. 260°C, som vist i Figur 2. Videre viser det termiske gravimetriske analyse (TGA) sporet ingen signifikant termisk hendelse under ca. 225°C.

Ifølge nok et annet trekk er et krystallinsk hydrokloridsalt kjennetegnet ved dets infrarøde absorpsjonsspektrum som viser signifikante absorpsjonsbånd ved ca. 758, 783, 795, 802, 949, 981, 1149, 1158, 1217, 1332, 1377, 1453, 1467, 1487, 1525, 1566, 1575, 1615, 1672 og 3197 cm"<1>.

Et krystallinsk hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I er demonstrert å ha en reversibel sorpsjons/desorpsjonsprofil med et eksepsjonelt lavt hygroskopisitetsnivå

(dvs. mindre enn ca. 0,2 vekt-% økning i fuktighetsområdet på 2% relativ fuktighet til 90% relativ fuktighet ved romtemperatur) som vist i Figur 3.

I tillegg er det krystallinske hydrokloridsaltet av forbindelsen av formel I funnet å være stabilt ved eksponering mot forhøyet temperatur og fuktighet i et utvidet tidsrom. For eksempel ved lagring i 24 uker ved 40°C og 75% relativ fuktighet viste analyse ved HPLC ingen kjemisk nedbrytning og det var ingen detekterbare endringer i resultatene fra DSC, TGA eller PXRD.

Ifølge et annet trekk tilveiebringer oppfinnelsen et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I.

Ifølge et trekk er et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjons (PXRD) mønster som har to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 5,30 ±0,2, 7,43 ±0,2, 8,72 ±0,2, 10,52 ±0,2, 13,85 ±0,2, 14,11 ±0,2, 15,80 ±0,2, 15,99 ±0,2, 17,26 ±0,2, 19,53 ±0,2, 20,08 ±0,2, 21,06 ±0,2, 21,48 ±0,2, 21,92 ±0,2, 22,85 ±0,2, 23,91 ±0,2, 25,28 ±0,2, 26,06 ±0,2, 27,34 ±0,2, 27,51 ±0,2 og 29,67 ±0,2.1 dette trekket er spesielt den krystallinske formen kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster som har to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 10,52 ±0,2, 13,85 ±0,2, 15,80 ±0,2, 17,26 ±0,2 og 21,06 ±0,2.

Ifølge et annet trekk er et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster hvori topposisjonene er i det vesentlige i samsvar med de vist i Figur 4.

Det krystallinske hydratet av et hydrokloridsalt ifølge foreliggende oppfinnelse er også kjennetegnet ved dets differensielle sveipkalorimetri (DSC) spor som viser en vesentlig topp i en endotermisk varmestrøm identifisert med smelting av krystallen i området på ca. 225°C til ca. 250°C, med brede eller svake endotermer ved lavere temperaturer som vist i Figur 5. Videre viser det termiske gravimetriske analyse (TGA) sporet at nedbrytningstemperaturen er over ca. 250°C.

Et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av forbindelsen av formel I er demonstrert å ha en reversibel sorpsjons/desorpsjonsprofil ved romtemperatur over hele området på ca. 2% til ca. 90% relativ fuktighet, som vist i Figur 6. Det krystallinske hydratet viser mindre enn ca. 0,25 vekt-% økning mellom ca. 40% og ca. 75% relativ fuktighet.

Disse egenskapene av saltformene ifølge foreliggende oppfinnelse er videre illustrert i eksemplene nedenfor.

Syntetiske fremfianfismåter

Det aktive midlet, l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^SiJ^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyll-S-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid, kan fremstilles fra lett tilgjengelige utgangsmaterialer ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene nedenfor, eller ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i søkerens andre US-søknader angitt ovenfor.

For å fremstille et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen, blir 1 -isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(lS^Æ^-S-KÆ^-hydroksy-S-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid typisk brakt i kontakt med ca. 1 til ca. 1,5 molarekvivalenter, innbefattende fra ca. 1 til ca. 1,2 molarekvivalenter, av konsentrert saltsyre. Generelt gjennomføres denne reaksjonen i et inert fortynningsmiddel ved en temperatur varierende fra ca. 20°C til ca. 80°C. Egnede inerte fortynningsmidler for denne reaksjonen omfatter, men er ikke begrenset til, etanol, metanol, isopropanol, etylacetat, acetonitril, toluen, tetrahydrofuran og kombinasjoner derav.

Ved fullførelse av reaksjonen isoleres et krystallinsk salt ifølge oppfinnelsen fra reaksjonsblandingen ved en hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte, så som utfelling, konsentrasjon, sentrifugering og lignende.

Det krystallinske hydratet kan fremstilles ved å oppløse hydrokloridsaltet av 1-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3i2,5i2)-8-[(i2)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid i vann ved en konsentrasjon over ca. 50 mg/ml, hvilket tilveiebringer en suspensjon hvorfra det resulterende krystallinske hydratet kan isoleres ved konvensjonelle fremgangsmåter.

Farmasøytiske preparater

De krystallinske hydrokloridsaltformene ifølge oppfinnelsen administreres typisk til en pasient i form av et farmasøytisk preparat. Slike farmasøytiske preparater kan administreres til pasienten ved en hvilken som helst administrasjonsmåte omfattende, men ikke begrenset til, oral, rektal, vaginal, nasal, inhalert, topisk (innbefattende transdermal) og parenteral administrering.

Ifølge et av preparattrekkene er oppfinnelsen følgelig rettet mot et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller et hjelpestoff og en terapeutisk effektiv mengde av et krystallinsk hydrokloridsalt av en forbindelse av formel I. Eventuelt kan slike farmasøytiske preparater inneholde andre terapeutiske og/eller formuleringsmidler om ønsket.

De farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen inneholder typisk en terapeutisk effektiv mengde av et krystallinsk salt ifølge foreliggende oppfinnelse. Typisk vil slike farmasøytiske preparater inneholde fra ca. 0,1 til ca. 95 vekt-% av det aktive midlet, innbefattende fra ca. 1 til ca. 70 vekt-%, så som fra ca. 5 til ca. 60 vekt-% av det aktive midlet.

Hvilken som helst konvensjonell bærer eller hjelpestoff kan anvendes i de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen. Valget av en spesiell bærer eller hjelpestoff, eller kombinasjoner av bærere eller hjelpestoffer, vil avhenge av administreringsmåten som anvendes for å behandle en spesiell pasient eller typen medisinsk tilstand eller sykdomstilstand. I dette henseende er fremstillingen av et egnet farmasøytisk preparat for en spesiell administreringsmåte innenfor kunnskapen til en fagmann innenfor farmasøytisk teknikk. I tillegg er bestanddeler for slike preparater kommersielt tilgjengelige fra for eksempel Sigma, P. O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Som ytterligere illustrasjon, er konvensjonelle formuleringsteknikker beskrevet i Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20. utgave, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); og H. C. Ansel et al., PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. utgave, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Representative eksempler på materialer som kan tjene som farmasøytisk akseptable bærere omfatter, men er ikke begrenset til, følgende: (1) sukkere, så som laktose, glukose og sukrose; (2) stivelser, så som maisstivelse og potetstivelse; (3) cellulose, så som mikrokrystallinsk cellulose, og dets derivater, så som natriumkarboksymetyl-cellulose, etylcellulose og celluloseacetat; (4) pulverisert tragakant; (5) malt; (6) gelatin; (7) talk; (8) hjelpestoffer, så som kakaosmør og suppositorievokser; (9) oljer, så som peanøttolje, bomullsfrøolje, solsikkeolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og soyabønneolje; (10) glykoler, så som propylenglykol; (11) polyoler, så som glycerol, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; (12) estere, så som etyloleat og etyllaurat; (13) agar; (14) bufrende midler, så som magnesiumhydroksid og aluminiumhydroksid; (15) alginsyre; (16) pyrogenfritt vann; (17) isotonisk saltvann; (18) Ringers oppløsning; (19) etylalkohol; (20) fosfatbufferoppløsninger; og (21) andre ikke-toksiske kompatible stoffer anvendt i farmasøytiske preparater.

De farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen fremstilles typisk ved grundig og omhyggelig blanding eller sammenblanding av en forbindelse ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk akseptabel bærer og en eller flere valgfrie bestanddeler. Om nødvendig eller ønsket, kan den resulterende uniformt blandede blandingen deretter formes eller fylles i tabletter, kapsler, piller og lignende ved å anvende konvensjonelle fremgangsmåter og utstyr.

De farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis forpakket i en enhetsdoseringsform. Betegnelsen "enhetsdoseringsform" refererer til en fysisk adskilt enhet som er egnet for dosering til en pasient, dvs. hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde aktiv bestanddel beregnet for å fremkalle den ønskede terapeutiske effekten enten alene eller i kombinasjon med en eller flere ytterligere enheter. For eksempel kan slike enhetsdoseringsformer være kapsler, tabletter, piller og lignende.

I en foretrukket utførelsesform er de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen egnede for oral administrering. Egnede farmasøytiske preparater for oral administrering kan være i form av kapsler, tabletter, piller, sugetabletter, poser, dragéer, pulvere, korn; eller som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske; eller som en olje-i-vann eller vann-i-olje emulsjon; eller som en eliksir eller sirup; og lignende; hver inneholdende en på forhånd bestemt mengde av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som en aktiv bestanddel.

Når den er ment for oral administrering i en fast doseringsform (dvs. som kapsler,

tabletter, piller og lignende), vil de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen typisk omfatte en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som den aktive bestanddelen og en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, så som natriumsitrat eller dikalsiumfosfat. Eventuelt eller alternativt kan slike faste doseringsformer også omfatte: (1) fyllstoffer eller drøyemidler, så som stivelser, mikrokrystallinsk cellulose, laktose, sukrose, glukose, mannitol og/eller kiselsyre; (2) bindemidler, så som karboksymetylcellulose, alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukrose og/eller akasie; (3) fuktiggjørende midler, så som glycerol; (4) sprengmidler, så som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet-eller tapiokastivelse, alginsyre, visse silikater og/eller natriumkarbonat; (5) oppløsningsretarderende midler, så som parafin; (6) absorpsjonsakseleratorer, så som kvaternære ammoniumforbindelser; (7) fuktemidler, så som cetylalkohol og/eller glycerolmonostearat; (8) absorpsjonsmidler, så som kaolin og/eller bentonittleire; (9) smøremidler, så som talk, kalsiumstearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat og/eller blandinger derav; (10) fargemidler og (11) bufrende midler.

Slippmidler, fuktemidler, beleggingsmidler, søtningsmidler, smaksmidler og parfymerende midler, konserveringsmidler og antioksidanter kan også være til stede i de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen. Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter omfatter: (1) vannoppløselige antioksidanter, så som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfat-natriumsulfitt og lignende; (2) oljeoppløselige antioksidanter, så som askorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfa-tokoferol og lignende; og (3) metall-chelaterende midler, så som sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og lignende. Beleggingsmidler for tabletter, kapsler, piller og lignende omfatter de anvendt for enteriske belegg, så som celluloseacetatftalat (CAP), polyvinylacetatftalat (PVAP), hydroksypropyl-metylcelluloseftalat, metakrylsyre-metakrylsyreesterkopolymerer, celluloseacetat-trimellitat (CAT), karboksymetyletylcellulose (CMEC), hydroksypropylmetyl-celluloseacetatsuccinat (HPMCAS), og lignende.

Om ønsket, kan de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse også formuleres for å tilveiebringe langsom eller kontrollert frigivelse av den aktive bestanddelen ved for eksempel å anvende hydroksypropylmetylcellulose i varierende andeler, eller andre polymermatrikser, liposomer og/eller mikrosfærer.

I tillegg kan de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse eventuelt

inneholde opacifiserende midler og formuleres slik at de frigir den aktive bestanddelen bare, eller fortrinnsvis, i en viss del av gastrointestinalkanalen, eventuelt på en forsinket måte. Eksempler på innstøpingssammensetninger som kan anvendes omfatter polymere stoffer og vokser. Den aktive bestanddelen kan også være i mikroinnkapslet form, om egnet, med ett eller flere av de ovenfor omtalte hjelpestoffene.

Egnede flytende doseringsformer for oral administrering omfatter som illustrasjon farmasøytisk akseptable emulsjoner, mikroemulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. Slike flytende doseringsformer omfatter typisk den aktive bestanddelen og et inert fortynningsmiddel, så som for eksempel vann eller andre oppløsningsmidler, oppløseliggjørende midler og emulgeringsmidler, så som etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, oljer (spesielt bomullsfrø-, jordnøtt-, mais-, kim-, oliven-, ricinus- og sesamolje), glycerol, tetrahydrofurylalkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan, og blandinger derav. Suspensjoner kan, i tillegg til den aktive bestanddelen, inneholde suspenderende midler så som for eksempel etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksyetylensorbitol og sorbitanestere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminiummetahydroksid, bentonitt, agar-agar og tragakant, og blandinger derav.

Alternativt formuleres de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen for administrering ved inhalering. Egnede farmasøytiske preparater for administrering ved inhalering vil typisk være i form av en aerosol eller et pulver. Slike preparater administreres generelt ved anvendelse av velkjente avleveringsinnretninger, så som en inhalator med utmålt dose, tørrpulverinhalator, forstøvningsinnretning eller en tilsvarende avleveringsinnretning.

Når de administreres ved inhalering ved anvendelse av en trykksatt beholder, vil de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen typisk omfatte den aktive bestanddelen og et egnet drivmiddel, så som diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller annen egnet gass.

I tillegg kan det farmasøytiske preparatet være i form av en kapsel eller patron (for eksempel fremstilt fra gelatin) omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen og et pulver egnet for anvendelse i en pulverinhalator. Egnede pulverbasiser omfatter, eksempelvis, laktose eller stivelse.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan også administreres transdermalt ved anvendelse av kjente transdermale avleveringssystemer og hjelpestoffer. For eksempel kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen administreres med permeeringsfremmende midler, så som propylenglykol, polyetylenglykolmonolaurat, azacykloalkan-2-oner og lignende, og inkorporeres i et plaster eller lignende avleveringssystem. Ytterligere hjelpestoffer, innbefattende geleringsmidler, emulgeringsmidler og buffere, kan anvendes i slike transdermale preparater dersom det er ønsket.

De følgende formuleringene illustrerer de representative farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse:

Formuleringseksempel A

Hårdgelatinkapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremfianfismåte:

Bestanddelene blandes grundig og fylles deretter i en hårdgelatinkapsel (260 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel B

Hårdgelatinkapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og føres deretter gjennom en 45 mesh US sikt og fylles i en hårdgelatinkapsel (200 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel C

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og fylles deretter i en gelatinkapsel (310 mg preparat per kapsel). Formuleringseksempel D

Representativ fremgangsmåte:

Den aktive bestanddelen, stivelse og cellulose føres gjennom en 45 US mesh sikt og blandes grundig. Oppløsningen av polyvinylpyrrolidon blandes med de resulterende pulverne, og denne blandingen føres gjennom en 14 US mesh sikt. De derved fremstilte kornene tørkes ved 50-60°C og føres gjennom en 18 US mesh sikt. Natriumkarboksymetylstivelsen, magnesiumstearatet og talk (på forhånd ført gjennom en 60 US mesh sikt) tilsettes deretter til kornene. Etter blanding, komprimeres blandingen på en tablettmaskin for å gi en tablett med vekt 100 mg.

Formuleringseksempel E

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og komprimeres deretter for å danne tabletter (440 mg preparat per tablett). Formuleringseksempel F

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og komprimeres for å danne en tablett med enkeltdelelinje (215 mg preparat per tablett).

Formuleringseksempel G

En suspensjon for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes for å danne en suspensjon inneholdende 10 mg aktiv bestanddel per 10 ml suspensjon.

Formuleringseksempel H

Et tørrpulver for administrering ved inhalering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Den aktive bestanddelen mikroniseres og blandes deretter med laktose. Den blandede blandingen fylles deretter i en gelatininhaleringspatron. Innholdet av patronen administreres ved å anvende en pulverinhalator.

Formuleringseksempel I

Et tørrpulver for administrering ved inhalering i en inhalator med utmålt dose fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

En suspensjon inneholdende 5 vekt-% av et salt ifølge oppfinnelsen og 0,1 vekt-% lecitin fremstilles ved å dispergere 10 g aktiv forbindelse som mikroniserte tabletter med midlere størrelse mindre enn 10 um i en oppløsning dannet fra 0,2 g lecitin oppløst i 200 ml demineralisert vann. Suspensjonen spraytørkes og det resulterende materiale mikroniseres til tabletter som har en midlere diameter på mindre enn 1,5 um. Partiklene fylles i patroner med trykksatt 1,1,1,2-tetrafluoretan.

Formuleringseksempel J

Et injiserbart preparat fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene ovenfor blandes og pH justeres til 4 ±0,5 ved anvendelse av 0,5 N HC1 eller 0,5 N NaOH.

Formuleringseksempel K

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og fylles deretter i en gelatinkapsel (størrelse nr. 1, hvit, opak) (264 mg preparat per kapsel).

Formuleringseksempel L

Kapsler for oral administrering fremstilles som følger:

Representativ fremgangsmåte:

Bestanddelene blandes grundig og fylles deretter i en gelatinkapsel (størrelse nr. 1, hvit, opak) (148 mg preparat per kapsel).

Anvendelighet

Forbindelsen av formel I, l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l^SiJ^^-S-t^^-hydroksy-S^metansulfonyl-metyl-am^propyll-S-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid, er en 5-HT4reseptoragonist og derfor er de foreliggende krystallinske saltformene av forbindelsen av formel I ventet å være nyttige for behandling av medisinske tilstander formidlet ved 5-HT4reseptorer eller assosiert med 5-HT4reseptoraktivitet, dvs. medisinske tilstander som lettes ved behandling med en 5-HT4reseptoragonist. Slike medisinske tilstander omfatter, men er ikke begrenset til, irritabel tarmsyndrom (IBS), kronisk konstipasjon, funksjonell dyspepsi, forsinket magetømming, gastroøsofageal reflukssykdom (GERD), gastroparese, diabetisk og idiopatisk gastropati, post-operativ ileus, intestinal pseudo-obstruksjon og legemiddelindusert forsinket gjennomgang. I tillegg er det antydet at noen 5-HT4reseptoragonistforbindelser kan anvendes ved behandlingen av lidelser i sentralnervesystemet innbefattende kognitive lidelser, oppførselsmessige forstyrrelser, stemningsforstyrrelser og forstyrrelser med kontroll av autonomisk funksjon.

Spesielt øker saltformene ifølge oppfinnelsen motiliteten av gastrointestinal (GI) kanalen og er derfor ventet å være nyttige for behandling av lidelser i GI-kanalen som er forårsaket av redusert motilitet i pattedyr, innbefattende mennesker. Slike GI motilitetslidelser omfatter, som illustrasjon, kronisk konstipasjon, konstipasjon-dominerende irritabel tarmsyndrom (C-IBS), diabetisk og idiopatisk gastroparese og funksjonell dyspepsi.

Ifølge et aspekt kan oppfinnelsen derfor anvendes i en fremgangsmåte for å øke motiliteten av gastrointestinalkanalen i et pattedyr, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et krystallinsk salt ifølge oppfinnelsen.

Når de anvendes for å behandle sykdommer med redusert motilitet av GI kanalen eller andre lidelser formidlet ved 5-HT4reseptorer, vil saltformene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt daglig dose eller i flere doser per dag, selv om andre administreringsformer kan anvendes. Mengden av det aktive midlet administrert per dose eller den samlede mengden administrert per dag bestemmes typisk av en lege, i lys av de relevante forholdene, innbefattende tilstanden som skal behandles, den valgte administrasjonsmåten, den reelle forbindelsen som administreres og dens relative aktivitet, alder, vekt og respons hos den individuelle pasienten, graden av pasientens symptomer og lignende.

Egnede doser for behandling av lidelser med redusert motilitet av GI kanalen eller andre lidelser formidlet ved 5-HT4reseptorer ventes å variere fra ca. 0,0007 til ca. 20 mg/kg/dag av aktivt middel, innbefattende fra ca. 0,0007 til ca. 1 mg/kg/dag. For et menneske på gjennomsnittlig 70 kg ville dette være fra ca. 0,05 til ca. 70 mg per dag av aktivt middel.

Saltformene ifølge oppfinnelsen kan således anvendes til å behandle kronisk konstipasjon. Når de anvendes for å behandle kronisk konstipasjon, vil saltene ifølge oppfinnelsen typisk bli administrert oralt i en enkelt daglig dose eller i flere doser per dag. Dosen for behandling av kronisk konstipasjon ventes å variere fra ca. 0,05 til ca. 70 mg per dag.

Saltformene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle irritabel tarmsyndrom. Når de anvendes for å behandle konstipasjon-hovedsakelig irritabel tarmsyndrom, vil saltene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt daglig dose eller i flere doser per dag. Dosen for behandling av konstipasjon-dominerende irritabel tarmsyndrom ventes å variere fra ca. 0,05 til ca. 70 mg per dag.

Saltformene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle diabetisk og idiopatisk gastroparese. Når de anvendes for å behandle diabetisk og idiopatisk gastroparese, vil saltene ifølge oppfinnelsen typisk administreres oralt i en enkelt daglig dose eller i flere doser per dag. Dosen for behandling av diabetisk gastroparese ventes å variere fra ca. 0,05 til ca. 70 mg per dag.

Saltformene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å behandle funksjonell dyspepsi. Når de anvendes for å behandle funksjonell dyspepsi, vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen typisk bli administrert oralt i en enkelt daglig dose eller i flere doser per dag. Dosen for behandling av funksjonell dyspepsi ventes å variere fra ca. 0,05 til ca. 70 mg per dag.

Oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr som har en sykdom eller lidelse forbundet med 5-HT4reseptoraktivitet, hvor fremgangsmåten omfatter administrering til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av en saltform ifølge oppfinnelsen eller av et farmasøytisk preparat omfattende en saltform ifølge oppfinnelsen.

Som beskrevet ovenfor, er saltformer ifølge oppfinnelsen 5-HT4reseptoragonister. Oppfinnelsen kan derfor videre anvende i en fremgangsmåte for agonisering av en 5-HT4reseptor i et pattedyr, hvor fremgangsmåten omfatter administrering av en saltform ifølge oppfinnelsen til pattedyret.

Deres egenskaper, så vel som anvendeligheten av hydrokloridsaltformene ifølge oppfinnelsen, kan demonstreres ved å anvende forskjellige in vitro og in vivo analyser som er velkjente for fagmannen. Representative analyser er beskrevet i større detalj i de etterfølgende eksemplene.

EKSEMPLER

De følgende syntetiske og biologiske eksemplene er angitt for å illustrere oppfinnelsen og er ikke å anse som begrensning på noen måte. I eksemplene nedenfor har følgende forkortelser følgende betydninger med mindre annet er angitt. Forkortelser som ikke er definert nedenfor har deres generelt aksepterte betydning.

Boe = tert-butoksykarbonyl

(Boc)20 = di-terf-butyldikarbonat

DCM = diklormetan

DMF = jV,jV-dimetylformamid

DMSO = dimetylsulfoksid

EtOAc = etylacetat

mCPBA =/M-klorbenzosyre

MeCN = acetonitril

MTBE = tert-butylmetyleter

PyBop = benzotriazol-1 -yloksytripyrrolidino-fosfoniumheksafluorfosfat Rf = retensjonsfaktor

RT = romtemperatur

TFA = trifluoreddiksyre

THF = tetrahydrofuran

Reagenser (innbefattende sekundære aminer) og oppløsningsmidler ble innkjøpt fra kommersielle leverandører (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.) og anvendt uten ytterligere rensing. Reaksjoner ble utført under nitrogenatmosfære, med mindre annet er angitt. Fremgangen av reaksjonsblandinger ble overvåket ved tynnsjiktkromatografi (TLC), analytisk høyytelsesvæskekromatografi (anal. HPLC) og massespektrometri, detaljene vedrørende dette er angitt nedenfor og separat i spesifikke eksempler på reaksjoner. Reaksjonsblandinger ble opparbeidet som beskrevet spesifikt i hver reaksjon; vanligvis ble de renset ved ekstraksjon og andre rensemetoder så som temperatur- og oppløsningsmiddelavhengig krystallisasjon og utfelling. I tillegg ble reaksjonsblandinger rutinemessig renset ved preparativ HPLC. Karakterisering av reaksjonsprodukter ble rutinemessig utført ved masse- og ^-NMR-spektrometri. For NMR-målinger ble prøver oppløst i deuterert oppløsningsmiddel (CD3OD, CDCI3eller DMSO-i/e), og 'H-NMR spektre ble opptatt med et Varian Gemini 2000 instrument (300 MHz) under standard observasjonsbetingelser. Massespektrometrisk identifikasjon av forbindelser ble utført ved hjelp av en elektrospray ionisasjonsmetode (ESMS) med et Applied Biosystems (Foster City, CA) modell API 150 EX instrument eller et Agilent (Palo Alto, CA) modell 1100 LC/MSD instrument. Vanninnhold bestemmes ved Karl Fischer titrering ved anvendelse av et Brinkmann (Westbury, NY) Metrohm Karl Fischer Model 813 coulometer.

Fremstilling 1: (l£,37?,57?)-3-amino-8-azabicyWo[3.2.1]oktan-8-karboksylsyre tert-butylester

a. Fremstilling av 8- benzyl- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11oktan- 3- on

Konsentrert saltsyre (30 ml) ble tilsatt til en heterogen oppløsning av 2,5-dimetoksy-tetrahydrofuran (82,2 g, 0,622 mol) i vann (170 ml) under omrøring. I en separat kolbe avkjølt til 0°C (isbad) ble konsentrert saltsyre (92 ml) langsomt tilsatt til en oppløsning av benzylamin (100 g, 0,933 mol) i vann (350 ml). 2,5-dimetoksytetrahydrofuran-oppløsningen ble omrørt i ca. 20 minutter, fortynnet med vann (250 ml) og deretter ble benzylaminoppløsningen tilsatt, etterfulgt av tilsetning av en oppløsning av 1,3-acetondikarboksylsyre (100 g, 0,684 mol) i vann (400 ml) og deretter tilsetning av natriumhydrogenfosfat (44 g, 0,31 mol) i vann (200 ml). pH ble justert fra pH 1 til pH -4,5 ved anvendelse av 40% NaOH. Den resulterende slørede og blekgule oppløsningen ble omrørt over natten. Oppløsningen ble deretter surgjort til pH 3 fra pH 7,5 ved anvendelse av 50% saltsyre, oppvarmet til 85°C og omrørt i 2 timer. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur, gjort basisk til pH 12 ved anvendelse av 40% NaOH og ekstrahert med diklormetan (3x500 ml). De kombinerte organiske lagene ble vasket med saltvannsoppløsning, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi det rå mellomproduktet i overskriften som en viskøs brun olje.

Til en oppløsning av det rå mellomproduktet i metanol (1000 ml) ble det tilsatt di- tert-butyldikarbonat (74,6 g, 0,342 mol) ved 0°C. Oppløsningen ble tillatt å oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt over natten. Metanolen ble fjernet under redusert trykk og den resulterende oljen ble oppløst i diklormetan (1000 ml). Mellomproduktet ble ekstrahert i IM H3PO4(1000 ml) og ble vasket med diklormetan (3x250 ml). Det vandige laget ble gjort basisk til pH 12 ved anvendelse av vandig NaOH og ekstrahert med diklormetan (3x500 ml). De kombinerte organiske lagene ble tørket (MgSO^, filtrert og konsentrert under redusert trykk for å gi mellomproduktet i overskriften som en viskøs, lys brun olje.

'H-NMR (CDCI3) 8 (ppm) 7,5-7,2 (m, 5H, C6H5), 3,7 (s, 2H, CH2Ph), 3,45 (bred s, 2H, CH-NBn), 2,7-2,6 (dd, 2H, CH2CO), 2,2-2,1 (dd, 2H, CH2CO), 2,1-2,0 (m, 2H, CH2CH2), 1,6 (m, 2H, CH2CH2).

(m/z): [M+H]<+>beregnet for C14H17NO 216,14; funnet 216,0.

b. Fremstilling av 3- okso- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11oktan- 8- karboksvlsyre fert- butylester

Til en oppløsning av 8-benzyl-8-azabicyklo[3.2.1]oktan-3-on (75 g, 0,348 mol) i EtOAc (300 ml) ble det tilsatt en oppløsning av di-tert-butyldikarbonat (83,6 g, 0,383 mol, 1,1 ekv.) i EtOAc (300 ml). Den resulterende oppløsningen og rensingen (100 ml EtOAc) ble tilsatt til en 1 liters Parr hydrogeneringsbeholder inneholdende 23 g palladiumhydroksid (20 vekt-% Pd, tørr basis, på karbon, -50% våt med vann; f. eks. Pearlmans katalysator) under en strøm av nitrogen. Reaksjonsbeholderen ble avgasset (alternerende vakuum og N2fem ganger) og trykksatt til 60 psi H2gass. Reaksjonsoppløsningen ble omrørt i 2 dager og igjen fylt med H2etter behov for å opprettholde H2-trykk ved 60 psi inntil reaksjonen var fullført, som overvåket ved silikatynnsjiktkromatografi. Den sorte oppløsningen ble deretter filtrert gjennom en pute av Celite<®>og konsentrert under redusert trykk for å gi mellomproduktet kvantitativt som en viskøs, gul til oransje olje. Det ble anvendt i det neste trinnet uten ytterligere rensing.

'H-NMR (CDCI3) 8 (ppm) 4,5 (bred, 2H, CH-NBoc), 2,7 (bred, 2H, CH2CO), 2,4-2,3 (dd, 2H, CH2CH2), 2,1 (bred m, 2H, CH2CO), 1,7-1,6 (dd, 2H, CH2CH2), 1,5 (s, 9H, (CH3)3COCON)).

c. Fremstilling av ( 1 S , 3R , 5R )- 3 - amino- 8- azabicyklo\ 3 . 2. 11 oktan- 8- karboksylsyre

fert- butvlester

Til en oppløsning av produktet fra det foregående trinnet (75,4 g, 0,335 mol) i metanol (1 liter) ble det tilsatt ammoniumformat (422,5 g, 6,7 mol), vann (115 ml) og 65 g palladium på aktivert karbon (10% på tørr basis, -50% våt i vann; Degussa type E101NE/W) under en strøm av N2under omrøring ved hjelp av mekanisk rører. Etter 24 og 48 timer, ble det tilsatt ytterligere porsjoner av ammoniumformat (132 g, 2,1 mol) hver gang. Når reaksjonsutviklingen opphørte, som overvåket ved analytisk HPLC, ble det tilsatt Celite (>500 g) og den resulterende, tykke suspensjonen ble filtrert og deretter ble det samlede faststoffet renset med metanol (-500 ml). Filtratene ble kombinert og konsentrert under redusert trykk inntil all metanol var fjernet. Den resulterende uklare, tofasede oppløsningen ble deretter fortynnet med IM fosforsyre til et endelig volum på -1,5 til 2,0 liter ved pH 2 og vasket med diklormetan (3x700 ml). Det vandige laget ble gjort basisk til pH 12 ved anvendelse av 40% vandig NaOH og ekstrahert med diklormetan (3x700 ml). De kombinerte organiske lagene ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert ved rotasjonsfordampning, deretter høyvakuum for å etterlate 52 g (70%) av mellomproduktet i overskriften, vanligvis N- Boc- endo- 3-aminotropan, som et hvitt til blekgult faststoff. Isomerforholdet mellom endo til ekso amin av produktet var >99% basert på ^-NMR analyse (>96% renhet ved analytisk

HPLC).

'H-NMR (CDCI3) 8 (ppm) 4,2-4,0 (bred d, 2H, CHNBoc), 3,25 (t, 1H, CHNH2), 2,1-2,05 (m, 4H), 1,9 (m, 2H), 1,4 (s, 9H, (CH3)3OCON), 1,2-1,1 (bred, 2H).

(m/z): [M+H]<+>beregnet for C12H22N2O2227,18; funnet 227,2. Analytisk HPLC (isokratisk metode; 2:98 (A:B) til 90:10 (A:B) i løpet av 5 minutter): retensjonstid = 2,14 min.

Fremstilling 2: l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre

Først ble aceton (228,2 ml, 3,11 mol) tilsatt til en omrørt suspensjon av 2-aminofenylmetanol (255,2 g, 2,07 mol) og eddiksyre (3,56 ml, 62 mmol) i vann (2 liter) ved romtemperatur. Etter 4 timer, ble suspensjonen avkjølt til 0°C og omrørt i ytterligere 2,5 timer og deretter filtrert. Det faste stoffet ble samlet og vasket med vann, og det våte faststoffet ble avkjølt og tørket ved lyofilisering for å gi 2,2-dimetyl-l,4-dihydro-2H-benzo[l,3]oksazin (332,2 g, 98%) som et beige-hvitt faststoff.

'H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 1,48 (s, 6H, C(CH3)2), 4,00 (bs, 1H, NH), 4,86 (s, 2H, CH2), 6,66 (d, 1H, Ar<g>), 6,81 (t, 1H, ArH), 6,96 (d, 1H, Arg), 7,10 (t, 1H, ArH).

En oppløsning av 2,2-dimetyl-l,4-dihydro-2H-benzo[l,3]oksazin (125 g, 0,77 mol) i THF (1 liter) ble filtrert gjennom en scintillasjonstrakt og deretter tilsatt dråpevis ved hjelp av en tilsetningstrakt, over en periode på 2,5 timer, til en omrørt oppløsning av 1,0 M LiAlH4i THF (800 ml) ved 0°C. Reaksjonen ble stoppet ved langsom, porsjonsvis tilsetning av Na2S04 IOH2O (110 g), over et tidsrom på 1,5 time ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten, filtrert og de faste saltene ble vasket grundig med THF. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi 2-isopropyl-aminofenylmetanol (120 g, 95%) som en gul olje.

^-NMRtCDCls; 300 MHz): 1,24 (d, 6H, CH(CH3)2), 3,15 (bs, 1H, OHj, 3,61 (sept, 1H, CH(CH3)2), 4,57 (s, 2H, CH2), 6,59 (t, 1H, ArH), 6,65 (d, 1H, ArH), 6,99 (d, 1H, ArH), 7,15 (t, 1H, ArH).

Mangandioksid (85% 182,6 g, 1,79 mol) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 2-isopropylaminofenylmetanol (118 g, 0,71 mol) i toluen (800 ml) og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 117°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøle til romtemperatur over natten, og ble deretter filtrert gjennom en pute av Celite som ble eluert med toluen. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi 2-isopropylaminobenzaldehyd (105 g, 90%) som en oransje olje.

'H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 1,28 (d, 6H, CH(CH^)2), 3,76 (sept, 1H, CH(CH3)2), 6,65 (t, 1H, ArH), 6,69 (d, 1H, Arg), 7,37 (d, 1H, ArH), 7,44 (t, 1H, ArH), 9,79 (s, 1H,

CHO).

2,2-dimetyl-[l,3]dioksan-4,6-dion, vanlig betegnet Meldrums syre, (166,9 g, 1,16 mol) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 2-isopropylaminobenzaldehyd (105 g, 0,64 mol), eddiksyre (73,6 ml, 1,29 mol) og etylendiamin (43,0 ml, 0,64 mol) i metanol (1 liter) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og deretter ved romtemperatur over natten. Den resulterende suspensjonen ble filtrert, og det faste stoffet ble vasket med metanol og samlet for å gi mellomproduktet i overskriften, 1-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre (146 g, 98%) som et beige-hvitt faststoff.

'H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 1,72 (d, 6H, CH(CH^)2), 5,50 (bs, 1H, CH(CH3)2), 7,44 (t, 1H, ArH), 7,75-7,77 (m, 2H, ArH), 7,82 (d, 1H, ArH), 8,89 (s, 1H, C H).

Eksempel 1: Syntese av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

a. Fremstilling av ( l^ S^ S^- S- ri- isopropyl^- okso- l^- dihydroquinolin- S-karbonyl) aminol- 8- azabicvklo[ 3. 2. 11oktan- 8- karboksvlsvre fert- butylester

I en 3 liters kolbe ble l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre (112,4 g, 0,486 mol, 1,1 ekv.) suspendert i toluen (1 liter). Blandingen ble oppvarmet til 85°C og tionylklorid (86,74 g, 0,729 mol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 70 minutter. Blandingen ble oppvarmet til 95°C i 1,5 time under omrøring og deretter tillatt å avkjøles til romtemperatur.

I en separat 12 liters kolbe ble (l,S',3./?,5./?)-3-amino-8-azabicyklo[3.2.1]oktan-8-karboksylsyre terf-butylester (100,0 g, 0,442 mol, 1 ekv.) suspendert i toluen (1 liter) og 3M NaOH (4 ekv.) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 minutter og deretter avkjølt til ca. 5°C. Syrekloridoppløsningen ble langsomt tilsatt under omrøring i løpet av 40 minutter mens den indre temperaturen ble holdt under 10°C. Blandingen ble omrørt ved 3-5°C i 30 minutter og lagene ble tillatt å separere over natten. Toluenlaget (~2,5 liter) ble samlet, konsentrert til ca. halvparten (-1,2 liter) ved rotasjonsfordampning og anvendt direkte i det neste trinnet.

b. Fremstilling av 1 - isopropyl- 2- okso- l , 2- dihvdroquinolin- 3- karboksvlsyre

{ q^ Æ5jfl- 8- azabicvklor3. 2. 11okt- 3- vllamid

Til toluenoppløsningen fremstilt i det forutgående trinnet ( -1,2 liter) ble det tilsatt

trifluoreddiksyre (200 ml) i løpet av 20 minutter ved 20°C under omrøring. Blandingen ble omrørt ved 20°C i 2 timer. Vann (1,55 liter) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 20°C. Etter 30 minutter, ble blandingen separert i tre lag. Bunnlaget ( -350 ml), en viskøs, brun olje, inneholdt det rå mellomproduktet.

Til en 12 liters kolbe fylt med MTBE (2,8 liter) ble den rå, brune oljen tilsatt i løpet av 1 time ved 1-2°C under omrøring. Suspensjonen ble omrørt ved den samme temperaturen i 1 time og deretter filtrert. Filtratet ble vasket med MTBE (2x300 ml) og tørket under vakuum ved romtemperatur i 4 dager for å gi trifluoracetatsaltet av mellomproduktet i overskriften (163,3 g) som et blekt, gult pulver.

c. Fremstilling av iV- metvl- jV-[( 5,)- 2- oksiran- 2- vlmetvllmetansulfonamid

En 12 liters kolbe ble fylt med vann (1 liter) etterfulgt av tilsetning av NaOH (50% i vann, 146,81 g, 1,835 mol). Begerglasset inneholdende NaOH ble vasket med vann (2x500 ml) og vaskevannene ble tilsatt til kolben. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 minutter og avkjølt til~8°C. (iV-metyl)metansulfonamid (200,2 g, 1,835 mol) i vann (500 ml) ble tilsatt i løpet av 5 minutter. Blandingen ble omrørt i 1 time ved~4°C og (S)-2-klormetyloksiran (339,6 g, 3,67 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 20 timer ved 3-4°C. Diklormetan (2 liter) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 5-10°C. De to lagene ble tillatt å separere i løpet av 10 minutter og ble samlet. Det organiske laget (-2,5 liter) ble tilsatt tilbake til 12 liters kolben og vasket med IM H3PO4(800 ml) og saltvannsoppløsning (800 ml). Diklormetan ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Til det rå produktet ble det tilsatt toluen (400 ml) og det ble fjernet ved rotajonsfordampning. Etter tre ytterligere sykluser med toluenprosessen, ble mellomproduktet i overskriften oppnådd (228,2 g) og dette ble anvendt uten ytterligere rensing i det neste trinnet.

d. Syntese av 1 - isopropyl- 2- okso- 1, 2- dihydroquinolin- 3- karboksvlsyre (( l^. BÆS. RVS- rr^^- hvdroksv- B- fmetansulfonvl- metvl- amino^ propvll- S-azabicyklo[ 3. 2. 11okt- 3- yl} amid

I en 3 liters kolbe ble l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l£3Æ,5i0-8-azabic<y>klo[3.2.1]olct-3-yl}amid trifluoracetat (105,0 g, 0,232 mol) suspendert i absolutt etanol (400 ml). Til denne suspensjonen ble det tilsatt NaOH (50% i vann, 0,243 mol, 1,05 ekv.) oppløst i absolutt etanol (100 ml) ved romtemperatur. Begerglasset inneholdende NaOH ble vasket med etanol (2x50 ml) og vaskevannene ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter 30 minutters omrøring, ble det tilsatt en oppløsning avN-metyl-N-[(S)-2-oksiran-2-ylmetyl]metansulfonamid (62,0 g, 1,5 ekv.) i absolutt etanol (100 ml). Blandingen ble tilbakeløpsbehandlet i 2 timer, avkjølt til romtemperatur og kimkrystaller av forbindelsen i overskriften ble tilsatt. Etter ca. 5 minutters omrøring, ble det dannet et hvitt faststoff. Blandingen ble avkjølt til 3-5°C og omrørt i 2 timer. Det hvite faststoffet ble filtrert og den våte kaken ble vasket med kald, absolutt etanol (3x50 ml). Det faste stoffet ble tørket under vakuum ved 30°C i 60 timer for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (93,8 g, vanninnhold ifølge Karl Fischer metode 2,03%).

'H-NMR (CDC13) 8 ppm 10,52 (d, 1H), 8,83 (s, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,64-7,60 (m, 2H), 7,28-7,26 (m, 1H), 4,33-4,26 (m, 2H), 3,78-3,75 (m, 1H), 3,27-3,20 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,58-2,53 (m, 1H), 2,30-1,81 (m, 11H), 1,68 (d, 6H).

Rimkrystallene ble oppnådd fra en forutgående fremstilling av forbindelsen i overskriften ved fremgangsmåten ifølge foreliggende eksempel i mindre målestokk, hvori krystallisasjon fant sted spontant.

Eksempel 2: Syntese av krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l£,3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicy klo [3.2.1] okt-3-yl} amid

I en 1 liters kolbe ble l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3JR,5JR)-8-[(JR)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8- azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (34,7 g, 0,069 mol) suspendert i absolutt etanol (210 ml). Konsentrert HC1 (1,1 ekv.) ble tilsatt ved romtemperatur under omrøring. Blandingen ble omrørt ved tilbakeløp i 30 minutter og avkjølt til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Det faste stoffet ble filtrert og den våte kaken ble vasket med kald, absolutt etanol (3x50 ml). Det faste stoffet ble tørket under vakuum ved 30°C i 48 timer for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (34,5 g, 93,7% utbytte, vanninnhold ved Karl Fischer metode 0,13%).

Eksempel 3: Syntese av krystallinsk hydrat av hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3-yl} amid hydroklorid (139 mg, 0,28 mmol) ble oppløst i sterilisert vann for injeksjon (2 ml). I løpet av få timer ble oppløsningen en sløret suspensjon. Suspensjonen ble omrørt og tillatt å hensettes over natten ved romtemperatur, hvilket resulterte i en hvit utfelling. Det faste stoffet ble samlet ved filtrering og tørket i 2 minutter ved omgivelsesbetingelser (ca. 40-50% relativ fuktighet) for å tilveiebringe forbindelsen i overskriften (130 mg, 91% utbytte).

Eksempler 4-9: Egenskaper av saltformer ifølge oppfinnelsen

Prøver av det krystallinske hydrokloridsaltet av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l*S,,3i?,5i2)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (forbindelse av formel I), fremstilt som i Eksempel 2 og av det krystallinske hydratet av hydrokloridsaltet av forbindelsen av formel I, fremstilt i Eksempel 3, ble analysert ved røntgenpulver-diffraksjon (PXRD), differensiell sveipkalorimetri (DSC), termogravimetrisk analyse (TGA), infrarød spektroskopi (IR) og elementanalyse.

Eksempel 4: Røntgenpulverdiffraksjon

Røntgenpulverdiffraksjonsmønstere ble oppnådd med et Thermo ARL X-Ray Diffractometer Model X'TRA (Thermo ARL SA, Sveits) ved anvendelse av Cu Ka-stråling ved 1,542 Å (45 kV, 40 mA) med en Si(Li) faststoffdetektor. Analysen ble typisk utført ved en sveiprate på 27min med en trinnstørrelse på 0,03° per punkt over et område på 2° til 35° i to-theta vinkel. Prøver, enten som mottatt eller malt til et fint pulver, ble omhyggelig pakket i en innføringsinnretning med lite volum utformet for å passe inn i instrument toppfylleprøvebeholderen for analyse. Instrumentkalibreringen til innenfor ±0,02° to-theta vinkel ble verifisert ukentlig ved sammenligning med en silisiummetallstandard. Representative PXRD-mønstere for prøver av det krystallinske hydrokloridsaltet og av hydratet av hydrokloridsaltet ifølge oppfinnelsen er vist i henholdsvis Figur 1 og 4.

Eksempel 5: Termisk analyse

Differensiell sveipkalorimetri (DSC) ble utført ved anvendelse av en TA Instruments Model Q-100 modul. Data ble samlet og analysert ved anvendelse av TA Instruments Thermal Advantage for Q-Series™ software. En prøve på ca. 1-10 mg ble nøyaktig veiet inn i en aluminiumbeholder med lokk. Prøven ble evaluert ved anvendelse av en lineær oppvarmingsrampe på 10°C/min fra 5°C til, typisk, 265°C. DSC-cellen ble spylt med tørr nitrogen under anvendelse. Representative DSC spor for prøver av det krystallinske hydrokloridsaltet og av det krystallinske hydratet av et hydrokloridsalt av forbindelse I er vist henholdsvis i Figur 2 og 5.

Termogravimetrisk analyse (TGA) ble utført ved å anvende en TA Instruments Model Q-500 modul. Data ble samlet og analysert ved anvendelse av TA Instruments Thermal Advantage for Q-Series™ software. En prøve med vekt ca. 1-5 mg ble plassert i en aluminiumbeholder på en platinakrybbe og scannet fra omgivelsestemperatur til 300°C med en lineær oppvarmingsrate på 10°C/min. Vekten og ovnskamrene ble spylt med nitrogen under anvendelse. Representative TGA spor for prøver av et krystallinsk hydrokloridsalt og av et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av forbindelse I er også vist henholdsvis i Figur 2 og 5.

DSC sporet i Figur 2 demonstrerer at et hydrokloridsalt ifølge foreliggende oppfinnelse har utmerket termisk stabilitet med et maksimum i endotermisk varmestrøm i området på ca. 230°C til ca. 260°C og ingen signifikante termiske hendelser under ca. 225°C. Sammenligning av DSC og TGA spor indikerer at et hydrokloridsalt ifølge foreliggende oppfinnelse undergår simultan smelting og dekomponering ved temperaturer over ca. 230°C.

DSC sporet i Figur 5 for foreliggende hydratform viser en vesentlig topp i endotermisk varmestrøm identifisert med smelting av krystallen i området på ca. 225°C til ca. 250°C og brede eller svake endotermer ved lavere temperaturer. Sammenligning av DSC og TGA sporene indikerer at dekomponering av den hydratkrystallinske formen ikke er signifikant ved temperaturen av smelteovergangen.

Eksempel 6: Dynamisk fuktighetssorpsjonsbedømmelse

Dynamisk fuktighetssorpsjon (DMS) bedømmelse ble utført ved 25°C ved anvendelse av en VTI atmosfærisk mikrovekt, SGA-100 system (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). En prøvestørrelse på ca. 5-10 mg ble anvendt og fuktigheten ble innstilt ved omgivelsesverdi ved starten av analysen. En typisk DMS-analyse besto av tre sveip: Omgivelse til 2% relativ fuktighet (RH), 2% RH til 90% RH, 90% RH til 5% RH ved en sveiprate på 5% RH/trinn. Massen ble målt hvert andre minutt og RH ble endret til neste verdi (±5% RH) når massen av prøven var stabil til innenfor 0,02% i 5 etter hverandre følgende punkter. Representative DMS spor for prøver av et krystallinsk hydrokloridsalt og av et krystallinsk hydrat av et hydrokloridsalt av forbindelse I er vist henholdsvis i

Figur 3 og 6.

Hydrokloridsaltet viser en reversibel sorpsjons/desorpsjonsprofil med en vektendring på mindre enn 0,2% over hele området på 2% til 90% RH. Hydratformen viser en reversibel sorpsjons/desorpsjonsprofil med et vekttap på ca. 2,3% etter som prøven ble tørket fra omgivelse til 2% RH som ble gjenvunnet etter som den ønskede prøven ble eksponert fra 2% RH til 40% RH. Hydratformen hadde mindre enn ca. 0,25% vektøkning i området 40% RH til 75% RH.

Eksempel 7: Infrarød analyse

Det infrarøde / JR) absorpsjonsspekteret ble bestemt over frekvensområdet 4000 til 675 cm"<1>ved å anvende et Avatar 360 FT-IR spektrometer utstyrt med en Nicolet svekket total refleksjon (ATR) prøveholder. Et representativt IR absorpsjonsspektrum for en prøve av et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen hadde signifikante absorpsjonsbånd ved 758 ±1, 783 ±1, 795±1, 802±1, 949±1, 981±1, 1149±1, 1158±1, 1217±1, 1332 ±1, 1377 ±1, 1453 ±1, 1467 ±1, 1487 ±1, 1525 ±1, 1566 ±1, 1575 ±1, 1615 ±1, 1672 ±1 og 3197 ±1 cm"<1>.

Eksempel 8: Faststoffstabilitetsvurdering

Prøver av hydrokloridsaltet ifølge oppfinnelsen ble lagret i flere åpne glassflasker ved 40°C og 75% RH. Ved spesifikke intervaller ble innholdet av en representativ flaske fjernet og analysert ved hjelp av DSC, TGA, PXRD og ved HPLC for kjemisk renhet. Etter 24 ukers lagring var det ingen detekterbar endring i DSC- eller TGA-termogrammene eller i PXRD-mønsteret. Den kjemiske renheten av den lagrede prøven var 99,6%.

Eksempel 9: Bestemmelse av motion molarforhold

Motion molarforholdet mellom saltsyre (HA) og l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (forbindelse av formel I) ble beregnet i henhold til følgende formel: hvor Wraer vektprosenten av HC1 i prøven, MWraer molekylvekten av HC1, MWier molekylvekten av forbindelsen av formel I (504,6 amu), og Wi er vektprosenten av forbindelsen av formel I i prøven, beregnet i henhold til formelen:

hvor Wh20er vektprosenten vanninnhold, Wrser vektprosenten gjenværende oppløsningsmiddel, under antagelsen at forbindelse I ikke har noen forurensninger.

Molarforholdet av saltsyre til forbindelse I for en prøve av et krystallinsk hydrokloridsalt ifølge oppfinnelsen ble beregnet som 0,94:1 ved anvendelse av vektprosenten av HC1 (WHa) på 6,3% og verdiene WH20= 0,26% og WRS= 0,47%. HCl-innholdet ble bestemt ved titrering med en standardoppløsning av sølvnitrat, vanninnholdet Wh20ble bestemt ved coulometrisk Karl Fischer titrering og rest-oppløsningsmiddelinnholdet Wrsble bestemt ved gasskromatografi. Sammenligningseksempel 1: Syntese av sitronsyresalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicy klo [3.2.1] okt-3-yl} amid

l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l*S',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (0,1 g, 0,2 mmol) ble suspendert i etanol (1 ml). Til denne suspensjonen ble det tilsatt en IM oppløsning av sitronsyre i etanol (0,072 ml, 0,072 mmol, 0,33 ekv.). Blandingen ble kort ultralydbehandlet inntil klarhet, lukket og deretter tillatt å hensettes over natten. Dekket ble deretter fjernet og blandingen ble tillatt å fordampe under omgivelsesbetingelser inntil faste stoffer ble observert. Blandingen ble deretter igjen lukket og hensatt i 72 timer. Det resulterende faste stoffet ble filtrert og vasket med kald etanol for å gi forbindelsen i overskriften som faststoff (74,3 mg).

Sammenligningseksempel 2: Syntese av syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicy klo [3.2.1] okt-3-yl} amid

Ved å følge fremgangsmåten fra Sammenligningseksempel 1, ble følgende syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {( lS, 3R, 5R)- S-[( R)- 2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3-yl} amid fremstilt i fast form ved å anvende de angitte ekvivalentene av syre (produktvekt i andre parentes): Adipinsyre (0,5 ekv.) (48,5 mg); fosforsyre (0,5 ekv.) (86,6 mg); svovelsyre (0,5 ekv.) (27,0 mg); vinsyre (0,5 ekv.) (66,3 mg); eplesyre (0,5 ekv.) (25,3 mg); og hydrobromsyre (1 ekv.) (62,9 mg).

Sammenligningseksempel 3: Syntese av metansulfonsyresalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid

Til en oppløsning av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3JR,5JR)-8-[(JR)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid (0,1 g, 0,2 mmol) i 50% acetonitril/vann (1 ml) ble det tilsatt en IM oppløsning av metansulfonsyre i etanol (0,2 ml, 0,2 mmol, 1 ekv.). Blandingen ble deretter frosset og lyofilisert til tørrhet over natten. Det resulterende faststoffet ble oppløst i isopropanol (1 ml) under forsiktig oppvarming og tillatt å avkjøles. Det resulterende faste stoffet ble samlet ved filtrering og vasket med kald isopropanol for å gi forbindelsen i overskriften som et faststoff (90 mg).

Sammenligningseksempel 4: Syntese av syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15,3/?,5/?)-8-[(/?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicy klo [3.2.1] okt-3-yl} amid

Ved å følge fremgangsmåten fra Sammenligningseksempel 3, ble følgende syresalter av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l*S',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3-yl} amid fremstilt i fast form ved å anvende de angitte ekvivalentene av syre (produktvekt i andre parentes): Fumarsyre (1 ekv.) (107,2 mg); benzosyre (1 ekv.) (105,2 mg); og ( R)-mandelsyre (1 ekv.) (96,1 mg).

Sammenligningseksempel 5: Egenskaper av forbindelser fra Sammenligningseksempler 1-4

De krystallinske syresaltene av forbindelsen av formel I fra sammenligningseksemplene 1-4 ble analysert ved PXRD, DSC og TGA. I alle tilfeller ble et vekttap observert ved TGA ved temperaturer under ca. 100°C, som mest sannsynlig kan tilskrives tap av oppløsningsmiddel. Temperaturen(e) ved hvilken endotermisk varmestrøm ble observert ved DSC, bortsett fra lavtemperaturtrekk som kan tilskrives oppløsningsmiddeltap, sammen med bekreftelse av krystallinitet ved PXRD, er sammenfattet i Tabell I hvor støkiometrien er indikert ved antallet ekvivalenter syre anvendt for å fremstille syresaltet.

Analyse 1: Radioligandbindingsanalyse på 5-HT4(C) humane reseptorer

a. MembranpreparerinR5- HT4r^

HEK-293 (humane embryotiske nyre) celler stabilt transfektert med human 5-HT4(C) reseptor cDNA (Bmax = -6,0 pmol/mg protein, som bestemt ved anvendelse av [ H]-GR113808 membranradioligandbindingsanalyse) ble dyrket i T-225 kolber i Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) inneholdende 4.500 mg/L D-glukose og pyridoksinhydroklorid (GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad CA: Cat#11965) supplert med 10% føtalt bovinserum (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10437), 2 mM L-glutamin og (100 enheter) penicillin-(100 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#15140) i en 5% C02, fuktiggjort inkubator ved 37°C. Celler ble dyrket under kontinuerlig seleksjonstrykk ved addisjonen av 800 ug/ml geneticin (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10131) til mediet.

Celler ble dyrket til omtrent 60-80% sammenflytning (< 35 subkulturpassasjer). Ved 20-22 timer før høsting, ble cellene vasket to ganger og tilsatt serumfritt DMEM. Alle trinn av membranprepareringen ble utført på is. Cellemonolaget ble løftet ved forsiktig mekanisk omrøring og triturering med en 25 ml pipette. Celler ble samlet ved sentrifugering ved 1000 opm (5 min).

For membranprepareringen ble cellepelleter resuspendert i iskald 50 mM 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES), pH 7,4 (membranprepareringsbuffer) (40 ml/totalt celleutbytte fra 30-40 T225 kolber) og homogenisert ved å anvende en polytron oppbryter (innstilling 19,2 x 10 sek) på is. De resulterende homogenatene ble sentrifugert ved 1200 g i 5 minutter ved 4°C. Pelleten ble avhendet og supernatanten sentrifugert ved 40.000 g (20 min). Pelleten ble vasket en gang ved resuspensjon med membranprepareringsbuffer og sentrifugering ved 40.000 g (20 min). Den endelige pelleten ble resuspendert i 50 mM HEPES, pH 7,4 (analysebuffer) (ekvivalent 1 T225 kolbe/l ml). Proteinkonsentrering av membransuspensjonen ble bestemt ved fremgangsmåten ifølge Bradford (Bradford, 1976). Membraner ble lagret frosset i porsjoner ved -80°C.

b. Radioligandbindingsanalyser

Radioligandbindingsanalyser ble utført i 1,1 ml 96-dypbrønns polypropylenanalyse-plater (Axygen) i et totalt analysevolum på 400 ul inneholdende 2 ug membranprotein i 50 mM HEPES pH 7,4, inneholdende 0,025% bovint serumalbumin (BS A). Metningsbindingsundersøkelser for bestemmelse av Kd-verdier av radioliganden ble utført ved anvendelse av [<3>H]-GR113808 (Amersham Inc., Bucks, UK: Cat# TRK944; spesifikk aktivitet -82 Ci/mmol) ved 8-12 forskjellige konsentrasjoner varierende fra 0,001 nM - 5,0 nM. Fortrengningsanalyser for bestemmelse av pKi-verdier av forbindelser ble utført med [<3>H]-GR113808 ved 0,15 nM og elleve forskjellige konsentrasjoner av forbindelse varierende fra 10 pM - 100 uM.

Forsøksforbindelser ble mottatt som 10 mM forrådsoppløsninger i DMSO og fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES pH 7,4 ved 25°C, inneholdende 0,1% BSA, og serievise fortynninger (1:5) deretter utført i den samme bufferen. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 1 uM umerket GR113808. Analyser ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur, og deretter ble bindingsreaksj onene terminert ved rask filtrering over 96-brønns GF/B glassfiberfilterplater (Packard BioScience Co., Meriden, CT) forbløtet i 0,3% polyetylenimin. Filterplater ble vasket tre ganger med filtreringsbuffer (iskald 50 mM HEPES, pH 7,4) for å fjerne ubundet radioaktivitet. Plater ble tørket, 35 ul Microscint-20 væskescintillasjonsfluid (Packard BioScience Co., Meriden, CT) ble tilsatt til hver brønn og plater ble telt i en Packard Topcount væskescintillasjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Bindingsdata ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ved anvendelse av 3-parameter modellen for ett-sete kompetisjon. BOTTOM (minimumkurven) ble fiksert til verdien for ikke-spesifikk binding, som bestemt i nærvær av 1 uM GR113808. Ki-verdier for forsøksforbindelsene ble beregnet, i Prism, fra de best tilpassede IC50-verdiene, og Kd-verdien av radioliganden, ved anvendelse av Cheng-Prusoff ligningen (Cheng og Prusoff, BiochemicalPharmacology, 1973, 22, 3099-108): Ki = IC50/ (1 +

[L]/Kd) hvor [L] = konsentrasjon [<3>H]-GR113808. Resultater er uttrykt som den negative dekadiske logaritmen av Ki-verdiene, pKi.

Forsøksforbindelser som har en høyere pKi-verdi i denne analysen har en høyere bindingsaffinitet for 5-HT4reseptoren. Forbindelsen av formel I hadde en pKi-verdi større enn ca. 7,5 i denne analysen.

Analyse 2: Radioligandbindingsanalyse på 5-HT3Ahumane reseptorer: Bestemmelse av reseptor undertype selektivitet

a. Membranpreparering 5- HT^ a

HEK-293 (humane embryotiske nyre) celler stabilt transfektert med human 5-HTjareseptor cDNA ble oppnådd fra Dr. Michael Bruess (University of Bonn, GDR) (Bmax = -9,0 pmol/mg protein, som bestemt ved anvendelse av [ H]-GR65630 membranradioligandbindingsanalyse). Cellene ble dyrket i T-225 kolber eller cellefabrikker i 50% Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) (GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad CA: Cat#11965) og 50% Ham's F12 (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#l 1765) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS)

(Hyclone, Logan, UT: Cat#SH30070.03) og (50 enheter) penicillin-(50 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#15140) i en 5% C02, fuktiggjort inkubator ved 37°C.

Celler ble dyrket til tilnærmet 70-80% sammenflytning (< 35 subkultur passasjer). Alle trinn av membranprepareringen ble utført på is. For å høste cellene, ble mediet aspirert og celler ble renset med Ca<2+>, Mg<2+->fri Dulbecco's fosfatbufret saltvannsoppløsning (dPBS). Cellemonolaget ble løftet ved forsiktig mekanisk omrøring. Celler ble samlet ved filtrering ved 1000 opm (5 min). Etterfølgende trinn av membranprepareringen fulgte fremgangsmåten beskrevet ovenfor for membranene som uttrykker 5-HT4(c) reseptorer.

b. Radioligandbindingsanalyser

Radioligandbindingsanalyser ble utført i 96-brønns polypropylen analyseplater i et samlet analysevolum på 200 ul inneholdende 1,5-2 ug membranprotein i 50 mM HEPES pH 7,4, inneholdende 0,025% BSA analysebuffer. Metningsbindingsstudier for bestemmelse av Kj-verdier av radioliganden ble utført ved anvendelse av [ H]-GR65630 (Perkin Eimer Life Sciences Inc., Boston, MA: Cat# NET1011, spesifikk aktivitet -85 Ci/mmol) ved tolv forskjellige konsentrasjoner varierende fra 0,005 nM til 20 nM. Fortrengningsanalyser for bestemmelse av pKi-verdier av forbindelser ble utført med [ H]-GR65630 ved 0,50 nM og elleve forskjellige konsentrasjoner av forbindelser varierende fra 10 pM til 100 uM. Forbindelser ble mottatt som 10 mM forrådsoppløsninger i DMSO (se seksjon 3.1), fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES pH 7,4 ved 25°C, inneholdende 0,1% BSA, og serievise (1:5) fortynninger ble deretter utført i den samme bufferen. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 10 uM umerket MDL72222. Analyser ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur, deretter ble bindingsreaksj onene terminert ved rask filtrering over 96-brønns GF/B glassfiberfilterplater (Packard BioScience Co., Meriden, CT) på forhånd gjennomfuktet i 0,3% polyetylenimin. Filterplater ble vasket tre ganger med filtreringsbuffer (iskald 50 mM HEPES, pH 7,4) for å fjerne ubundet radioaktivitet. Plater ble tørket, 35 ul Microscint-20 væskescintillasjonsfluid (Packard BioScience Co., Meriden, CT) ble tilsatt til hver brønn og plater ble telt i en Packard Topcount væskescintillasjonsteller (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Bindingsdata ble analysert ved anvendelse av den ikke-lineære regresjonsprosedyren beskrevet ovenfor for å bestemme IQ-verdier. BOTTOM (kurveminimum) var fiksert for verdien for ikke-spesifikk binding, som bestemt i nærvær av 10 uM MDL 72222. Størrelsen [L] i Cheng-Prusoff ligningen var definert som konsentrasjonen [ H]-GR65630.

Selektivitet for 5-HT4reseptor undertypen med hensyn til 5-HT3reseptor undertypen ble beregnet som forholdet Ki(5-HT3A) / Ki(5-HT4(C)). Forbindelsen av formel I hadde en 5-HT4/5-HT3reseptor undertype selektivitet større enn ca. 1000 i denne analysen.

Analyse 3: Helcelle cAMP akkumulering-flashplate analyse med HEK-293 celler som uttrykker humane 5-HT4(C) reseptorer

I denne analysen ble den funksjonelle virkestyrken av en forsøksforbindelse bestemt ved å måle mengden av cyklisk AMP produsert når HEK-293 celler som uttrykker 5-HT4ble brakt i kontakt med forskjellige konsentrasjoner av forsøksforbindelse.

a. Cellekultur

HEK-293 (humane embryotiske nyre) celler stabilt transfektert med klonet human 5-HT4(C) reseptor cDNA ble fremstilt under uttrykking av reseptoren ved to forskjellige densiteter: (1) ved en densitet på ca. 0,5-0,6 pmol/mg protein, som bestemt ved anvendelse av en [ H]-GR113808 membran radioligandbindingsanalyse, og (2) ved en densitet på ca. 6,0 pmol/mg protein. Cellene ble dyrket i T-225 kolber i Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) inneholdende 4.500 mg/L D-glukose (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 11965) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 10437) og (100 enheter) penicillin-(100 ug) streptomycin/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 15140) i en 5% C02, fuktiggjort inkubator ved 37°C. Celler ble dyrket under kontinuerlig seleksjonstrykk ved tilsetning av geneticin (800 ug/ml: GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 10131) til mediet.

b. Cellepreparering

Celler ble dyrket til rundt 60-80% sammenflytning. 20 til 22 timer før analyse, ble cellene vasket to ganger og tilført serumfri DMEM inneholdende 4.500 mg/L D-glukose (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 11965). For å høste cellene, ble mediet aspirert og 10 ml Versene (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat# 15040) ble tilsatt til hver T-225 kolbe. Celler ble inkubert i 5 minutter ved RT og deretter fjernet fra kolben ved mekanisk omrøring. Cellesuspensjonen ble overført til et sentrifugerør inneholdende et likt volum av forvarmet (37°C) dPBS og sentrifugert i 5 minutter ved 1000 opm. Supernatanten ble avhendet og pelleten ble resuspendert i forvarmet (37°C) stimuleringsbuffer (10 ml ekvivalent per 2-3 T-225 kolber). Denne tiden ble notert og markert som tid null. Cellene ble telt med en Coulter counter (telling over 8 um, flaskeutbytte var 1-2x10 celler/flaske). Celler ble resuspendert ved en konsentrasjon på 5 x IO<5>celler/ml i forvarmet (37°C) stimuleringsbuffer (som tilveiebrakt i flashplate-kifet) og preinkubert ved 3 7°C i 10 minutter.

cAMP analyser ble utført i et radioimmunoanalyseformat ved anvendelse av Flashplate adenylyl cyklaseaktiveringsanalysesystemet med<125>I-cAMP (SMP004B, Perkin Eimer Life Sciences Inc., Boston, MA), i henhold til fabrikantens instruksjoner.

Celler ble dyrket og preparert som beskrevet ovenfor. Endelige cellekonsentrasjoner i analysen var 25 x 10 celler/brønn og det endelige analysevolumet var 100 ul. Forsøksforbindelser ble mottatt som 10 mM forrådsoppløsninger i DMSO, fortynnet til 400 uM i 50 mM HEPES pH 7,4 ved 25°C, inneholdende 0,1% BSA, og serievise fortynninger (1:5) ble deretter fremstilt i den samme bufferen. Cykliske AMP akkumuleringsanalyser ble utført med 11 forskjellige konsentrasjoner av forbindelse varierende fra 10 pMtil 100 uM (endelig analysekonsentrasjoner). En 5-HT konsentrasjon-responskurve (10 pM til 100 uM) ble inkludert på hver plate. Cellene ble inkubert, under risting, ved 37°C i 15 minutter og deretter ble reaksjonen terminert ved tilsetning av 100 ul iskald deteksjons buffer (som tilveiebrakt i flashplate-kifet) til hver brønn. Platene ble forseglet og inkubert ved 4°C over natten. Bundet radioaktivitet ble kvantifisert ved scintillasjonsproksimitets-spektroskopi ved anvendelse av Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT).

Mengden av cAMP produsert per mL reaksjon ble ekstrapolert fra cAMP standardkurven, i henhold til instruksjonene tilveiebrakt i fabrikantens brukerveiledning. Data ble analysert ved ikke-lineær regresjonsanalyse med GraphPad Prism Software pakken ved anvendelse av 3-parameter sigmoidal doseresponsmodellen (stigning begrenset til en). Virkestyrkedata er rapportert som pECso-verdier, den negative dekadiske logaritmen av ECso-verdien, hvor EC50er den effektive konsentrasjonen for en 50% maksimal respons.

Forsøksforbindelser som viser en høyere pECso-verdi i denne analysen har en høyere virkestyrke for agonisering av 5-HT4reseptoren. Forbindelsen av formel I som ble testet i denne analysen i cellelinjen (1), som har en densitet på ca. 0,5-0,6 pmol/mg protein, hadde en pECso-verdi større enn ca. 7,5.

Analyse 4: In vitro spenningsklemmeanalyse av inhibering av kaliumionestrøm i hele celler som uttrykker hERG hjerte-kaliumkanalen

CHO-K1 celler stabilt transfektert med hERG cDNA ble oppnådd fra Gail Robertson ved University of Wisconsin. Celler ble holdt i kryogenisk lagring inntil behov. Celler ble ekspandert og ført i Dulbecco's Modified Eagles Medium/F12 supplert med 10% føtalt bovinserum og 200 ug/ml geneticin. Celler ble sådd på poly-D-lysin (100 ug/ml) belagte glassdekkplater, i 35 mm<2>skåler (inneholdende 2 ml medium) ved en densitet som muliggjorde isolerte celler å selekteres for helcelle spenningsklemmestudier. Skålene ble holdt i en fuktet, 5% C02omgivelse ved 37°C.

Ekstracellulær oppløsning ble fremstilt minst hver syvende dag og lagret ved 4°C når den ikke var i bruk. Den ekstracellulære oppløsningen inneholdt (mM): NaCl (137), KC1 (4), CaCl2(1,8), MgCl2(1), glukose (10), 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (10), pH 7,4 med NaOH. Den ekstracellulære oppløsningen, i fravær eller nærvær av forsøksforbindelse, ble inneholdt i reservoarer, hvorfra den fløt inn i registreringskammeret ved ca. 0,5 ml/min. Den intracellulære oppløsningen ble preparert, oppdelt og lagret ved -20°C inntil bruksdagen. Den intracellulære oppløsningen inneholdt (mm): KC1 (130), MgCl2(1), etylenglykol-bis(beta-aminoetyleter) ',jV"'-tetraeddiksyresalt (EGTA) (5), MgATP (5), 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (10), pH 7,2 med KOH. Alle forsøk ble utført ved romtemperatur (20-22°C).

Dekklagene hvorpå cellene var sådd ble overført til et registreringskammer og kontinuerlig perfusert. Gigaohm forseglinger var dannet mellom cellen og patch-elektroden. Når en stabil patch var oppnådd, startet registrering i spenningsklemmemodus, med det innledende holdepotensiale ved -80 mV. Etter at en stabil helcellestrøm var oppnådd, ble cellene eksponert mot forsøksforbindelse. Standard spenningsprotokollen var: Trinn fra holdepotensialet på -80 mV til -20 mV i 4,8 sekunder, repolarisering til -50 mV i 5 sekunder og deretter retur til det opprinnelige holdepotensialet (-80 mV). Denne spenningsprotokollen ble utført en gang hver 15. sekund (0,067 Hz). Toppstrømamplituder under repolariseringsfasen ble bestemt ved anvendelse av pClamp software. Forsøksforbindelser ved en konsentrasjon på 3 uM ble perfusert over cellene i 5 minutter, etterfulgt av en 5 minutters utvaskingsperiode i fravær av forbindelse. Endelig ble en positiv kontroll (cisapride, 20 nM) tilsatt til perfusatet for å teste funksjonen av cellen. Trinnet fra -80 mV til +20 mV aktiverer hERG kanalen, hvilket resulterer i en utgående strøm. Trinnet tilbake til -50 mV resulterer i en utadgående halestrøm, etter som kanalen tar seg opp fra inaktivering og deaktiverer.

Toppstrømamplituder under repolariseringsfasen ble bestemt ved anvendelse av pCLAMP software. Kontroll og forsøksartikkeldata ble eksportert til Origin (OriginLab Corp., Northampton MA) hvor de individuelle strømamplitudene ble normalisert til den innledende strømamplituden i fravær av forbindelse. Middelverdiene av den normaliserte strømmen og standardavvik for hver betingelse ble beregnet og avsatt som funksjon av tidsforløp for forsøket.

Sammenligninger ble gjort mellom de observerte K<+>strøminhiberingene etter fem-minutterseksponeringen mot enten forsøksgjenstanden eller bare kontroll (vanligvis 0,3% DMSO). Statistiske sammenligninger mellom forsøksgrupper ble utført ved å anvende en to-populasjon, uavhengig t-test (Microcal Origin v.6.0). Forskjeller ble ansett signifikante ved p < 0,05.

Jo lavere prosent inhibering av kaliumionestrømmen i denne analysen er, jo mindre er potensialet for forsøksforbindelser til å endre mønsteret av hjerterepolarisering når de anvendes som terapeutiske midler. Forbindelsen av formel I ble testet i denne analysen ved en konsentrasjon på 3 uM og viste en inhibering av kaliumionestrømmen på mindre enn ca. 15%.

Analyse 5: In vitro modell for oral biotilgjengelighet: Caco-2 permeeringsanalyse

Caco-2 permeeringsanalysen ble utført for å modellere evnen av forsøksforbindelser til å passere gjennom tarmen og komme inn i blodstrømmen etter oral administrering. Raten hvorved forsøksforbindelser i oppløsning permeerer et cellemonolag utformet for å etterligne den tette forbindelsen mellom humane tynntarmsmonolag ble bestemt.

Caco-2 (colon, adenokarcinom; human) celler ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection; Rockville, MD). For permeeringsundersøkelsen ble celler sådd ved en densitet på 63.000 celler/cm<2>på forfuktede transwells polykarbonatfiltere (Costar; Cambridge, MA). Et cellemonolag ble dannet etter 21 dager i kultur. Etter cellekultur i transwellplaten, ble membranen inneholdende cellemonolaget løsnet fra transwellplaten og innført i diffusjonskammeret (Costar; Cambridge, MA). Diffusjonskammeret ble innført i varmeblokken som var utstyrt med sirkulerende eksternt, termostatisk regulert vann av 37°C for temperaturkontroll. Et luftforgreningsrør avleverte 95% 02 / 5% CO2til hver halvpart av et diffusjonskammer og skapte et laminært strømningsmønster over cellemonolaget, som var effektivt for å redusere det uomrørte grenselaget.

Permeeringsundersøkelsen ble utført med forsøksforbindelseskonsentrasjoner ved 100 uM og med<14>C-mannitol for å overvåke integriteten av monolaget. Alle forsøk ble utført ved 37°C i 60 minutter. Prøver ble tatt ved 0, 30 og 60 minutter fra både donor-og mottakersiden av kammeret. Prøver ble analysert ved HPLC eller væske-scintillasjonstelling for forsøksforbindelse og mannitolkonsentrasjoner. Permeeringskoeffisienten (Kp) i cm/sekund ble beregnet.

I denne analysen antas en Kp-verdi større enn ca. 10 x IO"6 cm/sekund og indikerer en fordelaktig biotilgjengelighet. Forbindelsen av formel I ble testet i denne analysen og viste en Kp-verdi på større enn ca. 20 x IO"<6>cm/sek.

Analyse 6: Farmakokinetisk undersøkelse i rotte

Vandige forsøksformuleringer av forsøksforbindelser ble fremstilt i 0,1% melkesyre ved en pH på mellom ca. 5 og ca. 6. Sprague-Dawley hannrotter (CD stamme, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) ble dosert med forsøksforbindelser via intravenøs administrering (IV) ved en dose på 2,5 mg/kg eller ved oral magesonde (PO) ved en dose på 5 mg/kg. Doseringsvolumet var 1 ml/kg for IV og 2 ml/kg for PO administrering. Serievise blodprøver ble samlet fra dyr etter dosering, og ved 2 (bare IV), 5, 15 og 30 minutter, og ved 1, 2, 4, 8 og 24 timer etter dosering. Konsentrasjoner av forsøksforbindelser i blodplasma ble bestemt ved væskekromatografi-massespektrometri analyse (LC-MS/MS) (MDS SCIEX, API 4000, Applied Biosystems, Foster City, CA) med en nedre kvantifiseringsgrense på 1 ng/ml.

Standard farmakokinetiske parametere ble bedømt ved ikke-kompartmental analyse (modell 201 for IV og modell 200 for PO) ved å anvende WinNonlin (versjon 4.0.1, Pharsight, Mountain View, CA). Maksimum i kurven for forsøksforbindelseskonsentrasjon i blodplasma som funksjon av tid betegnes Cmax. Arealet under konsentrasjon som funksjon av tid kurven fra tiden for dosering til den siste målbare konsentrasjonen (AUC(O-t)) ble beregnet ved den lineære trapesoideregelen. Oral biotilgjengelighet (F(%)), dvs. det dosenormaliserte forholdet for AUC(O-t) for PO administrering og AUC(O-t) for IV administrering, ble beregnet som følger:

Forsøksforbindelser som viser større verdier for parametrene Cmax, AUC(O-t) og F(%) i denne analysen ventes å ha større biotilgjengelighet når de administreres oralt. Forbindelsen av formel I hadde en Cmaxverdi på 0,16 ug/ml, en AUC(O-t) verdi på 0,46 ug time/ml og oral biotilgjengelighet (F(%)) i rottemodellen på ca. 19%.

Claims

1. Krystallinsk saltform som er hydrokloridsaltet av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(l»S',3i2,5i2)-8-[(i2)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl]-8-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid eller et solvat derav.

2. Krystallinsk saltform ifølge krav 1,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er et krystallinsk hydrokloridsalt.

3. Krystallinsk saltform ifølge krav 2,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster som har to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 4,41 ±0,2, 8,82 ±0,2, 9,08 ±0,2, 11,21 ±0,2, 14,40 ±0,2, 16,42 ±0,2, 17,35 ±0,2, 17,61 ±0,2, 18,14 ±0,2, 19,04 ±0,2, 19,95 ±0,2, 20,20 ±0,2, 21,23 ±0,2, 22,13 ±0,2, 22,48±0,2, 22,83 ±0,2, 24,16 ±0,2, 25,37 ±0,2, 25,56 ±0,2, 26,22 ±0,2, 27,33 ±0,2, 29,08 ±0,2 og 29,61 ±0,2.

4. Krystallinsk saltform ifølge krav 3,karakterisert vedat røntgenpulverdiffraksjonsmønsteret omfatter to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 14,40 ±0,2, 17,35 ±0,2, 17,61 ±0,2, 19,04 ±0,2, 21,23 ±0,2 og 22,13 ±0,2.

5. Krystallinsk saltform ifølge krav 2,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster hvori topposisjoner er i det vesentlige i samsvar med topposisj onene i mønsteret vist i Figur 1.

6. Krystallinsk saltform ifølge krav 2,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et differensielt sveipkalorimetrispor som viser et maksimum i endotermisk varmestrøm ved en temperatur større enn ca. 230°C.

7. Krystallinsk saltform ifølge krav 2,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et differensielt sveipkalorimetrispor i det vesentlige i samsvar med det vist i Figur 2.

8. Krystallinsk saltform ifølge krav 1,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er et hydrat.

9. Krystallinsk saltform ifølge krav 8,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster som har to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 5,30 ±0,2, 7,43 ±0,2, 8,72 ±0,2, 10,52 ±0,2, 13,85 ±0,2, 14,11 ±0,2, 15,80 ±0,2, 15,99 ±0,2, 17,26 ±0,2, 19,53 ±0,2, 20,08 ±0,2, 21,06 ±0,2, 21,48 ±0,2, 21,92 ±0,2, 22,85 ±0,2, 23,91 ±0,2, 25,28 ±0,2, 26,06 ±0,2, 27,34 ±0,2, 27,51 ±0,2 og 29,67 ±0,2.

10. Krystallinsk saltform ifølge krav 9,karakterisert vedat røntgenpulverdiffraksjonsmønsteret omfatter to eller flere diffraksjonstopper ved 20 verdier valgt fra 10,52 ±0,2, 13,85 ±0,2, 15,80 ±0,2, 17,26 ±0,2 og 21,06 ±0,2.

11. Krystallinsk saltform ifølge krav 8,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et røntgenpulverdiffraksjonsmønster hvori topposisj onene er i det vesentlige i samsvar med topposisj onene av mønsteret vist i Figur 4.

12. Krystallinsk saltform ifølge krav 8,karakterisert vedat den krystallinske saltformen er kjennetegnet ved et differensielt sveipkalorimetrispor i det vesentlige i samsvar med det vist i Figur 5.

13. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og en krystallinsk saltform ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12.

14. Krystallinsk saltform ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, for anvendelse innenfor terapi.

15. Krystallinsk saltform ifølge krav 14, for anvendelse i behandling av en lidelse med redusert motilitet av gastrointestinalkanalen i et pattedyr.

16. Krystallinsk saltform ifølge krav 15, hvor lidelsen med redusert motilitet er valgt fra kronisk konstipasjon, konstipasjon-dominerende irritabel tarmsyndrom, diabetisk og idiopatisk gastroparese og funksjonell dyspepsi.

17. Anvendelse av en krystallinsk saltform ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 for fremstilling av et medikament for behandling av en medisinsk tilstand i et pattedyr hvori den medisinske tilstanden er en lidelse med redusert motilitet av gastrointestinalkanalen.

18. Anvendelse ifølge krav 17 hvori den medisinske tilstanden er valgt fra kronisk konstipasjon, konstipasjon-dominerende irritabel tarmsyndrom, diabetisk og idiopatisk gastroparese og funksjonell dyspepsi.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk hydrokloridsalt av l-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(lS,3Æ,5Æ)-8-[(Æ)-2-hydroksy-3-(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid,karakterisert vedat den omfatter: (a) 1 -isopropyl-2-okso-l ,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {( IS, 3R, 5R)- S- [ (i?)-2-hydroksy-3 -(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] - 8- azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid bringes i kontakt med saltsyre for å danne en reaksjonsblanding; og (b) isolering av det krystallinske hydrokloridsaltet fra reaksjonsblandingen.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk hydrat av hydrokloridsaltet av 1-isopropyl-2-okso-l,2-dihydroquinolin-3-karboksylsyre {(15',3i?,5i?)-8-[(i?)-2-hydroksy-3 -(metansulfonyl-metyl-amino)propyl] -8-azabicyklo[3.2.1 ] okt-3 -yl} amid,karakterisert vedat den omfatter: (a) oppløsning av 1 -isopropyl-2-okso-1,2-dihydroquinolin-3 -karboksylsyre {(l^Sii^^-S-t^^-hydroksy-S-Cmetansulfonyl-metyl-am^propyll-S-azabicyklo[3.2.1]okt-3-yl}amid hydroklorid i vann ved en konsentrasjon større enn ca. 50 milligram per milliliter for å danne en suspensjon; og (b) isolering av det krystallinske hydratet fra suspensjonen.